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Ao del buen servicio al ciudadano

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
Ao del buen servicio al ciudadano
opasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopa
FACULTAD DE INGENIERA
E. A. P. DE AGROINDUSTRIA
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Pre-Informe
Ao del buen n2:
servicio al ciudadano

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO
CELULAR POR LOTE ALIMENTADO DE
klzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz
Ao del buen servicio al ciudadano
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

xcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv Docente:
Ing. Augusto Castillo Caldern
bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnIntegrantes:

mqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq
CCERES PEREDA MERYSHELL
ENCINAS ESTRADA GREISY

wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwe
LOREO JIMENEZ ESTRELLA
PALACIOS HILARIO ANTONY
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VALERIO MOLINA MARIBY
Curso:
uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuio
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
Ciclo:
pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas VII
Grupo de prctica:
dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg B
Pre-informe N2
Nuevo Chimbote- Per
hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjk 2017
 DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR
POR LOTE ALIMENTADO DE Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4126

I. OBJETIVOS

1.1. Objetivo general

Disear y realizar una experiencia de cultivo por lotes alimentado

(CLA) con aireacin y alimentacin constante, utilizando una cepa de
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
1.2. Objetivos especficos

Identificar y describir las partes, accesorios y geometra, conocimiento

de la operacin del fermentador, esterilizacin, carga y descarga y
toma de muestras.
Identificar en el fermentador los instrumentos de medicin y control
automtico, as como la calibracin de los sensores.
Diseo del medio de cultivo.
Activacin celular y desarrollo del inculo.
Puesta en marcha del CLA. En el cultivo por lote determinar mx y Yx/s
as mismo determinar el KLa por el mtodo Dinmico de Humphrey.
Obtener los perfiles de masa celular y fuente de carbono a travs del
tiempo de operacin.
Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.
Determinar Yx/S y Qx del CLA.

II. MATERIALES Y METODOS

2.1. Medio de Mantencin:

 2.1.1. Materiales e instrumentos:
Guantes.
Capachos de papel.
Vasos precipitados 250ml.
Esptula.
Probeta graduada.
Matraz Erlenmeyer.
Tubos de ensayo
Pipetas.
Mechero bunsen
Varilla de vidrio.

2.1.2. Equipos:
Balanza analtica.
Olla a presin.

2.1.3. Reactivos:
Extracto de malta (3 g/l)
Peptona (5 g/l)
Agar (20 g/l)
Extracto de levadura (3g/l)

2.2. Medio de Activacin:

2.2.1. Materiales e instrumentos:

 Algodn.
Gaza.
Capachos de papel.
Guantes.
Matraz de 125ml
2 tubos de ensayo con tapa
Pinzas.
Mechero bunsen.
Trpode.
Rejilla

2.2.2. Equipos:
Balanza analtica.
Olla a presin.
Shaker.
pHmetro.

2.2.3. Reactivos:
Glucosa (5 g/l)
Extracto de levadura (3 g/l)
Extracto de malta (3 g/l)
Soluciones de sales (5 ml/L)

2.3. Medio de fermentacin:

2.3.1. Materiales e instrumentos:

 Gaza.
Capachos de papel.
Laminillas porta y cubre objeto.
Probeta graduada.
Varilla de vidrio.
Matraz 1L.
Matraces de 125 ml.

2.3.2. Equipos:
Balanza analtica.
Espectrofotmetro.
pHmetro.
Incubadora.
Microscopio.
Micropipeta.

2.3.3. Reactivos:

Extracto de levadura.(10g/l)
MgSO4.7H20 (0.386g/l)
(NH4)2SO4(10g/l)
KH2PO4 (2 g/l)
Cascarilla de arroz

2.4. Para cintica de crecimiento de biomasa

Capachos de papel aluminio
Gasa y algodn
Tubo de ensayo
 Matraz de 500 ml

2.5. Determinacin de la cintica de consumo de la fuente de

carbono
Materiales

Viales conteniendo el sobrenadante

Instrumentos e Equipos

Espectrofotmetro

Reactivos

Sacarosa
Agua destilada

III. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

A la hora de disear un medio de cultivo no slo hay que tener en cuenta los
nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento de
los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea
producir.Tambin es importante conocer las caractersticas de los
microorganismos con el que se va a trabajar.

Microorganismo: La levadura usada es Saccharomyces cerevisiae ATCC

4126, siendo el sustrato SACAROSA

Condiciones del medio:

Sustrato limitante: SACAROSA

Duracin: 10 horas de la etapa de CL
 Usar el fermentador automtico Biostat-A Plus de 3 litros
Control de pH mediante electrodo
Medicin de oxgeno disuelto mediante electrodo : 23.68cm/min
La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.
Utiliza macro nutrientes como: C.N.Mg,K,P
Utiliza micro nutrientes como: Ca,Na,Fe,Cu,Mn,Mo,Co,Zn

COMPOSICIN DEL MEDIO MNIMO DE PARA UN CRECIMIENTO

Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 EN BIOMASA

Elemento Nutriente % en % en Y x/s S`0 (g/l) S0 (g/l)

Clula nutriente (g/g)
C Sacarosa 45 42,105 0,5614 3,2063 3,2063
(C12H22O11)
N Sulfato de Amonio 9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457
(NH4)2SO4
K Fosfato Potsico 0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471
(KH2PO4)
Mg Sulfato de 0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095
Magnesio
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
P Fosfato Potsico 2 22,79 11,395 0,1580 0,2369
(KH2PO4)

Condiciones de Cultivo:

pH inicial 4,5
Temperatura 30C
 Velocidad de agitacin 220 rpm

Entonces de esta tabla tenemos el diseo para una concentracin de 2 g/L.

Ahora una vez obtenido nuestro diseo para nuestro medio de fermentacin
1 en el matraz, procedemos a inocular al fermentador, ahora haremos un
diseo para llegar en el fermentador a una concentracin de 2 g/L con un
volumen inicial de 200 ml, una vez cumplido este requerimiento
procederemos con la alimentacin empezando el CL.
Como la sacarosa es el nutriente limitante haremos un diseo aparte en base
a una concentracin final de 2 g/L, que es la concentracin con la cual
empezara el CL.

Tabla N 04: Concentracin de sacarosa para un medio de

fermentacin de con Vi = 200 ml.

(Para una concentracin final = 2 g/l)

Peso (gr)
Nutriente Fuente Concentracin (g/l)
Para V =200 ml

C12H22O11 C 3.34 2.672

Tabla N 05: Concentracin de nutrientes para un medio de

fermentacin de con Vi = 200 ml.
 (Para una concentracin final = 3.64 g/l)

Nutriente Fuente Concentracin (g/l) Peso (gr)

Para V = 800 ml
(NH4)2SO4 N 2.168 1.734
(NH4)2SO4 S 0.026 0.021
KH2PO4 K 0.089 0.071
KH2PO4 P 0.449 0.359
MgSO4.7H2O Mg 0.207 0.166
MgSO4.7H2O S 0.048 0.038
Extracto de - 1.8 1.44
levadura
Solucin de sales - 10ml/L 8 ml

Realizamos diseos separados para la sacarosa y los dems nutrientes

debido a que como la sacarosa es el nutriente limitante se terminara cuando
se llegue a la concentracin de 2 g/L y es ah cuando se iniciara el flujo de
alimentacin, en cambio los dems nutrientes seguirn en el medio hasta el
final del CL por esto se disea en base a 3.64 g/L.

Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin de con Vi =

200 ml.

(Para una concentracin final = 3.64 g/l)

 FUENTE ELEMENT % % Yx/s S (g/L) S
O CELULA NUTRIENTE (g/L)
(NH4)2SO4 N 9 21.21 2.36 1.445 2.168
(NH4)2SO4 S 0.12 24.24 202 0.017 0.026
KH2PO4 K 0.5 28.75 57.5 0.059 0.089
KH2PO4 P 2 22.77 11.39 0.299 0.449
MgSO4.7H2 Mg 0.4 9.87 24.68 0.138 0.207
O
MgSO4.7H2 S 0.12 12.99 108.2 0.032 0.048
O
5

X1= 0.23 g/L

Tenemos:

X2= 3.64 gr/L

Entonces: X = 3.41 g/L

PREPARACION DE LA SOLUCION TAMPN:

Buffer citrato
PH = 4.2
Se pes 57.5 g. de acido ctrico y se afor con agua destilada a 250 ml.
(en una fiola)
Se pes 29.41 g. de citrato de sodio y se afor con agua destilada a 100
ml. (fiola)
Luego se tom 157.5 ml. de la solucin A
Se tom 92.5 ml. de la solucin B
Despus se ajusto el pH con HCl o KOH.
Finalmente enrazar a 500ml.
pHinicial = 3.726, se utiliz KOH para ajustar el pH a 4.2

Caractersticas del equipo

El biorreactor usado es automatizado Biostat A plus de 3 litros, est bien diseado
para proporcionar un entorno estable, confiable, para diversas aplicaciones de
cultivo celular. Este sistema puede ser empleado para el cultivo de lotes alimentado,
el control de PC de pH, DO, la agitacin, la temperatura, antiespumante, la bomba
de alimentacin, entre otros.

El biorreactor antes de ser puesto en marcha tendr que ser esterilizado.

Para realizar nuestro CL el biorreactor usado ser puesto en marcha con un

volumen inicial igual a 0.2 L para llegar a un volumen final de 2 L.

Tenemos que el tiempo de fermentacin ser de 5 h para un flujo constante de

alimentacin de 0,16 L/h.

Se trabajara con 200 rpm como ser un cultivo por lote alimentado aireado no habr
flujo de salida.

El biorreactor del laboratorio es un biorreactor marca Biostat M que posee las

siguientes partes:

Sensor de PH
Sensor de T
Sensor Oxgeno Disuelto.
Condensador
Motor de rotor
Un vaso con capacidad de 2 lt

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. ACTIVACION CELULAR Y DESARROLLO DEL INOCULO

4.1.1. Sembrado de la cepa en el medio slido

Se parte de la cepa congelada del laboratorio, y se inocular la cepa

con 3 azadas en el tubo de ensayo que contiene 5 ml de medio rico
lquido, aspticamente bajo un mechero. y se tapa el tubo con un
tapn de gasa y algodn e incubar por 30 minutos a 30 C.
Posteriormente sembramos con 2 o 3 azadas en aspticamente en los
tubos con medio de cultivo slido, preparados para la mantencin.
Dejar en incubacin a 35C por un tiempo de 48 horas. Y almacenar
en refrigeracin hasta la activacin del microorganismo.

4.1.2. Activacin celular y desarrollo del inculo

De estos tubos de mantencin, se inocular con 3 azadas en el matraz

de 125 ml que contiene 30 ml de medio de activacin lquido.
Aspticamente, bajo un mechero.
Llevar al shaker para la incubacin con una temperatura de 35 C con
una velocidad de control de 200 rpm. por un tiempo de 10 horas hasta
alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el
incremento en la turbidez del medio.
1 hora antes de terminar la activacin poner a incubar el medio de
fermentacin a 35 C.
4.1.3. Cintica de la fermentacin

De la activacin, se inocular este (medio rico + biomasa) al matraz

de 500 ml, conteniendo 200 ml de medio de cultivo de la fermentacin.
A partir de este paso se determinar la cintica de crecimiento de la
biomasa.
Sacar 5 ml. del matraz de 500 ml y llevar a espectrofotmetro, para
obtener la biomasa inicial (Xo) a un tiempo cero.
Iniciar el medio de fermentacin en el shaker a 30 C a 180 rpm. y
tomar la absorbancia de la biomasa cada hora y media por 10 hrs.
 De las absorbancias obtenidas en cada medida podremos obtener la
concentracin celular en cada instante, utilizando el espectrofotmetro
y haciendo la curva de calibracin de biomasa.

4.1.4. Cintica de crecimiento de la biomasa

Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido

del mechero.
Una vez que se hizo la inoculacin al medio de fermentacin,
inmediatamente se extrae una muestra de 3 mL 4 mL de caldo y
medir Xo con D.O. Se coloca la muestra en el shaker.
La toma de muestras se realizaron cada hora y media para la primera
muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera.
Se extrae 4 mL del medio de cultivo, 1 mL se le agrega al tubo
espectrofotmetro y se mide la absorbancia, 3 mL se agrega al tubo
de centrifugado.
Luego se centrifugo los 3 mL a una velocidad mxima por 10 min.
Finalmente se toma el sobrenadante en los viales, para el consumo de
sustrato de carbono, y el slido para el anlisis de la biomasa.

4.1.5. Cintica de consumo de la fuente de carbono

Las muestras utilizadas para medir el crecimiento de la biomasa, las

centrifugamos por 15 minutos a 1000 rpm y guardamos los
sobrenadantes en viales en refrigeracin.
Luego las muestras sern analizadas mediante el mtodo del DNS.
Con la que se puede hallar una curva. Utilizando la curva de
calibracin

4.1.6. Mtodo del DNS (cido Dinitrosaliclico)

 Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en
aproximadamente 50 ml de agua, paralelamente el NaOH en 20 ml de
agua.
Ambas soluciones se mezclan en un vaso de precipitado de 250 ml y
se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes.
Se disuelve el DNS en pequeas cantidades con ayuda de un agitador
magntico y calentando.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Luego verter en una fiola de 100 ml, enrazar y mezclar
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:
Se aade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de solucin de sacarosa
hidrolizada.
Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos
para luego enfriar con agua helada por 3 minutos.
Se aaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 10 minutos,
luego agitar.
Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia
en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestra de
concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

1. PREPARACION DEL MEDIO:

1.1. PREPARACIN DEL MEDIO DE MANTENCIN

 La preparacin de este medio se realizara de acuerdo a los
componentes que se encuentran en la tabla N 01

Nutriente So (g/l) So (g/50ml)

Extracto de Levadura 3 0.15

Extracto de malta 3 0.15
Peptona 5 0.25
Agar 20 1
Glucosa 10 0.5

Tabla N1: Composicin de medio slido de mantencin (para 50 ml de solucin).

SOLIDO DE MANTENCION

Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composicin de medios

decultivo de mantencin para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

Luego de acuerdo a la tabla se pesan las cantidades requeridas de

cada compuesto, con mucho cuidado.

En una probeta graduada de 50

MEDIR ml de agua destilada.

Adicionando agua destilada.

Todos los componentes en
MEZCLAR un matraz Erlenmeyer
 Con el mechero de bunsen la mezcla
disuelta en el matraz, agitando con una
CALENTAR varilla de vidrio, hasta aparicin de la
primera burbuja, a partir de lo cual se
Adicionar 6 ml de mezcla a cada tubo controla de a 1 a 2 min.

8 tubos de ensayo con tapa y en

PREPARAR caliente, inmediatamente taparlos.

Los tubos en un vaso precipitado, y

llevarlos a la olla a presin,
COLOCAR
previamente aflojado las tapas, para
permitir el intercambio de gases.
Hasta que la temperatura alcance los
CALENTAR 121C y a partir de ello controlar de 15
a 20 minutos. Finalizando la
esterilizacin.

Las tapas de los tubos, luego

AJUSTAR colocarlos en posicin inclinada y
dejarlos a temperatura ambiente.

1.2. MEDIO DE ACTIVACIN:

Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin (15 ml y

100ml)
Nutriente Concentracin Peso - Peso - 100ml
(g/L) 15ml (gr)
(gr)
Glucosa 5 0.075 0.5
Extracto de levadura 3 0.045 0.3
Extracto de malta 5 0.075 0.5
Solucin de sales 5 ml/L 0.075 0.5

PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN

MEDIR Matraz Erlenmeyer de 125 ml

Todos los nutrientes

PESAR

En cada tubo y adicionar agua

COLOCAR
destilada para disolver

ESTERELIZAR

EL pH 6.0
MEDIR
 En el mechero de Bunsen la mezcla
CALENTAR
para evitar Cualquier tipo de
contaminacin

Constantemente con una varilla

AGITAR por un minuto (aparicin de la
primera burbuja)

DIAGRAMA N 02 RESIEMBRA SOLIDO LIQUIDO

La mezcla

AGREGAMOS En un matraz de 500ml

Tomamos una azada e inoculamos

INOCULAMOS en el matraz con el medio de
activacin

COLOCAMOS En el Shaker a T= 30 - 180 rpm

1.3. MEDIO FERMENTACION:

 2. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTE ALIMENTADO

AIREADO DE Saccharomycescerevisiae ATCC 4126

ACTIVIDADES FECHA

07/06/17
Reconocimiento del reactor
Presentacin del pre informe de 12/06/17
prcticas.
Resiembra en medio de mantencin. 13/06/17
13/06/17
Preparacin del medio de activacin.
Activacin del microorganismo.
14/06/17
Curva de calibrado para peso seco de
biomasa. (utilizar la obtenida en la
experiencia de cultivo por lote)
Esterilizacin de pipetas y preparacin
20/06/17
de viales.
Preparacin del inoculo. 21/06/17
Seguimiento de cintica en cultivo por
lote.
Seguimiento de cintica microbiana por
CLA.
Anlisis DNS 28/06/17
Curva de calibrado de biomasa
Imprevistos
Presentacin del informe final 03/07/17

ANEXOS