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Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Bacteriologia
Nutrio
2007
Universidade Federal Fluminense
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Apresentao
Os autores.
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ndice
Bibliografia ........................................................................................................................ 80
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importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um
laboratrio de microbiologia em geral, no importando se o microorganismo estudado ser uma
bactria, um fungo ou um vrus.
Cuidados fundamentais
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2 Antes de entrar no laboratrio, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados
em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papis e outros itens que no sero utilizados na
aula prtica.
3 Para entrar no laboratrio, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferncia
limpo e branco.
4 No incio e no final de cada aula prtica, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada
com uma soluo desinfetante prpria. Este espao deve ser mantido limpo e arrumado durante o
decorrer de toda a aula prtica.
6 Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.)
7 Anote todos os detalhes da aula prtica e faa os exerccios de fixao de cada assunto.
9 Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer,
chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha
desinfetante sobre o local (superfcies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha.
10 Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra.
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Em primeiro lugar essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas dos microscpios:
- Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para
mant-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o p e a multiplicao de fungos (Obs: as
capas devem ser lavadas periodicamente).
- Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na
base, ou com as duas no brao, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de
trabalho de superfcie plana, evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o
aparelho com a lmpada acesa ou logo aps ter sido apagada.
- Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o
risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho retirar o excesso de lquido com
papel de filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina; em de acidente, enxugar
imediatamente com papel absorvente macio.
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- Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para
focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma:
Escolha uma estrutura na preparao, mova a lmina at que o objeto fique exatamente
no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para
evitar o choque com a lamnula.
Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macromtrico muito
lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalizao com
o micromtrico.
O uso da objetiva de imerso mais delicado, pois a distncia focal entre a face da
objetiva e a parte superior da lamnula, diminui quando a ampliao aumentada.
Em primeiro lugar, assegure-se da existncia de algo no campo, posicionando a objetiva
de menor aumento.
Certifique-se que a iluminao e o objeto esto bem centrados, suspenda o tubo e
coloque uma gota de leo no centro da operao; o leo deve ter o mesmo ndice de refrao da
objetiva;
Abaixe o tubo at colocar a lente frontal em contato com a gota de leo ainda convexa,
at a mudana de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com
a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem
aparecer, complete a focalizao com o micromtrico.
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Introduo
Fundamentao terica
Meios de Cultura
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Tcnicas de Semeadura
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flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculaes, evitando a
contaminao da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo
desejado ser inoculado. (4)
De acordo com as caractersticas fsicas dos meios de origem e destino, alm da finalidade
da inoculao, podem-se utilizar diferentes tcnicas de inoculao.
A transferncia de inculo de um meio para outro tambm denominada genericamente
como repique.
A seguir, veremos quais so as tcnicas de inoculao:
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Objetivos
Material
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Execuo da prtica
- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colnia com auxlio de uma ala
bacteriolgica e transferir para o tubo com caldo, atravs do processo de difuso.
1. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com caldo, atravs da
tcnica de difuso.
2. Com auxlio de uma ala ou agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar
inclinado, atravs da tcnica de estria (sinuosa ou reta).
3. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para a placa com Agar, atravs da
tcnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias).
4. Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar semi-
slido, atravs da tcnica de picada central.
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- com o auxlio de uma pipeta estril, transferir 1 ml da amostra de gua para uma placa estril e
adicionar o meio fundido, realizando a tcnica do pour plate.
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Exerccios de fixao
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Observaes
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Introduo
Fundamentao terica
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Objetivos
Material
Execuo da prtica
Bactrias no ambiente:
- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da rea de segurana. Cada grupo deixar
a placa em exposio por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos)
- em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificao de bactrias em
diversas superfcies, de acordo com o diagrama representado a seguir:
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Exerccios de fixao
Observaes
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Introduo
Fundamentao terica
Calor
Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor mido.
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O calor mido mais eficaz que o calor seco, pois a gua melhor condutora de calor quando
comparada com o ar.
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Radiaes
No ionizantes Luz Ultravioleta
- possui atividade mxima num comprimento de onda de 260 nm
- desinfetante
- geralmente utilizado em ambientes
- no penetrante desinfeco apenas superficial
- a lmpada tem vida til de 200 horas (aproximadamente)
- age no DNA microbiano, gerando mutaes letais
Ionizantes Radiao Gama
- esterilizante
- mais energtico que UV, atua num comprimento de onda menor
- age ionizando componentes celulares, levando morte
- muito utilizado em produtos hospitalares descartveis
- seu uso nas indstrias de alimentos est crescendo
- possui baixo poder de penetrao desinfeco apenas superficial
Filtrao
Clarificante - retm as impurezas grosseiras
- desinfetante
Esterilizante - possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vrus.
Outros
Presso osmtica Adio de NaCl
- tambm conhecida como salga
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano. Tambm pode causar lise osmtica da clula bacteriana.
- muito utilizada em produtos crneos (carne seca, pescado)
Adio de outros slidos (acares)
- utilizado na fabricao de compotas e alimentos em calda
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- muito empregado para conservao de frutas e hortalias
Dessecao - retirada umidade do alimento em maior ou menor grau
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
Liofilizao - aplicao de dessecao em vcuo (presso negativa)
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- seu emprego na indstria de alimentos crescente
Baixas temperaturas Refrigerao
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lcool Etlico
um dos mtodos qumicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo
custo, relativa eficcia e fcil aplicao. Pode ser usado como desinfetante ou anti-sptico.
Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 70%), pois nessa condio
possui maior poder penetrante.
O lcool absoluto possui poder bacteriosttico, enquanto o lcool hidratado a 70% possui
poder bactericida.
So apontados diversos mecanismos de ao para o etanol:
- ao detergente: solvente de lipdeos
- ao desidratante: retira gua das clulas
- ao desnaturante: agindo sobre protenas celulares
Fenis e Derivados
O fenol um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante de referncia
para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto mais
ativo que o fenol.
Atua como desnaturantes de componentes proticos
Dentre os cresis, o mais importante a creolina, uma mistura de cresis muito utilizada
para pisos e sanitrios.
O hexaclorofeno muito utilizado na antissepsia cirrgica.
Halognios
Os principais halognios utilizados no controle microbiano so o Cloro e o Iodo.
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como anti-sptico na prtica cirrgica vem diminuindo, sendo substitudo por clorexidine e
similares.
Detergentes catinicos
Alteram a permeabilidade da membrana. mais ativo contra Gram negativos.
Exemplo: compostos quaternrios de amnio cloreto de benzalcnio.
Mercrio (Hg): j foi muito utilizado como anti-sptico, mas seu uso est decaindo devido ao
risco de intoxicao por absoro cutnea.
cidos
Tanto os cidos orgnicos quanto os inorgnicos so muito utilizados na conservao de
alimentos. So mais utilizados os cidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior
solubilidade.
A atividade antimicrobiolgica dos cidos fracos atribuda a sua forma no dissociada
(HA), pois esta penetra atravs da membrana tornando-se ionizada aps alcanar o interior da
clula. A concentrao intracelular destes cidos orgnicos altera o funcionamento normal do
gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular.
A concentrao da forma no dissociada do conservante qumico no alimento
determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molcula est na forma dissociada) do cido e do pH do
meio, como mostra a frmula a seguir:
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lcalis
Os principais lcalis utilizados so o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente,
est presente nos sabes, conferindo-lhes relativa ao anti-sptica.
Corantes bsicos
So mais eficiente contra Gram-positivos.
Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno.
Redutores
Reduzem compostos celulares, levando as clulas morte.
Aldedos e derivados: formaldedo e formalina so utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas
causam irritaes cutneas.
Oxidantes
Oxidam componentes celulares levando morte das clulas. So muito utilizados como
desinfetantes.
Exemplo: Oznio, gua oxigenada, permanganato de potssio, perxido de zinco.
xido de etileno (gs): um agente alquilante, age inativando protenas e cidos nuclicos.
temperatura de 52C o xido de etileno passa do estado lquido para o gasoso. Seus vapores so
utilizados para esterilizao de materiais de borracha ou plstico.
Antimicrobianos
Possuem ao seletiva contra microorganismos, ao contrrio dos anteriores. So um
mtodo biolgico de controle microbiano. Sero abordados num prximo assunto.
Objetivos
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Material
- Culturas bacterianas
- 2 Placas de Petri com Agar
- Solues anti-spticas
- Gaze estril
- Trip e tela de amianto
- Recipiente com gua em ebulio
Execuo da prtica
Agentes Qumicos
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- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espao respectivo ao
tempo 0
- para os prximos espaos, colocar as culturas em banho-maria fervente at atingir o tempo
especificado:
- 5 minutos reinocular
- 10 minutos reinocular
- 20 minutos reinocular
Exerccios de fixao
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Observaes
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Introduo
Coloraes simples tornam possvel a visualizao das bactrias ao microscpio, mas isso
no faz distino entre organismos de morfologia similar. Para tanto, necessrio realizar uma
colorao diferencial.
Existem diversos mtodos de colorao utilizados para a anlise de bactrias. Entre estes,
o mais utilizado a colorao desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas
seqncias de colorao, com diferentes corantes, este mtodo permite a diviso das bactrias
em 2 grandes grupos.
O primeiro grupo, que retm a cor do primeiro corante (o cristal violeta), denominado
Gram positivo.
O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retm a cor do segundo corante
utilizado (fucsina) e denominado Gram negativo.
Uma soluo de iodo (lugol) utilizada como mordente (um composto qumico que fixa um
corante ou outra substncia ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolvel) para
a primeira etapa da colorao.
H tambm um agente descorante entre a utilizao de um e outro corantes. Pode-se
utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descolorao desejada. O lcool
etlico a 95% um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa.
Geralmente utiliza-se uma mistura de lcool etlico e acetona (95:5), obtendo uma
velocidade de descolorao intermediria.
A maioria dos cocos Gram positiva com exceo dos gneros Neisseria e Veillonella que
so os nicos Gram negativos.
Assim tambm acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos
Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus,
Lactobacillus e Clostridium. Os vbrios so Gram-negativos.
A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais) das
bactrias etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de bactrias de
material clnico bem como de alimentos. No entanto, a identificao completa de uma bactria
sempre necessitar de dados fisiolgicos ou genticos da mesma.
Fundamentao terica
A colorao de Gram baseia-se na diferena das paredes celulares das diversas bactrias
e como estas sero coradas de forma distinta.
As bactrias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoprotena
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoprotenas e substncias
lipdicas. J as consideradas Gram positivas possuem uma nica e espessa camada de
glicoprotena.
Antes de iniciar a colorao, necessrio fazer um esfregao, ou seja, pegar uma colnia
previamente isolada ou uma alada de uma cultura pura e transferir para uma lmina limpa. Se for
utilizada uma colnia, deve-se adicionar uma gota/alada de soluo salina a 0,9%,
homogeneizando-a. importante que o esfregao seja bem preparado, para que, ao final da
colorao, seja possvel a visualizao das bactrias. Tambm importante no esquecer de fixar
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o esfregao na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de clulas a ser analisada se
perca durante as etapas da colorao.
Na primeira etapa da colorao, o corante violeta adicionado sobre o esfregao. O
corante, ento, penetra na parede da bactria, independente se esta Gram positiva ou Gram
negativa.
Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande
complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactria.
O lcool tem papel fundamental neste mtodo. Ao ser adicionado sobre o esfregao
corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactrias:
as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano sero
desidratadas, e os poros na parede sero reduzidos, impedindo a sada do complexo CV-I e
tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I).
as bactrias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima
desta camada encontra-se uma outra, de carter lipdico (rica em LPS, lipoprotenas e outros
componentes). Essa camada lipdica, em contato com o lcool, dissolve-se, deixando a camada
de peptidoglicano desprotegida e permitindo a sada do complexo CV-I, tornando a clula
descorada neste momento.
importante lembrar de lavar a lmina aps a etapa de descolorao, pois se restar algum
resduo de lcool, a prxima etapa no ser realizada adequadamente, e os resultados podero
ser alterados.
O esfregao ento tratado com fucsina, que no ter efeito algum sobre as clulas Gram
positivas, que esto com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrar na parede das clulas
Gram negativas, corando-as de vermelho.
Esta colorao utilizada para a maioria das bactrias, mas h algumas que no se coram
por este mtodo, como as micobactrias, as bactrias espiraladas e as bactrias que no
possuem parede celular. Para estes, h outros mtodos de colorao, como o mtodo de Zihel-
Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o mtodo de visualizao em campo escuro.
Objetivos
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relacionar a composio qumica da parede celular das bactrias com os corantes de Gram;
Material
- Lminas
- Culturas bacterianas em meio lquido e slido
- Alas e agulhas
- Bateria da colorao de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, lcool, gua)
- Papel de filtro
- leo de cedro (leo de imerso)
- Microscpio
- Bico de Bunsen
Execuo da prtica
Etapas Observaes
Transferir uma alada da cultura ou uma colnia Ao fazer o esfregao a partir de diferentes
da placa para uma lmina de microscpio limpa. culturas deve-se observar alguns detalhes:
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Passar a lmina com o esfregao sobre a chama importante fixar o esfregao para que este no
do Bico de Bunsen, at que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a
completamente seco. utilizao de um e outro corantes
Colorao do esfregao
A seguir, lavar em gua corrente com o A lavagem com gua importante aps cada
pissete. etapa para que uma substncia utilizada no
interfira na ao da prxima.
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Cobrir o esfregao com soluo de Lugol fraco O Lugol uma soluo de Iodo e funciona como
por cerca de 1 minuto. mordente neta etapa da colorao, ou seja, ele
fixa o corante Cristal Violeta na parede da clula,
pois forma um complexo grande: o CV-I
Novamente lavar com gua, e ento lavar com O lcool absoluto, ou soluo de lcool-acetona,
lcool absoluto at que no saia mais corante funciona como diferenciador da colorao:
da lmina (10 15 segundos). nas Gram +, o lcool desidrata a matriz
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os
poros da parede e impedindo a sada do
complexo CV-I, corando a clula de roxo:
Lavar com gua corrente em abundncia, importante prestar com bastante ateno nesta
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para que no reste lcool sobre a lmina. etapa, pois se restar algum lcool na lmina a
colorao no prosseguir, j que o prximo
corante no se fixar na lmina.
Cobrir o esfregao com fucsina por cerca de A fucsina age de diferentes formas nas
30 segundos. diferentes clulas:
nas Gram +, os poros esto reduzidos,
impedindo que a fucsina penetre na parede
celular, no alterando a cor roxa:
Lavar com gua e secar suavemente com Aps secar suavemente a lmina, observar ao
papel. microscpio na objetiva de imerso (100x), com
leo de cedro/mineral e identificar a clula
corada.
Para decorar!!!
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Exerccios de fixao
Observaes
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Introduo
Fundamentao terica
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substncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibio. Para minimizar os riscos
de resultados errneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este
um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar
que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma
colorao de Gram antes de qualquer TSA para a confirmao da pureza da cultura.
A base para o julgamento de sensibilidade o tamanho real do halo de inibio (zona sem
crescimento em volta dos discos de antibitico). O tamanho do halo sozinho no uma medida
quantitativa da atividade do antibitico, assim, errneo pensar que quanto maior o halo, mais
potente seja o antibitico. Por essa razo, comparaes diretas dos dimetros dos halos
produzidos por antibiticos no relacionados so falsos e no devem ser realizados. Deve-se
interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (dimetro do halo) em comparao
aos dados da tabela de interpretao do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na
teraputica clnica.
Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ao na clula bacteriana:
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Padro da 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
escala
MacFarland
Concentrao 300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000
aproximada de
microrganismos
(x106/ml)
Objetivos
citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito atravs de outras tcnicas.
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Material
- Cultura bacteriana
- Tubo com soluo salina estril
- Swab estril
- Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland
- Pipeta estril
- Placa de Agar Mueller-Hinton
- 4 discos de antibiticos diferentes
- Pina
- Rgua graduada
Execuo da prtica
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- aguardar um tempo para que o Agar absorva o inculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o
auxlio de uma pina estril, colocar os discos de antibiticos sobre o Agar, pressionando
levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles borda da
placa um espao no inferior a 15 mm.
Agar Mueller-Hinton
Composio do Meio (g/L) Observaes
Infuso desidratada de carne 300,0 pH do meio: 7,4 0,2
Casena hidrolisada 17,5 O meio no apresenta nenhum agente seletivo
Amido 1,5 ou inibidor que possa interferir nos resultados
do Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos.
Agar 17,0
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Exerccios de fixao
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Introduo
Fundamentao terica
Staphylococcus
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Streptococcus
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presso osmtica (at 6,5 % de NaCl). So membros da microbiota normal do trato gastrintestinal
de diversas pessoas.
O gnero Streptococcus composto de bactrias anaerbias facultativas, com maior
crescimento em atmosfera com 10% de CO2.
Possuem atividade hemoltica, fator importante para a classificao das cepas patognicas
em a (hemlise parcial), b (hemlise total) e g (anemoltico).
Os estreptococos a hemolticos apresentam zonas de hemlise, possuindo hemcias
ntegras na parte mais interna junto a colnia, e hemlise maior na parte mais externa.
Freqentemente, aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise (devido a alterao da
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana e conseqente liberao de biliverdina
e bilirrubina), que originou a qualificao "estreptococos do grupo esverdescente" ou
Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de
pneumonia, apresentam hemlise a, uma colnia puntiforme com um aprofundamento no pice da
colnia (parecendo um pequeno vulco).
Os estreptococos b hemolticos produzem uma zona de hemlise total, no se observando
hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes
apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O destruda pela ao do oxignio
atmosfrico e, portanto, s demonstrada em colnias crescidas em profundidade no Agar sangue.
A hemolisina S estvel ao oxignio do ar e produz hemlise mesmo nas colnias
crescidas na superfcie do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam
hemolisina O, se torna necessria a semeadura do germe pela tcnica em profundidade ("pour-
plate") , ou a realizao de perfuraes ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubao
em atmosfera pobre em oxignio (tcnica da jarra com vela).
Os estreptococos g no produzem hemlise, so anemolticos, isso significa que no tm
capacidade ltica nenhuma sobre as hemcias. Muitas das espcies saprfitas so deste grupo.
Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento.
O meio de seletivo especfico para estreptococos mais usado o Caldo Hitchens-Pike.
Um meio alternativo para enriquecimento o Caldo Tioglicolato de Sdio, adequado para o
crescimento de bactrias, inclusive aquelas microaerfilas e anaerbias.
O meio clssico de isolamento de estreptococos o Agar Sangue aonde pode-se observar
o perfil hemoltico dos mesmos.
As colnias de estreptococos isoladas em Agar Sangue so puntiformes (< 1mm de
dimetro), transparentes luz transmitida e peroladas luz refletida.
Na identificao de estreptococos alm do perfil hemoltico, utilizam-se outras provas
auxiliares para a identificao das principais espcies. O esquema abaixo apresenta estas provas:
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Objetivos
Material
- swabs estreis
- tubo com soluo salina
- Agar Chapman
- Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike).
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- Agar sangue
- Caldo simples ou BHI
- Agar inclinado
- Agar DNAse
- dessecador com vela.
Execuo da prtica
- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxlio de swab previamente umedecido
em soluo salina estril e inocular o meio Chapman com a tcnica de esgotamento em estria e
incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:
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- utilizando os reativos prprios, fazer as leituras das provas de catalase (H2O2), DNAse (HCl 1N)
e coagulase (plasma de coelho citratado)
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OBSERVAO:
As principais provas bioqumicas utilizadas para a identificao de bactrias do gnero
Staphylococcus so:
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teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de
escolha.
A coagulase livre reage com o fator de coagulao do plasma, o CRF, formando uma substncia
semelhante, mas no idntica trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste
utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo na proporo 1:5 em soluo
salina; a reao ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37 C.
Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica quando o
germe crescido em meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta forma, aconselha-se a
utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado (Chapman), este
procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.
Semear uma alada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diludo e incubar a
37C. Devem ser feitas leituras peridicas a cada30 minutos por um perodo de at 4 horas e uma
leitura final aps 24 horas, pois algumas espcies produzem tambm fibrinolisina, que dissolve o
cogulo formado. A menor coagulao considerada prova positiva. Aconselha-se, tambm
utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como
comprovao do teste.
Sensibilidade a Novobiocina: Este teste no ser realizado na aula prtica, mas muito
utilizado na rotina de laboratrio. Esta prova diferenciadora de espcie, pois apenas S.
epidermidis resistente a este antimicrobiano. O teste realizado semelhantemente ao TSA
(Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton,
de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Novobiocina com concentrao de
5 mg/ml. Aps a incubao verificar o tamanho do halo de inibio e comparar com uma tabela
especfica.
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Crescimento em Agar Chapman: Esta prova tambm diferencia os enterococos, pois estes
toleram a alta concentrao de NaCl presente no meio, como acontece com os estafilococos.
Crescimento em Agar EMB: Outra prova para identificao de enterococos, pois estes
suportam a presena de corantes como o azul de metileno (que inibidor para a maioria dos
Gram positivos).
Agar Chapman
Composio do Meio (g/L) Observaes
Extrato de carne 1,0 pH do meio: 7,5 0,2
Peptona 10,0
Manitol 10,0 Este meio possui agentes seletivo (NaCl a uma
Cloreto de sdio 75,0 concentrao de 7,5%), indicador (vermelho de
fenol) e diferencial (manitol).
Vermelho de fenol 0,025
Ou seja, alm de restringir o crescimento de
Agar 15,0
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Agar Sangue
Composio do Meio (g/L) Observaes
Triptona 14,0 pH do meio: 7,3 0,2
Peptona neutralizada 4,5
Extrato de levedura 4,5 O meio altamente nutriente, alm de ser
Cloreto de sdio 5,0 suplementado com sangue, o que o torna um
meio muito utilizado em etapas de
Sangue de carneiro 7,0
enriquecimento e para visualizao de
Agar 12,5 propriedades hemolticas de diversos
microorganismos. Como na possui agentes
seletivos, deve ser manipulado com bastante
cuidado.
Agar DNAse
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** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) so meios simples, sem nenhum nutriente de
enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composies no
sero estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos.
Exerccios de fixao
Observaes
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Introduo
Algumas bactrias no se coram pelo mtodo de colorao de Gram, pelo simples fato de
apresentarem composio da parede celular diferenciada das bactrias Gram positivas e Gram
negativas.
Entre estas bactrias esto as micobactrias, como o Mycobacterium tuberculosis, um
bacilo lcool-cido resistente de importncia mdica, por ser o causador da tuberculose humana e
o Mycobacterium bovis, de grande interesse na nutrio por causar tuberculose em bovinos,
sendo esta uma zoonose veiculada por alimentos. As micobactrias penetram pela mucosa da
orofaringe e do trato digestivo chegando aos ndulos mesentricos e a partir da pode se
disseminar para outros tecidos e rgos, quando inaladas podem provocar tuberculose pulmonar
idntica causada pelo Mycobacterium tuberculosis.
A colorao de Ziehl-Neelsen a tcnica mais utilizada na identificao das micobactrias
e de bactrias lcool-cido resistentes em geral, como as bactrias espiraladas..
Muitas bactrias espiraladas esto associadas a doenas humanas: Leptospira
(leptospirose); Treponema (sfilis) e Borrelia (doena de Lyme). Como so microrganismos muito
delgados e recobertos por uma bainha protica, a colorao de Gram no til na sua
visualizao. Para tanto so empregados mtodos de impregnao com sais de prata (mtodo de
Fontana-Tribondeau) que permite sua observao em microscopia de campo claro e a observao
direta em microscopia de campo escuro.
A presena de bacilos lcool-cido resistentes no escarro forte sugesto de tuberculose
pulmonar. Alm disso, sangue colhido do lbulo da orelha ou material colhido da prpria leso
indica o diagnstico da lepra (Mycobacterium leprae).
Faz parte da prtica do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importncia na
orientao do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as
infeces causadas por essas bactrias so graves.
Fundamentao terica
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Objetivo
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diferenciar microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importncia desta ltima
na observao de espiroquetas.
Material
Execuo da prtica
Etapas Observaes
Transferir uma alada da cultura ou uma Ao fazer o esfregao a partir de diferentes
colnia da placa para uma lmina de culturas deve-se observar alguns detalhes:
microscpio limpa.
de placa: deve-se coletar apenas 1 colnia,
espalhando-a pela lmina isso evitar a
observao de colnias diferentes na lmina e
que seja coletado um inculo muito carregado, o
que dificultar a visualizao das clulas
coradas.
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Passar a lmina com o esfregao sobre a importante fixar o esfregao para que este no
chama do Bico de Bunsen, at que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a
completamente seco. utilizao de um e outro corantes
Colorao do esfregao
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Lavar rapidamente com gua. Essa etapa realizada para que no haja
excesso de corante sobre o esfregao na
prxima etapa.
Lavar a lmina inclinada a 45 com soluo de A soluo lcool-cida responsvel por fixar o
lcool etlico:cido clordrico (97:3) at que corante na parede da clula, impedindo sua
no haja mais desprendimento de corante sada. Como essas bactrias so lcool-cido
(aproximadamente 2 minutos). resistentes, no h dissoluo da parede,
mesmo esta tendo alto carter lipdico.
Lavar o esfregao com soluo de lcool importante que esta etapa seja realizada, pois
etlico:cido clordrico (97:3) at que no haja se restar algum corante na lmina, o prximo
mais desprendimento de corante. corante a ser utilizado no se fixar na lmina,
no cumprindo seu papel.
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Cobrir o esfregao com corante Azul de importante que esta etapa seja realizada, pois
Metileno por 30 segundos. se restar algum corante na lmina, o prximo
corante a ser utilizado no se fixar na lmina,
no cumprindo seu papel..
Lavar com gua e secar suavemente com Aps secar, observar no microscpio, objetiva de
papel. imerso (100x), com leo de cedro/mineral.
Exerccios de fixao
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Observaes
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Introduo
Fundamentao terica
O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminao de origem fecal foi proposto
uma vez que este microorganismo encontrado no trato intestinal do homem e de animais de
sangue quente. O indicador ideal de contaminao fecal deveria ser de rpida e fcil deteco, ser
facilmente distinguvel de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hbitat
exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em nmeros muito altos nas
fezes, entre outras caractersticas importantes.
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Objetivos
Material
- Reativo de Kovacs
- Vermelho de Metila
- a-naftol VM
- soluo de KOH
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Execuo da prtica
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OBSERVAO:
- os reativos necessrios para a prtica so:
- Reativo para verificao de Indol: Reativo de Kovacs paradimetilaminobenzaldedo;
- Reativo para prova de Vermelho de Metila (VM): Corante Vermelho de Metila;
- Reativos para prova de Voges Proskauer (VP): VP1 a-naftol e VP2 KOH
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- conferir os resultados obtidos nas provas bioqumicas e compar-los com a tabela abaixo,
caracterizando a bactria analisada:
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gua Peptonada
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona 10,0 pH do meio: 7,2 0,2
Cloreto de sdio 5,0
A peptona fonte de triptofano, que pode ser
utilizado pelo microorganismo com produo de
indol, que pode ser verificado quando da
adio ao meio do Reagente do Kovacs (para-
dimetilaminobenzaldedo), com o aparecimento
de um anel vermelho na parte superior do tubo.
* gua triptonada: a nica diferena a substituio de peptona por triptona, que melhor fonte
de triptofano.
Caldo Uria
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona 1,0 pH do meio: 6,8 0,2
Glicose 1,0
Fosfato dissdico 1,0 O meio tamponado, para evitar mudanas
Fosfato monopotssico 20,8 bruscas de pH no meio. A produo de urease
resulta em alcalinizao do meio, o que pode
Cloreto de sdio 5,0
ser verificado atravs da viragem da cor do
Vermelho de fenol 0,004 meio de salmon (ou laranja claro) para rosa
Soluo de uria a 40% 50 (ml) brilhante (pink).
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Exerccios de fixao
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Observaes
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Introduo
Fundamentao terica
Contagem em Placa
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Coleta de Amostras
A coleta de amostras para exame microbiolgico deve ser feita em garrafas esterilizadas
que tenham sofrido tratamento prvio de limpeza e rinsagem com gua destilada.
gua clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sdio 10% para cada 250 mL de
gua para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades
desinfetantes entre o perodo da coleta e o momento da inoculao.
gua com alto teor de zinco e cobre: coletar na presena de um agente quelante, de
forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada
120 mL de gua).
Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa (a amostra
deve ocupar 4/5 da garrafa) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas
devem ser mantidas vedadas at o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os
cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar-se contaminaes secundrias.
Ponto de Coleta
gua da torneira Abrir a torneira e deixar a gua correr por 5 minutos, para eliminar as
impurezas e a gua acumulada na tubulao.
Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em
seguida flambar.
Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at
cerca de do seu volume.
Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio.
Poos e Cisternas Preparao do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com
um barbante para facilitar a descida no poo.
Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados.
Submergir o frasco completamente na gua.
Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para
criar um espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
Rios, Lagoas e Coleta da amostra de gua de rios e lagoas - nestes casos, deve-se
Mares mergulhar o frasco at uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada
em direo contrria a corrente, a fim de evitar a contaminao da gua com
as mos.
Coleta da gua do mar - a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas
costumam banhar-se, que corresponde profundidade aproximada de 1,0m,
que a regio das praias mais utilizada para a recreao de contato
primrio, na mar baixa e 24 horas sem chuvas.
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A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos onde foram
inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em frmulas
de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande escala, indicam
que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o nmero real. As
disparidades tendem a diminuir quando adota-se sries com maior nmero de tubos em cada
diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do nmero de tubos adotados.
Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das
caractersticas microbiolgicas da amostra.
Na aula prtica, utilizamos o sistema de 3 sries de 3 tubos, com diluies decimais
sucessivas.
A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existncia de
coliformes na amostra analisada, atravs da fermentao de lactose com produo de gs; e o
teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra so totais ou fecais.
Teste Presuntivo
Inocular a amostra em 3 sries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose ou Caldo
Lactose, de modo que cada srie seja inoculada com um volume de amostra 10 vezes menor que
a srie anterior. Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos. Aps incubao a 35 - 37C
por 24 - 24 horas, o crescimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para
coliformes. Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de incubao, devem
ser incubados at 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente
inoculados nos meios de confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante
provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos.
Testes de Confirmao
Para coliformes totais: A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior,
transferir uma alada para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile Lactose. Aps incubao a
35 37 C por 48 horas, a formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para
coliformes totais.
Para coliformes fecais: A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior,
transferir uma alada para tubos contendo caldo EC. Aps incubao a 44,5 - 45 C por 24 horas,
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Para completar o teste, podemos estriar uma alada de cada tubo positivo na estapa
confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com Agar EMB ], incubando a 35-37C por 24
horas e analisar a morfologia atravs da colorao de Gram e observao ao microscpio (bacilos
pequenos, Gram negativos, no esporulados)
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3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 >2400
Objetivos
Material
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Execuo da prtica
Primeiro dia
Contagem em placa
- Antes de realizar a tcnica, devemos realizar diluies decimais da amostra, para que a chance
de obteno de placas com nmeros de UFC contvel (30 - 300) seja maior.
- A tcnica utilizada ser a do pour plate, ou seja: transferir, com auxlio de uma pipeta estril, 1 ml
da amostra para uma placa de Petri vazia estril. Adicionar o Agar PCA (padro para contagem)
fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares,
conforme mostra a figura a seguir:
- Deve-se fazer em duplicata a inoculao das diluies 100 (amostra no diluda) e 10-1, ou 10-1 e
10-2.
Tcnica do NMP
- Homogeneizar por agitao a amostra de gua e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando
as pipetas estreis, da seguinte forma:
- Na primeira srie, note que a concentrao do caldo dupla, devemos inocular 10 ml de
amostra;
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Segundo dia
- Contar as colnias no Agar, calcular o nmero mdio de colnias obtidas, multiplicar pelo fator
de diluio e expressar o resultado em UFC/mL.
OBSERVAO.: No nosso caso, o fator de diluio, ou fator de correo, ser 1, pois o volume
inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correo importante para a expresso do
resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml.
Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou
utilizamos inculos provenientes de diluies (10-1, 10-2, etc.). Nesse caso, para a expresso do
resultado devemos multiplicar o nmero de UFCs obtido por um nmero que ir corrigir a
distoro do resultado.
Uma dica: se o inculo utilizado for diludo decimalmente, o FD ser o inverso da diluio utilizada.
Ex.1: se o inculo utilizado for 0,1ml, qual ser o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra
maneira: 1 0,1 = 10.
Ex.2: se o inculo for 1ml da diluio 10-2, qual ser o FD? 100, pois 100 x 10-2 = 1, ou de
outra maneira 1 10-2 = 100.
Ex. 3: se o inculo utilizado for 0,5, qual ser o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra
maneira 1 0,5 = 2.
- Proceder leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para
expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo).
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- Inocular os tubos positivos na colimetria para caldos EC e VBBL atravs da tcnica de difuso
(teste confirmativo), conforme o esquema a seguir:
- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 37C por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5
45C por 24 48 horas.
Terceiro dia
- Proceder leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos
os tubos com formao de gs no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais
sero positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais sero positivos em ambos os
caldos.
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Caldo Lactose
Composio do Meio (g/L) Observaes
Extrato de carne 3,0 pH do meio: 6,9 0,2
Peptona 5,0
Lactose 5,0 A lactose presente no meio o indicador da
presena de coliformes, atravs da verificao
da fermentao com produo de gs no tubo
de Durhan invertido introduzido no meio.
* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a
incubao e a leitura da mesma forma.
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Exerccios de fixao
Observaes
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Bibliografia
- Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology:
Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGrawHill Companies, 2003.
- Vicente, E. J.; Apostila de Aulas Prticas de Microbiologia. USP ICM Disciplina Microbiologia
Bsica. 2007.
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