Bioquímica, Bio Molecular e Hematologia Resumo FioCruz

Fundao Oswaldo Cruz
Presidente
Paulo Ernani Gadelha Vieira
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
Diretor
Paulo Csar de Castro Ribeiro
Vice-diretora de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico

Marcela Alejandra Pronko
Vice-diretora de Ensino e Informao

Pulea Zaquini Monteiro Lima
Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional

Jos Orblio de Souza Abreu
Instituto Oswaldo Cruz
Diretor
Wilson Savino
Vice-diretor de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao

Hugo Caire de Castro Faria Neto
Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao

Elisa Cupolillo
Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas

Eliane Veiga Costa
Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto

Valber da Silva Frutuoso
Volume 3
ORGANIZADORAS
Etelcia Molinaro
Luzia Caputo
Regina Amendoeira
2013
Rio de Janeiro
Escola Politcnica de Sade Joaquim Vencio
Instituto Oswaldo Cruz
Fundao Oswaldo Cruz
Copyright 2013 das organizadoras
Todos os direitos desta edio reservados
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fundao Oswaldo Cruz
Conselho Editorial Edio de Texto

Dr. Maria Regina Reis Amendoeira (presidente) Lisa Stuart
Dr. Ana Luiza Lauria Filgueiras
Dr. Clarissa Menezes Maya Monteiro Projeto Grfico e Editorao
Dr. Ftima Conceio Silva Marcelo Paixo
Dr. Herman Gonalves Schatzmayr (in memoriam)
Dr. La Camillo-Coura Capa
Especialista Luzia Ftima Gonalves Caputo Z Luiz Fonseca
Dr. Lycia de Brito Gitirana
Dr. Marcia Cristina Ferro Alexandre Fotos
Dr. Marco Antonio Ferreira da Costa Rodrigo Mexas
Dr. Margareth Maria de Carvalho Queiroz
Dr. Maria Helena Migues da Rocha Leo Desenhos
Dr. Otlio Machado Pereira Bastos Luzia Ftima Gonalves Caputo
Dr. Paulo Roberto Soares Stephens Newton Marinho da Costa Junior
Catalogao na fonte
Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
Biblioteca Emilia Bustamante
M722c Molinaro, Etelcia Moraes

Conceitos e mtodos para a formao de profissionais em laboratrios
de sade: volume 3 / Organizao de Etelcia Moraes Molinaro, Luzia
Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. Rio de
Janeiro: EPSJV; IOC, 2013.
306 p. : il. , tab. , graf.

ISBN: 978-85-98768-41-0
1. Tcnicas e Procedimentos de Laboratrio.2. Pessoal de Laboratrio.

3. Laboratrios. 4. Formao de Tcnicos. 5. Sade e Educao. I. Ttulo.
II. Caputo, Luzia Ftima Gonalves. III. Amendoeira, Maria Regina Reis.
CDD 542.1
Autores
Daniel Santos Souza

Bilogo, mestre em Sade Pblica pela Escola Nacional de Sade Pblica Sergio Arouca
(Ensp/Fiocruz), especialista em Polticas Pblicas em Sade, tcnico em Sade Pblica
da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio (EPSJV/Fiocruz) e egresso do Curso
Tcnico de Laboratrio de Biodiagnstico em Sade da Escola Politcnica de Sade
Joaquim Venncio (EPSJV/Fiocruz).
Elisngela de Souza Santos

Farmacutica, mestre em Cincias/Qumica pela Universidade Federal Fluminense (UFF),
doutoranda do Curso de Ps-graduao em Qumica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), perita legista em Toxicologia da Secretaria de Estado de Segurana Pblica
do Estado do Rio de Janeiro.
Emanuele Amorim Alves

Farmacutica industrial, especialista em Percia Criminal pela Universidade Castelo Branco,
mestre em Qumica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), doutoranda
em Cincias Forenses pela Universidade do Porto, tcnica em Sade Pblica da Escola
Politcnica de Sade Joaquim Venncio (EPSJV/Fiocruz).
Jurandy Susana Patrcia Ocampo Lyra
Mdica, mestre em Cincias pelo Hospital Universitrio Clementino Fraga Filho (HUCFF)
da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), doutora em Cincias pelo Instituto
de Bioqumica da UFRJ, professora associada da Universidade Federal do Estado do Rio
de Janeiro (Unirio), pesquisadora colaboradora do Laboratrio de Imunologia Clnica do
Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz).
Liliane Rosa Alves

Farmacutica, mestre e doutora em Qumica Biolgica pela Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), tecnologista em Farmcia do Instituto Nacional do Cncer (Inca).
Marcella Martins de Vasconcelos Vaena

Mdica hematologista, mestre em Sade da Criana e da Mulher pelo Instituto Fernandes
Figueira (IFF/Fiocruz), chefe da Hemoterapia do Hospital do Cncer II (Inca), mdica do
Instituto Fernandes Figueira (IFF/Fiocruz).
Marcelo Pelajo Machado

Mdico, doutor em Biologia Celular e Molecular pelo Instituto Oswaldo Cruz (IOC/
Fiocruz), ps-doutor em Biocincias pelo Centro Alemo de Pesquisas sobre o Cncer
DKFZ (Heidelberg, Alemanha), pesquisador titular da Fundao Oswaldo Cruz, chefe do
Laboratrio de Patologia do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz).
Mnica Mendes Caminha Murito

Engenheira qumica, mestre em Biocincias e Sade pelo Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz),
pesquisadora visitante da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio (EPSJV/Fiocruz).
Paulo Marcelo T. Cotias

Imuno-hematologista do Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas (Ipec/Fiocruz), chefe
do Laboratrio de Imuno-hematologia e da Agncia Transfusional do Ipec/Fiocruz.
Paulo Roberto Soares Stephens
Bilogo, mestre em Microbiologia e Imunologia pela Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), doutorando Universidade Federal Fluminense (UFF), tecnologista snior
em Sade Pblica do Laboratrio de Imunologia Clnica do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/
Fiocruz,) coordenador dos cursos Tcnico em Biotecnologia e de Especializao de Nvel
Tcnico em Biologia Parasitria e Biotecnologia do Instituto Oswaldo Cruz.
Virgnia de Lourdes Mendes Finete

Qumica, mestre em Qumica Analtica pela Pontifcia Universidade Catlica do Rio de
Janeiro (PUC-RJ), tcnica em Sade Pblica da Escola Politcnica de Sade Joaquim
Venncio (EPSJV/Fiocruz).
Sumrio
Prefcio..........................................................................17
Apresentao da coleo ...............................................21
Apresentao das organizadoras ................................... 23
Captulo 1. Bioqumica .................................................. 27
1.1 Introduo s biomolculas ................................................ 27
1.2 Biomolculas ...................................................................... 29
1.2.1 gua ...........................................................................29
1.2.2 Sais minerais .................................................................. 30
1.2.3 Protenas ...................................................................... 31
1.2.4 Glicdios ...................................................................... 42
1.2.5 Lipdios ........................................................................45
1.2.6 Hormnios ....................................................................52
1.2.7 Vitaminas ......................................................................53
1.3 Metabolismo ........................................................................56
1.3.1 Introduo ao metabolismo...................................................56
1.3.2 O ATP como moeda energtica.............................................57
1.3.3 Metabolismo dos carboidratos...............................................58
1.3.4 Metabolismo dos cidos graxos ............................................77
1.3.5 Metabolismo das protenas...................................................84
1.3.6 Integrao do metabolismo...................................................85
1.4 Bioqumica clnica.................................................................89
1.4.1 Anlise de componentes glicdicos..........................................93
1.4.2 Anlise de componentes lipdicos..........................................97
1.4.3 Anlise de componentes nitrogenados...................................102
1.4.4 Eletrlitos......................................................................121
Referncia bibliogrfica.............................................................130
Bibliografia complementar.........................................................131
Captulo 2. Biologia molecular.......................................133

2.1 Histria da biologia molecular..............................................133
2.1.1 A descoberta do DNA....................................................133
2.1.2 A estrutura dos cidos nucleicos..........................................137
2.1.3 Caractersticas fsicas da molcula de DNA.............................141
2.2 Duplicao da molcula de DNA.........................................142
2.2.1 A duplicao do DNA e o ciclo celular................................143
2.3 Transcrio..........................................................................146
2.3.1 Tipos de RNA...............................................................149
2.3.2 Regulao da expresso gnica.............................................151
2.4 Traduo..............................................................................153
2.4.1 O cdigo gentico...........................................................153
2.4.2 Sntese proteica...............................................................155
2.5 Mtodos de extrao de DNA..............................................156
2.5.1 Extrao de DNA genmico de sangue humano.......................158
2.5.2 Extrao do DNA genmico...............................................158
2.6 Mtodos de anlise e quantificao de DNA........................159
2.6.1 Eletroforese....................................................................159
2.6.2 Espectrofotometria............................................................161
2.7 Endonucleases de restrio...................................................163
2.8 Hibridao molecular...........................................................165
2.8.1 Tcnicas de hibridao......................................................165
2.9 Clonagem de DNA ..............................................................166
2.9.1 Clonagem......................................................................166
2.9.2 Clonagem de DNA.........................................................167
2.10 Transformao bacteriana..................................................169
2.11 Biblioteca genmica...........................................................169
2.12 A reao em cadeia da polimerase (PCR) ..........................170
2.13 Sequenciamento de DNA...................................................172
2.13.1 Sequenciamento de Sanger...............................................173
2.13.2 Exemplo de processo metodolgico
de anlise de cidos nucleicos.......................................................174
2.14 O DNA e as cincias forenses.............................................177
2.15 Utilizaes complementares do DNA.................................181
2.15.1 Transgnicos.................................................................181
2.15.2 Projeto Genoma Humano.................................................182
Referncia bibliogrfica.............................................................185
Captulo 3. Hematologia................................................187
3.1 A hematopoese...................................................................187
3.1.1 A eritropoese.................................................................192
3.1.2 A leucopoese.................................................................194
3.2 O sangue.............................................................................197
3.2.1 As clulas sanguneas........................................................197
3.3 A coleta de sangue...............................................................202
3.3.1 Material a ser checado antes de proceder venopuno.............202
3.3.2 Procedimentos para a venopuno........................................204
3.3.3 Cuidados com a amostra coletada.........................................207
3.4 O hemograma......................................................................209
3.4.1 Avaliao automatizada.....................................................211
3.4.2 Anlise morfolgica das clulas sanguneas...............................214
3.5 O hemograma alterado........................................................215
3.5.1 Alteraes da srie vermelha...............................................216
3.5.2 Alteraes da srie branca..................................................224
3.5.3 Alteraes das plaquetas....................................................226
3.6 Hemostasia e coagulao.....................................................227
3.6.1 Componentes principais.....................................................227
3.6.2 Fisiologia.......................................................................230
3.6.3 Avaliao laboratorial........................................................234
Captulo 4. Hemoterapia bsica

na prtica transfusional.................................................239
4.1 Histrico..............................................................................239
4.2 Imuno-hematologia: conceitos bsicos.................................241
4.3 O sistema ABO....................................................................243
4.3.1 Estrutura dos antgenos do sistema ABO................................244
4.3.2 Herana dos grupos sanguneos ABO...................................244
4.3.3 Antgenos do sistema ABO...............................................245
4.3.4 Fentipo de Bombaim.......................................................246
4.3.5 Interao dos genes Hh e ABO..........................................246
4.3.6 Formao dos antgenos solveis A, B e H ............................247
4.3.7 Interao de genes Sese, Zz e ABH.....................................247
4.3.8 Subgrupos de ABO.........................................................248
4.3.9 Anticorpos do sistema ABO..............................................249
4.4 Sistema RH ........................................................................250
4.4.1 Variantes fenotpicas do antgeno D......................................251
4.4.2 Recomendao transfusional.................................................252
4.4.3 Anticorpos do sistema Rh..................................................253
4.5 Outros sistemas de grupos sanguneos.................................254
4.5.1 O sistema Lewis.............................................................254
4.5.2 O sistema MNS.............................................................255
4.5.3 O sistema P...................................................................257
4.5.4 O sistema I ..................................................................257
4.5.5 O sistema Kell................................................................259
4.5.6 O sistema Duffy..............................................................262
4.5.7 O sistema Kidd..............................................................264
4.5.8 O sistema Lutheran..........................................................265
4.5.9 O sistema Diego.............................................................267
4.5.10 O sistema Cartwright.....................................................267
4.5.11 O sistema Colton..........................................................267
4.5.12 O sistema Scianna.........................................................267
4.5.13 O sistema Dombrock......................................................267
4.5.14 O sistema Xg...............................................................268
4.6 Doenas associadas aos grupos sanguneos.........................269
4.6.1 DHPN ou DHRN por Rh(D)............................................269
4.6.2 DHRN/DHPN por ABO.................................................274
4.7 Prtica imuno-hematolgica................................................275
4.7.1 Classificao direta do sistema ABO
(teste de Beth-Vincent).............................................................275
4.7.2 Classificao reversa do sistema ABO
(ou prova de Simonin)..............................................................277
4.7.3 Pesquisa de subgrupos do sistema ABO................................281
4.7.4 Classificao RhD............................................................281
4.7.5 Pesquisa de D fraco .........................................................283
4.7.6 Fenotipagem CDE............................................................285
4.7.7 Teste de antiglobulina humana
ou teste de Coombs..................................................................285
4.7.8 Teste indireto de antiglobulina humana
ou tcnica de Coombs indireto.....................................................288
4.7.9 Testes de compatibilidade..................................................290
4.7.10 Tcnicas de separao de anticorpos...................................295
4.8 Controle de qualidade de reagentes usados
em imuno-hematologia..............................................................297
4.9 Controle das hemcias fenotipadas......................................300
4.10 Controle da albumina bovina a 22%...................................300
4.11 Hemocomponentes usados em hemoterapia......................301
4.11.1 Principais hemocomponentes
utilizados em hemoterapia...........................................................301
Bibliografia consultada..............................................................303
Prefcio
O Chico Trombone costumava me dizer:

Isso eu sei fazer, dr. Luiz Fernando, aprendi com Joaquim Venncio.
E era com orgulho que se referia a seu mestre.
Vimos, portanto, que a formao de tcnicos j vem dos tempos de
Oswaldo. claro que no era institucionalizada como hoje. Eram outros
tempos.
Joaquim Venncio nasceu na fazenda Bela Vista, Minas Gerais. Era a
fazenda da me de Carlos Chagas, pai. Em 1916, veio trabalhar no Instituto
Oswaldo Cruz. Veio e deu certo. O dr. Lutz teria dito certa vez:
No troco o Venncio por nenhum doutor de Oxford ou de Cambridge.
Se no disse, pensou.
Eficincia nos processos de seleo de pessoal? Competncia do servio
de recursos humanos? Evidentemente que no. No havia nada disso nessa
poca. As coisas eram muito mais simples, e davam certo. Veio porque era
amigo do velho Carlos Chagas. Amigos de infncia. Brincaram juntos na
fazenda.
18 | Conceitos e Mtodos para Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
Quando Joaquim Venncio faleceu em 27 de agosto de 1955, teve seu

necrolgio publicado na Revista Brasileira de Biologia lugar de necrolgio
de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu durante cerca
de 35 anos que trabalhou ativamente, aprender zoologia, que conhecia
de modo invejvel. Como decorrncia das contingncias da vida, no teve
oportunidade de instruir-se, mas sua mentalidade era de um homem culto. Pela
convivncia com o dr. Lutz, pela observao direta do que via nas excurses e
no laboratrio, adquiriu conhecimento detalhado de vrios grupos zoolgicos,
principalmente, anfbios, moluscos fluviais e trematdeos. Chegou a conhecer
muito bem os anfbios e, com grande facilidade, os classificava nas excurses
pela voz. Dadas as indicaes feitas pelo dr. Lutz em seus trabalhos, h casos
em que foi citado na literatura como colaborador direto.
Joaquim Venncio era, sem dvida, um naturalista. Era competente, tinha o
domnio do ofcio, a maestria da arte.
E gostava de ensinar. Ensinou muita gente.
Certa vez, o Venancinho me disse:
Era a Escola do Venncio, n? Foi muito boa, n?
***
Na presidncia de Srgio Arouca, resolvemos atualizar a Escola de
Venncio. E foi assim que surgiu a Escola Politcnica, com o nome do seu
patrono. Cresceu e abriu vrias frentes, desde a vocao cientfica aos cursos
de nvel mdio, complementados pela formao de tcnicos. Foi um xito,
como a antiga. Aparece sempre nos primeiros lugares nas avaliaes e j se
estendeu a outras instituies.
***
E agora surgem os livros didticos: organizada por Etelcia Molinaro, Luzia
Caputo e Regina Amendoeira, vem luz a coleo Conceitos e mtodos para
formao de profissionais em laboratrios de sade, reunindo professores de
vrias unidades da Fiocruz.
Prefcio | 19
Os captulos oferecem a histria da tcnica, os seus fundamentos, a maneira

moderna de realiz-la, as suas aplicaes, a organizao do laboratrio etc.
til para os cursos da Fundao Oswaldo Cruz e para outros externos.
Mostra, tambm, o quanto as unidades da Fiocruz esto integradas na
realizao de suas tarefas.
Ensino questo primordial. Sem ele, o pas no se desenvolve.
Est de parabns a Fiocruz pela realizao de mais uma tarefa de primordial
importncia.
Oswaldo Cruz est orgulhoso dos seus continuadores.
Luiz Fernando Ferreira

Pesquisador emrito da Fundao Oswaldo Cruz
Apresentao
A coletnea de livros intitulada Conceitos e mtodos para formao de

profissionais em laboratrios de sade, organizada por Etelcia Molinaro,
Luzia Caputo e Regina Amendoeira, , antes de tudo, uma obra original,
importante e necessria. Original porque no existe na literatura tcnica em
sade, na rea biomdica brasileira e internacional, ao menos que eu saiba,
algo semelhante em abrangncia, profundidade e seleo dos temas abordados;
importante pelo pblico-alvo a que se destina, muito alm da formao de
tcnicos de laboratrios, abrangendo certamente todos os profissionais de
sade; e necessria porque servir como obra de referncia para a formao dos
mencionados tcnicos e como consulta obrigatria para todos os profissionais de
sade que necessitem de esclarecimento dos aspectos tcnicos ali abordados.
Versada em cinco volumes e 23 captulos, organizados em sequncia
lgica, desde a biossegurana e as boas prticas de laboratrio, passando por
todos os fundamentos das tcnicas laboratoriais bioqumica bsica, biologia
celular e molecular, histologia e ultraestrutura , at atingir o cerne da prtica
laboratorial, da imunologia infectoparasitologia virologia, bacteriologia,
micologia, protozoologia e helmintologia e seus vetores, com a entomologia

mdica e a malacologia. Os autores dos respectivos captulos so do melhor
nvel intelectual e cientfico, com titulao de mestres, doutores e especialistas,
e com grande experincia prtica nos assuntos de que tratam.
Parabenizo o Instituto Oswaldo Cruz e a Escola Politcnica Joaquim
Venncio, que patrocinaram esta obra de referncia, e que, desde os seus
primrdios, valorizaram a qualidade da formao dos seus tcnicos e com eles
povoaram e esto povoando o Brasil de Norte a Sul e de Leste a Oeste com
o que temos de melhor os fundamentos para uma boa pesquisa. Aproveito
esta oportunidade para homenagear a figura de Henry Willcox, que, no incio
da dcada de 1980, quando o convidei para me ajudar na coordenao
dos cursos de Ps-graduao em Biologia Parasitria e Medicina Tropical do
Instituto Oswaldo Cruz, foi o grande incentivador para criarmos paralelamente
o Curso de Tcnico em Pesquisa, do qual foi o seu primeiro coordenador.
Igualmente parabenizo as organizadoras desta coletnea, e a Fiocruz como
um todo, pelo lanamento desta obra pioneira.
Jos Rodrigues Coura

Pesquisador titular emrito da Fundao Oswaldo Cruz
Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias
do Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
Apresentao das organizadoras
Um sonho quase realizado

Oswaldo Cruz, 1872-1917
As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem como

consequncia o surgimento de novos paradigmas tecnolgicos, fazendo-se
necessrio que o ensino na rea da sade atenda s exigncias do mundo
moderno, do trabalho e do atual perfil do tcnico da rea.
Os cursos para a formao de tcnicos da Fundao Oswaldo Cruz
(Fiocruz) buscam demonstrar os princpios cientficos envolvidos com as
tcnicas laboratoriais, preparando os alunos para as transformaes no mundo
do trabalho em sade decorrentes do desenvolvimento tecnolgico e cientfico.
Nesse contexto, duas unidades tcnico-cientficas da instituio o Instituto
Oswaldo Cruz (IOC) e a Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio
(EPSJV) so historicamente as responsveis pela coordenao de cursos e
especializaes tcnicas que se firmaram como modelos desses princpios. Essas
unidades sempre estiveram intrinsecamente ligadas na rea de ensino tcnico,
e os professores realizam permanentemente parcerias entre si. Muitos de ns,

egressos desses cursos, somos hoje docentes e autores desta coleo.
Alm da formao tcnica de profissionais em nvel regional e nacional,
intensificou-se a demanda pelo estabelecimento de cooperaes tcnicas
internacionais na Fiocruz, que, por sua expertise e capacidade de produzir,
passou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e
tecnologias educacionais. A Escola Politcnica Joaquim Venncio, desde
2004, um centro colaborador da Organizao Mundial da Sade (OMS)
para a educao de tcnicos em sade.
A ideia da publicao desta coleo surgiu da necessidade conjunta das
duas unidades citadas da Fiocruz de produzir material didtico que atendesse
aos alunos dos cursos de nvel tcnico em Sade da Fiocruz e de outros locais.
Desse modo, o nosso principal desafio oferecer um contedo que abarque
todos os temas da rea tcnica da sade tratados nos principais cursos de nvel
mdio e que, ao mesmo tempo, possa manter-se suficientemente atualizado.
Dada a complexidade da estrutura instrumental e pedaggica dos cursos
tcnicos, fez-se necessrio publicar uma coleo escolhendo-se tpicos de
importncia bsica. Para tanto, foram convidados pesquisadores e professores
com experincia de ensino em cursos de nvel tcnico e com destacado
conhecimento nos temas abordados nos 23 captulos que integram os cinco
volumes da coleo.
A coleo Conceitos e mtodos para formao de profissionais em
laboratrios de sade tem como objetivo integrar conhecimentos tericos
e prticos, proporcionando ao aluno informaes que possibilitem uma
permanente reflexo de seu papel como agente transformador dos processos e
atividades de ensino, pesquisa cientfica e desenvolvimento tecnolgico. Outro
objetivo inconteste destes livros servir aos professores, como norteadores da
definio curricular de seus cursos.
Visando garantir a autonomia dos autores, e respectivas responsabilidades,
foi mantida a formatao original dos textos, inclusive as fotos, figuras, diagramas.
Apresentao das organizadoras | 25
Podem ocorrer, tambm, repeties de contedo em alguns captulos, mas, a

nosso ver, a retirada de partes j abordadas em captulos anteriores, poderia
descontextualizar o texto.
O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio
dado pelo professor Andr Paulo da Silva Malho, pela dra. Isabel Brasil
Pereira, pessoa-chave desencadeadora do processo, e a dra. Tnia Cremonini
de Arajo Jorge, que apoiaram e incentivaram institucionalmente o projeto.
Agradecemos especialmente aos autores que abraaram este trabalho com muito
entusiasmo e que possibilitaram a sua concretizao. E um carinho especial para
Josane Ferreira Filho pela organizao paciente de nossas reunies e textos, a
gratido das organizadoras e dos autores.
Agradecemos em especial aos renomados cientistas emritos da Fundao
Oswaldo Cruz, doutores Luiz Fernando Ferreira patrono da EPSJV e
Jos Rodrigues Coura, que nos deram a honra de apresentar esta coleo.
Esperamos, assim, contribuir para a sistematizao do conhecimento dos
leitores sobre os diferentes tpicos abordados nos captulos, apresentando
cada assunto de forma didtica e sinttica, e recomendando a consulta li-
teratura especializada sempre que houver necessidade de aprofundamento do
conhecimento em determinados temas.
Etelcia Molinaro
Luzia Caputo
Regina Amendoeira
Captulo 1
Bioqumica
Elisngela de Souza Santos
Mnica Mendes Caminha Murito
Virgnia de Lourdes Finete
Liliane Rosa Alves
1.1 Introduo s biomolculas
A bioqumica a cincia que congrega o estudo da qumica e da biologia.

Seu principal objetivo o estudo das interaes que ocorrem nos seres vivos
no nvel molecular, mediante a descrio dos seus processos qumicos e bio-
lgicos. Apesar de os seres vivos serem muito diferentes macroscopicamente,
existe muita semelhana molecular entre eles. Por exemplo, acompanhando as
homologias proteicas, a transmisso da informao gentica pelo DNA ocorre
da mesma forma, assim como as reaes que produzem ou utilizam energia.
As principais biomolculas encontradas nos tecidos e nas clulas humanas
so os cidos nucleicos, as protenas, os carboidratos e os lipdios. A maio-
ria das biomolculas derivada de hidrocarbonetos, pois a qumica do orga-
nismo vivo est organizada ao redor do elemento carbono, que representa mais
da metade do peso seco das clulas. Os cidos nucleicos so os responsveis

pela transmisso da informao gentica. As protenas participam da estrutura
das clulas e, entre outras funes, catalisam reaes qumicas. Os carboidra-
tos, assim como os lipdios, so importantes fontes de energia para as clulas.
Os lipdios possuem tambm papel estrutural fundamental, como principal
componente das membranas celulares. Alm das biomolculas, tambm esto
presentes nas clulas substncias inorgnicas, essenciais para o seu perfeito
funcionamento. So elas a gua, os sais minerais, o oxignio e o gs carbnico.
Os avanos no campo da bioqumica foram possveis pelo isolamento das
biomolculas, com a determinao de suas estruturas e a anlise de suas funes
e do seu metabolismo. O estudo da estrutura das biomolculas realizado
utilizando-se diferentes mtodos, como a espectrometria de massa, a ressonn-
cia nuclear magntica, a espectroscopia ultravioleta e visvel e a cristalografia
por difrao de raios X.
Quadro 1.1. Mtodos de anlise de biomolculas.

Mtodos para separao e purificao Mtodos para determinao
de biomolculas da estrutura das biomolculas
Fracionamento Anlise elementar
espectroscopia em
cromatografia: papel, troca inica, ultravioleta e no visvel
infravermelho
afinidade, camada fina, gel filtrao,
ressonncia nuclear
gs lquida e lquida de alta presso magntica
espectrometria de massas
uso de hidrlise cida ou
centrifugao diferencial alcalina para degradao da
biomolcula
eletroforese: papel, alta-voltagem, sequenciamento por reao
agarose, acetato de celulose, gel de de degradao de Edman
amido, gel de poliacrilamida espectrometria de massas
cristalografia por difrao
ultracentrifugao
de raios X
Bioqumica | 29
1.2 Biomolculas
1.2.1 gua
A gua uma substncia fundamental para a vida no planeta. As inmeras

reaes qumicas que ocorrem a cada momento no interior dos organismos
vivos tm a gua como solvente. Por meio da gua, so transportadas substn-
cias interna e externamente, nas clulas e entre os tecidos. A manuteno da
temperatura corprea tambm feita com o auxlio da gua, que atua como
protetor trmico contra variaes da temperatura ambiente. Isso resulta do
elevado valor do calor especfico da gua, 1 cal/gC, o que significa que a
energia varia em uma caloria por grama, quando a alterao na temperatura
de 1C. Assim, mesmo que ocorram variaes bruscas de temperatura no am-
biente externo, no interior do organismo a gua mantm a temperatura estvel.
Outro aspecto fsico-qumico importante da gua a sua neutralidade: seu va-
lor de pH igual a 7,0. Isso influencia na regulao do valor do pH em cada
rgo ou tecido do organismo e na ocorrncia de diversas reaes qumicas.
A capacidade que a gua tem de dissolver as diversas substncias que
compem as clulas pode ser explicada por sua estrutura qumica. A presena
de dois polos na molcula da gua, um positivo e outro negativo, decorre da
repulso dos eltrons desemparelhados (no ligados) e do fato de o oxignio
ser mais eletronegativo1 que o hidrognio, atraindo os eltrons presentes nas
duas ligaes covalentes. Essa atrao to forte que promove a ocorrncia
de interaes intermoleculares entre oxignio e hidrognio, chamadas ligaes
de hidrognio.
Por esse motivo, a gua apresenta propriedades fsico-qumicas peculiares,
como ponto de ebulio elevado, igual a 100C, e ponto de fuso igual a
0C. preciso energia para romper as ligaes de hidrognio e, com isso, fa-
zer a gua mudar de estado fsico. Assim, a gua se mantm no estado lquido
na maioria dos ambientes do planeta.
1
A eletronegatividade, uma propriedade peridica dos elementos, a capacidade de um tomo
atrair eltrons.
Em termos percentuais, aproximadamente 75% da massa de um indivduo

adulto constituda de gua.
Figura 1.1. Estrutura qumica da molcula da gua e ligaes

de hidrognio entre as molculas de gua.
1.2.2 Sais minerais
Os sais minerais participam de inmeras reaes qumicas que ocorrem no

organismo. O bom funcionamento das clulas depender dos ons provenien-
tes dos sais minerais, que so unidades eletricamente carregadas, por perda
ou ganho de eltrons. O quadro 1.2 relaciona alguns ons e suas principais
funes bioqumicas.
Bioqumica | 31
Quadro 1.2 Principais funes bioqumicas dos ons.

ONS
Ctions nions
(perda de eltrons carga positiva) (ganho de eltrons carga negativa)
Na+ e K+ (ction sdio e ction
Cl (nion cloreto): regulao
potssio): funcionamento das clulas
da osmolaridade2 de tecidos e
nervosas.
clulas, controlando a entrada
Ca2+ (ction clcio): contrao
e a sada de gua nessas
muscular, coagulao do sangue,
estruturas, e equilbrio do pH
estrutura ssea, motilidade dos
no suco gstrico.
espermatozoides e transmisso
PO42 (nion fosfato):
nervosa.
envolvido no processo de
Fe2+ e Fe3+ (ction ferro):
fosforilao das biomolculas
constituio da hemoglobina,
e no equilbrio e manuteno
protena responsvel pelo transporte
do pH.
de O2 no sangue dos pulmes at
HCO3 (nion bicarbonato):
os tecidos.
equilbrio e manuteno do
Mg2+ (ction magnsio):
pH, reduzindo a acidez
componente da clorofila das plantas
excessiva.
e cofator de diversas enzimas.
2
1.2.3 Protenas
As protenas, substncias essenciais para os seres vivos, so constitudas

por sequncias de aminocidos. Os aminocidos so formados por tomos
de carbono, hidrognio e oxignio; alguns deles contm enxofre. Existem vinte
aminocidos diferentes que possuem algo em comum em sua estrutura: um
tomo de carbono central, chamado carbono alfa (C ), ao qual se ligam
quatro grupos de tomos, de acordo com a figura abaixo. O grupo amino, a
carboxila e o hidrognio esto sempre nas mesmas posies em todos os vinte
aminocidos, que so diferenciados somente pelo grupo R (grupo radical ou
2
Osmolaridade a medida da presso osmtica exercida por partculas de soluto contidas em uma
soluo.
cadeia lateral). Todas as protenas existentes so formadas pela combinao

desses vinte aminocidos.
Figura 1.2. Frmula geral de um aminocido.
Quadro 1.3. Classificao dos aminocidos segundo a sua necessidade.

Aminocidos naturais: so fabricados Aminocidos essenciais: o organismo
pelo prprio organismo a partir de no consegue produzi-los; precisam ser
outras substncias qumicas obtidos atravs dos alimentos
cido asprtico (Asp)
cido glutmico (Glu) Histidina (His)
Alanina (Ala) Isoleucina (Iso)
Arginina (Arg) Leucina (Leu)
Asparagina (Asn) Lisina (Lis)
Cistena (Cis) Metionina (Met)
Glutamina (Gln) Fenilalanina (Fen)
Glicina (Gly) Treonina (Tre)
Prolina (Pro) Triptofano (Tri)
Serina (Ser) Valina (Val)
Tirosina (Tyr)
De acordo com as suas cadeias laterais, os aminocidos podem ser classifica-

dos como polares, apolares, carregados e aromticos. Os aminocidos polares
formam ligaes de hidrognio com a gua por meio de suas cadeias laterais. Os
aminocidos apolares possuem cadeias laterais alifticas (ricas em hidrocarbone-
tos), o que os torna hidrofbicos; por isso, geralmente voltam suas cadeias laterais
para o interior das protenas, uma vez que no interagem com o meio aquoso.
Os aminocidos carregados podem ter carga negativa ou positiva e so assim
classificados de acordo com a sua carga em pH 7,0. Os aminocidos aromticos
so aqueles que possuem um anel aromtico em sua cadeia lateral.
Bioqumica | 33
Em solues aquosas, os aminocidos esto ionizados, podendo agir como

cidos ou bases. Quando os aminocidos se encontram em um pH no qual
as cargas dos grupos ionizveis se anulam, formam os chamados zwitterons,
sendo, nessa forma, eletricamente neutros.
Os aminocidos podem ser identificados com base em uma curva de titu-
lao. Como possuem, considerando a glicina como exemplo, uma carboxila
e um grupo amino, esses, em pH cido, estaro protonados, e o aminocido
ter carga positiva. No momento em que se adiciona uma base, o pH aumenta
at que a carboxila doe o seu prton. A carboxila doa o prton primeiro,
pois possui uma caracterstica cida, o que no o caso do grupo amino. O
pH continua a aumentar, com a adio de mais base, at que o hidrognio do
grupo amino tambm seja perdido.
O pH com 50% das carboxilas protonadas e 50% desprotonadas
chamado pK. O pK se encontra na zona de tamponamento pois, nesse
momento, o hidrognio pode sair de uma carboxila e ser captado por outra;
com isso, o aumento de pH fica difcil, gerando uma faixa de pH tampo-
nada. O mesmo ocorre para as faixas de pH onde o pK do grupamento
amino se encontra; no caso dos aminocidos com cadeia lateral, ocorre uma
terceira regio de pK.
Existe uma faixa de pH na qual todas as molculas esto na forma de
zwitterons, e, por isso, a soluo no tem carga e chamada ponto isoeltrico
(pI). Em um aminocido sem cadeia lateral, o pI um valor equidistante dos
dois pKs, o do grupamento amino e o da carboxila. Nessa faixa, o pH varia
muito por causa da quantidade crescente de prton liberada, pois no h
carboxila protonada nem amino desprotonado para que ele seja captado.
As curvas de titulao dos aminocidos podem ser influenciadas pe-
los grupos presentes nas cadeias laterais, como mencionado acima. Caso
o grupo possa sofrer desprotonao, possvel que a sua participao
aumente as zonas de tamponamento da curva daquele aminocido. Numa
titulao pode haver no mximo trs e no mnimo dois pKs. importante
destacar que, como a gua polar, se a reao estiver acontecendo em
meio aquoso, ao atingir o seu pI e ficar neutro, o aminocido se tornar
insolvel, precipitando.
Figura 1.3. Curva de titulao da glicina.
Os aminocidos ligam-se entre si por meio das ligaes peptdicas, for-

mando molculas chamadas peptdeos. A ligao ocorre entre o grupo amino
de um aminocido e a carboxila do outro, em decorrncia da atrao entre as
suas cargas opostas. Essa reao libera uma molcula de gua. O grupo amino
livre e a carboxila livre para efetuar essa ligao so chamados, respectivamen-
te, amino-terminal e carboxi-terminal.
A estrutura primria das protenas formada pela sequncia de aminocidos
que as compem, que esto unidos pelas ligaes peptdicas. As protenas
esto presentes em todas as clulas e executam importantes funes, tais
como estrutura, transporte, sinalizao, adeso, motilidade, catlise e defesa.
Apesar de diferentes entre si, todas as protenas so formadas por cadeias
de aminocidos. Algumas protenas podem ter mais de uma cadeia, e diz-se
que elas possuem multissubunidades. A hemoglobina, por exemplo, um
tetrmero, pois possui quatro cadeias: duas cadeias a idnticas entre si e duas
cadeias b tambm idnticas entre si.
Bioqumica | 35
Figura 1.4. Ligao peptdica.
A maioria das protenas contm apenas aminocidos em sua estrutura, po-

rm muitas delas, chamadas protenas conjugadas, podem possuir grupamentos
qumicos diferentes. Chama-se grupo prosttico a parte da protena que no
formada por aminocidos. Um exemplo disso o grupo heme, grupo prosttico
da hemoglobina. no tomo de ferro desse grupo que ocorre a ligao do
oxignio, permitindo seu transporte pela protena. Na maioria das vezes,
o grupo prosttico desempenha importante papel na funo da protena,
como o caso da hemoglobina. As protenas que possuem em sua com-
posio molculas de lipdios ou carboidratos so denominadas, respecti-
vamente, lipoprotenas e glicoprotenas. Da mesma forma, as protenas que
possuem um metal em sua estrutura so classificadas como metaloprotenas.
Todas as funes de uma protena determinada so dependentes de sua es-
trutura primria. A forma e a ordem como seus aminocidos esto ligados defi-
nir qual a estrutura secundria da protena, e, consequentemente, a sua funo.
Figura 1.5. Estrutura primria de uma protena.
A estrutura secundria uma estrutura tridimensional formada mediante

a interao dos aminocidos da cadeia primria entre si. As cadeias laterais
dos aminocidos interagem, dando protena uma forma tridimensional. Essas
interaes so ligaes fracas, como as ligaes de hidrognio. As protenas
podem apresentar mais de uma estrutura secundria ao longo de sua cadeia.
As estruturas secundrias organizadas so a a-hlice, a folha-b-pregueada e a
hlice do colgeno.
Na a-hlice, as ligaes de hidrognio so feitas a cada quatro aminoci-
dos da sequncia, ficando as cadeias laterais para fora. Essa ligao sequencial
confere protena uma conformao de hlice. A queratina uma protena
formada por essa estrutura secundria, e a diferena entre os tipos de cabelo
se d pelas interaes das cadeias laterais da cistena, que formam pontes dis-
sulfeto. Em cabelos lisos, as ligaes dissulfeto so paralelas, ao passo que nos
cabelos cacheados as ligaes so oblquas. Isso depende da localizao da
cistena na sequncia da queratina, informao contida no DNA do indivduo.
Na folha-b-pregueada, a cadeia de aminocidos se organiza em v-
rias dobras consecutivas nas quais as ligaes de hidrognio so feitas entre
segmentos adjacentes da cadeia. Esse tipo de ligao faz a protena ficar
achatada e ter menos elasticidade do que a apresentada pelas protenas com
estrutura a-hlice. A fibrona uma protena rica nesse tipo de estrutura, o
que a torna rgida. encontrada na teia de aranha e na seda.
Como o nome j diz, a hlice do colgeno s encontrada no colgeno.
Ela consiste em trs cadeias polipeptdicas entrelaadas. Essa estrutura aparece
no tecido conjuntivo, cuja funo suportar tenso e dar proteo mecnica.
Bioqumica | 37
Uma fibra de colgeno contm vrias hlices unidas, oferecendo maior resistn-
cia. O colgeno possui em sua cadeia primria, basicamente, trs aminocidos:
a glicina, a alanina e a hidroxiprolina, esse ltimo aminocido o responsvel
pelas ligaes de hidrognio dessa estrutura.
O enovelamento proteico determina a estrutura terciria. As protenas fi-
brosas, em geral, no formam estruturas tercirias, pois sua forma alongada
favorece sua funo de sustentao e proteo.
Figura 1.6. Estruturas secundrias organizadas das protenas.
As protenas globulares so protenas com estrutura terciria bem definida.

Em geral, elas se enovelam para ocupar menos espao e para trazer para dentro
de sua estrutura os aminocidos apolares, pois eles so incapazes de interagir
com o meio celular, que aquoso. A solubilizao de protenas globulares
em meio aquoso se d pela interao dos aminocidos polares com a gua
por meio das ligaes de hidrognio. A forma da protena globular tambm
estabilizada pelas interaes hidrofbicas na parte interna da protena.
Figura 1.7. Estrutura terciria da cadeia de globina mostrando grupamento heme.
Quando a protena se encontra em sua conformao mais estvel ou seja,

naquela conformao em que existe menor gasto de energia , diz-se que ela
se encontra em sua forma nativa. A estrutura quaternria ocorre quando h mais
de uma cadeia polipeptdica ligada entre si. A hemoglobina uma protena
com estrutura quaternria, apresentando quatro cadeias globulares unidas entre
si. Essa conformao especfica permite que a hemoglobina tenha a funo de
carrear gases.
Figura 1.8. Estrutura quaternria da hemoglobina mostrando os grupos hemes.
A grande variedade de funes exercidas pelas protenas no organismo

resultado da possibilidade de gerao de inmeras sequncias que iro
proporcionar diversas estruturas secundrias, tercirias e quaternrias, oriundas
de um mesmo grupo de aminocidos.
Bioqumica | 39
Figura 1.9. Principais funes biolgicas das protenas.
A sequncia da cadeia primria fornece a identificao bsica da protena

a partir da qual sero formadas as cadeias secundria, terciria e quaternria.
Quando submetida a variaes de temperatura, pH ou concentrao de
outras substncias presentes, uma protena pode sofrer uma reao qumica
chamada desnaturao, uma alterao nas estruturas da protena que ocasiona
a inativao ou a modificao das mesmas. A nica estrutura que no
afetada pela desnaturao a estrutura primria. O fato de a desnaturao
no afetar a cadeia primria serviu para provar que a cadeia primria a
responsvel pela estrutura bsica da protena.
1.2.3.1 Enzimas
As enzimas so protenas que possuem a capacidade de aumentar a
velocidade de determinada reao qumica, atuando, portanto, como
catalisadores3 das reaes que ocorrem em clulas e tecidos vivos. As
enzimas so protenas com estrutura globular que apresentam uma regio onde
ocorre a ligao do substrato. Esse local denominado stio cataltico ou
stio ativo. Substrato a molcula que reconhecida pela enzima e que ser
modificada por ela. Com isso, forma-se o complexo enzima-substrato (ES).
Nesse processo, as enzimas catalisam as reaes com o substrato ligado e, em
geral, podem atuar seguidamente em novas molculas do substrato. Existem
dois modelos tericos principais para explicar a formao do complexo ES:
chave-fechadura (fig. 1.10) e encaixe induzido (fig. 1.11).
Figura 1.10. Modelo chave-fechadura para explicao da formao do complexo ES.
Figura 1.11. Modelo encaixe induzido para explicao da formao do complexo ES.
3
Catalisadores so substncias qumicas capazes de reduzir a energia de ativao em uma reao
qumica, aumentando a sua velocidade.
Bioqumica | 41
No modelo chave-fechadura, a enzima j possui um local especfico para

se ligar ao substrato, ao passo que, no modelo do encaixe induzido, a prpria
ligao do substrato induz a formao desse local especfico, pela mudana
na organizao molecular da enzima. Em alguns casos, as enzimas so bastante
especficas para determinado substrato. importante destacar que os centros
de ativao da enzima dependem diretamente das estruturas terciria ou
quaternria da protena.
Existem molculas orgnicas ou inorgnicas, denominadas cofatores,
que so necessrias para o funcionamento da enzima. A frao da enzima sem
o cofator chamada apoenzima; quando o cofator est presente, a enzima
denominada holoenzima. Os cofatores podem ser ons inorgnicos (Fe+2,
Cu+2, Zn+2, por exemplo), grupos prostticos (heme, por exemplo) ou
coenzimas (vitaminas, por exemplo). Existem alguns fatores que podem afetar
a atividade das enzimas, como a desnaturao e a saturao. A desnaturao
provoca alterao na estrutura da enzima, modificando seu centro de ativao;
a saturao ocorre quando a enzima atua em sua capacidade mxima. Em
ambas as situaes, a enzima tem sua atividade cataltica reduzida.
As enzimas podem ser classificadas da seguinte maneira:
oxidorredutases: catalisam reaes de oxidorreduo;
transferases: transferem uma molcula e adicionam outra;
hidrolases: fazem reagir determinado substrato com a gua;
liases: participam de quebras moleculares;
isomerases: transformam um ismero em outro.
ligases: fazem reagir dois substratos, formando um nico
produto.
As enzimas podem ser inibidas de forma reversvel ou de forma irreversvel.
Na inibio reversvel, a enzima tem sua capacidade cataltica recuperada
quando a inibio se encerra. Na inibio irreversvel, a enzima inativada.
A inibio reversvel pode ser competitiva ou no competitiva. O inibidor
competitivo disputa o stio cataltico da enzima com o substrato. Enquanto o
inibidor est ligado ao stio ativo, a enzima fica inativa, pois ele impede a ligao
do substrato no stio da enzima. De forma geral, o inibidor competitivo possui
estrutura semelhante do substrato da enzima. A inibio no competitiva
ocorre quando o inibidor no compete pelo stio cataltico com o substrato.

Ele simplesmente se liga a outro stio e, na maioria das vezes, modifica a
estrutura da enzima de forma a alterar o stio cataltico, impedindo a entrada
do substrato. Na inibio irreversvel, os inibidores se ligam covalentemente
enzima, inativando-a.
1.2.4 Glicdios
Os glicdios, tambm chamados carboidratos (hidratos de carbono)4

ou acares, so substncias que tm sua estrutura qumica formada por
aldedos, ou cetonas, poli-hidroxilados: para cada tomo de carbono, existem
dois tomos de hidrognio e um de oxignio. Podem tambm conter em sua
estrutura tomos de nitrognio, fsforo ou enxofre. So as biomolculas mais
abundantes no planeta e uma importante fonte de energia dos organismos no
fotossintticos. Alm de serem fonte de energia, os carboidratos participam
da estrutura de plantas; so fonte de reserva energtica tanto em plantas
(amido) quanto em animais (glicognio); e se ligam a protenas, participando
de processos de adeso celular, reconhecimento celular e endereamento
de protenas. Os monossacardeos podem ser classificados como aldoses
ou cetoses. As aldoses consistem em poli-hidroxialdedos com trs a sete
carbonos; as cetoses so poli-hidroxicetonas.
Figura 1.12. A) Estrutura de uma aldose; B) Estrutura de uma cetose.
4
Nos glicdios, hidrognio e oxignio ocorrem nas molculas de gua na proporo de 2:1, por
isso o nome hidrato.
Bioqumica | 43
Os monossacardeos podem se unir em cadeias para formar os oligossacar-

deos, com pequenas cadeias de monossacardeos, ou os polissacardeos, com
grandes cadeias. Os dissacardeos so oligossacardeos com duas unidades
de monossacardeos e so os mais abundantes. A sacarose e a lactose so os
dissacardeos mais conhecidos.
A B
Figura 1.13. A) Estrutura da sacarose; B) Estrutura da lactose.
Os carbonos que contm a hidroxila em uma molcula de monossacardeo

tornam-se um centro quiral (imagens especulares), pois nele so ligados quatro
grupos diferentes. Isso leva os monossacardeos a ocorrerem em formas isomricas
opticamente ativas. Assim, os monossacardeos possuem formas destrgeras
(D) e levgeras (L). As destrgeras desviam o plano da luz polarizada para
a direita e as levgeras, para a esquerda. As formas mais comuns de glicdios
na natureza so as formas D. Em todos os monossacardeos haver, pelo
menos, um carbono quiral. As formas D e L de um monossacardeo so
chamadas enantimeros. Quando a configurao de um acar diferente
da configurao de outro apenas por um tomo de carbono, ele chamado
epmero. Monossacardeos com cinco ou mais carbonos quando em soluo
assumem forma cclica. A ligao para fechamento da estrutura se d entre
o grupo funcional (aldedo ou cetona) e a hidroxila do carbono quiral. Se o
grupo funcional o aldedo, a forma cclica denominada hemiacetal; se uma
cetona, chama-se hemicetal.
Quando os carbonos do monossacardeo se fecham para formar o ciclo, o
carbono ligado ao grupo funcional se torna quiral, deixando a molcula com
dois centros assimtricos. Esse carbono agora chamado carbono anomrico.
H tambm o aparecimento de uma hidroxila, a hidroxila heterosdica. Quan-

do o ciclo se fecha com cinco carbonos, o acar chamado furanose; quando
so seis tomos de carbono, chamado piranose.
Os acares so capazes de sofrer oxidao no carbono da carbonila,
transformando-o em cido carboxlico. Essa oxidao pode ser causada por
agentes oxidantes fracos, como os ons metlicos por exemplo, o on frrico
(Fe+3) e os ons cpricos (Cu+2). Os acares que possuem essa caracterstica
so chamados redutores. A glicose possui essa capacidade de reduo; por
isso, sua dosagem no sangue foi durante muito tempo medida pelo teste de
Fischer, que se baseia na caracterstica redutora da glicose.
A formao dos dissacardeos, dos polissacardeos e dos oligossacardeos
se d por meio de uma ligao covalente forte entre o grupo funcional de um
monossacardeo e o carbono anomrico de outro. Essa ligao denominada
ligao O-glicosdica. Monossacardeos redutores podem perder sua capa-
cidade redutora quando fazem uma ligao glicosdica. O carbono anomrico
da extremidade de uma cadeia que possui um carbono anomrico livre
denominado extremidade redutora. Os dissacardeos, os oligossacardeos e os
polissacardeos podem sofrer hidrlise cida para liberam suas pores monos-
sacardicas.
Figura 1.14. Formao da ligao glicosdica na sntese da maltose.

Bioqumica | 45
1.2.5 Lipdios
Os lipdios so um grupo de substncias que se caracteriza pela baixa so-

lubilidade em gua. Eles desempenham vrias funes celulares e representam
outra importante forma de estocagem de energia na maioria dos organismos,
assim como o constituinte mais abundante das membranas celulares. Alm dis-
so, os lipdios esto relacionados com diversas funes biolgicas, podendo
atuar como cofatores, mensageiros intra e extracelulares ou transportadores.
De modo geral, os lipdios so molculas apolares que apresentam enorme
diversidade estrutural. O componente estrutural bsico da maioria dos lipdios
a molcula de cido graxo. Os cidos graxos so cidos carboxlicos cuja
cadeia de hidrocarboneto pode variar de 4 a 36 carbonos, apresentando
nveis diferentes de saturao. A nomenclatura dos cidos graxos baseada no
nmero de carbonos que apresentam e na quantidade e na posio das duplas
ligaes que eles contm. Considerando que o primeiro carbono o do grupo
carboxlico, a posio das duplas ligaes designada pelo smbolo D (delta)
seguido do nmero do carbono em que a dupla ligao est localizada.
Figura 1.15. A) Estrutura do cido esterico; B) Estrutura do cido oleico.

O cido esterico saturado, ao passo que o oleico insaturado.
A maioria dos cidos graxos de ocorrncia natural possui um nmero par

de carbonos, que varia de 12 a 24. As insaturaes possuem normalmente
configurao cis e so intercaladas com ligao simples. Quanto maior e mais
saturada for a cadeia carbnica, menor ser a solubilidade do cido graxo
em gua. O ponto de fuso tambm influenciado pelo grau de saturao

dos cidos graxos, sendo os poli-insaturados lquidos temperatura ambiente
(leos). A presena do grupo carboxlico na molcula de cido graxo per-
mite a sua participao em vrias reaes, gerando steres ou amidas como
derivados. Essas reaes so as responsveis pela grande diversidade estrutural
observada na classe dos lipdios.
1.2.5.1 Triacilgliceris (triglicerdeos)

Os triacilgliceris so steres formados a partir da reao de trs cidos
graxos com uma molcula de glicerol. Eles podem ser compostos por trs ci-
dos graxos iguais ou diferentes. Tambm conhecidos como triglicerdeos, essas
molculas so os lipdios mais simples gerados a partir dos cidos graxos.
Figura 1.16. Formao dos triacilgliceris.
Os triacilgliceris e outros lipdios neutros podem ser estocados no interior

das clulas eucariticas, em uma organela denominada gota lipdica presente
no citoplasma, provendo as demandas energticas e estruturais, e participando
dos processos de sinalizao e ativao celular.
Os triglicerdeos provenientes da dieta sofrem digesto no duodeno e
no leo proximal. Os triglicerdeos sofrem hidrlise pela ao de lpases e
cidos biliares, originando glicerol e cidos graxos livres. Aps a absoro,
so sintetizados novamente nas clulas epiteliais do intestino e se combinam
com o colesterol e as apolipoprotenas para formar os quilomcrons, que sero
transportados pelo ducto torcico para a circulao.
Bioqumica | 47
Alm de importante fonte de energia, os triglicerdeos, representados pelos

leos e gorduras animais ou vegetais, agem como isolante trmico sob a pele
(tecido adiposo), equilibrando e mantendo a temperatura corprea, uma vez
que so maus condutores de calor. Em regies onde a temperatura muito
baixa, os animais armazenam gordura nos perodos de clima mais quente e a
utilizam como fonte de energia nos mais frios. Os leos presentes em semen-
tes, como as de soja, oliva, milho e girassol, atuam como excelentes fontes de
lipdios na alimentao.
1.2.5.2 Fosfolipdios
Os fosfolipdios so os principais componentes das membranas celulares.
Eles formam uma barreira com permeabilidade seletiva que delimita o espao
intracelular e gera o arcabouo no qual esto inseridas as demais molculas
que compem a membrana plasmtica, como protenas e acares. Os fosfoli-
pdios tm como caracterstica principal a presena de um grupamento fosfato
associado, por meio de uma ligao fosfodister, a um esqueleto lipdico.
Podem ser classificados em dois grandes grupos: os glicerofosfolipdios e os
esfingolipdios.
Os glicerofosfolipdios so compostos por uma molcula de glicerol ligada
a dois cidos graxos e a um grupo fosfato. A um dos oxignios do fosfato
podem estar ligados grupos neutros ou carregados, como colina, etanolamina
e glicerol, que do origem, respectivamente, fosfatidilcolina, fosfatidileta-
nolamina e ao fosfatidilglicerol.
Os esfingolipdios so formados por um amino lcool (esfingosina), uma
molcula de cido graxo e um grupamento polar contendo fosfato. Um exem-
plo de esfingolipdio a esfingomielina, formada pela ligao de uma fosfoco-
lina cabea polar alcolica do esqueleto de esfingosina.
Figura 1.17. Estrutura geral de um glicerofosfolipdio (a) e de um esfingolipdio (b).
Na estrutura qumica dos fosfolipdios, podemos observar duas pores

distintas: uma regio polar ou hidroflica, representada pelo grupamento fos-
fato, e outra apolar ou hidrofbica, gerada pelo longo esqueleto carbnico.
Essa natureza anfiptica dos fosfolipdios essencial para a manuten-
o da arquitetura de bicamada lipdica observada nas membranas celulares.
As pores polares interagem com as molculas de gua no ambiente intra e
extracelular, enquanto as regies apolares interagem entre si na poro interna
da membrana.
1.2.5.3 Esteris
Os esteris so lipdios que possuem em sua estrutura qumica um ncleo
esteroide, que consiste em quatro anis carbnicos unidos entre si, trs com
seis carbonos e um com cinco.
Bioqumica | 49
Figura 1.18. Estrutura qumica do fosfolipdio, composio qumica

principal da membrana celular.
O esterol mais abundante nos tecidos animais o colesterol; nos fungos,

o ergosterol. O colesterol uma molcula anfiptica, com uma poro apolar,
formada pelo ncleo esteroide e pela cadeia de hidrocarboneto ligada ao car-
bono 17, e uma poro polar, decorrente do grupamento hidroxila associado
ao carbono 3. Os esteris possuem diversas funes biolgicas: alm do seu
importante papel estrutural como constituintes das membranas celulares, so
tambm precursores dos hormnios esteroides e dos sais biliares.
Figura 1.19. Estrutura qumica do colesterol, um esteroide que faz parte da

composio das membranas de clulas animais, porm no est presente
nas clulas de vegetais ou bactrias.
1.2.5.4 Lipoprotenas
Os lipdios so extremamente importantes do ponto de vista estrutural e
energtico, mas a natureza hidrofbica dessas molculas faz o seu transporte
no organismo ser possvel apenas quando associado a protenas. Em vertebra-

dos, os cidos graxos livres circulam no plasma associados albumina, que
os transporta do tecido adiposo para os demais tecidos, onde so utilizados
como fonte de energia. Existe tambm uma classe especfica de protenas, as
lipoprotenas plasmticas, responsveis pela distribuio dos diferentes tipos
de lipdios nos vrios tecidos do organismo.
As lipoprotenas de mamferos so molculas que contm uma regio in-
terna hidrofbica composta por lipdios neutros, principalmente ster de
colesterol e triacilglicerol e uma poro externa hidroflica formada por
uma nica camada de lipdios anfipticos (colesteris e fosfolipdios) e pelas
apoprotenas. Possuem composio proteica distinta que depende da nature-
za, da origem e do destino dos lipdios a serem transportados. Alm disso,
a relao entre o contedo lipdico e proteico faz as lipoprotenas apresen-
tarem densidades diferentes, sendo, por isso, classificadas em quatro grupos
principais: quilomcrons, VLDL (do ingls very low density lipoprotein, ou
seja, lipoprotena de muito baixa densidade), LDL (do ingls low density
lipoprotein, ou seja, lipoprotena de baixa densidade) e HDL (do ingls high
density lipoprotein, ou seja, lipoprotena de alta densidade). Quanto maior a
proporo de lipdios, menos densa ser a lipoprotena.
Para entender os processos fisiolgicos de absoro, sntese e degradao
de lipdios, preciso conhecer a dinmica de transporte dessas molculas
atravs do organismo. Os lipdios provenientes da dieta so emulsificados no
intestino com o auxlio dos sais biliares sintetizados no fgado. Os sais biliares
atuam como detergentes fisiolgicos, favorecendo a ao das lpases intestinais
sobre os triacilgliceris. A hidrlise dos triacilgliceris pelas lpases intestinais
gera cidos graxos livres e glicerol, que so absorvidos e, ainda na mucosa in-
testinal, reesterificados a triacilglicerol. Tanto os triacilgliceris quanto os demais
lipdios absorvidos na dieta so incorporados ainda na mucosa intestinal a uma
poro proteica (ApoC-II, ApoC-III e Apo B48), gerando uma lipoprotena
denominada quilomcron. Os quilomcrons so responsveis pelo transporte
dos lipdios provenientes da dieta para o fgado e demais tecidos, sendo a
molcula de quilomcron remanescente internalizada pelo fgado. Nesse rgo,
so formadas as partculas de VLDL, que carreiam os lipdios (principalmen-
Bioqumica | 51
te triacilglicerol e colesterol esterificado) do fgado para os outros tecidos.

Enquanto percorre a corrente sangunea, a VLDL sofre a ao de lpases
endoteliais, que reduzem o seu contedo de triacilgliceris, assim como da
protena transferidora de ster de colesterol (CETP, do ingls cholesteryl ester
transfer protein), que incorpora colesterol partcula de VLDL. Com isso, a
densidade da lipoprotena alterada, e ela passa a ser denominada LDL. A
molcula de LDL supre a demanda de colesterol dos tecidos, e a partcula de
LDL remanescente removida pela captao no fgado. Da mesma forma que
a VLDL, a HDL tambm produzida no fgado e no intestino. Porm, essa
lipoprotena constituda de fosfolipdios, colesterol e colesterol esterificado.
Essa partcula assume papel inverso ao da LDL, removendo o colesterol das
membranas dos tecidos e transportando-o para o fgado, transporte denomina-
do reverso de colesterol.
Quando a demanda energtica do organismo requer a utilizao dos tria-
cilgliceris estocados no tecido adiposo, a liberao de hormnios, como o
glucagon e a epinefrina, promove a ativao de lpases sensveis a hormnios
que degradam os triacilgliceris, gerando cidos graxos livres, transportados no
plasma at os demais tecidos associados albumina. Essa complexa rede de
transporte de lipdios permite que essas molculas sejam rapidamente estocadas
ou mobilizadas, mantendo a homeostasia do organismo.
Figura 1.20. Lipoprotenas e transporte de lipdios.

1.2.6 Hormnios
A manuteno da homeostasia de organismos multicelulares s possvel

por causa da existncia de molculas sinalizadoras que proporcionam a intera-
o intercelular e entre os tecidos. Esses sinalizadores so os hormnios. Os
mecanismos de sinalizao intercelular podem ser classificados em autcrinos
(quando a clula secreta substncias que vo atuar sobre seus prprios re-
ceptores), parcrinos (quando os mediadores secretados sensibilizam clulas
adjacentes), ou endcrinos (quando as clulas-alvo esto distantes do local
onde a molcula sinalizadora foi sintetizada).
Os hormnios tm atividade autcrina, parcrina ou endcrina e esto en-
volvidos na regulao de todos os processos essenciais para a manuteno da
vida: crescimento, maturao, reproduo, senescncia e comportamento. Eles
podem ser secretados por diversos tipos celulares, possuem grande variedade
molecular e possvel agrup-los em duas classes gerais: proteicos insulina
e hormnio folculo estimulante (FSH, do ingls follicle-stimulating hormone),
por exemplo e lipdicos testosterona e progesterona, por exemplo.
Os hormnios proteicos em geral so reconhecidos por receptores es-
pecficos na membrana plasmtica da clula-alvo. Com isso, o complexo
hormnio-receptor dispara uma cascata de sinalizao intracelular que culmina
na gerao de um segundo mensageiro, o qual desencadear as alteraes
intracelulares decorrentes do estmulo inicial. Os hormnios lipdicos, por sua
vez, podem atravessar a membrana plasmtica e interagem com receptores
nucleares especficos.
Alguns hormnios so secretados na corrente sangunea na sua forma ativa,
ao passo que outros so liberados na forma de pr-pr-hormnio e precisam
ser metabolizados antes de atuar na clula-alvo. De modo geral, a secreo
dos hormnios controlada por retroalimentao negativa, ou seja, inibida
pelo aumento da concentrao do hormnio ou de outra substncia que
esteja sendo secretada em resposta sua ao. O principal centro regulador
da secreo hormonal em mamferos o hipotlamo, situado no crebro.
ele que recebe os impulsos nervosos e, em resposta a esses estmulos, produz
vrios hormnios regulatrios, que passam pela glndula hipfise, estimulando
Bioqumica | 53
(ou inibindo) a liberao de hormnios em diversos rgos endcrinos. A

compreenso dos efeitos fisiolgicos e bioqumicos dos hormnios permite
o entendimento de algumas doenas endcrinas e o desenvolvimento de
terapias efetivas.
Os hormnios esteroides so sintetizados a partir do colesterol em
vrios tecidos endcrinos e so levados pela corrente sangunea, ligados a
protenas carreadoras, at as suas clulas-alvo. Eles afetam o desenvolvimento
e o comportamento sexual, alm de muitas outras funes reprodutivas e no
reprodutivas.
Os hormnios retinoides regulam o crescimento, a diferenciao e a sobre-
vivncia celular. Os hormnios tireoidianos T4 (tiroxina) e T3 (triiodotironina)
so sintetizados na glndula tireoide a partir da protena precursora tiroglobu-
lina (pr-hormnio). Esses hormnios necessitam do iodo para suas atividades
biolgicas e estimulam o metabolismo energtico, especialmente no fgado e no
msculo, ativando a expresso de genes que codificam enzimas-chave catab-
licas. O crtex adrenal sintetiza os glicocorticoides, os mineralocorticoides e
os andrgenos. Esses hormnios compartilham da estrutura bsica do ciclopen-
tanoperidrofenantreno. O cortisol o principal glicocorticoide produzido no
crtex adrenal. Essa produo regulada pelo mecanismo de retroalimentao
inibitria do hormnio liberador de corticotrofina (CRH, do ingls corticotropin-
releasing hormone) no hipotlamo e do hormnio adrenocorticotrfico (ACTH,
do ingls Adrenocorticotropic hormone) na pituitria anterior. Os hormnios
da adrenal so fundamentais na homeostase da glicose, na reteno de sdio,
na regulao da presso sangunea, nos mecanismos de defesa, na resposta ao
estresse e no anabolismo proteico geral.
1.2.7 Vitaminas
As vitaminas, molculas essenciais vida, no so sintetizadas pelos animais

superiores e precisam ser obtidas pela alimentao. Atuando como cofatores
enzimticos, podem ser agrupadas, de acordo com a sua solubilidade, em
hidrossolveis e lipossolveis.
Como integrantes da famlia das vitaminas hidrossolveis, podemos citar

as vitaminas do complexo B e a vitamina C; j nas vitaminas lipossolveis
esto compreendidas as vitaminas A, D, E e K. Os quadros 4 e 5 trazem a
relao das fontes e das funes das vitaminas lipossolveis e hidrossolveis,
respectivamente.
Quadro 1.4. Resumo das vitaminas lipossolveis.

Vitaminas
Fontes Funes
lipossolveis
crescimento,
fgado, gordura do leite, margarina,
Vitamina A desenvolvimento e
gema de ovo, folhas verdes e
(retinol) manuteno do tecido
amarelas, damascos e pssegos.
epitelial e viso noturna.
formao de ossos e
Vitamina D peixes gordurosos, gema de ovo e dentes, absoro e
(calciferol) fgado. metabolismo do fsforo e
do clcio.
germe de trigo, leos vegetais,
Vitamina E
vegetais de folhas verdes, gordura potente antioxidante.
(tocoferol)
do leite, gema de ovo e nozes.
auxilia na produo de
fgado, leo de soja, leo de
Vitamina K protrombina, necessrio
outros vegetais, vegetais de folhas
(filoquinona) para a coagulao sangunea
verdes e farelo de farinha.
normal.
Quadro 1.5. Resumo das vitaminas hidrossolveis.

Vitaminas
Fontes Funes
hidrossolveis
carne de porco,
fgado, vsceras,
auxilia na remoo do CO2
Tiamina legumes, gros
dos alfa-cetocidos durante a
integrais e cereais
oxidao dos carboidratos.
enriquecidos, germe
de trigo e batatas.
Bioqumica | 55
cont.
leite e seus
exerce importante papel
derivados, vsceras,
enzimtico na respirao
Riboflavina vegetais de folhas
dos tecidos e age como
verdes, cereais
transportador de ons
enriquecidos, pes e
hidrognio.
ovos.
peixe, fgado, carne, cofator enzimtico, auxilia na
aves, gros, ovos, transferncia de hidrognio e age
Niacina
amendoim, leite e no metabolismo de carboidratos
legumes. e aminocidos.
porco, vsceras,
auxilia na sntese e na quebra
farelo e germe de
de aminocidos e na sntese de
Vitamina B6 cereais, leite, gema
cidos graxos insaturados a partir
de ovo, farinha de
de cidos graxos essenciais.
aveia e legumes.
fundamental para a biossntese

fgado, rim, leite e de cidos nucleicos; exerce
Vitamina B12 derivados, carne e importante papel no
ovos. metabolismo do tecido nervoso
e no crescimento.
presente em todos
os alimentos vegetais
essencial no metabolismo
e animais; ovos,
cido pantotnico intermedirio de carboidratos,
rim, fgado, salmo
gorduras e protenas.
e levedura so as
melhores fontes.
vegetais de folhas
verdes, fgado, bife
essencial para a biossntese
magro, trigo, ovos,
de cidos nucleicos e para a
cido flico ou folato peixes, lentilha, feijo
maturao normal das hemcias;
de corda, aspargo,
sintetizado no intestino.
brcolis, couves e
levedura.
cont.
fgado, cogumelos,
componente essencial de
amendoim, levedura,
enzimas, atua na sntese e na
leite, carne, gema de
Biotina quebra de cidos graxos e de
ovo, a maioria dos
aminocidos, auxiliando na
vegetais, banana,
remoo de gs carbnico.
melo e morango.
acerola, frutas
ctricas, tomate, importante na resposta imune,
Vitamina C (cido melo, pimento na cicatrizao de feridas e em
ascrbico) verde, repolho cru, reaes alrgicas; aumenta a
morango, abacaxi, absoro de ferro.
goiaba e batata.
1.3 Metabolismo
1.3.1 Introduo ao metabolismo
Para que nos alimentamos? Dizemos que nos alimentamos de modo a obter
a energia suficiente para manter nossas funes. Consideramos alimento os
carboidratos, as protenas e os lipdios, que so macromolculas constitudas
basicamente de carbono, hidrognio, oxignio e nitrognio.
Os seres autotrficos, como as plantas, so capazes de transformar CO2
e gua em fontes de carbono reduzido. A reao pela qual eles efetuam essa
transformao chamada fotossntese. Os seres heterotrficos no so capa-
zes de efetuar tal reao; por isso, devem obter as molculas com carbono
reduzido de uma fonte, por meio da ingesto desses alimentos. Eles fornecem
macromolculas importantes para a sntese de novas molculas e para a obten-
o de energia, por meio das reaes que acontecem no metabolismo.
O metabolismo compreende uma srie de reaes qumicas efetuadas pelas
clulas na converso de uma molcula em outra. As reaes do metabolismo
podem gerar energia (reaes exergnicas) ou podem absorver energia (reaes
endergnicas). As reaes de catabolismo (quebra de molculas combustveis)
so exergnicas e sempre esto acopladas a reaes de anabolismo (sntese de
Bioqumica | 57
macromolculas), que so endergnicas. Esse conjunto de reaes anablicas

e catablicas denominado metabolismo. Os tipos de reao que podem
ocorrer no metabolismo celular so reaes de xido-reduo que participam
da transferncia de eltrons geradores de energia; reaes de ligao que
formam ligaes covalentes por meio da hidrlise de um ATP; isomerizao
quando os tomos so rearrumados, formando ismeros; transferncia de grupa
mentos quando um grupo funcional transferido de uma molcula para
outra; hidrlise quando ocorre a quebra de ligaes pela adio de gua;
e adio ou remoo de grupos funcionais quando grupos funcionais so
adicionados ou retirados da molcula, transformando-a. As reaes metablicas
so reguladas pelo controle da quantidade de enzimas que participam das
reaes, por suas atividades catalticas e pelo acesso da enzima ao substrato.
O metabolismo imprescindvel para a sobrevivncia do organismo. por
meio das reaes que o compem que o indivduo capaz de obter energia
dos alimentos, produzir macromolculas e sustentar o seu desenvolvimento.
1.3.2 O ATP como moeda energtica
As reaes qumicas so classificadas como endotrmicas e exotrmicas. As

reaes exotrmicas liberam energia no ambiente na forma de calor; j as rea-
es endotrmicas necessitam de energia para que possam ocorrer. Em sistemas
no biolgicos, fcil a manipulao da energia, sob a forma de calor, para
acelerar uma reao, ou para fazer uma reao que normalmente no acontece-
ria ocorrer. Para inibirmos uma reao basta diminuirmos sua temperatura; para
aceler-la, basta aquecermos o meio reacional.
Nos organismos vivos isso no possvel, pois esses so sistemas isotrmi-
cos e, por isso, necessitam de energia qumica para ocorrer. Nos organismos,
as reaes que necessitam de energia so chamadas endergnicas e aquelas
espontneas, que geram energia livre, so denominadas exergnicas. Para que
reaes endergnicas possam ocorrer, preciso que, ao mesmo tempo, tam-
bm ocorra uma reao exergnica, a qual fornecer a energia necessria. Nos
seres vivos, esse mecanismo denominado acoplamento.
A forma mais fcil de acoplamento de reaes a formao de uma mo-

lcula energtica em uma reao exergnica a ser utilizada como fonte de
energia em uma reao endergnica, que ser a responsvel pela transferncia
de energia. Em todos os organismos, essa molcula o ATP. O ATP um
nucleosdeo trifosfato que contm a base nitrogenada adenina, uma ribose e
seus trs grupos fosfatos.
Figura 1.21. Molcula de ATP.
O ATP capaz de produzir um ciclo de hidrlise e fosforilao entre ele e

seu anlogo, a adenosina difosfato (ADP). A hidrlise do ATP gera energia
e ADP; por conseguinte, a fosforilao do ADP consome energia e produz
ATP. Esse ciclo o processo fundamental de troca de energia entre sistemas
biolgicos.
O ATP formado em trs grandes processos metablicos: na fosforilao
oxidativa, na gliclise e no ciclo de Krebs.
1.3.3 Metabolismo dos carboidratos
A glicose capaz de atender a todas as demandas energticas de algu-

mas clulas. Apesar de a glicose no ser consumida diretamente, pode ser
obtida em nossa dieta mediante a quebra de outros acares maiores, como
Bioqumica | 59
o amido e a sacarose. Os animais e o homem se enquadram no grupo dos

organismos quimiotrficos, aqueles que obtm energia por intermdio de
reaes qumicas. A energia produzida pela oxidao de molculas para a
gerao final de ATP, importante moeda energtica para o organismo, como
mencionado. Existem organismos, porm, que no obtm energia dessa forma.
So os chamados organismos fototrficos, que produzem ATP utilizando
energia luminosa. Esses organismos fazem fotossntese, realizada por bactrias
verdes e prpuras as cianobactrias , algas e plantas, e seu nome decorre
da capacidade dessa reao de produzir carboidratos, pela adio de CO2 a
molculas orgnicas, mediante a catlise da luz.
Figura 1.22. Reao da fotossntese.
1.3.3.1 Gliclise
A gliclise a via metablica que transforma glicose em piruvato. uma
via anaerbica responsvel pela produo de duas molculas de piruvato e de
duas molculas de ATP. Nos mamferos, a glicose fonte de energia utiliza-
da pelas clulas do crebro e pelas hemcias. O piruvato formado nessa via
pode ser metabolizado de forma anaerbia, a partir das fermentaes lctica
e alcolica, ou de forma aerbia, no caso da fosforilao oxidativa, quando
haver formao de um nmero maior de ATPs. A gliclise uma via comum
tanto em organismos procariotos quanto em organismos eucariotos e ocorre no
citoplasma da clula.
A gliclise se inicia com a entrada da glicose na clula atravs de receptores
especficos para ela, denominados glut. Os receptores glut 1 e 3 so inde-
pendentes de insulina e responsveis pela captao basal de glicose na maior
parte das clulas. O receptor glut 2 est presente no fgado e no pncreas,
e s transporta glicose em concentraes muito altas. O receptor glut 4, que

est presente no tecido adiposo e muscular, depende de insulina para ser
colocado na membrana plasmtica. J o crebro independente de insulina,
necessitando de uma entrada constante de glicose.
Aps a entrada da glicose na clula, ela deve ser modificada para que
no possa sair. Para isso, fosforilada pelo ATP, formando o composto
glicose-6-fosfato. Essa reao catalisada pela enzima hexoquinase. O
fosfato adicionado glicose no permite que ela passe pela membrana
plasmtica, pois confere glicose carga negativa.
Figura 1.23. Fosforilao da glicose pela hexoquinase.
A prxima reao consiste na isomerizao da glicose frutose. Para isso,

a enzima responsvel pela reao necessita abrir o anel, transformar a aldose
da glicose em uma cetose e novamente fechar o anel glicosdico. A enzima
responsvel por essa etapa a fosfoglicose isomerase. A frutose-6-fosfato
ento novamente fosforilada pelo ATP para formar a frutose-1,6-bisfosfato
com o auxlio da fosfofrutoquinase do tipo 1 (PFK-1). Por ser uma enzima
alostrica, essa reao um dos pontos de regulao da gliclise.
Bioqumica | 61
Figura 1.24. Fosforilao da frutose-6-fosfato para a formao

da frutose-1,6-bisfosfato.
A partir dessa fase, a gliclise envolver reaes com compostos de

trs carbonos; por isso, a frutose-1,6-bisfosfato deve ser clivada em duas
molculas. Essa reao catalisada pela aldolase, ocorrendo ento a
formao da diidroxicetona fosfato e do gliceraldedo-3-fosfato.
Aps a ao da aldolase, dois fragmentos de trs carbonos so formados
para sua pronta utilizao na obteno de ATP. O nico problema que
a diidroxicetona no utilizada na gliclise; por isso, necessrio que seja
interconvertida a gliceraldedo-3-fosfato. Essa isomerizao catalisada pela
enzima triose fosfato isomerase, numa reao rpida e reversvel. Assim,
so formadas duas molculas de gliceraldedo-3-fosfato. O gliceraldedo-3-
fosfato tambm pode ser convertido em diidroxicetona; para que isso no
ocorra, ele logo consumido, e a converso da diidroxicetona para aldedo
favorecida.
Figura 1.25. Isomerizao da diidroxicetona-fosfato ao gliceraldedo-3-fosfato.
At agora, nenhuma molcula de ATP foi sintetizada, tendo sido apenas

consumidas duas molculas. As prximas reaes fazem parte da etapa de
obteno de energia. As duas molculas de gliceraldedo-3-fosfato so trans-
formadas em 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG), em uma reao catalisada pela
gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase.
Figura 1.26. Formao do 1,3-bisfosfoglicerato.
A partir do 1,3-bisfosfoglicerato, ocorre a formao de um ATP, em uma

reao catalisada pela fosfoglicerato quinase. Essa a primeira reao da
gliclise, quando ocorre a formao de ATP. Essa reao tem como produto,
alm do ATP, o 3-fosfoglicerato.
Bioqumica | 63
Figura 1.27. Primeira reao com produo de ATP.
Para a formao de ATP, ainda ocorrero outras reaes. A primeira uma

reao de rearranjo, catalisada pela fosfoglicerato mutase, quando o fosfato
do 3-fosfoglicerato transferido do carbono trs para o carbono dois, forman-
do o 2-fosfoglicerato.
Figura 1.28. Formao do 2-fosfoglicerato.
Em seguida, uma desidratao catalisada pela enolase forma o fosfoenolpi-

ruvato, no qual o grupo fosfato fica localizado no carbono do enol.
Figura 1.29. Formao do fosfoenolpiruvato por desidratao

catalisada pela enolase.
O grupo fosfato do fosfoenolpiruvato finalmente transferido para uma

molcula de ADP, com concomitante formao de ATP. Essa reao catali-
sada pela piruvato quinase. Em condies celulares, essa reao irreversvel
e possui participao na regulao dessa via.
Figura 1.30. Formao do piruvato e de ATP.
Os ATPs formados so quatro, sendo dois consumidos nas etapas iniciais

da gliclise, tendo um balano final positivo de duas molculas de ATP na
gliclise. Essa via tambm produz duas molculas de piruvato, que sero
os substratos iniciais para as prximas vias metablicas. Durante a gliclise,
tambm so reduzidas duas molculas de NAD+, formando nicotinamida
adenina dinucleotdeo (NADH). O NADH um aceptor intermedirio
dos eltrons formados nas reaes de oxidao da via. Sua quantidade
Bioqumica | 65
limita a via e, por isso, o NADH deve ser constantemente regenerado. A

regenerao dos aceptores intermedirios de eltrons (NAD+, FAD+ e, nas
vias biossintticas, NADP+) ocorre nas prximas etapas de metabolizao
do piruvato.
O piruvato possui trs caminhos finais distintos: etanol, cido lctico (nas
reaes anaerbicas) e dixido de carbono (nas reaes aerbicas). O balan-
o energtico final da gliclise dado por:
Na via glicoltica, so as enzimas irreversveis que controlam a velocidade

da via. So elas hexoquinase, fosfofrutoquinase (PFK-1) e piruvato quinase.
Uma enzima pode ser controlada pelo seu produto, e a via, pela inibio da
primeira reao pelo produto da ltima, evitando a formao de intermedirios
desnecessrios.
O ATP um grande inibidor da via glicoltica, pois inibidor alostrico
da PFK-1. Da mesma forma, ADP e a adenosina monofosfato (AMP) so
reguladores positivos da via, pois aumentam a velocidade da enzima. O on
H+ tambm um inibidor da via, pois formado na reao final de produo
de piruvato. Se essa via no fosse inibida pela concentrao de H+ no meio,
a diminuio do pH celular seria drstica para a clula.
A inibio da PFK-1 aumenta a concentrao, no meio, de frutose-6-
fosfato, que isomerizada glicose-6-fosfato, a qual funciona como inibidor
da hexoquinase.
A piruvato quinase inibida por ATP e alanina, dado que o piruvato se
transforma em alanina com o auxlio da transaminase.
1.3.3.2 Fermentao alcolica

Em organismos anaerbicos, as etapas de metabolizao final do piruvato
passam por um processo de fermentao. Os dois principais tipos de fermen-
tao so a alcolica e a lctica.
A fermentao alcolica ocorre principalmente nas leveduras e em v-

rios outros microrganismos. um dos processos mais antigos utilizados pelo
homem para a obteno de bebidas alcolicas, como o vinho e a cerveja.
Sua primeira etapa a descarboxilao do piruvato, pela ao da piruvato
descarboxilase, gerando o aldedo actico, que, em seguida, reduzido a
etanol pela enzima lcool desidrogenase, com a concomitante formao de
NAD+, por meio da regenerao de um NADH. Essa enzima tambm
responsvel pelo metabolismo do etanol consumido pelo indivduo.
Esse processo no ocorre em mamferos. Quando ingerimos lcool, ele
degradado pela lcool desidrogenase, gerando aldedo actico, porm no
convertido a piruvato, pois nos mamferos no h a presena da piruvato
descarboxilase.
Figura 1.31. Reaes da fermentao alcolica.
1.3.3.3 Fermentao lctica

A fermentao lctica ocorre em vrios microrganismos e em algumas clulas
de organismos superiores, como os msculos, quando em exerccio intenso e
quantidade limitada de oxignio.
A formao do lactato a partir do piruvato catalisada pela lactato desi-
drogenase.
Bioqumica | 67
Figura 1.32. Reaes da fermentao lctica.
1.3.3.4 Ciclo de Krebs

Os processos de formao de ATP pelas fermentaes em condies
anaerbias criam baixa quantidade de energia. Uma quantidade muito mais
alta de energia obtida pela degradao do piruvato em condies aerbicas,
durante o ciclo de Krebs e a fosforilao oxidativa.
O ciclo do cido ctrico ciclo dos cidos tricarboxlicos ou ciclo de
Krebs a primeira etapa na obteno de energia de forma aerbica. Ele
se inicia com a entrada da acetilcoenzima A (acetil-CoA) no ciclo. A acetil-
CoA formada pela descarboxilao oxidativa do piruvato pelo complexo
piruvato desidrogenase na mitocndria.
O ciclo de Krebs uma sequncia de reaes nas quais ocorre a oxidao
das molculas de carbono, levando liberao de eltrons que sero utilizados
na cadeia respiratria para a obteno de ATP. Ele se inicia com a entrada da
acetil-CoA, que se condensa com o oxalacetato a fim de formar o citrato que
possui seis carbonos. Essa reao catalisada pela citrato sintase. O citrato
formado ento isomerizado ao isocitrato, pois sua carboxila precisa estar em
uma posio que facilite a sua descarboxilao. Essa reao, catalisada pela
enzima aconitase, ocorre em duas etapas: uma desidratao seguida de uma
hidratao. O isocitrato formado capaz de sofrer descarboxilao, catalisada
pela isocitrato desidrogenase, para formar o a-cetoglutarato, um composto
com cinco carbonos. O a-cetoglutarato tambm sofre mais uma descarboxila-
o, catalisada pelo complexo a-cetoglutarato desidrogenase, formando um
intermedirio, o succinilcoenzima A (succinil-CoA). Essa fase importante
pois, com a quebra da succinil-CoA, ocorre liberao de energia, formando
um GTP. O GTP pode transferir o seu Pi para um ADP, formando um ATP.

o nico momento do ciclo em que ocorre a formao de um composto pron-
to de alta energia. O succinato, um composto de quatro carbonos, formado
em seguida, pela ao da succinato sintetase, e a coenzima A retorna ao pool
inicial da mitocndria.
Aps isso, ocorrem reaes que objetivam a regenerao do oxaloacetato.
O succinato sofre uma srie de reaes de oxidao, hidratao e uma segunda
oxidao para a formao do oxaloacetato. Na primeira etapa de oxidao,
ocorre a regenerao de uma FADH2 e a formao do fumarato, pela ao
da enzima succinato desidrogenase. Essa enzima muito utilizada em testes
de quantificao celular pelo MTT (brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazlio), um sal tetrazlico que reduzido pela enzima, formando os
cristais de formazan, um produto colorido.
Figura 1.33. Formao dos cristais de formazan.
Em seguida, o fumarato sofre uma hidratao catalisada pela fumarase para

formar o L-malato. formado somente o L-malato, pois a enzima adiciona a
hidroxila somente em um dos lados da molcula, formando o ismero L es-
pecificamente. Por ltimo, o L-malato oxidado pela malato desidrogenase
para formar o oxaloacetato. Nessa reao, h a regenerao de uma molcula
de NAD+. Essa reao impulsionada pela utilizao, no incio do ciclo, do
oxaloacetato, que condensado a uma unidade acetila da acetil-CoA, permi-
tindo a entrada de dois carbonos no ciclo.
Bioqumica | 69
A sntese do fosfoenolpiruvato a partir do piruvato ocorre in vitro, mas

incapaz de ocorrer in vivo. O grande regulador do ciclo o ATP, produto
final do ciclo sintetizado na cadeia respiratria. No h formao propriamente
dita de ATP no ciclo de Krebs, mas os NADH e FADH2 acabam por ger-
lo quando se regeneram. Por isso o ciclo de Krebs est sujeito aos controles
de concentrao [ATP/ADP], [NADH.H/NAD+] e [FADH2/FAD+]. Na
fosforilao oxidativa, so geradas cerca de 2,5 ATP por NADH e 1,5 ATP
por FADH2. Apesar de o oxignio no participar diretamente do ciclo de
Krebs, esse um ciclo estritamente aerbico, dado que os NAD+ e os FAD
necessrios ao ciclo s podem ser regenerados na mitocndria quando transfe-
rem seus hidrognios para o oxignio.
Assim como na gliclise, os pontos de controle so as reaes das enzimas
irreversveis. Um dos principais controles do ciclo ocorre na reao catalisada
pela enzima piruvato desidrogenase. Nessa reao, h a formao da acetil-
CoA por meio do piruvato obtido na gliclise. Essa reao no reversvel
nos animais e, por isso, a partir desse ponto, os carbonos da glicose utilizada
s podem entrar no ciclo de Krebs ou para formar energia ou para ser trans-
feridos para a sntese de cidos graxos. Por isso, altas concentraes de seus
produtos (acetil-CoA, NADH e, indiretamente, o ATP) inibem a sua reao.
Outros mecanismos tambm so utilizados para a sua regulao.
O ciclo de Krebs regulado pelo nvel energtico da clula; por isso, altas
concentraes de ATP inibem as enzimas alostricas (isocitrato desidrogenase
e a-cetoglutarato desidrogenase), alm de seus produtos de reao respec-
tivamente. O ciclo de Krebs nunca para; portanto, substncias que inibam
as enzimas desse ciclo podem ser fatais para a clula. Ele tambm fornece
precursores de biossntese.
Figura 1.34. Reaes do ciclo de Krebs.
1.3.3.5 Cadeia respiratria ou fosforilao oxidativa

A fosforilao oxidativa o processo pelo qual os NADH e os FADH2
formados na oxidao dos cidos graxos, na gliclise e no ciclo de Krebs so
regenerados. Como suas concentraes celulares so muito baixas, os NADH
e os FADH2 devem ser constantemente regenerados para retornarem cadeia
metablica. Eles entregam seus eltrons ao aceptor final, o oxignio, gerando
gua e uma fora eletromotriz responsvel pela sntese de ATP. na fosfori-
lao oxidativa que ocorre a formao de uma grande quantidade de ATP na
clula, por meio da oxidao de uma molcula de glicose, com concomitante
formao de CO2 e gua.
A fosforilao oxidativa ocorre na membrana interna da mitocndria. A
mitocndria uma organela formada por duas membranas principais: a interna
e a externa. A membrana externa permevel aos contedos citoplasmticos.
Por isso, costuma-se dizer que o espao entre a membrana interna e a externa
da mitocndria, denominado espao intermembranar, uma continuao do
citoplasma. J a membrana interna muito seletiva, e a entrada de substncias
nela necessita de um transportador especfico. Ela muito extensa e se dobra
dentro da mitocndria, formando estruturas denominadas de cristas. O espao
delimitado pela membrana interna denominado matriz mitocondrial.
Bioqumica | 71
Figura 1.35. Estrutura da mitocndria.
A cadeia respiratria um processo do qual participam quatro complexos

proteicos e dois carreadores, responsveis pela transferncia dos eltrons at o
oxignio, que o aceptor final. Esses complexos so denominados NADH-
coenzima Q oxidorredutase (complexo I), succinato-coenzima Q oxidorredu-
tase (complexo II), coenzima Q-citocromo c oxidorredutase (complexo III)
e citocromo c oxidase (complexo IV). Os carreadores so a ubiquinona e
o citocromo c. O ltimo complexo, no qual se d a sntese do ATP, ser
abordado mais adiante. O fluxo de eltrons entre os complexos proteicos
transmembranares que leva ao transporte de prtons atravs da membrana
interna da mitocndria.
Inicialmente, o NADH se aproxima do complexo I e transfere seus eltrons
para o grupamento prosttico desse complexo, a flavina mononucleotdeo
(FMN), reduzindo-a FMNH2. Por sua vez, a flavina transfere seus eltrons
para uma srie de aglomerados ferro-enxofre (Fe-S), um segundo tipo de gru-
po prosttico do mesmo complexo. Essa transferncia faz todo o complexo I
assumir uma forma reduzida. O NAD+ reoxidado fica livre para ser novamente
utilizado. Com a formao do NAD+, ocorre a sada de H+ da matriz mito-
condrial, o que deixa o espao intermembranar mais cido.
O carreador ubiquinona se aproxima do complexo I, recebendo seus el-
trons e regenerando o complexo para que esse possa receber novos eltrons.
Por ser hidrfoba, a ubiquinona se difunde para dentro da matriz, atravs da

membrana mitocondrial interna. A ubiquinona tambm capaz de receber
eltrons do complexo II, regenerando o FADH2 gerado pela succinato de-
sidrogenase no ciclo de Krebs. Para a ubiquinona, a reao de transferncia
de eltrons est diretamente ligada liberao de prtons, uma propriedade
importante para o transporte de H+ atravs da membrana.
A ubiquinona transfere os eltrons tanto do complexo I quanto do comple-
xo II para o complexo III, que apresenta como grupos prostticos os citocro-
mos b e c. O citocromo c, uma protena pequena e solvel, carreia os eltrons
do complexo III para o complexo IV. Essa transferncia bombeia para fora da
matriz mitocondrial dois prtons. Assim, a ubiquinona oxidada e pode ser
reutilizada.
Finalmente, o complexo IV catalisa a reduo do oxignio molecular gua,
utilizando os prtons provenientes da matriz mitocondrial. Para que ocorra a
sntese de ATP, necessria a ao da F0F1 ATPase, tambm chamada complexo
V, um agregado enzimtico presente na membrana mitocondrial interna. A sntese
se d por causa do gradiente de prtons formado entre a matriz mitocondrial e
o espao intermembranar. Esse gradiente formado com a reduo do oxignio
gua, quando prtons so lanados para o espao intermembranar, tornando-o
mais cido. O retorno desses prtons se d atravs do canal formado pela
poro F0 do complexo proteico. O ATP formado por meio da fosforilao
de ADP, reao catalisada pela poro F1 do complexo V.
1.3.3.6 Metabolismo do glicognio

Alguns rgos do corpo so incapazes de sobreviver sem a entrada de
glicose em suas clulas. Porm, nem sempre ela est disponvel no sangue nas
concentraes ideais para ser captada e utilizada na produo de energia. A
fim de que rgos como o crebro no fiquem sem o seu abastecimento de
glicose, o organismo possui mecanismos de armazenamento da glicose, sob a
forma de glicognio, para momentos de jejum. O glicognio um polmero
de glicose formado por ligaes glicosdicas do tipo a-1,4. Ele possui vrias
Bioqumica | 73
ramificaes, que se repetem a cada dez oses e que so formadas por ligaes
do tipo a-1,6. O glicognio principalmente armazenado no fgado, mas
tambm est presente nos msculos esquelticos.
Apesar de fornecer uma quantidade menor de energia quando comparado
aos cidos graxos, ao ser oxidado, o glicognio liberado no sangue medida
que a taxa de glicemia diminui. Isso o faz funcionar como um tampo de glicose
sangunea, impedindo a falta de glicose para os rgos que a utilizam como
fonte de energia somente. O glicognio uma fonte de glicose que pode
ser liberada com muita rapidez, e por isso muito importante em atividades
extremas e repentinas.
Para ser utilizado, o glicognio deve ser quebrado. Isso ocorre em trs
etapas: a enzima glicognio fosforilase quebra as ligaes a-1,4 do glicog-
nio e a a-1,6 glicosidase quebra as ligaes a-1,6, que liberam, no meio, a
glicose-1-fosfato, posteriormente transformada em glicose-6-fosfato pela fos-
foglicomutase. A quebra do glicognio energeticamente vantajosa para a
clula, dado que a molcula de glicose formada j vem fosforilada. Isso ocorre
porque a quebra uma clivagem fosforoltica, na qual a enzima fosforila para
clivar o glicognio.
J a sntese do glicognio, ao contrrio do que se possa imaginar, no o
inverso de sua quebra. Para que o glicognio seja sintetizado, h necessidade
da presena de uridina difosfato glicose (UDP-glicose). A UDP-glicose fun-
ciona como um doador ativado de glicose na sntese do glicognio, quando
adicionada s extremidades das cadeias de glicognio pela ao da enzima
glicognio sintase. Essa enzima, porm, s capaz de adicionar essas subuni-
dades de glicose se a cadeia poliosdica contiver mais de quatro oses. Assim,
a sntese, bem como a duplicao do DNA, necessita de um primer.5 Quem
executa esse papel a glicogenina, uma protena que contm duas subunida-
des, cada uma delas ligada a um oligosdeo de unidades a-1,4 de glicose.
As ramificaes, ligaes a-1,6, so feitas por uma enzima ramificadora, e sua
importncia reside no fato de aumentarem a solubilidade do glicognio, alm
de criarem um grande nmero de radicais terminais, que so locais onde as
enzimas de degradao do glicognio agem. Para que no ocorram, ao mesmo
5
Molcula iniciadora.
tempo, a sntese e a degradao do glicognio, existe uma regulao hormonal

por glucagon e insulina ou, no msculo, por adrenalina. Quando a adrenali-
na aumenta, dispara a cascata de AMP cclico, que ativa a fosforilase quinase.
Essa fosforila a glicognio sintase, deixando-a inativa. Nesse momento, a que-
bra de glicognio prefervel. Isso tambm ocorre quando h um aumento de
glucagon. Na presena de insulina, a glicognio sintase desfosforilada por
uma fosfatase, tornando-se ativa e, assim, sintetizando glicognio.
O msculo utiliza glicognio em suas atividades (quando h necessidade
imediata de energia extra), e a quebra de glicognio nele independente
do estado alimentar do indivduo. J o fgado responsvel pela liberao
de glicose no sangue, e a sntese e a degradao do glicognio nesse rgo
esto diretamente ligadas presena ou no de glicose no sangue.
1.3.3.7 Gliconeognese
A gliconeognese o processo pelo qual h a transformao de compostos
no glicdicos (contendo no mximo trs carbonos) em glicose, processo que
ocorre nos animais, vegetais e em microrganismos. Nos mamferos, a gliconeo-
gnese ocorre principalmente no fgado e, em menor extenso, em clulas do
crtex renal.
Na via glicoltica, a transformao de glicose em piruvato tem papel funda-
mental na obteno final de energia. Na gliconeognese, ocorre a formao de
glicose a partir do piruvato. Apesar disso, essa via no o inverso da gliclise,
e enzimas diferentes participam dos processos na gliconeognese. Assim, mes-
mo que as duas vias apresentem reaes reversveis compartilhadas (sete das
dez reaes da gliconeognese so inverses das reaes da gliclise), sempre
haver um passo enzimtico exclusivo de cada uma delas. A estimulao de
uma via sempre gera inibio da outra, mesmo que seus controles sejam feitos
por enzimas distintas.
Existem trs reaes da gliconeognese que contornam os passos irrever-
sveis da gliclise (converso da glicose em glicose-6-fosfato, fosforilao da
frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bisfosfato e converso do fosfoenolpiruvato
em piruvato). Tais reaes so especficas dessa via e so responsveis por
sua regulao. Seguindo a via glicoltica em seu inverso, o primeiro passo que
Bioqumica | 75
deve ser contornado pela gliconeognese a formao de piruvato a partir do

fosfoenolpiruvato. Sua sntese se d pela ao da enzima piruvato quinase,
com concomitante formao de ATP. Como uma reao irreversvel, so
necessrias, na gliconeognese, participaes de novas enzimas para reverter a
converso.
O piruvato utilizado no incio da gliconeognese pode ser aquele formado
na gliclise no citoplasma. Em seguida, ele transportado para dentro da
mitocndria ou pode ser obtido na mitocndria por meio da desaminao
da alanina. A enzima piruvato descarboxilase, uma enzima mitocondrial que
requer a biotina como coenzima, converte, ento, o piruvato a oxaloacetato,
com concomitante formao de ADP e Pi. So dois os caminhos que o
oxaloacetato formado pode seguir. Ele pode ser convertido a malato pela ma-
lato desidrogenase, com consumo de NADH, e sair da mitocndria atravs
do transportador malato-a-cetoglutarato, presente na membrana mitocondrial
interna, sendo, no citoplasma, novamente reoxidado a oxaloacetato, com a
formao de NADH citoslico (processo essencial na manuteno do equi-
lbrio entre a produo e o consumo de NADH no citoplasma). Ou pode
ser convertido a fosfoenolpiruvato dentro da mitocndria, pela ao da enzima
fosfoenolpiruvato carboxiquinase, numa reao que necessita de Mg+2 e de
GTP, como doador de fosfato.
A prxima etapa irreversvel da gliclise que precisa ser contornada na
gliconeognese a fosforilao da frutose-6-fosfato pela fosfofrutoquinase 1
(PFK-1). Para contorn-la, novamente ocorre a ao de uma enzima espe-
cfica da gliconeognese, que no participa da via glicoltica. Nesse caso, a
formao de frutose-6-fosfato a partir de frutose-1,6-bisfosfato catalisada
pela enzima frutose-1,6-bifosfatase, que promove a hidrlise do fosfato do
carbono 1.
A ltima etapa irreversvel da gliclise a fosforilao da glicose em glicose-
6-fosfato pela hexoquinase. Essa fosforilao impede que a glicose saia da
clula. A gliconeognese tem como objetivo restaurar os nveis de glicose
sangunea e, por isso, extremamente necessrio que a glicose formada na
via seja liberada pela clula. Para tal, necessrio desfosforilar a glicose-6-
fosfato. Essa reao hidroltica catalisada pela glicose-6-fosfatase, numa
reao que gera glicose livre e um grupo fosfato. A glicose-6-fosfatase

encontrada nos hepatcitos e depende de Mg+2 como cofator. Ela no est
presente nos msculos ou no crebro, uma vez que a gliconeognese no
ocorre nesses tecidos. A glicose formada por essa via no fgado liberada no
sangue para ser utilizada pelo crebro e pelos msculos.
Como no se trata de uma via inversa via glicoltica, seu consumo
de ATP no o mesmo produzido nessa via. Na gliconeognese so
necessrios dois ATPs e dois GTPs para a formao de glicose; alm disso,
por ser uma via muito custosa ao organismo, ela irreversvel dentro das
condies intracelulares. Muitos outros intermedirios podem ser utilizados
para formar oxaloacetato e entrar na gliconeognese. Substncias do ciclo
de Krebs como o citrato, o isocitrato, o a-cetoglutarato, o succinato, o
fumarato e o malato podem ser convertidas a oxaloacetato, para posterior
formao de fosfoenolpiruvato. Alguns aminocidos, como a alanina e o
glutamato, tambm so capazes de ser convertidos em glicose; por isso, so
chamados de aminocidos glicognicos. Os cidos graxos no so capazes
de ser transformados diretamente em glicose pela gliconeognese, mas,
indiretamente, auxiliam a gliconeognese, dado que a oxidao dos cidos
graxos, quando liberados no jejum, fornece uma boa parte do ATP e NADH
necessrios para auxiliar energeticamente a gliconeognese.
A gliconeognese regulada em muitos pontos. A enzima piruvato car-
boxilase ativada pelo excesso de acetil-CoA, que indica estar a clula
produzindo energia e j no ser necessria a transformao da glicose em
ATP, podendo a glicose ser armazenada. Assim, a glicose pode ser produ-
zida pela gliconeognese para, posteriormente, ser armazenada na forma de
glicognio. Outro ponto de regulao a reao catalisada pela frutose-
1,6-bifosfatase, enzima ativada pela presena de ATP e citrato (produto da
condensao de oxaloacetato com a acetil-CoA). Esses produtos indicam
excesso de energia na clula e novamente a sntese de glicose preferida
para sua posterior armazenagem.
Grande parte do controle da glicose sangunea realizada pelo fgado.
Quando o nvel de glicose sangunea baixo, o hormnio glucagon sinaliza
ao fgado para que ele produza e libere mais glicose. O fgado faz isso esti-
Bioqumica | 77
mulando a quebra do glicognio armazenado e ativando a gliconeognese. O

processo contrrio tambm regulado pelo fgado: quando h alta concen-
trao de glicose no sangue, o hormnio insulina sinaliza a entrada da glicose
nas clulas, atravs de transportadores especficos, e ativa a via glicoltica para
a produo de energia.
1.3.3.8 Via das pentoses

A via das pentoses uma via alternativa de oxidao de glicose. Seu objetivo
gerar NADP+, que auxilia nas reaes de reduo que ocorrem na clula. O
NADP+ tambm responsvel pela manuteno do ferro em sua forma reduzida
(Fe+2) na hemoglobina. Caso o ferro no se encontre nessa forma, a hemoglo-
bina fica incapaz de transportar O2. O tripeptdeo glutationa garante que o
Fe+2 fique nessa forma, pois oxida o NADPH em NADP+.
O NADPH importante por direcionar as reaes de reduo no organis-
mo. Como as formas de obteno de energia se baseiam em oxidaes, para
que a energia seja armazenada, deve estar em sua forma reduzida. O NADPH
importante na biossntese de lipdios e na sntese de colesterol responsvel
pela fluidez das membranas e precursor de hormnios como a testosterona, o
estrognio e a progesterona.
A via das pentoses tambm gera as pentoses que sero utilizadas na snte-
se de DNA e de RNA (riboses). Em clulas tumorais e fibroblsticas, essa
via est superativa.
1.3.4 Metabolismo dos cidos graxos
Como mencionado anteriormente, os lipdios so molculas altamente

energticas que podem ser obtidos atravs da dieta ou por biossntese
celular. Existem diversas vantagens em se utilizar os lipdios como substrato
para obteno de energia. Por um lado, essas molculas so mais reduzidas
do que os carboidratos e, por meio das reaes de oxidao, geram mais
energia; por outro lado, o fato de serem molculas hidrofbicas permite
que o seu armazenamento no altere a osmolaridade dos fludos orgnicos
nem esteja associado a molculas de gua, como aquelas presentes nas

camadas de solvatao dos carboidratos. Para serem utilizados como fonte
de energia, os triglicerdeos sofrem primeiramente a ao de lpases, que
clivam a ligao ster, dando origem aos cidos graxos livres e ao glicerol.
Os carboidratos proporcionam uma fonte energtica que pode ser mais
rapidamente mobilizada; contudo, a maior parte da energia estocada no
organismo sob a forma de lipdios.
1.3.4.1 Sntese dos cidos graxos

Os lipdios desempenham um nmero muito grande de funes no orga-
nismo: participam da estrutura das membranas biolgicas, so precursores
de hormnios, so cofatores enzimticos, detergentes e mensageiros, alm
de serem estocados para a produo de energia. Por isso, importante que
o indivduo seja capaz de sintetiz-los. Como todas as reaes biossintti-
cas, a sntese de lipdios envolve reaes endergnicas e de carter redutor,
utilizando o ATP como fonte de energia e o NADPH como transportador
de eltrons.
A via de biossntese de cidos graxos no o inverso da b-oxidao, sen-
do catalisada por enzimas diferentes e em compartimentos distintos da clula.
A b-oxidao ocorre na mitocndria, ao passo que a biossntese de cidos
graxos ocorre no citoplasma. Alm disso, o intermedirio malonil-CoA parti-
cipa da biossntese, mas no da degradao, sendo importante na regulao
da b-oxidao.
Em uma primeira etapa da sntese de lipdios, o malonil-CoA sintetizado
pela ao da acetil-CoA carboxilase, a partir da condensao do bicarbonato
com uma molcula de acetil-CoA.
Na degradao, os transportadores de eltrons envolvidos so o NAD+ e
o FAD; na biossntese, o transportador o NADPH. No processo de snte-
se, todas as reaes so catalisadas por um complexo enzimtico, denominado
cido graxo sintase. Esse complexo enzimtico formado por protenas que
agem em conjunto, catalisando a formao de cidos graxos a partir de acetil-
CoA e malonil-CoA. Nesse complexo, uma protena carreadora de acila
Bioqumica | 79
(ACP) possui a fosfopantetena, que apresenta um SH livre como grupo

prosttico. Esse grupo prosttico responsvel por segurar a cadeia de cido
graxo em crescimento na superfcie do complexo proteico.
Inicialmente, os grupos acetil e malonil so ativados, ao se ligarem
ao grupo SH da ACP. O primeiro passo da biossntese aps a ativao
dos grupos acetil e malonil a condensao entre os dois, que forma um
grupo acetoacil ligado ACP e produz uma molcula de CO2. Essa reao
catalisada pela b-cetoacil-ACP sintase. A prxima reao a reduo do
grupo carbonila situado em C3 para formar D-b-hidroxibutiril-ACP, reao
que catalisada pela b-cetoacil-ACP redutase e que tem o NADPH como
doador de eltrons. Em seguida, ocorre uma desidratao para formar a trans-
D2-butenoil-ACP. A enzima que catalisa essa desidratao a b-hidroxiacil-
ACP desidratase. A ltima etapa a reduo da dupla ligao resultado da
desidratao, formando o butiril-ACP pela ao da enoil-ACP redutase,
sendo, novamente, o NADPH o doador de eltrons. A cada ciclo de
condensaoreduodesidrataoreduo, a cadeia de cido graxo
aumentada de dois carbonos. A sequncia de reaes se repete para formar o
palmitato, um cido graxo com 16 tomos de carbono. Aps a sua formao,
o palmitato liberado pela ao de uma atividade hidroltica que existe no
complexo enzimtico.
Nos vegetais, ocorre a sntese de alguns cidos graxos de cadeia maior,
como os de 18 carbonos. Nos animais, a sntese de cidos graxos ocorre prin-
cipalmente no citoplasma, ao passo que, nos vegetais, ocorre nos cloroplastos.
Figura 1.36. Ciclo de biossntese de um cido graxo.

1.3.4.2 b-oxidao
A oxidao de cidos graxos de cadeia longa uma via de grande
importncia na obteno de energia, dado que os eltrons liberados nas
reaes entram na fosforilao oxidativa para gerar ATP. Essa reao de
oxidao gera acetil-CoA, que tambm capaz de gerar energia, pois
completamente oxidada a CO2 no ciclo de Krebs.
O destino da acetil-CoA obtida na oxidao dos cidos graxos varia em
alguns organismos. Nos animais, ela convertida, pelo fgado, em corpos
cetnicos, que so combustveis solveis em meio aquoso, utilizados pelo
crebro e por outros tecidos quando no h glicose disponvel.
Os triglicerdeos so excelentes fontes de energia, pois so formados por
longas cadeias de hidrocarboneto, as quais so extremamente reduzidas e
possuem alta energia de oxidao.
A gordura utilizada na obteno de energia pode ser obtida de trs
formas: ingesto pela alimentao, mobilizao de gordura armazenada (nos
vertebrados, do tecido adiposo) e converso de carboidratos a cidos graxos
pelo fgado.
Os cidos graxos obtidos na alimentao so absorvidos no intestino e
transportados no sangue, ligados a protenas transportadoras. Eles podem ir
para os msculos, onde sero oxidados para a obteno de energia, ou para o
tecido adiposo, onde sero reesterificados e armazenados como triacilgliceris.
Os triacilgliceris tambm podem ser transportados para o fgado a fim de ser
utilizados na produo de corpos cetnicos.
Os hormnios sinalizam quando o organismo necessita de energia, e os
triacilgliceris armazenados no tecido adiposo so mobilizados e transportados
para os tecidos onde so necessrios. Quando ocorre baixa concentrao
de glicose sangunea, os hormnios epinefrina e glucagon estimulam essa
mobilizao. A epinefrina e o glucagon ativam uma cadeia de sinalizao
dentro do adipcito que leva ativao da enzima lpase de triacilgliceris
hormnio-sensvel. Essa enzima catalisa a hidrlise das ligaes steres dos
triacilgliceris, formando cidos graxos livres e glicerol. Por serem insolveis
em meio aquoso, os cidos graxos livres so transportados pelo sangue ligados
protena albumina. Por essa forma, so capazes de chegar aos tecidos que
Bioqumica | 81
necessitam de energia. O glicerol formado pela ao da lpase fosforilado

pela ao da glicerol quinase, formando glicerol-3-fosfato. Esse oxidado
diidroxiacetona fosfato e, posteriormente, isomerizado, pela ao da triose
fosfato isomerase, gliceraldedo-3-fosfato, que entra na cadeia glicoltica
para ser oxidado a piruvato.
A oxidao dos cidos graxos ocorre na matriz mitocondrial. Porm, os
cidos graxos livres que entram na clula so incapazes de passar para o
interior da mitocndria. Para que isso seja possvel, sofrem uma srie de
reaes, que os transforma em um acil-CoA, reao que ocorre na membrana
externa e que serve para ativar o cido graxo.
Na membrana interna, a carnitina aciltransferase I retira o grupo CoA
do acil, colocando a carnitina em seu lugar. Assim, o cido graxo atravessa a
membrana por meio de um transportador da carnitina. J na parte interna da
membrana, a enzima carnitina aciltransferase II retira a carnitina e recoloca o
grupo CoA. A carnitina retorna ao espao intermembranar pelo transportador.
Com isso, os conjuntos de CoA citosslico e mitocondrial no se misturam,
dado que o primeiro usado na biossntese de lipdios e o segundo, na
oxidao degradativa de cidos graxos, piruvato e aminocidos.
Uma vez dentro da mitocndria, o acil graxo est pronto para sofrer
oxidao. A oxidao mitocondrial dos cidos graxos ocorre em trs
etapas. No primeiro estgio, os cidos graxos de cadeia longa so oxidados
e sofrem remoo sucessiva de dois tomos da sua cadeia, formando vrias
unidades de acetil-CoA. Na segunda etapa, as molculas de acetil-CoA,
ao entrarem no ciclo de Krebs, so oxidadas CO2 e as molculas de
acetil-CoA obtidas na gliclise tambm tm o mesmo destino. Essa etapa
tambm gera NADH e FADH2, que, na terceira etapa, transferem seus
eltrons para a cadeia respiratria mitocondrial; com isso, os eltrons so
transferidos para o oxignio, ocorrendo tambm formao de ATP.
A formao de ATP se inicia a partir da desidrogenao para produzir uma
ligao entre os carbonos a e b (C2 e C3). Essa oxidao gera uma dupla
em configurao trans, o que incomum nos cidos graxos naturais. A enzima
responsvel por esse passo a acil-CoA desidrogenase, que contm o FAD
como grupo prosttico. Os eltrons produzidos na oxidao so transferidos
para o FAD, que logo os transfere para a ETFP (flavoprotena transportadora

de eltrons). A ETFP uma protena da membrana mitocondrial interna que
tambm participa como transportadora de eltrons da cadeia respiratria
essa transferncia de eltrons na primeira etapa da b-oxidao capaz de gerar
duas molculas de ATP. Em seguida, ocorre uma hidratao: uma molcula
de gua adicionada dupla ligao trans por meio da ao da enoil-CoA
hidratase. Nessa reao, forma-se uma 3-hidroxiacil-CoA, tambm chamada
L-b-hidroxiacil-CoA, pois h a formao do ismero L e a introduo da
hidroxila ocorre no carbono b carbono adjacente ao carbono ligado ao
grupo funcional. Posteriormente, o produto anterior desidrogenado e, pela
ao da b-hidroxiacil-CoA desidrogenase, forma-se a b-cetoacil-CoA.
Essa enzima utiliza o NAD+ como receptor de eltrons; alm disso, ela
tambm muito especfica para o ismero L. O NADH formado transfere
seus eltrons ao complexo I da cadeia respiratria para posterior sntese de
ATP. Na ltima etapa da oxidao dos cidos graxos, ocorre o rompimento
de duas unidades de carbono da molcula de cido graxo. Esse passo resulta
da ao da acil-CoA acetiltransferase, tambm conhecida como tiolase. Essa
enzima promove a reao entre a b-cetoacil-CoA e uma molcula de CoA,
reao que tem, como produtos finais, a acetil-CoA e o tioster da coenzima
A e do cido graxo original, diminudo de dois carbonos. Essas etapas se
repetem at a degradao total do cido graxo. As molculas de acetil-CoA
formadas nas etapas da b-oxidao podem ser totalmente oxidadas no ciclo
de Krebs, para posterior sntese de ATP.
Essas etapas ocorrem apenas em cidos graxos de cadeia simples. Porm,
comum a ocorrncia de cidos graxos com cadeia insaturada (ligaes duplas
cis). Para que possam ser metabolizados, ocorrem etapas adicionais que vo
variar no caso de cidos graxos mono ou poli-insaturados. Nos pontos da
molcula onde h ligaes simples, a b-oxidao ocorre normalmente. No
momento em que a reao chega a uma dupla ligao cis, que no pode sofrer
a ao da enoil-CoA hidratase, entram em ao as enzimas que participam
dessas duas etapas adicionais. Primeiramente, a enoil-CoA isomerase
transforma a ligao cis em trans, que convertida pela enoil-CoA hidratase
na L-b-hidroxiacil-CoA correspondente. Essa reao uma alternativa na
Bioqumica | 83
oxidao de cidos graxos monoinsaturados. No caso de cidos graxos

poli-insaturados, necessria a utilizao de outra enzima. Isso porque,
para a oxidao ocorrer, a ligao deve estar em posio trans e no cis.
Nos poli-insaturados, tambm h a ao da enoil-CoA isomerase na dupla
ligao mais prxima ao carbono a (carbono situado ao lado do carbono do
grupo funcional). Com isso, essa molcula sofre mais um ciclo de oxidao,
liberando uma molcula de acetil-CoA, alm de sofrer a primeira reao do
segundo ciclo de oxidao. A ao conjunta da 2,4-dienoil-CoA redutase
e, novamente, da enoil-CoA isomerase permite a mudana da configurao
das ligaes para que elas possam novamente entrar no ciclo de oxidao e
gerar acetil-CoA.
Essa primeira etapa na oxidao dos cidos graxos diferente para os
cidos graxos de cadeia par e para os cidos graxos de cadeia mpar. Apesar
de os cidos graxos de cadeia par serem mais comuns do que os de cadeia
mpar, tambm possvel encontrar como fonte de lipdios os de cadeia mpar.
Os cidos graxos de cadeia mpar so, inicialmente, oxidados da mesma
forma que os cidos graxos de cadeia par; nas ltimas reaes, porm, haver
um acil-CoA graxo de cinco carbonos. Quando ele clivado novamente,
forma-se acetil-CoA e propionil-CoA. A acetil-CoA prontamente utilizada
pelo ciclo de Krebs, mas o propionil-CoA no. Ele necessita de uma via
particular para a sua oxidao total.
Nessa via, o propionil-CoA primeiramente carboxilado, formando o
ismero D-metilmalonil-CoA pela ao da propionil-CoA carboxilase.
O produto formado ento epimerizado ao ismero L pela metilmalonil-
CoA epimerase e, em seguida, sofre um rearranjo intramolecular, formando
o succinil-CoA, que pode, agora, participar do ciclo de Krebs. Essa reao
catalisada pela metilmalonil-CoA mutase, que possui como cofator a
desoxiadenosilcobalamina coenzima B12, derivada da vitamina B12.
O acil-CoA graxo formado no citoplasma das clulas pode entrar na
mitocndria para ser oxidado na via da b-oxidao ou ser transformado em
triacilglicerol e fosfolipdio por enzimas do citoplasma. O que regula a oxidao
a velocidade com que esses acil-CoA graxos entram na mitocndria. Um
excesso de malonil-CoA, primeiro intermedirio da biossntese dos cidos
graxos, aumenta sempre que o nvel de glicose no sangue est alto, pois
o excesso de glicose no metabolizado ou no convertido em glicognio
transformado em cidos graxos para posterior estocagem. O malonil-CoA
inibe a carnitina acil transferase I, enzima responsvel pela entrada desses acil-
CoA graxos na mitocndria para serem oxidados, diminuindo a degradao
de lipdios pelo organismo.
A b-oxidao tambm ocorre nos peroxissomos. Ela necessria na
sntese de perxido de hidrognio (H2O2). Nos humanos e na maioria dos
mamferos, a acetil-CoA formada na b-oxidao possui outra via distinta alm
do ciclo de Krebs. Ela pode ser convertida aos chamados corpos cetnicos
(acetoacetato, D-b-hidroxibutirato e acetona), que servem como combustvel
para outros tecidos e que so oxidados pelo ciclo de Krebs para fornecer
energia. Os tecidos que mais utilizam os corpos cetnicos so os msculos
esquelticos, cardaco e o crtex renal. O crebro, quando em baixa de glicose,
pode utilizar os corpos cetnicos como energia alternativa; essa, porm, no
a melhor forma de obteno de energia para esse rgo. A acetona o nico
corpo cetnico que expelido na respirao e no utilizado como fonte de
energia. A produo de corpos cetnicos estimulada em situaes de jejum
severo e de diabetes no controlado.
1.3.5 Metabolismo das protenas
As protenas so constantemente produzidas e degradadas. Sua sntese e

degradao dependem das necessidades das clulas. Um maquinrio celular
imenso est diretamente relacionado com o metabolismo proteico. Estima-se
que cerca de 400 g de protenas sejam renovadas por dia em um ser humano
adulto. A quantidade ideal de determinada protena no organismo mantida
pelo balano perfeito entre a sua sntese e a sua degradao.
1.3.5.1 Sntese proteica

As protenas so as principais estruturas celulares; elas participam de to-
das as atividades celulares. Sua sntese se d no citoplasma, e as estruturas
Bioqumica | 85
responsveis por esse processo so os ribossomos. Na sntese proteica, esto

envolvidas muitas protenas, enzimas, RNAs e o prprio DNA. As protenas
so formadas com base em moldes diretos do DNA, que so levados ao
citoplasma atravs do RNA.6
Aps a sua sntese, as protenas podem sofrer modificaes a fim de exerce-
rem suas funes. Tais modificaes, chamadas modificaes ps-traducionais,
incluem, entre outras, a adio de acares, de lipdios e de grupos prost-
ticos, e a formao de pontes dissulfeto. Cada modificao ser especfica e
auxiliar a protena a exercer a funo qual se destina.
1.3.5.2 Degradao proteica

A degradao de protenas um processo constante na clula. Protenas
defeituosas ou com tempo de vida curto so degradadas a cada momento.
o processo de degradao que regula o tempo de vida de uma protena. Nos
eucariotos, com exceo de algumas protenas como a hemoglobina, que
est presente durante todo o perodo de vida de uma hemcia , as protenas
se degradam muito rapidamente.
As protenas defeituosas e com tempo de vida curto so degradadas por
sistemas dependentes de ATP, ao passo que as protenas de membrana, extra-
celulares e com tempo de vida longo so degradadas nos lisossomos.
Nos procariotos, o sistema de degradao dependente de ATP , na
realidade, uma enzima, denominada La, que ativada somente em presena
das protenas a serem degradadas. J nos eucariotos, essa via de degradao
bem diferente. Nela, h a presena da protena ubiquitina, que se liga covalen-
temente, com o auxlio de outras enzimas, protena a ser degradada, em um
processo denominado ubiquitinao. Essa ligao ocasiona o direcionamento
dessa enzima para a protelise.
1.3.6 Integrao do metabolismo
O metabolismo na clula regulado pela ao das enzimas, pela

disponibilidade de substratos e por modificaes nas enzimas. Quando
6
Mais detalhes sobre a sntese proteica so encontrados no captulo 2 deste volume, Biologia
molecular.
pensamos em um organismo complexo multicelular, o mecanismo de regulao

muito complicado. No corpo humano existem vrios tecidos, formados por
diferentes tipos celulares. Tais tecidos participam da formao dos rgos do
corpo, os quais exercem funes muito distintas. O corao e os msculos
so capazes de se contrair; o crebro capaz de passar informaes por meio
de pulsos eltricos; e o fgado o principal responsvel pela degradao de
substncias e pelo armazenamento de glicose sob a forma de glicognio.
No organismo, os hormnios so os responsveis pela transmisso de
informao entre os diferentes rgos; so eles tambm que organizam as
atividades metablicas de cada tecido.
O metabolismo dos mamferos comea no momento da alimentao. A
digesto quebra as macromolculas obtidas na alimentao em molculas
menores, que podem ser absorvidas no trato gastrointestinal. Os carboidratos,
protenas e lipdios quebrados e absorvidos passam para o sangue. Os
aminocidos e os acares so principalmente enviados para o fgado; j os
triglicerdeos entram no tecido adiposo. As necessidades dos rgos variam
muito, e o fgado o responsvel por suprir a demanda de cada um deles.
A glicose absorvida no intestino entra no fgado e fosforilada pela
hexoquinase, formando a glicose-6-fosfato. A partir da, ela entra na via
glicoltica e em seguida, no ciclo de Krebs, e os eltrons obtidos nessas vias
chegam cadeia respiratria, onde ocorre a produo de ATP.
Os nveis de glicose sangunea so sinalizados para o fgado mediante
informaes hormonais. Quando a glicose est em alta concentrao, o hormnio
insulina ativa a sua entrada no fgado, levando-a para as vias metablicas
que culminam na formao de ATP. Assim que as necessidades energticas
so supridas, o excesso de glicose convertido em glicognio pelo fgado,
onde o glicognio ficar armazenado. A glicose tambm pode ser convertida
para a sntese de lipdios aps a sua entrada na via glicoltica, e a posterior
transformao, pela ao da desidrogenase pirvica, do piruvato formado
em acetil-CoA, criando lipdios que sero posteriormente armazenados no
tecido adiposo. Essa forma de armazenamento no to disponvel quanto o
glicognio, mas importante em momentos de alta demanda energtica e em
jejuns de longo perodo. O excesso de glicose tambm pode ser desviado
Bioqumica | 87
para a via das pentoses-fosfato, responsvel pela gerao de NADPH, um

carreador de eltrons na biossntese de lipdios e de cidos nucleicos.
Quando o nvel de glicose sangunea est baixo, entra em ao o glucagon,
que estimula a quebra de glicognio heptico para suprir as demandas de
glicose de outros rgos. Alm disso, a prpria glicose-6-fosfato, presente
ainda no citoplasma da clula, pode ser desfosforilada pela glicose-6-fosfatase
a fim de liberar a glicose, cuja concentrao deve ser mantida em 4 mM,
novamente no sangue. Como mencionado, o crebro funciona somente com
glicose, podendo, em situaes muito extremas, utilizar os corpos cetnicos
produzidos na gliconeognese como fonte de energia. Na gliconeognese, o
organismo obtm glicose por meio de precursores no glicdicos.
J os aminocidos que so captados pelas clulas aps a degradao das
protenas da alimentao possuem vrias rotas metablicas importantes: so pre-
cursores para a biossntese de protenas no fgado e participam da sntese
proteica em todos os tecidos e da biossntese de nucleotdeos; alm disso,
podem ser desaminados e degradados para produzir acetil-CoA, composto
que pode entrar no ciclo de Krebs e produzir energia. Os intermedirios des-
se ciclo podem ser convertidos glicose pela via gliconeognica.
Os cidos graxos tambm possuem diferentes caminhos metablicos. Podem
ser oxidados para formar acetil-CoA e produzir ATP, alm de NADH. A
produo em excesso de acetil-CoA pode formar corpos cetnicos que so
capazes de suprir a energia de determinados rgos no jejum. Alm disso,
parte da acetil-CoA produzida desviada para a biossntese de colesterol,
necessrio na sntese das membranas plasmticas.
Em momentos de longo jejum (durante o sono) ou de desnutrio, o
glicognio armazenado no fgado e nos msculos sofre depleo. Assim, a
produo de glucagon estimulada, levando mobilizao dos triacilgliceris,
que funcionaro como combustveis primrios para os msculos e o fgado. Para
fornecer glicose ao crebro, o fgado degrada protenas cujos grupos aminos
so degradados e seus corpos carbnicos, utilizados na gliconeognese. O
fgado tambm utiliza os cidos graxos para isso.
O metabolismo do corpo humano todo mobilizado e dependente
da situao energtica do organismo. As alteraes das taxas de glicose
sangunea so responsveis por estmulos hormonais que controlam todas as

vias metablicas do corpo. As doenas que alteram o controle hormonal
como o diabetes podem causar grandes alteraes metablicas no organismo
e devem ser cuidadosamente controladas. O diabetes, deficincia na secreo
ou ao da insulina, uma doena muito comum e que decorre da m-
alimentao, com excesso de doces e massas, podendo ser fatal quando
no tratada. Seus principais sintomas so sede excessiva, mico frequente e
superproduo de corpos cetnicos, alm de acidose decorrente da grande
formao de cidos carboxlicos, que se ionizam e acidificam o sangue,
condio que pode ser fatal ao paciente. O diabetes no tem cura, mas pode
ser controlado com remdios ou injees subcutneas de insulina.
Figura 1.37.Integrao do metabolismo.

Bioqumica | 89
1.4 Bioqumica clnica
Com a evoluo constante das tcnicas bioqumicas, os ensaios tornam-se

ultrapassados e precisam ser reformulados para alcanar os objetivos inerentes
ao processo de modernizao. Por esse motivo, abordam-se, neste item, algu-
mas tcnicas de anlise bioqumica, sem deixar de lado os conceitos bsicos
necessrios compreenso de cada uma delas.
Inicialmente, importante esclarecer que uma anlise bioqumica sofre
influncia e interferncia de certos fatores, que podem comprometer a
qualidade do resultado final. Dentro eles, esto o jejum e a dieta, o uso
de medicamentos/drogas, o tabagismo, o consumo de bebidas alcolicas, o
estado fsico e emocional do paciente, a coleta das amostras, a hemlise e as
condies de armazenamento e transporte das amostras. No quadro 1.6 esto
relacionados alguns fatores que podem interferir no resultado analtico de um
exame bioqumico.
Quadro 1.6. Fatores que interferem e/ou influenciam

nos exames laboratoriais.
Variveis do paciente Variveis da amostra
dieta
drogas/medicamentos turvao/lipemia
raa hemlise (causa fisiolgica e/ou mecnica)
exerccios fsicos ictercia
tabaco (fumo) jejum
sexo condies de transporte e armazenamento
idade anticoagulantes
fase do ciclo menstrual sangue venoso ou capilar
menopausa contaminaes bacteriolgicas
estresse
Jejum
Uma dvida bastante frequente ao se realizar um exame laboratorial
quanto obrigatoriedade ou no do jejum, e sua durao.
Para anlises bioqumicas, como a dosagem da glicose, testes
de tolerncia glicose, d-xilose, lactose etc. , perfil lipdico
tambm chamado lipidograma , ferro e capacidade de fixao do
ferro, vitamina B12, entre outros, o jejum recomendado para a
anlise adequada. No caso da dosagem de triglicerdeos, no devem
ser ingeridos alimentos por um perodo mnimo de 12 horas, a fim
de evitar valores falsamente alterados. O aumento nos triglicerdeos
normalmente altera o aspecto do soro, tornando-o opalescente (soro
lipmico), e essa condio interfere potencialmente no resultado de
vrias dosagens. Por sua vez, jejuns prolongados, em perodo superior
a 14 horas, podem influenciar as dosagens sricas. No caso dos
triglicerdeos, por exemplo, o jejum prolongado acarreta um resultado
falsamente diminudo. Nos dias que antecedem os exames, deve-
se manter a alimentao habitual, exceto para os testes em que
obrigatria uma dieta especial por exemplo, dosagem de oxalatos em
urina coletada num perodo de 24 horas. Mudanas alimentares bruscas
podem ocasionar alteraes na concentrao de alguns constituintes
plasmticos, dado que as alteraes permanecem aparentes mesmo
transcorridas 12 horas.
lcool e tabaco
O uso casual do lcool no exerce efeito significativo nos testes
laboratoriais, porm, dependendo da quantidade e frequncia em que
consumido, podem ocorrer vrias modificaes no metabolismo. O uso de
bebida alcolica diminui a glicose srica e aumenta o lactato plasmtico;
logo, no recomendado ingerir lcool de duas a quatro horas antes do
exame. J o tabaco composto por vrias substncias como nicotina,
piridina, cianeto, entre outras , e o seu consumo est associado a
alteraes, agudas ou crnicas, que tambm so influenciadas pelo sexo
e idade do paciente. As alteraes causadas pelo tabagismo crnico
Bioqumica | 91
incluem a elevao da atividade de vrias enzimas e lipoprotenas, assim

como o aumento das catecolaminas, glicose, cortisol, aldosterona e
cidos graxos livres.
Drogas (medicamentos, vitaminas etc.)

Diversas substncias podem interferir nos resultados das anlises
laboratoriais. importante que seja informado o uso de medicaes,
inclusive das no prescritas, como suplementos minerais e vitaminas. Altas
concentraes de vitamina C, por exemplo, podem elevar os resultados
das frutosaminas e do cido rico e provocar possveis alteraes na
creatinina srica. O uso de contraceptivos orais eleva os nveis sricos
de ferro, triglicerdeos, transaminase pirvica e gamaglutamil-transferase,
e diminui os nveis de albumina. Os medicamentos diurticos
frequentemente elevam a concentrao de sdio, o clcio e a glicose,
e diminuem o potssio.
Gravidez
Durante a gravidez, ocorrem diversas mudanas metablicas, de acordo
com o perodo gestacional, que promovem modificaes nos valores de
muitos exames. H mudanas na funo renal, que acarretam a elevao
dos nveis de filtrao glomerular e, consequentemente, uma maior
excreo de glicose, ureia, creatinina e protena. Em contrapartida, so
observadas diminuies no nvel srico dessas substncias.
Exerccio fsico
A atividade fsica influencia e interfere substancialmente no metabolismo
e, dependendo de sua intensidade e durao, muitas substncias podem
sofrer alteraes nas concentraes sanguneas e urinrias. Inicialmente,
ocorre aumento da concentrao de glicose e de insulina, que pode levar
a um quadro de hipoglicemia com a intensificao da atividade fsica.
As enzimas desidrogenase lctica (LDH), creatinofosfoquinase (CPK)
e aldolase so extremamente sensveis e se elevam com a realizao
de exerccios fsicos. Pode ocorrer tambm aumento de glicoprotenas,
transferrina, transaminases, ureia, creatinina e cido rico. possvel,

ainda, que as concentraes lipdicas, conforme o aprimoramento das
atividades fsicas, sofram alteraes, tais como reduo do colesterol
srico, da frao LDL-colesterol e dos triglicerdeos e aumento dos
valores de HDL-colesterol.
Hemlise
A ruptura da hemcia (hemlise) pode ser provocada por um
processo mecnico (traumatismo durante a puno venosa) ou por
questes fisiolgicas, seja em um processo natural de renovao da
clula vermelha ou como consequncia de doena, como a anemia
hemoltica. A hemlise causa elevao de bilirrubinas, transaminases,
fosfatase cida, LDH, magnsio e potssio, influenciando de modo
menos marcante na dosagem de protenas totais, fosfatase alcalina, ferro
e fsforo.
Transporte e preparo da amostra

Para realizar adequadamente o armazenamento e o transporte de amostras
biolgicas, so necessrios cuidados que garantam a preservao dos
analitos a serem pesquisados. As consequncias do preparo ou do
transporte inadequados podem variar desde a perda da amostra por
vazamento at alteraes na concentrao dos seus diferentes constituintes.
Valores de referncia
No so somente metodologias e equipamentos que influenciam nos
valores de referncia; o resultado de um exame pode ser influenciado
por diversos outros fatores, como variaes fisiolgicas, alimentares
e genticas, sexo, idade etc. Nem sempre tais variaes so consi-
deradas em um estudo populacional para a determinao de valores
referenciais. Normalmente, os valores de referncia so estabelecidos
aps o estudo de um grupo de indivduos sadios e expressam o que
foi observado em 95% da populao estudada e no na sua tota-
lidade. O que realidade para uma populao pode no ser para
Bioqumica | 93
outra. Portanto, necessrio considerar que os valores de referncia so

utilizados como orientao genrica, mas no devem ser considerados
um determinante para o que normal ou anormal.
1.4.1 Anlise de componentes glicdicos
A anlise de alguns componentes glicdicos indispensvel para o diagns-

tico do diabetes, independentemente de suas causas e dos diferentes quadros
clnicos.
1.4.1.1 Glicose (glicemia em jejum de 8 horas)

Vrios so os mtodos propostos para determinar o teor de glicose em uma
amostra. Inicialmente, utilizava-se o carter redutor da glicose. So exemplos
desses mtodos o Folin-Wu e o Somogyi-Nelson, ambos utilizando sais de co-
bre em meio alcalino. A grande problemtica dos testes que envolvem reaes
de oxidao-reduo o fato de que qualquer interferente com propriedades
redutoras, e no apenas a glicose, pode sofrer esse tipo de reao. Dessa for-
ma, tais mtodos no so especficos e, por esse motivo, so pouco utilizados.
Outros mtodos foram desenvolvidos nos quais a glicose reage direta-
mente com compostos orgnicos, como a anilina, a antrona e a ortotoluidina
(o-toluidina), essa ltima muito utilizada por fornecer resultados mais
confiveis. A reao se d entre o grupo aldedo da glicose com a o-toluidina
em meio cido, formando uma glicosamina e a base de Schiff correspondente,
responsvel pela colorao verde, cuja intensidade medida fotometricamente.
Posteriormente, mtodos envolvendo a ao de enzimas por exemplo,
glicose-oxidase e hexoquinase foram desenvolvidos e passaram a integrar
a prtica laboratorial. No mtodo que utiliza a glicose-oxidase, a glicose
sofre a ao dessa enzima, formando cido glicnico e gua oxigenada
(H2O2), a qual, na presena de uma peroxidase, se decompe em gua
(H2O) e oxignio (O2). O oxignio formado reage com substncias pre-
sentes no meio reacional e leva formao de um complexo de colorao
vermelho-cereja cuja intensidade, medida fotometricamente, diretamente
proporcional concentrao de glicose.
No quadro 1.7 esto relacionadas algumas causas do aumento e da redu-

o dos nveis de glicose no sangue.
Quadro 1.7. Causas para o aumento ou a diminuio

dos nveis de glicose no sangue.
Nveis aumentados Nveis diminudos
insulinomas
diabetes tumores extrapancreticos: fibromas,
sarcomas, hepatomas, mesoteliomas
hipertireoidismo
insuficincia adrenal (doena de
feocromocitoma Addison)
estresse hipotireoidismo
pancreatite aguda hipopituitarismo
drogas: atropina, cido desnutrio
acetilsaliclico (AAS), sndrome de m absoro
cido ascrbico, alcoolismo
diurticos, adrenalina,
dano heptico insuficincia cardaca
corticoides, dopamina,
severa, necrose heptica fulminante
estrognios, tiabendazol,
anticonvulsivantes, drogas: bloqueadores beta-
adrenrgicos, esteroides, anablicos,
contraceptivos orais
levodopa, anti-histamnicos, etanol,
inibidor da MAO, acetaminofen
importante salientar que a determinao do teor de glicose sangunea

deve ser realizada logo aps a coleta da amostra, num perodo mximo de
30 minutos, pois a glicose sangunea sofre destruio enzimtica (gliclise)
sob a ao das hemcias e dos leuccitos. Essa destruio ocorre a 37C
e at mesmo em refrigerao. Assim, deve-se centrifugar a amostra logo que
ocorra a retrao do cogulo; caso contrrio, coleta-se a amostra em fluoreto
de sdio (1 mg/mL de sangue), que age como conservante e inibe a gliclise.
O indivduo deve estar em jejum de pelo menos 8 horas; perodos superiores
a 14 horas, porm, podem conduzir a resultados abaixo dos valores reais.
Bioqumica | 95
1.4.1.2 Teste oral de tolerncia glicose

O diabetes pode ser antecedido por estgios com glicemia de jejum
inapropriada (entre 100 e 125 mg/dL) e/ou tolerncia glicose diminuda
(entre 140 e 200mg/dL, aps a administrao de 75g de glicose anidra). O
tempo de durao desses estgios varia, e pode haver reverso do quadro,
com normalizao do metabolismo glicdico. Em casos de glicemia de jejum
inapropriada, deve efetuar-se o teste oral de tolerncia glicose (TOTG),
que avalia a glicemia basal (glicemia de jejum) e, aps 120 minutos, a
sobrecarga glicdica adultos: ingesta de 75 g de glicose anidra; crianas:
1,75 g/kg de peso, no ultrapassando 75 g. No TOTG, a ingesta da soluo
de glicose deve ser realizada no mximo em 5 minutos, com jejum de 8 a 12
horas antes da coleta basal, e o indivduo deve estar em dieta sem restrio de
carboidratos durante pelo menos os trs dias que antecedam ao teste. Trata-
se de uma anlise utilizada na construo de um diagnstico especfico, no
sendo recomendada como exame de rotina, e que apresenta valores diferentes
conforme o estgio clnico do indivduo (quadro 1.8).
Quadro 1.8. Valores de referncia para os testes

envolvendo a anlise da glicose.
Teste
Estgio
Glicemia TOTG/glicemia aps
Glicemia de jejum (GJ)
aleatria (GA) 2 horas
menor ou igual a 140
Normal menor ou igual a 99 mg/dL
smg/dL
Intolerncia maior de 140 e
entre 100 e 125 mg/dL
glicmica menor de 200 mg/dL
GA maior ou
igual a 200 mg/
maior ou igual a 126 mg/ maior ou igual a 200
Diabetes dL associada
dL mg/dL
sintomatologia
clssica
1.4.1.3 Curva glicmica

A curva glicmica uma anlise de perfil glicdico muito realizada em ges-
tantes com o objetivo de controlar o diabetes gestacional, quadro que acarreta
complicaes fetais. Trata-se de um TOTG, porm com algumas diferenas.
Realiza-se a coleta de sangue basal (glicemia de jejum) e, aps a ingesto de
100 g de glicose anidra, efetuam-se outras trs coletas. Essas trs ltimas cole-
tas para determinao da glicemia so realizadas de hora em hora 60, 120
e 180 minutos aps a ingesta da sobrecarga glicdica. A presena de duas ou
mais glicemias acima dos valores apresentados no quadro 1.9 indicativa de
diabetes gestacional.
Quadro 1.9. Valores de referncia para a curva glicmica.

Hora da coleta Glicemia (mg/dL)
Glicemia de jejum 95
60 minutos 180
120 minutos 155
180 minutos 140
1.4.1.4 Hemoglobina glicosilada

Trata-se de uma hemoglobina que apresenta carboidratos, constituinte nor-
mal do sangue, em sua estrutura. Num primeiro momento, no foram identi-
ficadas as suas funes fisiolgicas especficas, porm os estudos realizados
puderam relacionar, nos indivduos diabticos, um aumento da hemoglobina
glicosilada (HG) no observado em no diabticos.
De modo lento e gradual, a hemoglobina glicosilada formada
em duas etapas, pela ligao da glicose com o N terminal da cadeia b
da hemoglobina, por meio de uma reao no enzimtica. Essa ligao
contnua e irreversvel, refletindo as concentraes mdias da glicose nos
dois a trs meses que precedem o exame. A dosagem da HG proporciona
monitoramento a longo prazo da glicose no sangue, visto que suas breves
alteraes no influenciam a taxa.
A anlise da HG se d por cromatografia, tcnica que permite a separao
da frao mais rpida (HG) da hemoglobina total (HT).
Bioqumica | 97
1.4.1.5 Glicose urinria

A glicosria, ou seja, presena de glicose na urina, geralmente ocorre quan-
do a glicose sangunea alcana valores em torno de 180 mg/dL. Porm, dis-
funes na taxa de filtrao glomerular, na taxa de reabsoro tubular e no
fluxo urinrio tambm podem influenciar o seu aparecimento. Outras situaes,
como infeces, queimaduras, doenas neurolgicas e uso de esteroides orais,
tambm podem provocar glicosria. Quando so analisadas amostras isoladas
de urina, a presena de glicose no est necessariamente relacionada com os
nveis de glicose sangunea, pois eles refletem momentos diferentes. Dessa for-
ma, indicado utilizar a urina coletada num perodo de 24 horas.
1.4.1.6 Frutose
A frutose a maior fonte de energia para os espermatozoides, e o principal
elemento da sua motilidade. A frutose produzida nas vesculas e ampolas
seminais a partir da glicose, atravs da via fosforilativa.
A dosagem de frutose realizada por meio do mtodo de Seliwanoff, no
qual pentoses e hexoses reagem com o resorcinol em pH cido e temperatura
elevada, originando um composto de colorao vermelha cuja intensidade
diretamente proporcional concentrao de frutose.
1.4.2 Anlise de componentes lipdicos
O perfil lipdico alterado encontra-se entre as causas de doena arterial

coronariana (DARC). Com isso, o estudo e a dosagem dos lipdios plas-
mticos ganharam inestimvel interesse clnico. Cerca de 80% dos casos
podem ser diagnosticados por uma simples interpretao dos nveis de co-
lesterol total, colesterol HDL e de triglicerdeos, associada avaliao do
aspecto do soro aps refrigerao, o que permite evidenciar opalescncia
ou a presena de quilomcrons. Um colesterol total elevado somado a um
valor de colesterol HDL baixo constitui um fator de risco independente para
o desenvolvimento de DARC.
importante salientar que, para avaliar e acompanhar corretamente o perfil
lipdico, a qualidade da amostra fundamental. A amostra deve ser coletada
mediante confirmao do jejum de 12 a 14 horas. No dia anterior ao da cole-
ta, o indivduo deve alimentar-se normalmente, evitando o consumo de lcool

e os exerccios fsicos. Deve ser evitada tambm a coleta em pessoas enfermas,
durante a fase aguda e nas trs semanas posteriores recuperao. Deve-se
avaliar sempre o uso de medicamentos.
1.4.2.1 Colesterol total

O colesterol total compreende todo o colesterol encontrado em vrias
lipoprotenas: cerca de 60% a 70% transportados pela LDL-lipoprotena;
20% a 35% pela HDL-lipoprotena; e 5% a 12% pela VLDL-lipopro-
tena. Um colesterol alto, maior ou igual a 240 mg/dL em adultos acima de
20 anos, ou maior ou igual a 200 mg/dL em crianas e adolescentes (de 2
a 19 anos) eleva o risco para DARC. Recomenda-se uma dieta estvel nas
trs semanas que antecedem a coleta. A postura anterior ao teste tambm
pode ser significativa (aps 20 minutos em repouso, os valores podem ficar
de 10% a 15% mais baixos).
Quadro 1.10. Possveis causas de alterao do teor de colesterol total.

abetalipoproteinemia
hipercolesterolemia primria, por hipertireoidismo
fatores alimentares ou ambientais
alguns casos de carcinoma, anemia
hipercolesterolemia secundria: sideroblstica e talassemia
pancreatite, hepatopatia
obstrutiva, sndrome nefrtica m absoro
alguns casos de diabetes mellitus m nutrio
hipotireoidismo leucemia mieloctica crnica
cirrose biliar primria metaplasia mieloide
gravidez mieloma
policitemia vera
Atualmente, a determinao dos nveis de colesterol total realizada por

meio de mtodos enzimticos colorimtricos, e, dependendo dos reagentes
utilizados, os valores de referncia variam. Os valores de referncia atualmente
Bioqumica | 99
considerados, que tm pequenas variaes relacionadas faixa etria, so

apresentados no quadro 1.11.
Quadro 1.11. Valores de referncia utilizados atualmente para o

colesterol total.
Colesterol Resultado
< 200 mg/dL desejvel
200 a 239 mg/dL limtrofe
240 mg/dL aumentado
1.4.2.2 Colesterol HDL (C-HDL)

A frao HDL (do ingls high density lipoprotein) do colesterol tem rela-
o inversa com o risco de doena coronariana: para cada 1 mg/dL de HDL
reduzido, o risco para DARC se eleva de 2% a 3%. Isso ocorre porque a
frao HDL est envolvida no chamado transporte reverso do colesterol a ser
metabolizado no fgado, onde ocorre a sua maior excreo.
Valores de C-HDL dependem de sexo e idade, e tendem a diminuir tem-
porariamente aps infarto agudo do miocrdio. Em doenas da tireoide, os
valores do C-HDL no devem ser usados como estimativa de risco de DARC,
pois no hipotireoidismo ocorre o aumento dos seus nveis e no hipertireoidis-
mo, a diminuio. A terapia de reposio hormonal em mulheres na menopau-
sa aumenta seus ndices, reduzindo o risco de DARC. Preconiza-se uma dieta
estvel nas trs semanas que antecedem a coleta. A variao individual para o
HDL de 3,6% a 12,4%.
Quadro 1.12. Valores de colesterol HDL em humanos.

Sexo Desejvel Mdio risco Alto risco
Masculino > 55 mg/dL 35 a 55 mg/dL < 35 mg/dL
Feminino > 65 mg/dL 45 a 65 mg/dL < 45 mg/dL
1.4.2.3 Colesterol LDL (C-LDL) e colesterol VLDL (C-VLDL)

A lipoprotena de baixa densidade LDL (do ingls low density lipoprotein)
a maior carreadora de colesterol no plasma. Seus valores esto associados
diretamente ao risco de desenvolver DARC. Vrios estudos mostram que o
risco de DARC tem maior correlao com os altos nveis de LDL do que com o
colesterol total. Sua dosagem tem servido como fator determinante para o incio
de terapias e dietas. Indivduos com nveis elevados de LDL (160 mg/dL)
possuem alto risco de desenvolver doena coronariana e devem ser tratados
para reduzir os nveis de colesterol. Indivduos com nveis entre 130 mg/dL
e 159 mg/dL (borderline) devem ser tratados caso possuam outros dois
fatores de risco para DARC.
A lipoprotena de muito baixa densidade VLDL (do ingls very low den-
sity lipoprotein) transporta triglicerdeos e colesterol sintetizados no fgado,
derivados provavelmente de precursores da dieta, como cidos graxos livres,
glicerol e carboidratos.
A determinao dos nveis de LDL e VLDL pode ser realizada por clculo,
de acordo com o procedimento-padro da frmula de Friedewald. Essa frmu-
la depende da exatido de trs dosagens diferentes (colesterol total, colesterol
HDL e triglicerdeos) e no pode ser usada quando os nveis de triglicerdeos
estiverem acima de 400 mg/dL, ou na presena de quilomcrons.
Atualmente, novas tcnicas, envolvendo antissoros policlonais em partculas
de ltex com afinidade para lipoprotenas especficas humanas, possibilitam
a dosagem, mesmo com nveis de triglicerdeos acima de 400 mg/dL, pois
removem HDL e VLDL da amostra.
O quadro 1.13 traz a relao entre os nveis de colesterol e suas fraes
com o risco de doena coronariana.
Bioqumica | 101
Quadro 1.13. Relao entre os nveis de colesterol e o risco

de doena coronariana.
Analito Valor desejvel Risco moderado Alto risco
Colesterol total < 200 mg/dL 200 a 239 mg/dL 240 mg/dL
LDL < 130 mg/dL 130 a 159 mg/dL 160 mg/dL
HDL (homens) > 55 mg/dL 35 a 55 mg/dL < 35 mg/dL
HDL (mulheres) > 65 mg/dL 45 a 65 mg/dL < 45 mg/dL
VLDL < 30 mg/dL 30 a 40 mg/dL > 40 mg/dL
Triglicerdeos < 150 mg/dL 150 a 200 mg/dL > 200 mg/dL
1.4.2.4 ndices de Castelli (I e II)

Alguns autores usam correlaes entre o colesterol srico total, o HDL e
o LDL como uma maneira de visualizar a influncia combinada de importan-
tes fatores de risco de doena coronariana. O ndice de Castelli I a razo
entre o colesterol total e o HDL e o ndice de Castelli II a razo entre o
LDL e o HDL.
ndice de Castelli I = [colesterol total] / [C-HDL]
ndice de Castelli II = [C-LDL] / [C-HDL]
1.4.2.5 Triglicerdeos
O aumento de triglicerdeos indicativo de distrbios no metabolismo
e, quando associado ao aumento do colesterol total, fator de risco para
DARC. A taxa de triglicerdeos sofre aumento em seus valores no diabetes
mellitus, na sndrome nefrtica, na pancreatite, em doenas coronarianas e na
arteriosclerose. Valores acima de 2.000 mg/dL aumentam o risco de pancrea-
tite aguda. Alguns medicamentos, como a prednisona, podem elevar os nveis
sricos dos triglicerdeos. necessrio jejum de 12 a 14 horas para realizar a
dosagem de triglicerdeos, alm de dieta estvel durante as trs semanas que
antecedem a coleta e absteno de lcool por trs dias. Se possvel e apenas

com orientao mdica, suspender drogas que possam afetar as concentraes
de triglicerdeos no sangue.
Os nveis de triglicerdeos podem estar diminudos por interferncia de
substncias com o glucagon e a heparina endovenosa. Ocorre aumento dos
nveis de triglicerdeos pela interferncia bacteriana, tabagismo, consumo de
lcool e administrao de estrgenos. Outras causas de aumento da concentra-
o de triglicerdeos so cirrose heptica, diabetes mellitus, sndrome nefrtica
e hiperlipidemia essencial.
1.4.3 Anlise de componentes nitrogenados
1.4.3.1 cido rico

O cido rico o produto final do catabolismo das purinas. Seus nveis
sricos esto diretamente relacionados com a velocidade de sua formao e
so inversamente proporcionais capacidade e velocidade de sua excreo.
Outros fatores, como predisposio gentica, sexo, idade, peso corporal,
ingesto de lcool, raa, diabetes, dislipidemia, dieta e uso de medicamentos,
tambm exercem influncia sobre os seus nveis sricos. Tanto a hiperuricemia
aumento dos nveis sricos de cido rico quanto a hipouricemia reduo
dos nveis sricos de cido rico podem ser provocadas por diversas causas,
relacionadas no quadro 1.14.
excretado por via urinria e, por ser o produto final do metabolismo dos
compostos purnicos derivados de nucleoprotenas exgenas e endgenas, sua
excreo est relacionada com a ingesta e o catabolismo das nucleoprotenas.
O cido rico urinrio analisado a partir de uma amostra de urina coletada
num perodo de 24 horas e, por sofrer influncia de diversas drogas como
aspirina, warfarina, vitamina C e diurticos , o uso de qualquer medicao
deve ser informado ao entregar a amostra para anlise. A hiperuricosria (au-
mento dos nveis de cido rico na urina) pode ser causada por gota aguda,
anemias hemolticas, leucemias, defeito tubular renal, dieta rica em purinas,
Bioqumica | 103
uso de diurticos e drogas uricosricas, tratamento com quimioterpicos e

radioterpicos. J a hipouricosria (reduo do cido rico urinrio) obser-
vada na gota crnica e em indivduos com uma dieta pobre em purinas.
Quadro 1.14. Causas de aumento ou diminuio dos

nveis sricos de cido rico.
Hiperuricemia Hipouricemia
aumento da produo: aumento da velocidade de
alteraes enzimticas por excreo: defeito da reabsoro
exemplo, deficincia de glicose- tubular, carcinoma de pulmo,
6-fosfato. leucemia mieloide aguda.
aumento do metabolismo das aumento da secreo
nucleoprotenas: leucemias, tubular: hiperparatireoidismo,
anemias hemolticas, policitemia, hipervolemia.
anemia perniciosa, quimioterapia,
neoplasias, psorase, drogas (efeitos hiper ou
mononucleose infecciosa. hiporicos, dependendo da
dose): aspirina, fenilbutazona,
diminuio da velocidade probenecida, salicilatos,
de excreo: alteraes tiazdicos e warfarina .
da funo renal, jejum
prolongado, intoxicao por diminuio da produo: dieta
chumbo, hiperparatireoidismo, pobre em purinas, deficincia de
hipercalcemia, dieta/perda de adenosina desaminase, porfiria
peso, exerccio muscular intenso, intermitente aguda, inibidores
acidose lctica, drogas (efeitos da xantina oxidase, alopurinol
hiper ou hiporicos, dependendo e sndrome paraneoplsica
da dose), tiazdicos, furosemida (adenocarcinoma metasttico
e salicilatos. de pulmo).
1.4.3.2 Creatinina
A creatinina um produto metablico formado pela descarboxilao da
creatina-fosfato no msculo. Assim, possui relao direta com a massa muscular.
Homens e atletas produzem maiores quantidades de creatinina do que crianas,
idosos e mulheres. Deve-se considerar a perda de massa muscular no idoso na

interpretao dos resultados. Geralmente, a creatinina no afetada pela dieta,
porm, se houver aumento excessivo na ingesta de carnes, os seus nveis sricos
podero sofrer aumento por um perodo de 48 horas. A reduo do fluxo
sanguneo renal promove a elevao da creatinina, porm de forma mais lenta do
que a ureia. De modo geral, a concentrao de creatinina s comea a se elevar
quando a velocidade de filtrao glomerular menor do que 75 mL/min.
Os nveis sricos da creatinina encontram-se aumentados em casos de
insuficincia cardaca congestiva, choque, desidratao, glomerulopatias,
obstruo do trato urinrio, intoxicao por metanol, uso de metildopa,
trimetoprim, hidantona, cefalosporinas e vitamina C. Baixas concentraes
sricas so observadas nos casos de desnutrio, diminuio da massa muscular,
doena heptica severa e processo gestacional.
A creatinina livremente filtrada pelos glomrulos e excretada constante-
mente. A determinao da creatinina urinria (mg/kg em 24 horas) um par-
metro indicativo do volume correto da urina colhida durante um dia inteiro. A
secreo tubular da creatinina pode ser inibida por drogas, como cimetidina,
trimetoprim e probenecida. A creatinina urinria avaliada laboratorialmente
em conjunto com a determinao da creatinina srica, e o resultado dessa ava-
liao importante nos casos de insuficincia renal aguda ou crnica.
Exerccios severos e ingesto de altas quantidades de carne podem provo-
car aumentos significativos na excreo de creatinina; j a diminuio da massa
muscular nos idosos provoca a diminuio na excreo.
Clearance de creatinina
o ndice de depurao renal de creatinina que avalia o nvel de filtra-
o glomerular. Quando comparado avaliao dos nveis sricos de
ureia e creatinina isolados, esse ndice possibilita um diagnstico mais
precoce de alterao da funo renal. As provas de depurao exigem
um controle rgido dos tempos e da coleta de urina, sem perda do vo-
lume urinrio. So tecnicamente rigorosas, exigindo dosagens simultneas
da creatinina no soro e na urina, e a correo da superfcie corporal do
paciente pela superfcie corporal-padro.
Bioqumica | 105
A velocidade de filtrao glomerular encontra-se elevada durante a

gravidez; do mesmo modo, exerccios fsicos tambm podem elevar o
clearance de creatinina. Alm disso, drogas como trimetoprim, cimetidina
e probenecida interferem na excreo desse analito.
Para o clearance, o mtodo mais utilizado o mtodo de Jaff, baseado
na reao entre a creatinina presente na amostra e o picrato alcalino. O
produto formado, o cido picrmico, possui colorao alaranjada, medida
fotometricamente.
1.4.3.3 Ureia
A ureia o metablito quantitativamente mais importante do catabolismo
proteico e da desaminao dos aminocidos ciclo da ornitina, que libera
NH2-amonaco. a principal fonte de excreo do nitrognio nos seres hu-
manos e compreende de 80% a 90% do nitrognio urinrio total excretado.
Produzida no fgado, passa para a circulao sangunea, onde degradada e
eliminada pelo suor, pelo trato gastrointestinal e pelo rim. filtrada livremente
pelos glomrulos e, dependendo do estado de hidratao do indivduo, entre
40% a 80% de seu volume sofrem reabsoro tubular. Sua concentrao
varia em indivduos sadios, sendo influenciada por diversos fatores, como grau
de hidratao, dieta proteica e funo renal. utilizada para avaliar o estado
do funcionamento renal e, em conjunto com a creatinina plasmtica, sua dosa-
gem auxilia na diferenciao entre a azotemia pr e ps-renal. A designao
azotemia denomina qualquer aumento significativo na concentrao srica de
componentes nitrogenados no proteicos, principalmente ureia e creatinina, e
classificada como pr-renal, renal e ps-renal.
Em comparao com a creatinina, a ureia sofre maior variao com a
dieta, eleva-se mais precocemente nos casos de insuficincia renal e no
influenciada pela massa muscular. Glicocorticoides e hormnios tireoidianos
(que exercem efeito catablico proteico) tendem a aument-la, ao passo que
andrognios e hormnio de crescimento, por causa de seus efeitos anabli-
cos, diminuem sua formao.
Algumas condies em que a ureia pode estar aumentada ou diminuda no
organismo encontram-se listadas no quadro 1.15.
Quadro 1.15. Causas de aumento ou diminuio dos nveis

de ureia no organismo.
pr-renal: reduo da circulao renal,
desidratao, reduo do volume
ingesta proteica
sanguneo (hemorragias digestivas),
diminuda
catabolismo proteico aumentado (febre,
estresse), insuficincia cardaca. insuficincia heptica
aguda
renal: diminuio da filtrao glomerular
causada por doena renal aguda ou gravidez
crnica, nefropatias, tratamento com diluio sangunea
glicocorticoides (efeito antianablico).
infncia
ps-renal: obstruo do trato urinrio
(clculo, obstruo prosttica).
A dosagem de ureia urinria utilizada na avaliao dos compostos urin-

rios nitrogenados no proteicos e na medida da taxa de produo de ureia.
Como a sua produo depende de inmeras variveis no renais, como dieta
e sntese heptica, o clearance de ureia tem pouca utilidade como medida da
taxa de filtrao glomerular, pois pode subestim-la. A ureia urinria encontra-
se aumentada quando ocorre aumento do catabolismo proteico, nas dietas
hiperproteicas e no hipertireoidismo. Seus nveis encontram-se diminudos nos
casos de dietas pobres em protenas, na insuficincia heptica, na insuficincia
renal, na gravidez e na obstruo do trato urinrio.
Um dos mtodos utilizados para a anlise da concentrao de ureia o
mtodo da diacetilmonoxima. Nele, ocorre a reao da ureia com a diacetil-
monoxima, na presena de tiossemicarbazida, em meio cido, para formar um
produto colorido, que pode ser medido fotometricamente e proporcional
concentrao de ureia.
Um mtodo enzimtico tambm utilizado para esse fim o mtodo da urease.
Nele, a ureia sofre a ao da enzima urease e converte-se em dixido de carbono
e amnia. Essa reage com o fenol e o hipoclorito alcalino, sob a ao cataltica do
Bioqumica | 107
nitroprussiato, para formar o azul de indofenol. A intensidade da colorao formada

proporcional concentrao de ureia e pode ser medida fotometricamente.
1.4.3.4 Mucoprotenas
A mucoprotena uma glicoprotena tpica das secrees mucosas, com
contedo superior a 4% de hexosamina. Denominada inicialmente seromucoide,
aps estudos realizados por Winzler e colaboradores (Winzler et al., 1948)
passou a ser tambm conhecida como mucoprotena, baseando-se em sua
capacidade de permanecer em soluo de cido perclrico 0,6 M, enquanto
outras glicoprotenas precipitam. Seus nveis esto consideravelmente aumentados
nos processos inflamatrios agudos e ela um importante ndice da atividade
reumtica, pois se mantm elevada quando outras provas j se normalizaram.
Nveis reduzidos so observados em casos de insuficincia heptica hepatite
aguda, cirrose , insuficincia da suprarrenal e insuficincia hipofisria.
Para a anlise de mucoprotenas, o mtodo mais utilizado o mtodo de
Winzler, que envolve a desproteinizao da amostra com cido perclrico. As
mucoprotenas permanecem em soluo e so posteriormente precipitadas pela
ao do cido fosfotngstico, sendo quantificadas com a utilizao do reagente
de Folin-Ciocalteu.
1.4.3.5 Protenas totais e fraes

As protenas so compostas por aminocidos e so sintetizadas no fgado
e no sistema reticuloendotelial. So essenciais para a manuteno da presso
osmtica e tm diversas funes no organismo, incluindo ao enzimtica,
autoimune e hormonal, e fatores de coagulao e de transporte, por meio
de suas ligaes no sangue com substncias hormonais ou no hormonais.
Sua dosagem utilizada como parmetro para avaliar o estado nutricional do
indivduo e a presena de doenas sistmicas severas. Seus ndices podem estar
reduzidos (hipoproteinemia) em casos de deficincias nutricionais, infeces
graves e prolongadas, defeito de sntese (insuficincia hepatocelular),
anemias graves e perdas cutneas (queimaduras).
Na urina, normalmente no so detectadas protenas ou so detectadas em
baixas quantidades (at 150 mg em 24 horas). So principalmente protenas
sricas de baixo peso molecular, filtradas de forma seletiva pelos glomrulos

(por exemplo, albumina). Somente as protenas de baixo peso molecular so
pequenas o suficiente para atravessar a membrana e alcanar o filtrado glome-
rular, sendo grande parte delas reabsorvida pelos tbulos renais.
Por sua predominncia srica, a albumina a principal frao proteica en-
contrada na urina normal. Outras protenas, tambm de baixo peso molecular,
so detectadas em menores quantidades, como algumas fraes da globulina.
As principais causas patolgicas para a proteinria (presena de albumina na
urina) so leso glomerular, distrbios da reabsoro tubular e aumento dos
nveis sricos de protenas de baixo peso molecular. Conforme a gravidade,
uma leso glomerular pode ou no levar perda de seletividade, permitindo
a passagem de protenas de alto peso molecular. Quando a proteinria de-
corrente de defeitos na reabsoro tubular (por exemplo, mieloma mltiplo),
as protenas presentes na urina tm baixo peso molecular.
A velocidade de excreo das protenas varia em 24 horas. Assim sendo,
para uma melhor avaliao, o teste deve ser feito em uma amostra de urina
coletada num perodo de 24 horas. A determinao da proteinria de 24
horas til no diagnstico e no controle de diversas patologias em que ocorre
perda de protenas, como sndrome nefrtica, intoxicao por metais e lpus
eritematoso sistmico. Indivduos com diabetes mellitus correm maior risco de
sofrer dano renal e, por esse motivo, o aumento subclnico da excreo da
albumina urinria tido como preditivo de nefropatia diabtica. Reaes falso
positivas ocorrem ocasionalmente por causa do uso de salicilatos, contrastes
radiolgicos e doses macias de penicilinas.
Um dos mtodos mais utilizados para a dosagem de protenas o mtodo
do biureto. Nesse mtodo, ocorre a reao entre os compostos com mais de
duas ligaes peptdicas presentes na amostra com ons de cobre (Cu+2) em
meio alcalino, gerando um complexo de cor violeta. A intensidade da cor
formada medida fotometricamente.
Albumina
A dosagem dos nveis de albumina auxilia na avaliao do estado nutri-
cional, da sntese heptica e da perda renal do paciente. ndices abaixo
Bioqumica | 109
de 1,5 g/dL so considerados alarmantes; em casos de edema, os nveis

sricos da albumina encontram-se entre 2 g/dL e 2,5 g/dL. Com a ida-
de, gradativamente ocorre o decrscimo de seus nveis. O aumento dos
seus nveis registrado nos quadros de desidratao vmitos e diarreias
graves e em casos de uso excessivo de diurticos. A reduo de seus
nveis ocorre nos casos de queimaduras graves, sndrome nefrtica, des-
nutrio, hepatopatias, neoplasias, estado gestacional, alcoolismo crnico
e uso de anticoncepcionais.
Para a anlise da albumina, utiliza-se o mtodo do verde de bromo-
cresol, mtodo que envolve uma reao, em meio tamponado, entre a
albumina e o reagente verde de bromocresol, gerando um composto de
colorao verde, medida fotometricamente.
1.4.3.6 Bilirrubinas sricas

A bilirrubina proveniente da quebra da hemoglobina. formada pelo
sistema reticuloendotelial e circula no sangue ligada albumina, sob a forma
de frao no conjugada. A frao no conjugada da bilirrubina chega ao
fgado e sofre conjugao com o cido glicurnico, convertendo-se em frao
conjugada, a qual hidrossolvel e pode ser eliminada pelo rim. A bilirrubina
conjugada tambm excretada pelos canalculos hepticos no intestino del-
gado, onde parte dela desconjugada, transformada pela flora bacteriana em
estercobilinognio e eliminada pelas fezes. O estercobilinognio, por sua vez,
tambm pode entrar no ciclo entero-heptico ou ser excretado, como urobili-
nognio, pela via renal. Nveis elevados de bilirrubina srica total, geralmente
acima de 2,5 mg/dL, provocam ictercia clnica, que caracterizada pela cor
amarelada da pele e mucosas.
Para determinar a dosagem de bilirrubina total utiliza-se um reagente diazo,
o qual produz uma reao colorida que pode ser medida com o auxlio de um
espectrofotmetro. A frao conjugada da bilirrubina reage diretamente com o
diazo, sendo por isso denominada bilirrubina direta. J a frao no conjugada
necessita de um catalisador para auxiliar na reao, por isso chamada indireta.
Nos casos de aumento dos nveis de bilirrubina srica (hiperbilirrubinemia),
a investigao diagnstica deve considerar qual a frao predominante, se a
conjugada ou a no conjugada. Dentre as possveis causas para a hiperbilirrubi-

nemia, esto as hepatopatopatias e as hemoglobinopatias. Em recm-natos, os
valores de bilirrubina total variam com o tempo e com o estado de maturidade.
Geralmente, ocorre um aumento fisiolgico nas primeiras 48 horas de vida,
seguido por uma queda desses nveis entre o 3 e o 5 dia de vida. Algumas
causas da hiperbilirrubinemia em recm-nascidos esto relacionadas ictercia
fisiolgica, deficincia de glicose-6-fosfato desidrogenase, reabsoro de he-
matomas, infeces congnitas (toxoplasmose, sfilis, citomegalovrus, rubola),
anemias hemolticas e a patologias menos frequentes, como galactosemia e
hipotireoidismo congnito. O quadro 1.16 apresenta algumas causas de alte-
rao dos nveis das fraes de bilirrubina.
Quadro 1.16. Causas de alterao dos nveis das fraes de bilirrubina.

Aumento da bilirrubina conjugada Aumento da bilirrubina no conjugada
(direta) (indireta)
alterao no transporte: mecanismo
falha na excreo da de competio de drogas pelo stio
bilirrubina conjugada: de ligao da albumina, acidose
sndrome de Dubin-Johnson. metablica, hipoalbuminemia.
disfuno hepatocelular: aumento da oferta: reao
hepatite, cirrose heptica, transfusional, anemia hemoltica
colestase intra-heptica (autoimune, hemoglobinopatias,
(drogas, cirrose biliar, drogas), infeces virais e bacterianas,
sepse, ps-operatrio), queimaduras, reabsoro de
mononucleose, linfomas. hematomas, infarto pulmonar.
obstruo biliar: reduo da captao: contrastes
coledocolitase, carcinoma radiolgicos, distrbio transitrio aps
(vias biliares, fgado ou hepatite, imaturidade neonatal, alguns
pncreas), verminoses casos de sndrome de Gilbert.
(Ascaris lumbricoides),
abscessos, pancreatites, alterao na conjugao: deficincia
doenas congnitas das vias total ou parcial da enzima
biliares. glicuroniltransferase (sndrome de
Gilbert), imaturidade neonatal.
Bioqumica | 111
1.4.3.7 Enzimas
As reaes bioqumicas que ocorrem no corpo humano normalmente so
catalisadas pelas enzimas. Neste tpico, sero apresentadas algumas das in-
meras enzimas avaliadas nas anlises clnicas e suas aplicaes no diagnstico
de diferentes condies patolgicas.
Amilase
Hidrolase de origem predominantemente pancretica e da glndula sali-
var, cuja funo degradar complexos de carboidratos. So conhecidas
duas isoenzimas: a pancretica e a salivar, na proporo de 30:70 em
soro de indivduos sadios. As dosagens de amilase srica e urinria so
largamente utilizadas no diagnstico de doenas do pncreas e na inves-
tigao da funo pancretica. A maioria dos pacientes com pancreatite
aguda possui nveis sricos que se elevam entre 2 e 12 horas aps
o incio do episdio, atingindo concentraes mximas em 24 horas,
que retornam faixa de normalidade entre 48 e 72 horas. As altas
concentraes de amilase srica no esto diretamente relacionadas
gravidade do envolvimento pancretico, mas indicam grande probabili-
dade de um quadro clnico de pancreatite aguda. Aumentos da amilase
srica (hiperamilasemia), no entanto, no se devem necessariamente
pancreatite, pois tumores de pulmo e de ovrio podem elevar seus
nveis em cerca de 50 vezes o intervalo de referncia. Ao redor de
25% da amilase srica eliminada pela urina, e na insuficincia renal
a amilase srica mantm-se elevada proporcionalmente extenso do
comprometimento do rgo. Aproximadamente 20% dos indivduos
com pancreatite aguda apresentam ndices normais de amilase srica.
Em episdios agudos de pancreatite crnica, esses nveis podem estar
ligeiramente aumentados, porm frequentemente permanecem normais.
A amilase pode ligar-se a protenas, formando complexos de alto
peso molecular (macroamilases). Esse fato caracterizado por valores
de amilase srica persistentemente elevados sem causa aparente, acom-
panhados de dosagem urinria normal ou baixa. Deve suspeitar-se de
macroamilasemia quando a relao entre o clearance de amilase e o
clearance de creatinina < 1% (relao normal entre 1% e 4%). No

quadro 1.17 esto listadas algumas causas de hiper e hipoamilasemia.
Quadro 1.17. Principais causas de hiperamilasemia e hipoamilasemia.
Hiperamilasemia Hipoamilasemia
parotidite
pancreatite aguda
macroamilasemia
queimaduras graves
leso de glndula salivar
doena intra-abdominal (peritonite, insuficincia pancretica
apendicite aguda) fibrose cstica avanada
intoxicao alcolica hepatopatias graves
insuficincia renal grave
cncer de pncreas
obstruo das vias biliares
obstruo do canal pancretico
neoplasias de pulmo ou ovrio
Para a anlise de amilase presente em soro ou plasma heparinizado,

utiliza-se o mtodo de Caraway modificado. A a-amilase presente na
amostra hidrolisa o amido do substrato, gerando a maltose. A soluo
de iodo utilizada no ensaio reage com o amido que sobrou da reao
com a a-amilase. A atividade enzimtica medida de acordo com a
intensidade da cor azul formada (complexo iodo-amido).
Bioqumica | 113
Colinesterase
A colinesterase encontrada no organismo sob duas formas: a colinesterase
verdadeira acetilcolinesterase ou colinesterase eritrocitria , encontrada
nas hemcias e nas sinapses do sistema nervoso central, e a pseudocolines-
terase benzoilcolinesterase ou colinesterase plasmtica , encontrada no
soro e no fgado. As duas so muito importantes para o diagnstico da
intoxicao por organofosforados, condio na qual se apresentam em n-
veis reduzidos. Na suspeita de intoxicao crnica, indica-se a dosagem
da acetilcolinesterase; na exposio aguda, recomenda-se determinar a
taxa de pseudocolinesterase. A terapia ps-intoxicao pode ser acom-
panhada pela determinao da concentrao de acetilcolinesterase, uma
vez que nveis reduzidos dessa enzima levam a coma e convulses. Os
nveis de colinesterase tambm podem estar reduzidos nos casos de ane-
mias, desnutrio, distrofia muscular, doenas hepticas (hepatite viral,
cirrose, congesto heptica e amebase heptica), doena renal crnica,
infarto do miocrdio, infeces agudas e uso de contraceptivos orais, es-
trognios e corticoides. Nveis aumentados podem ser observados nos
casos de alcoolismo, cncer de mama, sndrome nefrtica e obesidade.
Para a dosagem de colinesterase em soro ou plasma, utiliza-se o mtodo
de Ellman modificado. Nesse ensaio, ocorre a hidrlise do iodeto de
acetiltiocolina, com formao de iodeto de tiocolina e cido actico. A
tiocolina reage com o cido dinitrobenzoico presente no meio reacional,
gerando um composto de colorao amarela, cuja intensidade medida
fotometricamente (avaliao cintica).
Creatinoquinase
A creatinoquinase (CK), tambm denominada ATP-creatina-N-fosfo-
transferase, funciona como importante enzima reguladora da produo
e da utilizao de fosfatos de alta energia nos tecidos contrteis. A
creatinoquinase total encontrada em altas concentraes na musculatura
esqueltica e cardaca e, em menores quantidades, no crebro, intestino
e pulmes. Trata-se de um dmero composto por duas cadeias distin-
tas, denominadas M (muscle = msculo) e B (brain = crebro), que
podem estar combinadas de trs formas, criando as isoenzimas da CK:

CK-MM, CK-MB e CK-BB. A CK-MM encontrada principalmente
na musculatura estriada; a CK-BB est presente no crebro, clon, leo,
estmago e bexiga; e a CK-MB encontra-se principalmente no miocr-
dio, mas pode estar presente em menor proporo no msculo estriado
esqueltico (1% a 4%, sendo o restante CK-MM).
A CK utilizada para realizar o diagnstico e o acompanhamento de
patologias que envolvem os msculos esquelticos, como a dermatomio-
site e o hipotireoidismo. Sua importncia no infarto agudo do miocrdio
atualmente limitada, uma vez que sua elevao ocorre mais lentamente
aps o incio da dor precordial (4 a 6 horas), alm de no ser especfica
para a musculatura cardaca e de apresentar uma faixa de referncia bas-
tante ampla por exemplo, pode apresentar-se normal em indivduos
sedentrios com infarto agudo do miocrdio.
Assim sendo, marcadores cardacos mais especficos, que se elevam
mais precocemente, como CK-MB e as troponinas (I e T), atualmente
substituem a CK total nos quadros de infarto agudo do miocrdio. Os
nveis de CK podem estar elevados nos casos de infarto do miocrdio,
exerccio fsico recente, miopatias congnitas e adquiridas, acidente vas-
cular cerebral, doenas infecciosas, convulses generalizadas e neopla-
sias de prstata, vescula e trato gastrointestinal. Em casos onde ocorre
diminuio da massa muscular, em doenas do tecido conjuntivo e em
doena alcolica do fgado, os nveis de CK se encontram diminudos.
Creatinoquinase frao MB
A creatinoquinase frao MB (CK-MB) considerada um dos marca-
dores bioqumicos para o diagnstico de leso miocrdica, sendo a base
para a comparao com outros marcadores. Em termos de diagnstico,
apesar de ser especfica para leso do miocrdio, a CK-MB tambm
pode estar elevada em paciente com leses concomitantes na muscu-
latura esqueltica e cardaca, e isso pode diminuir sua especificidade
cardaca; para aumentar a sua especificidade, no caso da dosagem de
CK-MB, pode ser calculado um ndice relativo, conforme a equao:
Bioqumica | 115
ndice de CK-MB = (CK-MB/CK total) x 100.
Essa equao permite avaliar, em termos percentuais, se a frao MB

est aumentada em relao CK total. Embora existam variaes entre
diferentes autores, valores acima de 5% esto associados com provvel
origem cardaca para a CK-MB, indicando leso do miocrdio. Por outra
parte, nveis acima de 25% indicam possvel interferncia na dosagem causada
pela presena da CK-BB ou CK, dado que pacientes com infarto agudo do
miocrdio raramente tm concentrao percentual de CK-MB superior a esse
limite. A elevao e a queda caractersticas da CK-MB em uma dosagem
seriada so quase decisivas para o diagnstico de infarto do miocrdio.
O aumento inicial dos nveis de CK-MB ocorre entre 4 e 6 horas aps
o incio dos sintomas, atingindo nveis mximos depois de 24 horas e
retornando ao nvel normal entre 48 e 72 horas. Para um diagnstico
com alta sensibilidade e especificidade, recomendada a dosagem se-
riada ao longo de um perodo de 8 a 12 horas. A CK-MB tambm
um componente importante para o diagnstico de um novo episdio de
infarto ou para avaliar a extenso da rea de infarto.
Apesar de seu excelente desempenho, existem algumas limitaes no
uso da CK-MB como marcador ideal no infarto agudo do miocrdio,
pois em alguns casos sua elevao s ocorre aps 8 a 12 horas do
incio dos sintomas, uma vez que ela transportada para a circulao
estritamente atravs do sistema linftico. Em comparao com a mio-
globina que atinge a corrente sangunea mais rapidamente porque
no passa pela circulao linftica , a frao CK-MB compromete a
rapidez do diagnstico de infarto agudo do miocrdio, alm de no
ser totalmente especfica para o miocrdio. Para essa anlise, utiliza-se
o mtodo de Rosalki.
Desidrogenase lctica (lactato desidrogenase)

A lactato desidrogenase (LDH), uma enzima tetramrica, pertence a
uma classe de enzimas que catalisam reaes de oxirreduo ampla-
mente distribudas em todos os tecidos humanos. Dependendo da
sua origem, a LDH apresenta pequenas diferenas. Os mamferos

possuem basicamente duas cadeias proteicas que compem a LDH.
Essas cadeias, quando combinadas, formam as isoenzimas LDH1,
LDH2, LDH3, LDH4 e LDH5, separveis eletroforeticamente. A
LDH localiza-se no citoplasma e seu aumento srico ocorre aps lise
celular. As isoenzimas da LDH existem em diferentes propores nos
vrios tecidos: no msculo cardaco, rim e eritrcitos, predominam a
LDH1 e a LDH2; as isoenzimas LDH4 e a LDH5 so as formas domi-
nantes no fgado e no msculo esqueltico. Como as concentraes
da LDH dentro das clulas so cerca de quinhentas vezes maiores
do que no soro, qualquer aumento na atividade da LDH no sangue
sugere leso tissular, e a frao isoenzimtica predominante identifica
o rgo de origem.
Aps um infarto agudo do miocrdio, as atividades sricas da CK e da
CK-MB elevam-se antes do aumento da LDH. Presente no miocrdio,
a LDH1 frequentemente acompanha a atividade da LDH total, elevan-
do-se entre 8 e 12 horas aps o incio da dor precordial e atingindo
seus nveis mximos em 24 a 72 horas. Como a LDH e suas isoenzimas
esto presentes em todos os tecidos, necessrio realizar, na suspeita
de infarto agudo do miocrdio, o diagnstico diferencial com outras
patologias ocasionadas por injria tecidual, como infarto renal agudo,
infarto mesentrico, neoplasia, hemlise aguda, hipotireoidismo, pan-
creatite e pneumonia.
Para a anlise de LDH em soro ou plasma, utiliza-se o mtodo de
Wroblewski e colaboradores modificado. Nesse teste, a LDH con-
verte reversivelmente o piruvato em lactato, com oxidao simultnea
do NADH para NAD+. A diminuio da concentrao de NADH
proporcional atividade de LDH.
Fosfatase cida total

Enzima presente em tecidos, como ossos, prstata e bao, e nas clulas
sanguneas (hemcias, plaquetas e leuccitos). Sua elevao ocorre em
processos de destruio plaquetria, doenas hemolticas, doena de
Bioqumica | 117
Paget, metstase ssea, mieloma mltiplo e no cncer de prstata. Em

indivduos do sexo masculino, a frao prosttica representa aproxima-
damente 50% da fosfatase cida total, sendo o restante proveniente do
fgado e da desintegrao das plaquetas e eritrcitos.
Fosfatase cida prosttica

Enzima que auxilia no diagnstico e no monitoramento da terapia do
carcinoma prosttico, mas no substitui o antgeno prosttico (PSA),
uma vez que seus nveis podem se manter normais nos quadros iniciais
da doena. Alm do adenocarcinoma de prstata, pode estar elevada
na leucemia mieloctica, na prostatite e na reteno urinria. Da mesma
forma que o PSA, seus resultados sofrem interferncia da manipulao
prosttica, como no toque de prstata e na ultrassonografia de prstata.
Um dos mtodos utilizados para a anlise de fosfatase cida em soro
o mtodo de Bessey-Lowry modificado. Nesse mtodo, a fosfatase
cida hidrolisa o p-nitrofenilfosfato em pH cido (4,8), formando
p-nitrofenol e fosfato. Em meio alcalino, o p-nitrofenol encontra-se sob
a forma ionizada, apresentando colorao amarela que pode ser medida
fotometricamente.

Fosfatase alcalina
Enzima presente em muitos tecidos, principalmente no epitlio intesti-
nal, tbulo renal, osteoblastos, fgado e placenta. No soro de adultos
normais, a forma predominante origina-se principalmente no fgado e no
esqueleto, e depende acentuadamente da idade. Sua funo no meta-
bolismo, que ainda no est bem compreendida, parece estar associada
ao transporte lipdico no intestino e a processos de calcificao ssea.
Sua dosagem importante na investigao de doenas hepatobiliares
e sseas associadas hiperatividade osteoblstica. A fosfatase alcalina
tem seus nveis aumentados nos casos de doenas hepticas e do trato
biliar, na doena de Paget e nas metstases sseas e de fgado (funciona
como marcador tumoral). Em processos de crescimento sseo fisiolgi-
co, tambm ocorrem aumentos nos nveis sricos da enzima: mulheres
no terceiro trimestre de gravidez podem apresentar nveis at trs vezes

acima do normal em decorrncia da frao placentria adicional, dado
que a atividade osteoblstica elevada no feto. Os nveis de fosfatase
alcalina podem estar diminudos em casos de hipotireoidismo e durante
o uso de estrognios simples e conjugados com andrognio.
Para a dosagem de fosfatase alcalina em soro, o mtodo mais utilizado
o Bessey-Lowry modificado. Nesse mtodo, ocorre a reao da fos-
fatase alcalina com o p-nitrofenilfosfato, que hidrolisado a p-nitrofenol
e cido fosfrico. Em meio alcalino, o p-nitrofenol encontra-se sob a
forma ionizada, apresentando colorao amarela que pode ser medida
fotometricamente.
Lpase
A lpase uma enzima que hidrolisa triglicerdeos, formando monoglice-
rdeos, e atua retirando a molcula de glicerol e liberando cidos graxos
livres. produzida predominantemente no pncreas exgeno, sendo um
marcador de pancreatite. Na doena pancretica, a elevao de seus
nveis sricos nem sempre coincide com a da amilase, e, frequentemente,
ela permanece elevada por um perodo mais longo. Enquanto a amilase
tende a aumentar os seus nveis mais precocemente na pancreatite agu-
da, a lpase eleva-se nas primeiras 12 horas aps o incio do episdio,
mantendo os seus nveis aumentados por sete a dez dias.
Ao contrrio da amilase, no existe interferncia da lpase nos casos de
parotidites agudas, uma vez que ela no est presente nas glndulas
partidas. E o aumento de seus nveis, quando comparado ao aumento
da amilase, menos pronunciado na doena renal crnica e aguda.
Para a dosagem de lpase em soro, que deve ser sem hemlise e no
ictrico, o mtodo mais utilizado o de Vogel e Zieve modificado.
Nesse mtodo, a lpase presente na amostra catalisa a hidrlise dos s-
teres presentes no leo de oliva tamponado. So realizadas duas leituras
de absorbncia, e a diferena entre essas leituras representa a atividade
enzimtica da lpase.
Bioqumica | 119
Gama-glutamiltransferase (GGT/gGT)
Enzima originada particularmente do sistema hepatobiliar e que possui a
funo de transferir o cido glutmico atravs das membranas celulares.
Seus nveis encontram-se elevados especialmente nas colestases intra ou
extra-hepticas e tambm em casos de hepatoma, carcinoma de cabea
de pncreas, carcinoma metasttico de fgado, doena crnica alcolica,
cirrose, hepatite, hipertireoidismo e lpus eritematoso sistmico. No hi-
potireoidismo, os nveis da enzima encontram-se reduzidos.
O uso de lcool, agudo ou crnico, tambm pode ser verificado pela
dosagem dessa enzima heptica, pois seus nveis sricos tornam-se pelo
menos duas vezes mais elevados que o seu valor de referncia aps a
ingesta. A liberao da GGT no soro reflete o efeito txico do lcool
e de drogas como fenitona, fenobarbital e cido valproico sobre a es-
trutura microssomal dos hepatcitos.
Para a anlise de GGT em soro e plasma, o mtodo utilizado o mtodo
de Szasz modificado. Esse mtodo envolve a reao entre o substrato
g-glutamil-p-nitroanilina e a enzima GGT presente na amostra analisada.
A enzima transfere o radical glutamil para a glicilglicina presente no meio
reacional, liberando a p-nitroanilina, que responsvel pela formao de
colorao amarela, medida fotometricamente.
Transaminases (aminotransferases)
A atividade enzimtica um indicador comumente utilizado para avaliar
possvel dano hepatocelular. Duas das enzimas que podem ser utilizadas
para esse fim so a alanina aminotransferase (ALT) e a aspartato amino-
transferase (AST).
A ALT, tambm chamada transaminase glutmico-pirvica (TGP), est
presente em grandes quantidades no fgado e no rim, e em pequenas
quantidades na musculatura esqueltica e no corao. Na avaliao da
funo heptica, a ALT mais sensvel para a deteco de danos do
hepatcito do que para quadros de obstruo biliar e, por esse motivo,
considerada um excelente marcador hepatocelular.
A AST, ou transaminase glutmico-oxalactica (TGO), encontrada

no miocrdio, fgado, musculatura esqueltica, rim e crebro. A dosa-
gem dessa enzima auxilia no diagnstico de doenas cardacas, hepticas
e musculares.
Cerca de 80% da AST dos hepatcitos mitocondrial. J a ALT ci-
toplasmtica. Essa diferena muito importante e auxilia no diagnstico
e prognstico de doenas hepticas. Nos danos hepatocelulares graves,
ocorre aumento da AST, ao passo que, nos casos onde as leses he-
pticas so leves, a forma predominante no soro a citoplasmtica, ou
seja, ocorre elevao da ALT. A relao AST/ALT (ndice de DeRittis)
geralmente menor que 1 em indivduos com danos hepatocelulares
agudos e alta em casos graves.
A ALT encontra-se elevada na hepatite infecciosa e txica, doena
pancretica, mononucleose, cirrose, ictercia obstrutiva e carcinoma me-
tasttico. Pacientes com infarto do miocrdio apresentam nveis de ALT
geralmente normais ou levemente elevados.
Os nveis de AST elevam-se nas primeiras 12 horas aps um infarto do
miocrdio, atingindo seus valores mximos em 24 horas e normalizam-
se aps cerca de cinco dias. Ocorre tambm seu aumento significativo
na necrose heptica, pancreatite aguda, anemias hemolticas, hepatites,
cirrose heptica, ictercia obstrutiva, hipotireoidismo, trauma e infarto
cerebral, queimaduras severas e leses da musculatura esqueltica.
Podem ocorrem pequenas elevaes durante a gravidez. Drogas como
a isoniazida, a eritromicina, a progesterona e os esteroides anablicos
podem elevar seus nveis; por isso, essa enzima til no monitoramento
de terapias com substncias hepatotxicas.
Para a anlise de AST em soro e plasma, utiliza-se o mtodo de
Reitman-Frankel modificado para AST. Nesse mtodo, a enzima
AST transfere o grupo amino da molcula de aspartato para o
a-cetoglutarato, formando glutamato e oxalacetato. Esse ltimo reage
com a 2,4-dinitrofenil-hidrazina, presente no meio reacional, para
formar a hidrazona correspondente, que em meio alcalino apresenta
colorao diretamente proporcional atividade enzimtica e que pode
ser medida fotometricamente.
Bioqumica | 121
Uma variao desse mtodo tambm utilizada para a anlise de ALT.

Nela, a enzima ALT transfere o grupo amino da molcula de alanina
para o a-cetoglutarato, formando glutamato e piruvato. Esse ltimo
reage com a 2,4-dinitrofenil-hidrazina presente no meio reacional para
formar a hidrazona correspondente, que, em meio alcalino, apresenta
colorao que pode ser medida fotometricamente e diretamente
proporcional atividade enzimtica.
1.4.4 Eletrlitos
1.4.4.1 Clcio
O clcio o quinto componente mineral mais abundante no organismo e
encontrado principalmente nos ossos (98%), nos dentes e nas cartilagens.
Atua de forma importante na contrao e relaxamento do miocrdio, no pro-
cesso de ossificao, na coagulao sangunea, na conduo neuromuscular, na
manuteno da integridade da membrana celular, no mecanismo de ao de
alguns hormnios e na ativao de algumas enzimas.
No trato gastrointestinal, o clcio sofre a ao do suco gstrico, sendo
absorvido em seguida no duodeno e no leo. Essa absoro ocorre por um
processo ativo, mediado por protenas intestinais especficas, cujos nveis au-
mentam pela ao da vitamina D3, do paratormnio (PTH) e de esteroides
sexuais, e diminuem pela ao de corticoides e algumas drogas anticonvulsivan-
tes. O PTH atua na mobilizao de clcio e fsforo do osso, aumentando a
reabsoro tubular de clcio e a eliminao do fosfato pela urina. A calcitonina
inibe a reabsoro ssea e tubular de clcio, e a vitamina D aumenta a minera-
lizao do tecido sseo. Os glicocorticoides e os hormnios tireoidianos reab-
sorvem clcio e fsforo do osso; j o hormnio de crescimento aumenta a massa
ssea, com a manuteno de clcio e fsforo na matriz ssea. O clcio sanguneo
pode estar ionizado sob forma ativa (50%), associado albumina e globulina
(45%), ou formando complexos com citrato, fosfato e bicarbonato (5%).
Nveis elevados de clcio (hipercalcemia) provocam leses no rim e litase
renal, distrbios neurolgicos e neuromusculares. A hipocalcemia (nveis redu-
zidos de clcio) provoca hiperexcitabilidade neuromuscular, com espasmos e

contraturas musculares. A anlise dos nveis de clcio srico um teste bioqu-
mico de triagem muito comum e confivel para diagnosticar o hiperparatireoi-
dismo primrio ou secundrio. No quadro 1.18 encontram-se listadas algumas
possveis causas de hipercalcemia e hipocalcemia.
Quadro 1.18. Causas de aumento e reduo

dos nveis de clcio sanguneo.
Hipercalcemia Hipocalcemia
hiperparatireoidismo
hipoparatireoidismo
hipervitaminose D
deficincia de vitamina D
doena de Paget
acidose crnica
doenas malignas com
comprometimento sseo esteatorreias
carcinoma de mama, gstrico ou de m absoro intestinal
pulmo uremias
nefropatias
Outra anlise que reflete a absoro intestinal, a reabsoro ssea e a perda

renal de clcio a dosagem de clcio urinrio. Essa dosagem auxilia no acompa-
nhamento das terapias de reposio, nas doenas sseas, na avaliao do meta-
bolismo do clcio, na nefrolitase, nas hipercalcirias idiopticas e nas doenas da
paratireoide. Na determinao desses valores, deve-se considerar a ingesto de
clcio nos dias que antecedem a coleta de urina. Para a realizao dessa anlise,
o indivduo deve realizar uma dieta pobre em clcio, evitando leite e derivados
nos quatro a sete dias que antecedem a coleta, ou conforme solicitao mdica.
Para a anlise de clcio em soro ou urina (coletada num perodo de 24
horas), utiliza-se o mtodo de Bachra modificado. Esse mtodo envolve a
titulao direta do clcio pelo EDTA, em meio alcalino, com o cido calcon-
carboxlico como indicador. O magnsio interfere no mtodo, porm o pH
Bioqumica | 123
12 do meio reacional minimiza essa interferncia. Outro mtodo utilizado o

mtodo compleximtrico, no qual o clcio reage com a cresolftalena comple-
xona em meio alcalino, formando um complexo colorido que determinado
fotometricamente.
1.4.4.2 Cloro (ons cloreto)

O cloreto (Cl) o principal nion extracelular e, juntamente com o sdio,
representa a maioria dos constituintes osmoticamente ativos do plasma. Est
envolvido no balano hidroeletroltico e na manuteno da presso osmtica.
A maior parte do cloreto ingerido absorvida; seu excesso excretado na
urina. Os nveis de cloreto, portanto, sofrem alteraes nos distrbios cido-
bsicos e nos hidroeletrolticos. O quadro 1.19 relaciona algumas causas de
aumento e reduo dos nveis de cloreto no sangue.
Quadro 1.19. Causas de aumento e diminuio

dos nveis de cloreto no sangue.
insuficincia renal aguda vmito prolongado (perda de

acidose metablica por perda de secreo gstrica)
bicarbonato alcalose metablica
acidose tubular renal nefrite com perda de sal
alcalose respiratria acidose respiratria
intoxicao por salicilato doena de Addison
desidratao hipersudorese
Para a anlise de cloreto em sangue e em urina coletada num perodo de

24 horas, utiliza-se o mtodo de Schales e o mtodo de Schales modificado.
Nesses mtodos, ocorre a reao dos ons cloreto com os ons mercrio,
formando o cloreto de mercrio, no dissociado e solvel. Os ons mercrio
em excesso se combinam com a difenilcarbazona presente no meio reacional,

gerando um complexo de colorao azul-violeta. Tambm utilizado o m-
todo colorimtrico, no qual os ons cloreto ligam-se ao mercrio do reagente
cloroanilato de mercrio, formando o cloreto de mercrio, que solvel, mas
no ionizvel. Ocorre tambm a liberao de cido cloroamlico, que possui
colorao vermelha e pode ser medido fotometricamente.
1.4.4.3 Ferro
A dosagem do ferro srico fundamental para o diagnstico das anemias
ferroprivas (hipocrmicas e microcticas), nas quais h deficincia desse analito.
A avaliao dos nveis sricos de ferro tambm importante nas alteraes
hematolgicas em que ocorre o excesso desse analito, como o caso da he-
mocromatose e da hemossiderose.
Sua determinao pode ser feita isoladamente ou em conjunto com a ferriti-
na e hemossiderina, que avaliam as reservas de ferro no organismo. Na anemia
megaloblstica por carncia de B12, pode ocorrer uma carncia de ferro aps
a reposio da vitamina, por causa do aumento do consumo de ferro pelas
hemcias. Nas anemias hemolticas, o ferro srico pode variar de normal at au-
mentado, dependendo do tempo em que o processo hemoltico foi iniciado.
Para a dosagem de ferro em soro, utiliza-se o mtodo TPTZ, que envolve
uma reao de reduo do ferro em meio cido. O ferro ligado transferrina
liberado, reagindo, posteriormente, com o TPTZ (2,3,5-cloreto de trifenil-
tetrazolium). Ocorre a formao de um produto colorido, cuja intensidade
medida fotometricamente.
Transferrina
Glicoprotena sintetizada no fgado, com meia-vida de aproximadamente
sete dias. a principal protena plasmtica transportadora de ferro, e, por
esse motivo, seus nveis sofrem variaes em consequncia da deficincia de
ferro ou de doenas crnicas, voltando ao normal aps o tratamento. Em
condies normais, apenas um tero da transferrina plasmtica encontra-se
sob a forma saturada. Sua concentrao est diretamente relacionada
Bioqumica | 125
capacidade total de ligao do ferro (TIBC), por isso, til nos casos
de dosagens peditricas, uma vez que exige pequenas quantidades de
amostra quando comparada com a tcnica do TIBC.
Os nveis de transferrina encontram-se aumentados na anemia ferropriva,
no perodo gestacional e durante o uso de contraceptivos orais. A
reduo dos nveis de transferrina observada nos estados inflamatrios
crnicos, nas doenas hepticas crnicas e nos casos de doena renal.
Capacidade total de ligao do ferro

A capacidade total de ligao do ferro (TIBC) representa a poro
total de ferro ligada transferrina. Em patologias que reduzem as reser-
vas de ferro (anemia ferropriva, deficincia do metal ou perda sangu-
nea), na insuficincia heptica ou em situaes em que a produo de
transferrina encontra-se aumentada (gestao e uso de anticoncepcional
oral), a capacidade total de combinao do ferro aumenta. Na hemo-
cromatose, patologia em que os nveis de ferro esto elevados, a TIBC
diminui. A reduo da produo heptica de transferrina na cirrose
heptica, as nefropatias, hepatopatias crnicas e as perdas proteicas na
sndrome nefrtica tambm diminuem a capacidade total de combina-
o do ferro.
Para a avaliao dessa ligao, utiliza-se a capacidade do ferro de
precipitar na presena de carbonato de magnsio. No soro, a transferrina
totalmente saturada aps o tratamento com excesso de ferro. O ferro no
combinado precipitado com o carbonato de magnsio presente no meio
reacional, e o ferro combinado pode ser determinado no sobrenadante.
ndice de saturao da transferrina

O ndice de saturao da transferrina usado na distino das causas
comuns de anemias. Ele estabelece a relao entre a quantidade
de ferro srico e a quantidade de transferrina ou com a capacidade
total de fixao do ferro (TIBC) presente. Normalmente, aumentos
da TIBC ocorrem em resposta ao decrscimo nos nveis de ferro
srico (deficincia de ferro), porm, em geral, a TIBC apresenta-se
normal em doenas inflamatrias crnicas. O ndice de saturao da

transferrina obtido pelo seguinte clculo:
O quadro 1.20 apresenta a comparao entre os nveis de ferro srico, a

TIBC e o ndice de saturao da transferrina em diferentes quadros clnicos.
Quadro 1.20. Comparao entre nveis de ferro, TIBC

e ndice de saturao.
ndice de
Quadro clnico Ferro TIBC
saturao
deficincia de ferro reduzido aumentada reduzido
infeco crnica reduzido reduzida reduzido
malignidade reduzido reduzida reduzido
menstruao reduzido normal reduzido
envenenamento aumentado aumentada aumentado
por ferro
anemia hemoltica variado variada variado
hemocromatose aumentado normal/reduzida aumentado
infarto do reduzido normal reduzido
miocrdio
gravidez tardia reduzido aumentada reduzido
uso de aumentado/ aumentada normal
contraceptivo oral normal
normal/
hepatite viral aumentado aumentada
aumentado
nefrose reduzido reduzida aumentado
talassemia aumentado reduzida aumentado
1.4.4.4 Fsforo
O fsforo um elemento amplamente distribudo no organismo sob a forma
de fosfato orgnico ou inorgnico. Nos indivduos adultos, aproximadamente
Bioqumica | 127
85% do fsforo inorgnico esto presentes no esqueleto. O percentual res-

tante encontra-se combinado com carboidratos, protenas e lipdios, e incorpo-
rado a outras substncias orgnicas, como fosfolipdios, fosfoprotenas, cidos
nucleicos e outros compostos de alta energia envolvidos na integridade celular,
com funo de estocagem e troca de energia.
Trs rgos esto principalmente comprometidos com o equilbrio homeost-
sico do fsforo: o intestino delgado, responsvel pela sua absoro, os rins, en-
carregados das funes de filtrao e reabsoro do fsforo, e o esqueleto, que
promove o seu armazenamento. Cerca de dois teros do fosfato ingerido sofre
absoro ativa, principalmente no jejuno; o restante excretado por via fecal.
O aumento do fosfato srico ocorre por reduo da filtrao glomerular,
aumento da reabsoro tubular renal e aporte exgeno ou endgeno. Os
nveis de fosfato encontram-se aumentados na hipocalcemia, em casos de hi-
pervitaminose D, na osteoporose, na metstase ssea, na insuficincia renal
etc. A ao do paratormnio tambm influi nesse aumento, como provvel
efeito indireto do metabolismo da vitamina D. Cerca de 90% do fosfato
filtrado pelos glomrulos e reabsorvido pelos tbulos. A diminuio ocorre por
desordens tubulares de reabsoro e aumento das perdas. Os nveis de fosfato
encontram-se reduzidos na hipovitaminose D, no raquitismo, em indivduos
que fazem uso de anticidos e diurticos e no alcoolismo. O PTH inibe sua
reabsoro tubular renal, ou seja, no hiperparatireoidismo primrio encontramos
elevao do fsforo urinrio. Os nveis sricos dependem da alimentao.
Recomenda-se a coleta pela manh por causa de relatos de variaes diurnas.
Os nveis de fosfato urinrio variam com a idade, a funo renal, a massa
muscular, a hora do dia, a dieta e a ao do PTH. A dosagem de fosfato
urinrio auxilia no diagnstico das doenas sseas, como a osteomalacia e a
doena de Paget.
A anlise de fosfato urinrio realizada em urina coletada num perodo de
24 horas. Para isso, utiliza-se o mtodo de Fiske e Subbarow. Nesse mtodo,
a amostra desproteinizada com cido tricloroactico, e o fosfato presente rea-
ge com o molibdato de amnio para formar o fosfomolibdato de amnio. Esse,
na presena do cido aminonaftolsulfnico, gera o azul de molibdnio (xido
de molibdnio), cuja intensidade de colorao medida fotometricamente.
1.4.4.5 Magnsio
O magnsio o quarto ction mais abundante no organismo humano. Atua
como cofator indispensvel para as enzimas ligadas aos processos de respirao
celular, gliclise e transporte de clcio e sdio atravs da membrana. Num
adulto, o magnsio total encontra-se distribudo da seguinte forma: aproxima-
damente 60% nos ossos, 20% na musculatura esqueltica, 19% em outros
tecidos e 1% no lquido extracelular. Cerca de dois teros do magnsio srico
existem predominantemente como ons livres, um tero est ligado a prote-
nas, principalmente albumina, e um pequeno percentual forma complexos de
nions. O magnsio ingerido absorvido no intestino delgado e excretado pela
via urinria. Essa eliminao controlada pela reabsoro tubular.
A reduo dos nveis de magnsio srico (hipomagnesemia) est associada
hipocalcemia (reduo do clcio) e hipocalemia (reduo do sdio). Den-
tre as causas mais comuns de diminuio do magnsio, esto o alcoolismo agu-
do, a pancreatite aguda, as perdas gastrointestinais (m absoro, uso abusivo
de laxantes e vmitos) e as perdas renais (diurticos, necrose tubular, acidose
tubular renal). Deficincias severas esto ligadas a disfunes neuromusculares,
como tetania, fraqueza, convulses, irritabilidade e delrio.
A hipermagnesemia comumente causada pelo uso de anticidos contendo
magnsio, enemas com magnsio, intoxicao por ltio e nutrio parenteral;
tambm observada em indivduos com nefrolitase, insuficincia renal aguda
ou crnica.
A determinao dos nveis de magnsio urinrio indicada para auxiliar o
diagnstico da hipomagnesemia, quando o indivduo apresenta sintomas neu-
rolgicos e gastrointestinais sem, no entanto, apresentar reduo do magnsio
srico. Na ausncia de condies que promovam a excreo do magnsio, o
indivduo tende a apresentar nveis urinrios acima dos valores de referncia
(25 mg em 24 horas), o que sugere o quadro de hipomagnesemia.
Para a dosagem de magnsio em soro ou em urina (coletada num perodo
de 24 horas), utiliza-se o mtodo de Sky-Peck. Esse mtodo envolve a for-
mao de um complexo de colorao vermelha proveniente da reao entre
o magnsio e o amarelo titan em meio alcalino. A intensidade da colorao
medida fotometricamente.
Bioqumica | 129
1.4.4.6 Potssio
O potssio est presente em elevadas concentraes no espao intracelular
e tem grande importncia na manuteno do equilbrio eletroltico atravs da
membrana celular. As variaes em suas concentraes prejudicam a capaci-
dade de contrao muscular, tanto da musculatura lisa quanto da musculatura
estriada. Os nveis sricos de potssio encontram-se aumentados (hiperpotas-
semia) em casos de hemlise macia, insuficincia renal e aumento do cata-
bolismo celular. Patologias que evoluem com hiperplaquetemia por liberao
do potssio intraplaquetrio tambm podem apresentar hiperpotassemia arti-
ficial. A hipopotassemia (nveis reduzidos de potssio no sangue) pode ser
observada nas seguintes condies: vmitos e diarreias excessivos, nefrites e
administrao de diurticos, digitlicos, cortisona e testosterona. Amostras he-
molisadas so inadequadas para essa anlise, pois aumentam sensivelmente os
nveis sricos de potssio.
1.4.4.7 Sdio
O sdio um ction presente em grande quantidade no lquido extracelular.
As variaes em seus nveis sricos, seja a reduo (hiponatremia) ou o aumento
(hipernatremia), provocam alteraes na osmolaridade. Graas ao seu grande
poder osmtico, o sdio possui a capacidade de distribuir gua por todo o
corpo. Quase todo o sdio proveniente da dieta excretado por via urinria.
Nveis reduzidos resultam em alteraes neurolgicas que vo desde fraqueza
muscular at alteraes de comportamento, distrbios de equilbrio e coma.
A dosagem do sdio urinrio importante para a avaliao das hiponatre-
mias por perda renal (rins policsticos, acidose tubular proximal), nas oligrias
pr-renais (sdio urinrio < 10 mEq/L) ou oligria renal (sdio urinrio >
10 mEq/L).
O quadro 1.21 apresenta algumas causas de aumento ou reduo dos
nveis de sdio no sangue e na urina.
Quadro 1.21. Causas de aumento ou reduo de sdio

no sangue e na urina.
Sangue Urina
Nveis Nveis Nveis Nveis
aumentados reduzidos aumentados reduzidos
terapia excessiva
dieta pobre
com salina ingesta baixa diurticos
em sdio
de sdio
acidose dieta rica em
necrose
diabtica reposio sdio
tubular
inadequada
desidratao secreo
sndrome
(vmito, uso abusivo de inapropriada de
nefrtica
diarreia) diurticos ADH
reteno pr-
sudorese hipotireoidismo hipotireoidismo
menstrual
excessiva
Uma soluo que entre em contato com uma chama atomizada, emitindo
luz. Cada elemento qumico analisado emite radiaes especficas, que so
isoladas de outras radiaes e podem ser medidas. A separao do espectro
de emisso de cada elemento realizada por filtros pticos e prismas. A in-
tensidade da emisso proporcional concentrao do elemento analisado.
Devido preciso e rapidez de anlise, possvel determinar os nveis de
mais de um analito simultaneamente. O sdio possui a capacidade de emitir
luz quando atomizado em chama, e essa caracterstica pode ser utilizada em
sua dosagem. O sdio emite luz amarela quando atomizado.
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Bioqumica | 131
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Captulo 2
Biologia molecular
Daniel Santos Souza
2.1 Histria da biologia molecular
2.1.1 A descoberta do DNA
Em muitos aspectos a histria da biologia molecular se confunde com a

descoberta do cido desoxirribonucleico (DNA) e de sua importncia na
transmisso de informaes entre geraes. No de hoje que os cientistas
tentam entender as diferentes caractersticas de cada espcie. A enorme
variedade de seres, desde indivduos minsculos at animais de grandes
dimenses, tem intrigado e maravilhado muitos pesquisadores. Porm o mun-
do cientfico teve de esperar at 1858 para que Charles Darwin (1809-
1882) e Alfred Russel Wallace (1823-1913) descrevessem, separada e
concomitantemente, suas teorias da evoluo das espcies. Essas teorias
concebem a evoluo das espcies como um processo pelo qual o indivduo
mais adaptado ao meio sobrevive, e aquele que no consegue se adaptar a
determinada mudana do ambiente termina por se extinguir. Tais mudanas

seriam geradas por mutaes adaptativas?
Somente aps a segunda metade do sculo XIX surgiram as primeiras con-
cluses sobre a perpetuao das caractersticas hereditrias dos seres, baseadas
no estudo desenvolvido pelo monge austraco Gregor Mendel (1822-1884).
Suas teorias evolutivas, resultado de estudos realizados com ervilhas, consti-
tuem o marco inicial da gentica, e seus conceitos so at hoje estudados.
Mendel introduziu o conceito de genes chamados por ele de fatores e a
ideia de que eles eram herdados em pares: um gene materno e outro paterno,
sendo as caractersticas da prole recessivas ou dominantes em relao s carac-
tersticas dos pais.
Anos mais tarde, Friedrich Miescher (1844-1895) isolou um tipo de
molcula encontrada no ncleo de linfcitos, ao qual denominou nuclena. A
nuclena tinha caractersticas cidas e era solvel em solues alcalinas diludas.
Miescher tambm determinou a composio qumica dessa molcula, que seria
rica em oxignio, nitrognio e fsforo. Mais tarde, a natureza cida da nuclena
serviria de base para a denominao cidos nucleicos.
Entre 1882 e 1885, Walther Flemming (1843-1905) e Eduard Strasburger
(1844-1912), em estudos sobre estruturas celulares, descobriram estruturas
em forma de basto no ncleo das clulas e as chamaram de cromossomos,
pois eram estruturas intensamente coradas. Poucos anos mais tarde, Theodor
Boveri (1862-1915) observou que o nmero de cromossomos das clulas
germinativas, em determinado estado de sua maturao, era reduzido metade.
Essa observao permitiu elucidar o fenmeno de unio dos gametas para
criarem uma clula somtica do organismo em formao, reforando ainda mais
a teoria de Mendel.
Em 1909, o termo gene foi introduzido por Wilhelm Johannsen (1857-
1927) para designar a unidade mendeliana antes conhecida como fator, de-
signando os termos gentipo para as caractersticas genticas do indivduo e
fentipo para se referir ao seu aspecto externo.
Baseado no estudo que fez com a mosca-das-frutas (Drosophila melano-
gaster), o pesquisador Thomas Hunt Morgan (1866-1945) publicou, em
1915, o livro O mecanismo da hereditariedade mendeliana, em que afirmava
Biologia molecular | 135
representarem os genes regies dos cromossomos responsveis pelas caracters-

ticas inatas do indivduo. Curiosamente, esse trabalho teve o auxlio de Alfred
Sturtevant (1891-1970), um aluno de Morgan que, ao ler os trabalhos de
Mendel, inicialmente no lhes dera muito crdito. A partir do trabalho de
Thomas Hunt Morgan, passou-se a aceitar que os cromossomos estocavam
muitos genes, e que os genes guardavam as informaes passadas prognie.
Em 1923, Robert Feulgen (1884-1955) demonstrou, por meio de tcni-
cas de colorao especficas para o DNA, que o mesmo estava ligado intima-
mente aos cromossomos. Contudo, at ento no se sabia da importncia da
molcula do DNA na transmisso das informaes de um indivduo para outro.
At o incio do sculo XX, as biomolculas mais estudadas foram as protenas,
pois seu isolamento era mais simples do que o de outras biomolculas, e a cada
ano eram obtidas mais informaes sobre protenas do que sobre qualquer outra
biomolcula existente na clula. Por isso, era de se esperar que a transmisso de
informaes de pais para filho, processo muito importante para a manuteno da
espcie, fosse feita por meio dessas molculas to complexas, as protenas.
Esse paradigma s foi quebrado em 1928, quando Frederick Griffith (1879-
1941) introduziu o conceito de transformao com base em seus experimentos
com pneumococos, bactrias causadoras da pneumonia. Nesse experimento,
Griffith utilizou dois tipos de bactrias: o Pneumococcus do tipo S (do ingls
smooth, que significa liso), que possui superfcie lisa em decorrncia de uma
cobertura de polissacardeo o que o torna extremamente virulento , e o
Pneumococcus do tipo R, assim chamado por possuir a superfcie rugosa (rough
em ingls) e no ter cobertura polissacardica, no sendo virulento.
Ao inocular a bactria R viva e a bactria S morta, o camundongo morria.
Griffith concluiu ento que havia algum fator na bactria S que transformava
a bactria R em S. Essa concluso foi confirmada quando Griffith observou,
nos camundongos mortos, a presena de colnias de bactrias S vivas. Como
elas eram mortas por meio do uso de calor, que desnatura protenas, era lgico
supor que o material que transmitia essa informao no era uma protena. Pes-
quisadores contemporneos de Griffith concluram que a substncia capaz de
estimular essa transformao devia ser o material gentico dos Pneumococci
do tipo S, que readquiriam a sua virulncia.
Alguns anos aps o experimento de Griffith, pesquisadores repetiram os

seus experimentos utilizando separaes que continham apenas DNA, carboi-
dratos, protenas ou lipdios. Constatou-se que somente a poro com DNA
era capaz de transformar as bactrias, e que o DNA perdia essa capacidade
quando tratado com enzimas DNAses. Tais experimentos confirmaram a teoria
de Griffith e deram grande credibilidade aos seus experimentos.
Em 1931, Phoebus Aaron Theodor Levene (1869-1940) identificou que
bases nitrogenadas, acar e fosfato formavam as estruturas bsicas dos ci-
dos nucleicos, afirmando que esses cidos eram polmeros. Foi ele tambm que
descreveu as diferenas entre o cido ribonucleico (RNA) e o DNA, sendo
essa nomenclatura amplamente utilizada aps suas pesquisas.
Em 1952, Alfred Hershey (1908-1997) e Martha Chase (1927-2003)
estavam utilizando em seus experimentos um tipo de vrus, denominado fago,
capaz de infectar bactrias. No experimento, que ficou conhecido como
experimento do liquidificador, eles marcaram duas culturas de fagos. Uma
delas foi marcada com enxofre radioativo, que se incorporou s protenas, e
a outra, com fsforo radioativo, que se incorporou ao DNA. Posteriormente,
incubaram culturas de Escherichia coli com os fagos para que as bactrias se
contaminassem com os vrus; em seguida, liberaram os vrus das clulas bacterianas,
utilizando um liquidificador. Com isso, as cpsulas virais, por serem mais leves,
localizavam-se no sobrenadante e as bactrias, no precipitado. Hershey e
Chase perceberam que grande parte do fsforo se encontrava no precipitado
e que a maior parte do enxofre estava no sobrenadante, e concluram que o
material infectante era o DNA do vrus injetado dentro das clulas bacterianas.
Aps esse experimento, houve uma grande corrida cientfica para descobrir
a estrutura do DNA.
Utilizando a tcnica de cromatografia, Erwin Chargaff (1905-2002) verifi-
cou que havia uma relao quantitativa entre as bases nitrogenadas do DNA:
a quantidade de adenina era proporcional quantidade de timina (T), assim
como a de citosina (C), de guanina (G). Esses dados foram posteriormente
denominados postulados de Chargaff e seriam muito importantes na desco-
berta da estrutura do DNA.
Em 1953, os pesquisadores James Dewey Watson (1928) e Francis
Harry Compton Crick (1916-2004) publicaram trabalho em que elucidaram
a estrutura do DNA, utilizando para isso dados das pesquisas de Rosalind

Franklin (1920-1958) e Linus Pauling (1901-1994). Por meio da difrao
de raios X, Rosalind obteve excelentes imagens do DNA que mostravam com
grande preciso as dimenses da molcula: a estrutura era formada por uma
espiral de 20 A, a distncia entre as bases dispostas paralelamente ao eixo
helicoidal era de 3,4 A e o valor da altura de um giro da espiral cristalizada
era de 34 A. Pauling descreveu inicialmente um modelo para o DNA no qual
as bases nitrogenadas estavam voltadas para o lado externo da molcula e os
fosfatos, voltados para o interior da espiral.
Watson e Crick viram que o DNA era uma espiral, mas as bases no pode-
riam ser externas molcula por proporcionar caractersticas bsicas ao DNA.
Alm disso, se os grupos fosfato estivessem to prximos uns dos outros no
interior da estrutura seriam repelidos, fazendo-a instvel.
Utilizando essas informaes, Watson e Crick descreveram a molcula de
DNA como uma espiral na qual as bases nitrogenadas so ligadas entre si
internamente (timina com adenina e citosina com guanina) e os grupos fosfato,
carregados negativamente, esto voltados para fora da molcula. O corpo da
molcula constitudo por polmeros de base nitrogenada acar-fosfato, e as
ligaes entre eles, denominadas ligaes fosfodister, ocorrem na direo 3-5.
A elucidao da estrutura do DNA representou um marco na biologia,
sendo responsvel pelo surgimento da biologia molecular. Originada na bio-
qumica e na gentica, a biologia molecular, principal ferramenta na atualidade
para a elucidao e o aperfeioamento da vida, a cincia do sculo XXI e
seguramente ainda tem potencial para auxiliar o ser humano.
2.1.2 A estrutura dos cidos nucleicos
O DNA, assim como o RNA, um polmero formado por vrios nu-

cleotdeos ligados entre si. Os nucleotdeos so formados por uma base ni-
trogenada, um acar e um radical de cido fosfrico (fig. 2.1). Graas ao
cido fosfrico, os cidos nucleicos tm propriedades cidas e possuem carga
negativa quando em pH neutro ou alcalino.
Figura 2.1. Esquema da estrutura de um nucleotdeo.
As bases nitrogenadas podem ser purinas adenina e guanina e pirimi-

dinas citosina, timina e uracila (presente somente no RNA). A estrutura das
bases nitrogenadas encontra-se na figura 2.2.
Figura 2.2. Estrutura das bases nitrogenadas do DNA e do RNA: a molcula de

DNA apresenta as bases adenina, timina, citosina e guanina; o RNA contm adenina,
uracila, citosina e guanina.
Os nucleotdeos se ligam por meio de ligaes fosfodister que ocorrem

entre a hidroxila do carbono 5 da pentose e a hidroxila do carbono 3 do
nucleotdeo seguinte.
O DNA formado por duas fitas de nucleotdeos; j o RNA formado
por uma nica fita. Existe interao entre as duas fitas de DNA: por inter-
mdio de pontes de hidrognio entre as bases e por interaes hidrofbicas.
As pontes de hidrognio ocorrem entre as bases timina (T) e adenina (A) e
entre a citosina (C) e a guanina (G). Entre a timina e a adenina, existem duas
pontes de hidrognio; entre a citosina e a guanina existem trs. Essas ligaes
ocorrem por causa das dimenses moleculares das bases nitrogenadas e de
seus radicais, assim como em decorrncia do posicionamento dos grupos que
formam as pontes de hidrognio. Isso significa que as duas fitas de DNA so
complementares entre si, sendo esse fato importante no momento da transmis-
so de informao. Outra forma de interao ocorre por meio das interaes
hidrofbicas entre os anis heterocclicos das bases. Essa interao faz que a
parte interna das fitas seja apolar e, em um ambiente aquoso, ela favorece a
interao entre a dupla fita.
Figura 2.3. Esquema simplificado das interaes de hidrognio que ocorrem entre as
bases nitrogenadas do DNA. Em (a), as duas pontes que ocorrem entre a timina e a
adenina; em (b), as trs pontes de hidrognio entre a guanina e a citosina.
A espiral formada pelas fitas de DNA tambm possui outras caractersticas.

Seu formato favorece a formao de duas reentrncias, denominadas sulco
menor e sulco maior, que auxiliam a interao entre as protenas e a molcula
do DNA. A espiral do DNA tambm apresenta mais duas conformaes,
que so variaes e dependem da composio de bases e do meio em que
o DNA se encontra. Essas formas foram analisadas por meio de estudos de
cristalografia.
A espiral descrita por Watson e Crick denominada forma B do DNA.
Essa a forma mais abundante nas condies fisiolgicas e em solues de
baixa fora inica. Ainda existem as formas A e Z. A forma A mais curta
e mais grossa do que a forma B, e encontrada em meios de baixo contedo
salino. A forma Z mais longa e fina do que a forma B. No se conhecem
ainda as vantagens da estrutura Z, mas fato que h converso entre B e Z
no organismo.
Figura 2.4. Representao esquemtica da molcula dupla fita de DNA.

O RNA semelhante ao DNA, porm no forma fita dupla. Alm disso,

o acar do RNA uma ribose, diferente do DNA, que uma desoxirribose.
Outra caracterstica particular do RNA que as bases nitrogenadas que for-
mam seus nucleotdeos apresentam pequena diferena em relao ao DNA. No
RNA, a timina substituda pela uracila (U), que tambm pareia com a adenina.
O RNA possui trs classes principais: RNA mensageiro (mRNA), que
contm a informao gentica para a produo de protenas; RNA transporta-
dor (tRNA), responsvel por carrear o aminocido especfico para o stio de
sntese proteica; e RNA ribossomal (rRNA), que forma grande parte da massa
do ribossomo. no ribossomo que ocorre a sntese proteica.
2.1.3 Caractersticas fsicas da molcula de DNA
Uma caracterstica dos cidos nucleicos a sua capacidade de absorver luz

ultravioleta no comprimento de onda de 260 nm. Isso ocorre por causa das
ligaes duplas dos anis que formam as bases nitrogenadas. Essa caractersti-
ca favorece medies que utilizam a espectrofotometria como ferramenta e que
permitem quantificar as molculas de DNA presentes em determinada soluo
e tambm obter informaes sobre as caractersticas da fita. Como as bases se
encontram no interior da fita, sua absorvncia menor quando comparada
mesma molcula desnaturada, pois, quando as fitas esto separadas, elas expem
as bases, permitindo a adsoro de maior quantidade de luz ultravioleta (UV).
Uma das formas mais comuns de separar as fitas de DNA aumentando-se
a temperatura. Isso induz o aumento da energia cintica na molcula, causando
o rompimento das pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas, alm de
romper as interaes hidrofbicas processo denominado desnaturao. A
desnaturao tambm ocorre a partir da alterao de alguns parmetros fsicos,
como o pH do meio, entre outros.
A capacidade de aumentar a absoro da luz UV pela molcula de DNA,
utilizando o calor para desnatur-la, denominada hipercromia. Esse fenme-
no reversvel: com a diminuio da temperatura, as fitas de DNA se unem
lentamente, fazendo a absoro de luz voltar absoro inicial. A reorga-
nizao das cadeias evidenciada pela diminuio da leitura de absoro,

fenmeno chamado hipocromia.
Ao se avaliar a relao entre a temperatura e a absorvncia de uma amostra,
observa-se que, conforme a temperatura aumenta, tambm aumenta a absor-
vncia. Isso acontece porque o aumento da temperatura das fitas abre as
duplas, permitindo maior interao das bases com a luz UV e aumentando
sua absoro. O ponto mdio de absoro, denominado Tm, representa o
ponto mdio da curva de aumento de temperatura versus absoro da luz UV
e define a temperatura na qual a metade das cadeias est dissociada.
O Tm importante, pois permite avaliar a quantidade de citosina e guanina
presente no DNA quanto mais C e G, maior a interao, por causa da forma-
o de trs pontes de hidrognio. Assim, em molculas com alto teor de C e G,
o Tm mais alto. Essa caracterstica distingue as molculas de diferentes DNAs.
Para a manuteno da estrutura da dupla fita, tambm existem as interaes
hidrofbicas dos anis das bases. Essas interaes so evidenciadas quando se
coloca o DNA em uma soluo contendo compostos que desestruturam as
interaes, como detergentes ou o sal trifluoroacetato. Quando essas substncias
so acrescentadas, o Tm diminui; quando elas so retiradas, ocorre a reassocia-
o, assim como ocorre com o aquecimento e o resfriamento da molcula. Nesse
caso, o tempo de reassociao depende do tamanho da molcula, o que per-
mite calcular o tamanho do DNA por meio de clculos utilizando dados desses
experimentos. Essa anlise importante ao se tratar de DNAs desconhecidos.
Alm das foras de interao, tambm h foras de repulso, exercidas
pelos grupos fosfatos dos nucleotdeos, na dupla fita. Assim, se o DNA for
inserido em uma soluo que contenha ons que minimizem a repulso, haver
maior estabilidade da molcula. Isso ocorre quando acrescentamos soluo
ctions como o Na+.
2.2 Duplicao da molcula de DNA
As informaes contidas no DNA residem na ordem das bases nitro-

genadas que o compem. No momento da duplicao, essas informaes
devem ser passadas para as fitas filhas. Porm de que forma possvel pre-
servar essa informao?
Desde a publicao do trabalho de Watson e Crick sobre a estrutura do
DNA, concebeu-se a possibilidade de duplicao do DNA. Nesse trabalho,
alm da descrio da dupla hlice, os cientistas ressaltaram que a duplicao
do DNA ocorria de forma semiconservativa, ou seja, a dupla hlice recm-
formada seria um hbrido entre uma nova cadeia e uma cadeia do DNA que
dera origem a ela. Assim, a complementaridade entre as bases uma forma de
preservar as informaes contidas no DNA.
A duplicao de forma semiconservativa foi comprovada nos experimen-
tos de Matthew Meselson (1930) e Franklin Stahl (1929), em trabalho
publicado em 1958. Meselson e Stahl incubaram bactrias Escherichia coli
em um meio onde a nica fonte de nitrognio eram os istopos de N15,
no radioativos, mas mais pesados que o N14. As bactrias eram mantidas
durante vrias geraes nesse meio, a fim de incorporar nitrognio em seu
DNA. Posteriormente, eram retiradas do meio e colocadas em meio conten-
do N14. Com esse experimento, Meselson e Stahl desejavam avaliar se as
novas molculas de DNA eram hbridas, ou seja, parte sintetizada e parte
originria da fita antiga.
Os pesquisadores lisaram as membranas das clulas e isolaram o seu DNA; esse
material foi posteriormente centrifugado em gradiente de densidade. Meselson e
Stahl observaram que havia molculas de DNA leves na parte superior do tubo,
molculas com peso intermedirio e molculas mais pesadas. Assim, concluram
que a duplicao do DNA era semiconservativa, conforme suposto anos antes
por Watson e Crick, porque as molculas leves s continham N14, as molculas
pesadas continham somente N15, e as molculas intermedirias eram formadas por
fitas hbridas contendo os dois istopos do nitrognio.

2.2.1 A duplicao do DNA e o ciclo celular
A necessidade de duplicao do DNA algo que ocorre quando a pr-

pria clula precisa duplicar todo o seu material para formar uma nova clula. A
duplicao celular parte integrante do ciclo celular e deve estar relacionada

sinalizao recebida pela clula em determinado momento de sua vida.
O ciclo celular formado por cinco fases: G1, S, G2, M e G0. Na
fase G0, a clula encontra-se em perodo de dormncia, com o o maquinrio
celular voltado para as funes celulares. O ciclo de replicao se inicia me-
diante sinalizaes que induzem a clula a entrar no perodo G1. Nessa fase,
ocorre a sntese de protenas, enzimas e RNA. Em seguida, a clula entre na
fase S, na qual h a duplicao do material gentico. Na fase G2, ocorre a
sntese do material necessrio para a duplicao celular. J na fase M, ocorre
a duplicao da clula como um todo.
A duplicao do DNA na fase S deve ter uma velocidade tal que acom-
panhe todo o processo do ciclo celular da clula. Clulas procariticas pro-
movem sua duplicao em tempos muito mais curtos do que as clulas de
organismos eucariticos. O tempo de gerao da E. coli, por exemplo, de
aproximadamente 20 minutos; j as clulas animais em cultura apresentam ciclos
celulares de at 24 horas.
A duplicao se inicia em pontos especficos do DNA, denominados
ORIs (origens de replicao), uma regio rica em sequncias GATC, com
aproximadamente 15 a 20 nucleotdeos. As sequncias GATC so stios de
metilao do DNA nas duas fitas responsveis pela ligao do DNA mem-
brana celular. na regio de ORI que se inicia a forquilha de replicao. Essa
forquilha pode ser ativada mais de uma vez nos procariotos e somente uma vez
nos eucariotos. No DNA humano podem existir vrios ORIs. Quando h a
ativao, verifica-se a abertura das fitas de DNA na regio de ORI, formando-
se a forquilha de replicao. Isso ocorre com o auxlio da enzima helicase, que
capaz de desfazer as pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas, com
gasto de trifosfato de adenosina (ATP).
Aps a abertura, as fitas so estabilizadas pela ao das topoisome-
rases. As protenas estabilizadoras de fita simples, ou SSB (do ingls single
strand binding proteins), protegem a fita aberta. Essas protenas se ligam ao
DNA de forma cooperativa e impedem que o DNA aberto se feche, manten-
do o DNA de fita simples numa conformao ideal para a duplicao, alm
de protegeram a fita de ser degradada por nucleases.
Com as fitas abertas, a duplicao se inicia pela ao da enzima primase,

responsvel pela insero de um RNA iniciador, chamado primer. O primer
um conjunto de nucleotdeos com cerca de 20 pares de bases; ele serve para
promover uma terminao 3-OH livre. A terminao livre importante
para o incio da sntese da fita de DNA.
A enzima responsvel pela sntese da cadeia complementar a DNA
polimerase. Essa enzima necessita da extremidade 3-OH livre para iniciar o pro-
cesso de elongamento da fita, ou seja, a adio de nucleotdeos na extremidade
3-OH livre de uma regio pareada do DNA, possibilitando o crescimento da
cadeia no sentido 5-3. A DNA polimerase possui trs funes distintas: poli-
merizao (insero de nucleotdeos na direo 5-3), funo exonuclease
no sentido 3-5 (edio e correo) e funo exonuclease no sentido 5-3
(retirada dos primers).
A DNA polimerase dimrica e capaz de sintetizar as duas fitas ao mes-
mo tempo; porm, como a sua sntese se d na direo 5-3, uma das fitas
polimerizada continuamente, ao passo que a polimerizao da outra se d
de forma fragmentada, uma vez que as fitas do DNA possuem polaridades
opostas. A fita sintetizada de forma contnua denominada fita leading e a
fita fragmentada denominada fita lagging. Na fita fragmentada, necessrio
que haja constante insero de primers para haver extremidades 3-OH livres;
assim, a atuao da primase contnua nessa fita. Os fragmentos obtidos pela
sntese descontnua so denominados fragmentos de Okazaki. Eles possuem
cerca de 100 a 200 nucleotdeos de comprimento, sendo intermediados pe-
los primers sintetizados pelas primases. Com o final da sntese e a substituio
dos primers por DNA, a enzima DNA ligase liga os fragmentos que foram
formados na fita contnua e na fita descontnua para que haja, no final, uma fita
inteira de DNA complementar ao seu molde.
A terminao da duplicao ocorre de diversas formas. No DNA circular,
de procariotos e mitocndrias, o trmino da sntese se d quando as duas for-
quilhas de replicao se encontram numa regio denominada Ter. Para terminar
a replicao, ela foi arranjada de maneira a formar uma espcie de armadilha
onde a forquilha de replicao entre e no possa sair. Isso obtido pela liga-
o da protena Tus regio Ter.
Nas clulas de DNA linear, h um problema na replicao na extremidade

da fita tardia. Para solucion-lo, ocorre a sntese dos telmeros. Os telmeros
so pores terminais dos cromossomos que no contm informao para as
clulas e que possuem vrias cpias de uma sequncia consenso que so adi-
cionadas, pela telomerase, fita tardia no final de replicao. Na fita leading,
a terminao ocorre naturalmente ao final do molde parental.
2.3 Transcrio
Existem semelhanas e diferenas entre o processo de duplicao do DNA e

a sntese de RNA. Na duplicao, deve-se ter o mximo de cuidado para que
as informaes sejam transferidas de forma fidedigna, ou seja, sem que nenhuma
informao seja perdida. Na transcrio, que a sntese de RNA utilizando
a molcula de DNA como modelo, retratam-se as necessidades da clula em
determinado momento de sua vida. Somente sero produzidos RNAs para a
sntese de protenas necessrias para a clula naquele momento determinado de
sua existncia. na transcrio que a clula regula sua expresso gnica.
A transcrio um processo executado pela enzima RNA polimerase e
assemelha-se muita duplicao, sendo a fita resultante nica e formada por
nucleotdeos de RNA. Somente uma das fitas do DNA serve como molde
para a fita de RNA que ser formada. A transcrio segue as mesmas regras
de pareamento da duplicao do DNA, mas a timina substituda pela uraci-
la, que pareia com a adenina.
Assim como o DNA, o RNA formado por nucleotdeos compostos por
um radical de cido fosfrico, uma base nitrogenada e um acar. No RNA,
esse acar a ribose. As bases nitrogenadas do RNA so as mesmas do
DNA, com exceo da timina, que, no RNA, substituda pela uracila.
Em eucariotos, existem trs RNA polimerases diferentes. A RNA polimerase
I responsvel pela sntese de RNA ribossomal; a RNA polimerase II sintetiza
o RNA que origina as protenas (RNA mensageiro); e a RNA polimerase III
responsvel pela sntese de RNAs menores e de RNA transportador.
Sabe-se que grande parte do genoma humano no funcional, ou seja, no

gera nenhuma protena. Assim, de se esperar que grande parte do DNA
no seja transcrita. Essa regio no transcrita denominada intron, e a regio
funcional denominada xon.
Para que a RNA polimerase possa iniciar a transcrio e dissociar-se depois
do gene, necessrio um estmulo. No caso de genes constitutivos no h
esse tipo de regulao, pois eles sempre esto sendo transcritos. A regulao
ocorre principalmente em genes que se expressam somente em determinados
momentos da vida da clula. Esse processo chamado regulao da expresso
gnica. A RNA polimerase no necessita de primer para iniciar a transcrio.
No DNA existe uma regio, que antecede a regio a ser transcrita, deno-
minada regio promotora. Nela existem sistemas que auxiliam a RNA polime-
rase a reconhecer o local onde deve iniciar a transcrio. Nos procariotos, essa
regio denominada caixa de Pribnow e, nos eucariotos, denominada caixa
de TATA, por causa das repeties TATA presentes nela.
A transcrio se inicia na regio promotora, e o primeiro nucleotdeo a ser
transcrito denominado +1 (stio de incio). Regies que antecedem ao stio
de incio recebem nmeros negativos e crescentes, ao passo que as regies
posteriores recebem nmeros positivos e crescentes.
A fase de reconhecimento da regio promotora crtica na regulao da
expresso gnica, porque define se um gene ser transcrito ou no. Existem duas
sequncias altamente conservadas nos genes. A primeira localiza-se na regio 10
e tem a sequncia TATAAT em repeties. A segunda est na regio 35 e
possui a sequncia TTGACA. A RNA polimerase reconhece a sequncia em
35 e inicia a sua interao com a fita de DNA. Essa interao se fortalece no

momento em que a RNA polimerase chega regio 10.
Figura 2.5. Representao esquemtica dos processos de transcrio e traduo:

A) viso geral do fenmeno dentro de clulas eucariotas e procariotas; B) RNA
transportador, evidenciando a regio onde encontramos a trinca de bases nitrogenadas
chamada anticdon; C) interao do RNA mensageiro com o RNA transportado e
com as subunidades ribossomais, representando a sntese de uma cadeia polipeptdica.
2.3.1 Tipos de RNA
2.3.1.1 RNA mensageiro

O RNA mensageiro de procariotos, ou mRNA, policistrnico, isto ,
uma molcula possui informaes de mais de um gene controlado pelo mesmo
promotor. Tambm existem sequncias, denominadas sequncias lderes, que
so transcritas, mas no traduzidas. So sequncias importantes no momento
do reconhecimento do mRNA pelo ribossomo. Esse mecanismo de transcrio
fundamental nas bactrias por aumentar a velocidade da transcrio, com
vrias protenas podendo ser sintetizadas ao mesmo tempo. Geralmente os
RNAs traduzem vrias cpias da mesma protena ou de protenas diferentes
que participam de uma mesma via metablica. Em procariotos, o mRNA tem
vida curta, no processado, mas transcrito, traduzido e logo degradado.
Nos eucariotos, o mRNA um pouco diferente, sofrendo processa-
mento de perda dos ntrons e adio de protees que aumentam o tempo
de vida do RNA. Essas modificaes so chamadas modificaes ps-
transcricionais ou processamento do RNA. O RNA de eucarioto, quando
transcrito, no est completamente maduro e chamado transcrito primrio
ou pr-RNA. Para que o RNA possa exercer sua funo biolgica, ne-
cessrio que ele passe pelo processamento.
No mRNA de eucariotos, essas modificaes constituem principalmente a
colocao de estruturas protetoras e sinalizadoras, e na retirada de partes que
no geraro protenas (splicing), sendo a principal modificao a insero de
nucleotdeos na extremidade 5 (cap) e 3 (poliadenilao).
O splicing, retirada de ntrons do transcrito primrio, realizado com o
auxlio de um complexo de ribonucleoprotenas denominado spliceossomo.
Esse processo ocorre em duas etapas e aps duas reaes de transesterificao,
nas quais h a liberao do ntron na forma de lao. Tambm h ntrons que
participam de sua prpria retirada, num processo denominado autosplicing.
A adio do cap 5 se d pela ao da guanilil-transferase, quando se
insere no DNA um resduo de guanina por meio de ligao covalente. O cap
protege o RNA da degradao por exonucleases, alm de auxiliar no reconhe-
cimento pelo ribossomo do local onde se iniciar a sntese proteica.
A poliadenilao ocorre ao trmino da transcrio e auxiliada pela enzima

poli-A polimerase. Alm de proteo, a cauda poli-A auxilia no processo de
trmino da transcrio.
2.3.1.2 RNA ribossmico

O RNA ribossmico, ou rRNA, um tipo de RNA que participa da
estrutura do ribossomo. Os ribossomos so estruturas mistas de rRNA e pro-
tenas nas quais ocorre a sntese de protenas.
Nos procariotos, o gene que codifica o rRNA se encontra em sequncia,
e os genes so transcritos em tandem. Os trs tipos de rRNA so 16S, 23S
e 5S. Logo aps a sua transcrio, os RNAs so processados pela enzima
Rnase II responsvel por uma srie de clivagens , resultando na liberao
dos rRNAs. O processamento at a forma madura dos rRNAs feito por
outras ribonucleases.
Em eucariotos, o processo muito semelhante, havendo quatro tipos de
rRNA: 5S, 5,8S, 18S e 28S. Como nos procariotos, seus genes so trans-
critos de forma a fazer parte de uma mesma e longa unidade de transcrio,
produzida pela RNA polimerase I. Somente o 5S no se encontra prximo
dos outros, e seus genes esto espalhados pelo genoma do indivduo. Sua
transcrio feita pela RNA polimerase III e no pela I.

2.3.1.3 RNA transportador
Nos procariotos, os genes que codificam os RNAs transportadores, ou
tRNAs, podem ou no estar agrupados e podem codificar o mesmo tRNA
ou tRNAs diferentes. Quando esto unidos, so separados no processa-
mento. O gene do tRNA no policistrnico, e esses genes at podem ser
transcritos juntos, mas a ao de nucleases altamente especficas os separa, e
eles geram extremidades 5 e 3. A molcula de tRNA transcrita ao mesmo
tempo, sendo metilada e adquirindo estrutura secundria, muito importante no
seu processamento. Na extremidade 3, sempre h a adio da sequncia de
nucleotdeos ACC, que ir formar o primeiro brao do tRNA no total, o
tRNA apresenta cincos braos, sendo quatro deles fixos e um varivel. Cada
brao responsvel por uma ao especfica que ir auxiliar na funo do
tRNA de transportar o aminocido certo para o stio de sntese proteica. No

brao que contm ACC, existe o encaixe do aminocido que ser trans-
portado. Esse encaixe auxiliado pela enzima aminoacil-tRNA sintetase. O
segundo brao reconhece o ribossomo, o terceiro contm o cdigo comple-
mentar sequncia do mRNA (anticdon) e o quarto contm o encaixe da
aminoacil-t RNA sintetase no momento em que carreia o aminocido. O
quinto brao varivel no possui funo especfica.
Nos eucariotos, os tRNAs so muito semelhantes; sintetizados separada-
mente, seus braos so especficos para cada tipo de aminocido e apresentam
estrutura terciria.
2.3.2 Regulao da expresso gnica
Todos os organismos possuem formas de regulao de quando e quais

genes sero transcritos em determinado momento da vida. Alguns genes, ditos
constitutivos, so transcritos continuamente, pois so fundamentais na formao
de estruturas celulares bsicas para o perfeito funcionamento da clula, alm
de participarem de rotas metablicas indispensveis, como a gliclise. Outros
genes, ditos induzveis, somente so transcritos quando a protena codificada
por eles necessria clula. Esse processo economiza a energia gasta pela
clula na sntese e na degradao de protenas.
Para as protenas constitutivas, existem sequncias que antecedem a seus
genes no DNA, denominadas promotores fortes. Essas sequncias so facil-
mente reconhecidas pela RNA polimerase e muito preservadas. Nos genes
induzveis, esses promotores no esto acessveis RNA polimerase a todo
momento; esto acessveis apenas quando h um estmulo externo ou interno
para a sntese da protena.
Em eucariotos multicelulares, a resposta direta s condies externas limi-
tada. A maioria das clulas encontra-se em meios uniformes, e existe uma ao
coordenada que possibilita a sua diferenciao, culminando no desenvolvimen-
to do organismo. Em determinado momento, as clulas sintetizam e acumulam
diferentes mRNAs e protenas que possibilitaro a diferenciao.
A regulao da expresso gnica em eucariotos se d, na maioria das vezes,

pela ao de hormnios, principalmente esteroides, sendo pouco afetada por
mudanas ambientais.
Nos procariotos, a ausncia ou a presena de nutrientes no meio influencia
muito a expresso proteica. Na presena de determinado nutriente, aumenta a
expresso das enzimas responsveis pelo metabolismo desse nutriente.
Em 1961, surgiu o modelo de peron. Existem vrios perons, mas o mais
estudado o peron lac. Nele, o RNA policistrnico e responsvel pela
sequncia das trs protenas envolvidas no metabolismo da lactose. O gene
lac Z codifica a enzima -galactosidase, responsvel pela quebra da lactose
em glicose e galactose. O gene lac Y responsvel por codificar uma protena
permease que permite a entrada da lactose na clula. O gene lac A codifica a
enzima transacetilase, que possui funo desconhecida.
Constitutivamente, a clula sintetiza um repressor que se sobrepe ao pro-
motor no mRNA da clula, impedindo que ele seja transcrito. No momento
em que h ausncia de glicose e presena de lactose, ocorre a ligao da lacto-
se com o repressor, inativando-o, a fim de que no haja nenhum impedimento
para que o promotor impea a transcrio dos genes lac Z, lac Y e lac A.
Assim, a clula sintetiza o maquinrio que permitir o aumento da entrada de
lactose nela e a quebra da lactose em galactose e glicose, para ser posterior-
mente usada na via glicoltica, visando obteno de energia.
As vias degradativas so induzidas, em geral, quando h a presena do seu
substrato. Nas vias biossintticas, pelo contrrio, a ausncia de determinado
nutriente estimula a sua sntese, como o caso da via de sntese do triptofano,
que se assemelha do lac peron.
Nos eucariotos, muitas so as formas de regulao da expresso gnica.
No trmino da transcrio de determinado gene, a expresso gnica pode no
terminar ali e continuar, transcrevendo outro gene. Outra forma de regulao
a que ocorre com algumas protenas ribossomais que, quando em excesso,
ligam-se aos genes que as originariam e impedem a sua transcrio. Tambm
possvel encontrar partes do DNA onde ocorre metilao. A presena da
metila inibe a transcrio do gene daquela regio. A regulao tambm se d
no processamento do RNA, pois, com a adio da cauda poli-A do cap 5, o
tempo de vida de determinado mRNA aumenta, tornando possvel a traduo

de mais protenas a partir dele.
2.4 Traduo
2.4.1 O cdigo gentico
Como j mencionado, a descoberta do DNA ocasionou uma grande corri-

da para decifrar as informaes contidas nessa molcula e como elas eram trans-
mitidas. Sabe-se que as estruturas de constituio e de atividade em uma clula
so formadas por protenas. Como ento relacionar a sequncia do DNA de
um indivduo com as protenas necessrias sua sobrevivncia? Para tal, deve-
se levar em considerao que as protenas j haviam sido bem estudadas na
poca de descoberta do DNA e que, desde a dcada de 1950, j se sabia
que cada protena era constituda de sequncias de aminocidos.
a sequncia de nucleotdeos que determina a sequncia dos aminocidos
que formar a protena. A relao entre o DNA e os aminocidos deno-
minada cdigo gentico, que lido em trincas denominadas cdons. Cada
cdon, ou seja, trs nucleotdeos, corresponde a determinado aminocido. Na
sntese de uma protena, os nucleotdeos de DNA so transcritos para RNA,
e a informao contida no RNA gera a sequncia de aminocidos da protena
a ser traduzida.
Como existem quatro nucleotdeos diferentes, sua combinao dois a dois
resultaria em uma probabilidade de 16 aminocidos diferentes. Como existem
20 aminocidos, essa probabilidade no era vivel. Por isso, percebeu-se que,
na verdade, cada aminocido gerado por uma trinca de nucleotdeos, o que
resulta na probabilidade de formar 64 aminocidos. Cada trinca, ou cdon,
gera um aminocido; nos humanos, somente 61 cdons geram aminocidos os
trs restantes so cdons de terminao, no especificando nenhum amino-
cido. Em eucariotos, os cdons de terminao so, na sua grande maioria,
UAA, UGA e UAG. O cdon de iniciao, tanto em procariotos quanto
em eucariotos, o AUG, que codifica a metionina, sendo esse aminocido,
portanto, o primeiro em todas as protenas. Em E. coli, o cdon GUG tam-

bm pode ser utilizado.
Como se explica o fato de haver 61 cdons diferentes e somente 20 ami-
nocidos? Em 1961, Marshall Nirenberg e colaboradores iniciaram pesquisas
utilizando sistemas in vitro que permitiam fazer combinaes e determinar quais
aminocidos correspondiam a cdons especficos. Com base nesses achados,
novos estudos descobriram os cdons e seus aminocidos correspondentes,
percebendo-se que mais de um cdon gerava um mesmo aminocido, o que
j havia sido previsto. Essa caracterstica do cdigo gentico chamada dege-
nerao, por isso diz-se que o cdigo gentico degenerado. A partir desses
estudos, montou-se o quadro 2.1.
Quadro 2.1. Cdigo gentico.

Segunda base
U C A G
UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys
UUC UCC UAC UGC
U UUA Leu UCA UAA Term UGA Term
UUG UCG UAG UGG Trp
CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg
CUC CCC CAC CGC
C CUA CCA CAA Gln CGA
Primeira base
CUG CCG CAG CGG

AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser
AUC ACC AAC AGC
A
AUA ACA AAA Lys AGA Arg
AUG Met ACG AAG AGG
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly
GUC GCC GAC GGC
G GUA GCA GAA Glu GGA
GUG GCG GAG GGG
Apenas a metionina (Met) e o triptofano (Trp) possuem somente um

cdon; todos os outros aminocidos so gerados por mais de um cdon. A
degenerao do cdigo gentico permite que exista mais de um tRNA para
o mesmo aminocido, ou at mesmo que um mesmo tRNA possa parear com
cdons diferentes. Os dois processos so possveis, pois, caso haja apenas
uma mudana no ltimo nucleotdeo do cdon, existe a ligao do tRNA.

Ocorre o que se chama pareamento oscilante, pois o pareamento com a ltima
base menos rgido.
O cdigo gentico, alm de degenerado, possui muitas outras caractersticas:
sendo um cdigo no ambguo ou seja, um cdon codifica apenas um nico
aminocido , o cdigo universal, pois igual em todos os seres, desde bac-
trias at os seres humanos, o que comprova ser essa forma de armazenamento
de informaes muito eficiente e ter-se mantido ao longo de milhes de anos
de evoluo.
2.4.2 Sntese proteica
A sntese proteica um processo complexo que envolve grande variedade

de macromolculas. Ela se d nos ribossomos do citoplasma e nos ribossomos
aderidos ao retculo endoplasmtico rugoso, cujo nome deriva da presena dos
ribossomos ligados sua membrana.
Aps a transcrio nos procariotos e a transcrio e o processamento nos
eucariotos, o mRNA maduro est pronto para transmitir, na forma de uma
protena, as suas informaes. Quando se encontra no citoplasma, o mRNA
reconhecido pelo ribossomo. Isso decorre da interao do mRNA com o
rRNA do ribossomo, mediante uma sequncia no mRNA, denominada stio
de ligao dos ribossomos (RBS), de 30 a 40 nucleotdeos. Essa regio
contm o cdon AUG de iniciao e uma sequncia capaz de fazer parea-
mento com o rRNA, chamada sequncia de Shine-Delgarno. Nos eucariotos,
tambm ocorre o reconhecimento do cap do mRNA, que auxilia no reconhe-
cimento do incio da traduo.
O ribossomo possui dois stios diferentes: A e P. No stio A, d-se a
ligao do aminoacil tRNA; no stio P, ocorre a ligao tanto do aminoacil
tRNA quanto do peptidil tRNA. Aps o reconhecimento da sequncia de
Shine-Delgarno, o mRNA se liga ao ribossomo, ocorrendo a interao entre as
duas subunidades ribossomais. A partir dessa interao, o cdon de iniciao
vai se localizar no stio A do ribossomo, permitindo que se d a interao
dele com o metionil tRNA. Aps a ligao do tRNA ao cdon do mRNA,

o ribossomo desliza sobre o mRNA, de forma que o cdon inicialmente
localizado no stio A passe a se localizar no stio P, deixando o stio A
livre. Os ribossomos deslocam-se na direo 5-3, sintetizando a protena no
sentido amino-terminal para carboxi-terminal. Quando o stio A se encontra
vazio, o ribossomo permite a interao de outro aminoacil tRNA, que
conter o anticdon especfico do cdon do mRNA que se encontra
no stio A. Assim, o segundo aminocido incorporado ao peptdeo em
formao. A ligao entre os aminocidos realizada pela ao da peptidil
transferase, que liga o aminocido, ou a sequncia j formada, ao aminocido
preso ao tRNA no stio A, alongando a cadeia. O tRNA desativado, que
ocupava o stio P, deixa o complexo ribossmico para ser novamente ativado
no citoplasma. Esse processo acontece incessantemente e aos poucos forma-se
a estrutura primria da protena que est sendo sintetizada. O ltimo cdon
lido no mRNA deve ser um fator de trmino (UAA, UAG ou UGA), que
no codifica nenhum aminocido mas indica o final da sntese proteica.
A sntese proteica termina com a desativao do complexo ribossomo-mR-
NA, a desativao do tRNA e a formao da protena em sua estrutura primria.
2.5 Mtodos de extrao de DNA
Os protocolos utilizados para a extrao de DNA so muito parecidos,

diferindo apenas em alguns detalhes relativos natureza do material biolgico
de onde o DNA ser extrado. Basicamente, consistem na lise celular e na
purificao do DNA obtido.
A lise celular ocorre mediante o rompimento das membranas celulares, que
libera o DNA contido no ncleo. Para esse processo, so utilizados deter-
gentes que desestabilizam os lipdios das membranas. Nessa fase, comum
o uso de cido etilenodiaminotetractico (EDTA), que quela ons bivalentes
que funcionam como cofatores de DNAses, inibindo-as. Aps a liberao do
material gentico, seguem-se as fases de purificao do DNA.
A fase de purificao consiste em reaes enzimticas ou interaes entre

macromolculas que favorecem a retirada de todos os contaminantes do
DNA. As principais molculas contaminantes so as protenas, principalmente
as histonas, por estarem intimamente ligadas ao DNA e ao RNA.
O RNA geralmente retirado atravs do uso de RNAses que iro
degrad-lo, permitindo a sua retirada, juntamente com molculas menores, por
meio de dilise.
Os contaminantes proteicos podem ser digeridos pela ao da proteinase K;
porm, o agente desproteinizante mais comum o fenol, um excelente desnatu-
rador de protenas. Por ser um composto orgnico, o fenol atua desnaturando as
protenas e transferindo-as, ao mesmo tempo, para uma fase orgnica, enquanto
o DNA, que no interage com o fenol, permanece na fase aquosa. O clorofr-
mio tambm um excelente desnaturante e pode atuar em conjunto com o fenol
como estabilizador da juno entre as fases aquosa e fenlica. O uso da mistura
fenol/clorofrmio diminui a quantidade de soluo aquosa retida na fase orgni-
ca, melhorando o rendimento da extrao. Nessa fase de desnaturao, pode
ocorrer formao de espuma por causa das protenas desnaturadas. A formao
de espuma impedida com o uso de lcool isoamlico no processo.
Aps a desnaturao das protenas, a soluo centrifugada para a to-
tal separao das fases aquosa e orgnica. A fase aquosa contm o DNA;
j as protenas desnaturadas localizam-se em um anel intermedirio entre as
duas fases. O DNA contido na fase aquosa precipitado com etanol. Na
presena de altas concentraes de ctions monovalentes, o etanol induz uma
mudana estrutural transitria nas molculas dos cidos nucleicos, ocasionando
sua agregao e precipitao. Os ctions utilizados na precipitao, assim
como pequenas molculas orgnicas ainda presentes na preparao, podem ser
removidos por lavagem com etanol 70%. Ao final do processo, o DNA
solubilizado em gua Milli-Q autoclavada e livre de nucleases, sendo armaze-
nado em baixa temperatura. A seguir, apresenta-se um protocolo de extrao
de DNA genmico de clulas sanguneas.
2.5.1 Extrao de DNA genmico de sangue humano
Preparao do sangue
1) Transferir 300 mL de sangue total para cada tubo de centrfuga. Adi-
cionar 900 mL de tampo para lise de clulas sanguneas em cada tubo e
inverter o tubo cuidadosamente, a fim de homogeneizar a mistura. Incubar a
mistura em temperatura ambiente por 10 minutos, invertendo-se o tubo de vez
em quando.
2) Centrifugar os tubos em uma microcentrfuga por 20 segundos, em
velocidade mxima, em temperatura ambiente.
3) Descartar todo o sobrenadante, deixando cerca de 20 mL.
4) Ressuspender o pellet1 de clulas brancas na pequena quantidade de
sobrenadante deixada em cada tubo. Juntar as clulas ressuspensas em um
nico tubo.
5) Centrifugar novamente e retirar todo o sobrenadante.
2.5.2 Extrao do DNA genmico
1) Ressuspender as clulas sedimentadas em 567 mL de Tris EDTA (TE).

2) Adicionar 3 mL de proteinase K2 (20 mg/mL) e 30 mL de SDS3
10%.
3) Incubar a mistura a 37C por 1 hora.
4) Adicionar 100 mL de NaCl 5 M.
5) Em seguida, adicionar 80 mL de soluo CTAB4/NaCl (CTAB 10%,
NaCl 1,5 M), misturando os componentes suavemente.
6) Incubar por 10 minutos, a 65C.
7) Adicionar 1 V (~800 mL) de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1).
8) Misturar as fases e centrifugar por 5 minutos, a 1.400 rpm, em micro-
centrfuga tipo Eppendorf.
9) Transferir a fase aquosa para um novo tubo.
1
Precipitado de clulas.
2
A proteinase K auxilia na lise celular.
3
Detergente que lisa as membranas celulares.
4
Brometo de trimetilamnio, um complexante de protenas que auxilia na precipitao.
10) Adicionar 1 V de fenol/clorofrmio/lcool isoamlico (25:24:1).

11) Misturar as fases e centrifugar por 5 minutos a 1.400 rpm em micro-
centrfuga tipo Eppendorf.
12) Transferir a fase aquosa para um novo tubo.
13) Adicionar 0,6 V de isopropanol; inverter o tubo vrias vezes.
14) Centrifugar por 5 minutos, a 1.400 rpm, em microcentrfuga tipo
Eppendorf.
15) Lavar o material com etanol 70% gelado e centrifugar por 5 minutos,
a 1.400 rpm, em microcentrfuga tipo Eppendorf.
16) Ressuspender o pellet em 50 mL de gua Milli-Q.
2.6 Mtodos de anlise e quantificao de DNA
2.6.1 Eletroforese
A eletroforese a principal tcnica utilizada em biologia molecular para

a anlise de DNA. Ela permite separar, identificar e purificar os fragmentos
de DNA quando no possvel utilizar outras tcnicas, como os gradientes
de centrifugao. uma tcnica rpida, que permite excelente resoluo dos
fragmentos de DNA.
A eletroforese utilizada na separao de vrias macromolculas e consiste
na migrao das partculas nesse caso, de fragmentos de DNA atravs de
um gel durante a aplicao de uma diferena de potencial. Assim, em um polo
da eletroforese, fornecida carga negativa e, no outro, positiva. Como os gru-
pos fosfatos possuem carga negativa, o DNA corre, ento, do polo negativo
para o positivo. Essa corrida se d atravs de uma malha, que auxiliar na
separao das molculas. Para formar essa malha, utilizam-se gis que, quando
gelificados ou seja, quando se tornam slidos , formam as malhas dentro
de suas estruturas. Os gis mais utilizados em biologia molecular so os de
poliacrilamida e os de agarose.
O gel de poliacrilamida formado pela reao da acrilamida com a bi-

sacrilamida. A acrilamida uma molcula linear, e a bisacrilamida apresenta
forma de T. Misturando essas duas molculas, forma-se a malha. Diferentes
relaes entre as concentraes dessas molculas permitem criar diferentes gra-
dientes de separao. Para preparar o gel de poliacrilamida, devem-se misturar
as duas substncias formadoras, nas concentraes desejadas, e adicionar o
Temed, que atua como catalisador da polimerizao.
O gel de agarose formado somente por agarose. A agarose um polissa-
cardeo e forma uma malha que retm as molculas durante a migrao. Depen-
dendo da concentrao de agarose, h diferenas no gradiente de separao.
Quanto maior a concentrao, mais fechados so os buracos da malha e maior
a reteno de molculas. Para preparar um gel de agarose, faz-se a mistura do
p de agarose com uma soluo tampo. Aps realizar a fuso da agarose,
coloca-se brometo de etdio, um corante capaz de se intercalar entre as bases
do DNA e que fluoresce quando excitado com luz UV. Por sua capacidade
de interao com as bases do DNA, o brometo de etdio considerado um
corante carcinognico, devendo o seu manuseio ser efetuado com grande cui-
dado. Quando a mistura esfria, o gel est slido. Esse endurecimento feito
diretamente na cuba de corrida da amostra. Antes da total solidificao, deve-
se colocar um pente de eletroforese, pois ele cria poos que sero utilizados
para a colocao das amostras.
A corrida de DNA se d em conjunto com duas molculas, adicionadas
amostra de DNA. Tais molculas so denominadas monitores de corrida. Os
monitores mais utilizados so o azul de bromofenol e o xilenocianol. O azul
de bromofenol possui cor azulada e corre como um DNA pequeno, ao passo
que o xilenocianol possui cor esverdeada e corre como um DNA maior.
Aps a corrida, o DNA visualizado mediante transiluminao de luz UV,
que excita o brometo de etdio, o qual fluoresce com uma cor alaranjada
(590 nm). Para o armazenamento das informaes contidas no gel, existem
aparelhos com cmeras fotogrficas acopladas que permitem fotografar e trans-
ferir para o computador a fotografia do gel.
A B C
D E F
Figura 2.6. Etapas do preparo de uma eletroforese em gel de agarose: A) cuba de

eletroforese horizontal com o pente e o suporte para preparo do gel; B) suporte com
pente pronto para receber a agarose aquecida; C) cuba preparada para a gelificao
do gel; D) agarose aquecida para preparo do gel; E) aparato de eletroforese
preparado para a corrida; F) fotografia de um gel de eletroforese mostrando uma
corrida de fragmentos de DNA (padro de 50pb).
2.6.2 Espectrofotometria
A espectrofotometria uma tcnica muito utilizada na biologia, na qumica

e na fsica e utiliza um aparelho denominado espectrofotmetro, instrumento
que permite comparar a radiao absorvida por uma soluo ao incidirmos
radiao na amostra.
Cada substncia capaz de absorver uma quantidade de luz especfica quan-
do excitada com determinada quantidade de energia. A energia inserida eleva
os eltrons da molcula para nveis energticos mais altos. A energia necessria
para essa elevao de nvel eletrnico especfica de cada molcula e vai variar
segundo as caractersticas das ligaes presentes na mesma.
Em decorrncia das ligaes duplas presentes nas bases purnicas e pirimi-
dnicas do DNA e do RNA, esses, quando so excitados com uma luz no
comprimento de onda de 560 nm, emitem fluorescncia e podem ser detec-

tados por espectrofotometria. Quanto maior a quantidade de DNA e RNA
presente em determinada amostra, maior ser a absorvncia lida.
Para diminuir ao mximo a interferncia das protenas que ainda podem
estar presentes na amostra, deve-se fazer uma leitura a 280 nm comprimento
de onda em que as ligaes peptdicas das protenas fluorescem. Para avaliar
o nvel de pureza dos cidos nucleicos contidos em determinada extrao,
fazem-se leituras a 260 e 280 nm, analisando-se a relao 260/280. Se
o resultado obtido estiver entre 1,8 e 2,0, a amostra se encontra em boas
condies de anlise, contendo pouca interferncia de protenas. Caso a lei-
tura seja menor do que 1,6, ser necessrio novo processo de purificao dos
cidos nucleicos. Essa relao para a anlise de pureza no confivel se a
amostra estiver contaminada com fenol, pois a mistura de gua e fenol fluoresce
a 270 nm, um comprimento de onda muito prximo dos 280 nm utilizados
na medio. Para utilizar tal relao, deve-se garantir que todo o fenol tenha
sido retirado da amostra no momento de seu preparo.
A espectrofotometria no indica se a amostra contm somente DNA,
somente RNA, ou ambos, nem se eles esto ntegros, mas proporciona uma
boa noo da quantidade na amostra, em mg, do DNA e do RNA. Para se
obterem dados quantitativos, preciso levar em considerao algumas relaes
matemticas. No caso de um DNA de fita simples, como uma sonda ou um
primer, cada unidade de absorvncia a 260 nm equivale a 32,7 mg de DNA.
Numa amostra de extrao de DNA genmico, estima-se que em uma absor-
vncia igual a 1 haja uma concentrao de 50 mg de DNA/mL.
Em algumas preparaes, a quantidade de DNA pode ser pequena e limitar
bastante o uso da espectrofotometria como tcnica de quantificao. Nesses casos,
a tcnica escolhida a fluorimetria. A fluorimetria detecta nanogramas de DNA.
Nesse mtodo, a amostra incubada com o fluorocromo Hoechst 33258 que se
liga minor groove do DNA. Essa caracterstica do corante permite que ele core
somente DNA ntegros e no core o RNA. , portanto, uma tcnica seletiva. Para
efetuar a anlise, deve-se construir uma curva de calibrao do aparelho e avaliar a
amostra desconhecida, interpolando os resultados lidos com a reta a fim de encon-
trar o valor correspondente concentrao do DNA desconhecido.
2.7 Endonucleases de restrio
As endonucleases de restrio so enzimas capazes de reconhecer e cortar

o DNA em locais precisos, permitindo a obteno de fragmentos especficos
de DNA. Na dcada de 1950, cientistas observaram que algumas cepas de
E. coli eram resistentes infeco por bacterifagos. Avanos nos estudos
indicaram, e posteriormente confirmaram, que a resistncia aos parasitas ocorre
pela existncia de um sistema de enzimas na parede da bactria que reconhece
e elimina seletivamente o DNA dos bacterifagos.
As endonucleases de restrio pertencem a um grupo maior de enzimas,
denominadas nucleases, que em geral atuam clivando as ligaes fosfodister
ligantes de nucleotdeos adjacentes no DNA. O corte na molcula de DNA
feito mediante o reconhecimento, por parte das enzimas, de sequncias
especficas de 4 a 8 pares de base (pb). Essas sequncias de reconhecimento
variam de acordo com a enzima; uma vez identificadas, feito um corte duplo
na molcula de DNA: um em cada fita.
Existem dois tipos distintos de clivagem do DNA: 1) cortes em um mesmo
eixo de simetria, gerando extremidades abruptas; e 2) cortes simtricos, que
apresentam sequenciais de bases complementares, porm sem apresentar o
mesmo eixo, gerando extremidades coesivas. O quadro 2.2 mostra os dois
tipos de cortes e as extremidades formadas.
Quadro 2.2. Tipos de clivagem do DNA.

Extremidades coesivas Extremidades abruptas
(corte pela enzima EcoRV) (corte pela enzima BamHI)
5 GGATCC 3 5 GATATC 3
3 CCTAGG 5 3 CTATAG 5
Mais de cem tipos de enzimas de restrio foram identificados e purifica-

dos. A identificao de cada uma dessas enzimas feita pela abreviao do
nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada, seguida de algarismos
romanos (ou outras letras) que representam a ordem da descoberta ou a linha-
gem que a bactria utilizada pertence. Por exemplo, a enzima Hind III foi
isolada da linhagem d III da bactria Haemophilus influenzae. O quadro 2.3

traz a relao de algumas das principais enzimas de restrio, o organismo de
origem e o local de clivagem.
Quadro 2.3. Relao das principais enzimas de restrio.

Enzima Organismo fonte Local de clivagem
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5 GGATCC 3
Bg/II Bacillus globigii 5 AGATCT 3
EcoRI Escherichia coli RY13 5 GAATTC 3
EcoRV Escherichia coli R321 5 GATATC 3
HaeIII Haemophilus aegyptius 5 GGCC 3
HindIII Haemophilus influenzae Rd 5 AAGCTT 3
HpaII Haemophilus parainfluenzae 5 CCGG 3
NotI Nocardia otitidiscaviarum 5 GCGGCCGC 3
PstI Providencia stuartii 164 5 CTGCAG 3
SmaI Serratia marcescens Sb 5 CCCGGG 3
Figura 2.7. Funcionamento das endonucleases de restrio.

2.8 Hibridao molecular
O processo de hibridao do DNA um dos principais processos para de-

teco de um gene em particular ou de um segmento especfico de cido nuclei-
co. Apesar de existirem algumas variaes do mtodo clssico de hibridao,
os procedimentos bsicos desses mtodos se assemelham em muitos pontos.
Na tcnica, um papel de nitrocelulose prensado numa placa de gar com
colnias individuais de bactrias oriundas de uma biblioteca, contendo cada
bactria um DNA recombinante diferente. Ao tocar a placa com o papel,
algumas bactrias ficam aderidas, fornecendo uma cpia da placa. O papel
, ento, tratado com substncias alcalinas que provocam a destruio das
clulas e a desnaturao do DNA presente, o qual permanece aderido ao
papel no local da colnia de origem.
Aps essa etapa, adicionada ao papel a sonda de DNA marcada com
nucleotdeos radioativos, que somente vai ligar-se ao DNA complementar.
Como as molculas de DNA foram desnaturadas pela adio do lcali, elas
se encontram no formato de fita simples, e isso permite o pareamento com
o DNA marcado (anelamento). O papel lavado para a retirada da sonda
de DNA que no foi anelada. Ao final, o DNA hibridado (que anelou
com a sonda de DNA) pode ser detectado por autorradiografia.
2.8.1 Tcnicas de hibridao
Os mtodos de eletroforese em gel so fundamentais para separar mol-

culas de DNA de diferentes tamanhos. Assim como as protenas, os cidos
nucleicos apresentam grupamentos qumicos com cargas eltricas. Porm, en-
quanto as protenas apresentam grupamentos positivos e negativos, os cidos
nucleicos s apresentam cargas negativas, provenientes dos radicais fosfatos
presentes em sua molcula.
Fragmentos de DNA contendo menos de 1.000 nucleotdeos so sepa-
rados por gis de poliacrilamida. Entretanto, como os poros desses gis so
muito pequenos para permitir a passagem de molculas maiores de DNA,
utiliza-se a eletroforese em gel de agarose, um polissacardeo extrado de algas
marinhas. A eletroforese em gel de agarose o mtodo mais utilizado nas

anlises de fragmentos de DNA e RNA. Cromossomos inteiros, contendo
milhes de nucleotdeos, podem ser separados por uma tcnica de eletroforese
em gel de agarose intitulada eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
(do ingls pulsed field gel electrophoresis).
As amostras formam bandas invisveis, que ficam situadas em diferentes
posies do gel de agarose ou poliacrilamida, e necessrio que as bandas de
DNA sejam coradas ou marcadas. Um mtodo de boa sensibilidade para corar
o DNA a utilizao do brometo de etdio. Outro mtodo de deteco
ainda mais sensvel consiste na incorporao de um radioistopo nas molculas
de DNA. Um fragmento de restrio contendo uma sequncia especfica de
bases pode ser identificado mediante hibridao a um filamento complementar
de DNA marcado radioativamente. O radioistopo 32P, por sua capacidade
de se incorporar ao fosfato do DNA, muito utilizado para isso. Um
fragmento de interesse de DNA separado de um conjunto de molculas
por eletroforese em agarose, desnaturado para formar um nico filamento e,
em seguida, transferido para um suporte de nitrocelulose, onde exposto a
uma sonda marcada com 32P complementar sua sequncia. O fragmento de
DNA contendo a sequncia visualizado por autorradiografia. Essa tcnica
foi desenvolvida pelo bioqumico britnico Edwin Southern, sendo chamada
Southern blotting. O Northern blotting utilizado para detectar RNA e
segue o mesmo protocolo do Southern blotting. A transferncia de Western
blotting uma tcnica que detecta protenas por colorao, por meio do
emprego de anticorpos especficos.
2.9 Clonagem de DNA
2.9.1 Clonagem
O fenmeno da clonagem aquele no qual um organismo, ou uma clula,

formado a partir de outro por meio de um tipo de reproduo assexuada,
mantendo-se, em geral, seu conjunto de genes.
A existncia dos clones algo comum na natureza. Muitos protozorios,

bem como as bactrias e alguns tipos de fungos, reproduzem-se por clona-
gem. E at mesmo as nossas clulas, ao realizarem o tipo de diviso celular
conhecida como mitose, efetuam um processo de clonagem. Com os avanos
da biotecnologia, os cientistas passaram a ser capazes de clonar organismos
inteiros. A ovelha Dolly foi o primeiro deles.
Por conta do desenvolvimento de novas tcnicas de engenharia gentica,
pode-se isolar um gene especfico (ou um conjunto de genes) de um organis-
mo e introduzi-lo em outro de espcie diferente, permitindo sua multiplicao
junto com a reproduo do organismo receptor.
2.9.2 Clonagem de DNA
Na biologia molecular, clonagem consiste na produo de cpias exatas

de genes ou de grupo de genes (fragmentos de DNA). Nessa tcnica, o
DNA retirado de uma matriz (uma suspenso celular ou um fragmento de
tecido) e digerido por endonucleases de restrio. Os fragmentos gerados
contm os genes de interesse, que so ligados a um vetor de clonagem, geral-
mente um plasmdeo.
Um vetor de clonagem uma estrutura de DNA com capacidade de se in-
troduzir em clulas bacterianas, um processo conhecido como transfeco. Um
dos vetores de clonagem mais utilizados so os plasmdeos. Os plasmdeos so
molculas circulares de DNA presentes em bactrias nas quais geralmente se
encontram os genes responsveis pela resistncia a antibiticos. Entretanto,
importante lembrar que existem vrios outros vetores de clonagem, bem como
diferentes formas de se fragmentar e clonar o DNA.
O primeiro passo da clonagem a extrao do DNA de uma clula do-
adora qualquer e tambm do plasmdeo que servir de vetor. A extrao de
DNA apresenta uma srie de protocolos diferentes, sendo o fundamento bsi-
co acessar o DNA presente em determinado compartimento celular para depois
separ-lo dos demais componentes celulares (lipdios, protenas, RNA etc.).
A principal diferena entre a extrao de DNA genmico e a extrao do

plasmdeo a necessidade, na extrao desse ltimo, de se separar o plas-
mdeo do DNA bacteriano. Para que essa separao seja possvel, utiliza-se
a caracterstica do plasmdeo de ser uma molcula muito menor do que os
fragmentos de DNA cromossmico da bactria.
Certa quantidade de substncia alcalina (bsica) adicionada na soluo
de lise celular. Essa substncia provoca a elevao do pH, que acaba por
desnaturar as molculas de DNA (plasmidial ou cromossmico). Em seguida,
adicionado cido actico, que neutraliza o lcali, e acetato de potssio. Aps
a neutralizao, os fragmentos de DNA tendem a refazer a molcula original.
Entretanto, o sal (acetato de potssio) provoca a precipitao de todas as
molculas que no so muito solveis em gua. Os fragmentos grandes for-
mados pela desnaturao do DNA cromossomial no conseguem se renaturar
com rapidez suficiente e, por serem insolveis, precipitam junto com os restos
celulares e protenas da bactria. O DNA plasmidial, ao contrrio, por cau-
sa de seu menor tamanho, regenera-se rapidamente, com o que aumenta
a sua solubilidade na gua e evita a sua precipitao. Dessa forma, ao se
recolher o sobrenadante aps uma centrifugao, teremos essencialmente o
DNA plasmidial. Uma vez que se tenham os dois tipos de DNA (da clula
doadora e o plasmidial), a fase seguinte consiste em clivar ambos com a enzima
de restrio escolhida, misturando-os depois em uma soluo contendo enzimas
ligases, o que permitir o pareamento dos fragmentos e a reconstruo das liga-
es fosfodister em cada fita de DNA. Essa unio entre o fragmento de DNA
(inserto) e o plasmdeo (vetor) forma o que chamamos DNA recombinante.
O DNA recombinante deve ser introduzido na clula hospedeira para que
ela possa replicar-se e, consequentemente, replicar o(s) gene(s) do inserto.
Isso obtido, em um processo passivo, por meio das membranas plasmticas
das bactrias previamente tratadas com soluo de cloreto de clcio, ou ativo,
pelo uso de descargas eltricas que abrem os poros das clulas, processo de-
nominado eletroporao. Veremos ambos os mtodos a seguir.
2.10 Transformao bacteriana
O processo de transformao bacteriana consiste na introduo de um vetor

dentro da bactria. Esse processo chamado transformao por causa das novas
caractersticas que podem ser adquiridas pela bactria com a introduo do
vetor (como a resistncia a determinados antibiticos). Existem basicamente dois
processos distintos: a eletroporao e a transformao com cloreto de clcio.
A eletroporao a unio das bactrias e dos vetores em um nico tubo,
submetido a uma descarga eltrica com o intuito de provocar a desestabiliza-
o da membrana plasmtica da bactria e permitir a entrada do vetor. Aps
essa etapa, as bactrias so transferidas para um meio de cultura e incubadas a
37C, a fim de que possam se recuperar do choque recebido.
Na transformao com cloreto de clcio, misturam-se, em um nico tubo,
as bactrias, o vetor e o cloreto de clcio. O cloreto de clcio dissocia-se na
soluo, liberando ons clcio (ctions) que iro neutralizar a carga negativa
do DNA. Com o choque trmico, a membrana da bactria desestabiliza (ele
tem, portanto, o mesmo papel do choque eltrico), e o DNA, com sua carga
neutralizada pelos ons de clcio, entra facilmente na bactria.
Aps a transformao, as bactrias so colocadas em meios de cultura e in-
cubadas para que possam se multiplicar e formar colnias. A distino entre as
bactrias que possuem o vetor e aquelas que no possuem feita mediante as
caractersticas conferidas pelos plasmdeos. Se o plasmdeo confere resistncia
a determinado antibitico, o plaqueamento das bactrias em um meio com esse
antibitico selecionar somente aquelas que so resistentes (transformadas),
matando as demais.
2.11 Biblioteca genmica
A biblioteca genmica uma coleo de fragmentos de DNA que repre-

senta o genoma inteiro de um organismo ou de uma clula, coleo adquirida
pelo processo de clonagem. Dependendo da fonte de DNA utilizada, h uma
variedade de formas de bibliotecas genmicas. Uma das formas mais comuns
aquela na qual a biblioteca formada pela clivagem do genoma inteiro de

determinado organismo em milhares de fragmentos que sero clonados por
insero em determinado vetor de clonagem.
Primeiramente, o DNA a ser clonado parcialmente digerido por uma
endonuclease de restrio, gerando fragmentos grandes, mas com tamanhos di-
ferentes. Esses fragmentos de DNA de tamanhos diferentes so separados por
eletroforese em gel, para se separar um tamanho especfico de fragmento, que
ser escolhido em razo do vetor a ser utilizado por exemplo, um bacterifa-
go (fago l). Aps a insero do fragmento no vetor, promove-se a transformao
bacteriana, e o lisado resultante apresenta fragmentos de DNA do organismo
escolhido em um grande nmero de fagos, o que garante que praticamente todo
o genoma esteja ali representado. Esses fagos recombinantes constituem a biblio-
teca genmica. O organismo pode ser propagado milhares de vezes, o que
permite a utilizao da biblioteca por longos perodos.
2.12 A reao em cadeia da polimerase (PCR)
O Projeto Genoma Humano (PGH) permitiu avanos tecnolgicos que

ampliaram a capacidade de acesso a informaes relativas sequncia de genes
de um organismo. Enquanto o sequenciamento do genoma completo de um
organismo apresenta como etapa intermediria a criao de uma ou mais bi-
bliotecas, a clonagem de um gene pode ser feita de maneira rpida, sem ajuda
da biblioteca, visto que a sequncia genmica j est completa. Se soubermos
pelo menos uma parte da sequncia do gene a ser clonado, podemos gerar
milhares de cpias pelo processo conhecido como reao em cadeia da poli-
merase (PCR) (do ingls polimerase chain reaction).
A reao preparada a partir de uma soluo contendo a amostra de
DNA que se quer amplificar, uma DNA polimerase estvel ao calor (Taq
polimerase), quatro tipos de deoxinucleotdeos trifosfatados (nucleotdeos com
as bases nitrogenadas A, T, C e G, chamados de dNTPs), alm de dois
oligonucleotdeos chamados primers. Os primers so oligonucleotdeos com-
plementares s duas extremidades (5 e 3) do fragmento a ser amplificado.
No incio, as enzimas utilizadas na PCR no resistiam s altas tempera-

turas necessrias para a desnaturao da molcula de DNA, o que implicava a
adio de grandes quantidades de enzimas a cada novo ciclo de amplificao.
Com a descoberta da enzima termostvel Taq DNA polimerase, isolada da
bactria de fontes termais Thermus aquaticus, resistente a temperaturas de at
117C (com temperatura tima de 72C), foi possvel a realizao da reao
sem que houvesse necessidade de adio de novas quantidades de enzimas.
A utilizao de Taq polimerase e a criao de termocicladores (equipamento
que automatiza os ciclos de temperatura) mais eficientes tornaram a tcnica mais
fcil e barata.
Aps o preparo da mistura para a reao, a amostra colocada em
um termociclador, onde ser submetida a ciclos trmicos que se alternam entre
temperaturas elevadas e temperaturas mais baixas. A alta temperatura causa a
desnaturao da molcula de DNA, desfazendo as pontes de hidrognio e
separando as duas fitas complementares. Por outra parte, a diminuio da tem-
peratura permite a hibridao das extremidades do fragmento de DNA com os
oligonucleotdeos complementares (primers). A enzima Taq polimerase utiliza
os nucleotdeos para polimerizar uma nova sequncia de DNA complementar
ao fragmento de interesse. O DNA original utilizado como molde para a
construo da nova sequncia o molde chamado de template. Um novo
ciclo iniciado com a desnaturao dos fragmentos e a sntese de novos frag-
mentos em temperaturas baixas. Dessa maneira, a cada novo ciclo, aumenta-se
a quantidade de cpias do fragmento de DNA a ser amplificado. Ao final da
reao, o produto apresenta grande quantidade de DNA amplificado junto
com o DNA original do incio.
Em outras palavras, podemos separar as fases da reao de polimerase em
trs etapas: separao dos filamentos do DNA (desnaturao), hibridao de
primers (anelamento) e sntese de DNA (extenso).
A separao dos filamentos ocorre por desnaturao do DNA. Nessa eta-
pa, os dois filamentos da molcula de DNA so separados por aquecimento
da soluo a temperaturas prximas de 95C.
A hibridao de primers (oligonucleotdeos) consiste no anelamento ou
pareamento de cada par de primers a um filamento de DNA. A soluo
abruptamente resfriada para a temperatura especfica de anelamento do primer

utilizado, permitindo sua ancoragem e a delimitao da regio especfica a ser
amplificada pela DNA polimerase.
A sntese de DNA ocorre com o aquecimento da soluo a 72C, tempe-
ratura tima para a Taq DNA polimerase, que faz a extenso dos dois primers
de oligonucleotdeos. A Taq polimerase sintetiza um novo fragmento de DNA
a partir da fita molde original.
Figura 2.8. Representao das etapas sequenciais

da reao em cadeia da polimerase (PCR).
2.13 Sequenciamento de DNA
Mtodos de sequenciamento do DNA so importantes para a determina-

o das sequncias de nucleotdeos de um fragmento de DNA, permitindo o
sequenciamento completo de dezenas de milhares de genes. Vrios organismos
tiveram seus genomas completamente decifrados inclusive o homem, no Pro-
jeto Genoma Humano (PGH).
O Projeto Genoma Humano teve incio nos Estados Unidos em 1990.
Seus principais objetivos foram os de identificar e mapear os genes dos 23
pares de cromossomos humanos, determinar a sequncia de todas as bases
do nosso genoma, armazenar essas informaes em bancos de dados para
analis-las e desenvolver mtodos eficientes para usar essas informaes na
biologia e na medicina.
No dia 6 de abril de 2000, a firma americana Celera Genomics anunciou

a obteno da sequncia do genoma humano, e a publicao da anlise da
sequncia do genoma humano foi feita em fevereiro de 2001. Por meio do
PGH, foi possvel descobrir que o genoma humano possui entre 30 mil e
50 mil genes. Partindo-se da ideia de que cada nucleotdeo do DNA repre-
sentado por uma letra correspondente sua base nitrogenada (A, T, C ou G),
seria possvel escrever um livro genmico humano com aproximadamente
840 mil pginas.
Inicialmente, os processos de sequenciamento de DNA eram realizados
manualmente. Isso consumia muito tempo, dinheiro e esforos dos pesquisado-
res envolvidos. Atualmente, com o avano na tecnologia de sequenciamento,
possvel a leitura de 500 mil nucleotdeos em apenas um dia.
2.13.1 Sequenciamento de Sanger
No ano de 1977, Frederick Sanger, na Inglaterra, desenvolveu um mto-

do que se tornou a base para todo o sequenciamento moderno de DNA.
O mtodo consiste na incorporao aleatria de dideoxinucleotdeos trifosfatos
(ddNTPs), em uma fita de DNA, pela enzima DNA polimerase. As ddNTPs,
ao contrrio dos deoxinucleotdeos trifosfatados (dNTPs), no possuem em sua
estrutura uma hidroxila na posio 3. Assim, a sntese da fita de DNA parali-
sada sempre que a DNA polimerase incorpora uma ddNTP na nova fita.
A primeira etapa da reao consiste na desnaturao da molcula de
DNA, formando fitas simples que serviro de molde para a DNA polimera-
se. necessria a presena de sequncias iniciadoras, os primers, para que a
DNA polimerase possa comear a atuar. Alm disso, a soluo deve conter
baixas concentraes de ddNTP e altas concentraes de dNTP. No decorrer
da reao, a DNA polimerase utiliza os dNTPs para a sntese na nova fita de
DNA at que, aleatoriamente, utiliza uma ddNTP, a qual, por no possuir
uma hidroxila na posio 3, interrompe a polimerizao da nova cadeia.
A incluso de marcadores fluorescentes de cores diferentes para cada
ddNTP permite a identificao da cadeia truncada (que no foi capaz de
terminar a polimerizao em virtude da adio da ddNTP), independentemente

do tamanho do fragmento. Os fragmentos so separados por eletroforese em
gel de poliacrilamida. Existem equipamentos (sequenciadores automticos)
capazes de distinguir os quatro tipos de ddNTP existentes em razo da
captao de sua fluorescncia. A ordem em que os diferentes fragmentos
passam pelo detector de fluorescncia indica a sequncia dos nucleotdeos
da cadeia complementar ao DNA molde, determinando assim a sequncia
original.
Figura 2.9. Desoxirribonucleosdeos trifosfatos (dNTP).
Figura 2.10. Didesoxirribonucleosdeos trifosfatos (ddNTP).
2.13.2 Exemplo de processo metodolgico de anlise de cidos nucleicos
Muitos so os mtodos utilizados na manipulao e anlise de cidos nu-

cleicos. A seguir, apresentamos um exemplo de processo metodolgico muito
utilizado atualmente, denominado polimorfismo no comprimento dos fragmen-

tos de restrio (RFLP, do ingls restriction fragment lenght polymorphisms).
2.13.2.1 Polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrio

Apesar dos mecanismos bioqumicos existentes para que erros sejam evita-
dos durante a duplicao do DNA, existe uma taxa de mutao constante no
genoma de todas as espcies. Essas mutaes, nem sempre perceptveis pois
podem estar localizadas em regies no codificantes (ntrons ou regies inter-
gnicas) , so chamadas polimorfismos e podem ser de grande importncia,
por exemplo, no entendimento da evoluo de determinados genes e na de-
teco de susceptibilidade gentica a determinadas doenas.
A tcnica de RFLP baseia-se na hidrlise do DNA com enzimas de restri-
o especficas e posterior separao dos fragmentos gerados pela digesto por
eletroforese. Dessa maneira, busca-se reconhecer modificaes do DNA que
possam estar presentes dentro da sequncia de reconhecimento das enzimas
de restrio. Ento, um indivduo que apresente uma modificao no genoma
que impossibilite a clivagem por determinada enzima de restrio pode ser
identificado por meio da comparao com outro da mesma espcie e que no
apresente essa modificao, o que no impossibilita a clivagem do DNA.
Com a realizao da eletroforese, pode-se comparar o tamanho das amostras
de DNA e inferir sobre uma possvel alterao ou no. O RFLP pode ser
aplicado em DNA plasmidial ou DNA cromossmico.
Eletroforese
Primeira etapa: extrao de DNA
A retirada do DNA da matriz escolhida pode seguir protocolos variados.
Geralmente o DNA genmico extrado de uma camada de clulas brancas
separadas (buffy-coat) ou do sangue total.
Podem ser utilizados kits comerciais para o processo de extrao. Seja
como for, o processo baseia-se em dois procedimentos bsicos: rompimento
das membranas celulares (geralmente com detergentes), permitindo a liberao
do DNA; e tratamentos qumicos ou enzimticos, como RNA, protenas e

outras molculas, para purificar a amostra de contaminantes.
Segunda etapa: amplificao

Aps a extrao do DNA da matriz escolhida, preciso amplificar o
fragmento especfico do material gentico de interesse. Para isso, utiliza-se a
tcnica de PCR anteriormente descrita. Em geral, o procedimento o mesmo,
contendo apenas algumas modificaes.
A escolha dos primers responsveis por selecionar a regio correta do ge-
noma escolhido a ser amplificada depender do produto desejado ao final da
amplificao. Da mesma maneira, as condies de temperatura do termocicla-
dor dependem das caractersticas fsico-qumicas dos primers utilizados. Aps
essa etapa, o analisador ter uma quantidade suficiente de DNA, e ele poder
ser quantificado por mtodos espectrofotomtricos.
Terceira etapa: purificao do DNA

A etapa de purificao consiste na eliminao de substncias indesejveis
anlise, deixando-se somente o cido nucleico de interesse. A escolha do
processo de purificao depende de vrios fatores, como as substncias con-
taminantes de sua amostra, o grau de pureza de que sua anlise necessita
e a disponibilidade financeira e temporal do projeto desenvolvido. Alguns
protocolos de purificao de cidos nucleicos podem ser muito rpidos. No
entanto, dependendo da complexidade da amostra analisada, o mtodo mais
rpido pode no ser o mais adequado. O mesmo ocorre em relao ao custo.

Quarta etapa: digesto
O tratamento com enzimas de restrio comumente chamado digesto. A
digesto gera fragmentos de tamanhos especficos de pares de base, que podem
ser identificados por eletroforese em gel de agarose. Aqueles fragmentos de
menor peso molecular migram mais rapidamente do que os de maior peso
molecular.
Quinta etapa: eletroforese

Aps as etapas de amplificao, purificao e digesto, so realizadas ele-
troforeses, para a anlise do produto, em gel de agarose. Depois da eletrofore-
se, o gel corado com brometo de etdio. O tamanho dos fragmentos (bandas)
determinado pela comparao com um DNA-padro colocado no mesmo gel
em que esto as amostras. Esse DNA-padro comercializado por empresas
especializadas, e contm molculas que geram bandas de tamanhos especficos
de pares de bases. O intervalo entre as bandas pode representar um salto de
50 ou de 100 pares de bases, dependendo do padro adquirido.
2.14 O DNA e as cincias forenses
Cada indivduo possui seu DNA prprio, com exceo de gmeos idn-
ticos. Mesmo em indivduos da mesma espcie, o DNA muito semelhante
em vrios aspectos, pois so necessrias snteses das mesmas protenas para as
atividades de um organismo de mesma espcie.
Como descrito anteriormente, cada protena possui um gene no DNA res-
ponsvel por sua codificao. Assim, no momento da traduo, aquela sequ-
ncia do mRNA obtida a partir de nucleotdeos complementares do DNA
gerar a protena necessria para o perfeito funcionamento da clula. Porm, em
eucariotos, vale ressaltar a presena de ntrons, isto , pedaos do DNA que
no codificam nenhuma protena e por isso no so utilizados. Seria lgico pensar
que, caso houvesse uma mutao nesses pedaos do DNA, no haveria altera-
o na vida do indivduo, pois esse ntrons no so utilizados. O que ocorre
exatamente isso. Os xons so extremamente conservados para que se possa
preservar o proteoma do indivduo, mas os ntrons so passveis de variadas
mutaes.
Esse fato foi constatado por Alec Jeffreys, um geneticista ingls. A partir
de seus estudos com a mioglobina, ele percebeu que havia um pequeno tre-
cho do DNA que se repetia continuamente. Jeffreys tambm percebeu que
esse trecho no fazia parte somente do DNA da mioglobina, mas do genoma.
Em 1980, outros dois geneticistas, Ray White e Arlene Wyman, perceberam
que o nmero de repeties do trecho descrito por Jeffreys variava de indiv-

duo para indivduo.
O trecho descrito por Jeffreys era uma sequncia curta de quatro nucleo-
tdeos GATA , que se repetiam de forma varivel em cada indivduo.
Surgia, assim, a tcnica de DNA fingerprinting (impresso digital de DNA),
pois a anlise do nmero de repeties desses trechos permite individualizar uma
pessoa. Tais trechos foram denominados microssatlites ou STRs (do ingls shot
tandem repeats, ou seja, repeties curtas consecutivas). a anlise dos STRs que
permite, atualmente, correlacionar amostras de DNA a amostras de determinado
indivduo, sendo importante instrumento tcnico na medicina forense.
A tcnica de DNA fingerprinting se inicia com a extrao do DNA de
amostras coletadas da vtima ou de algum suspeito. Qualquer tipo de fluido
biolgico ou amostra de tecido que contenha clulas pode ser utilizado para
a anlise de DNA. As amostras mais utilizadas atualmente so sangue, smen
(no caso de crimes sexuais), clulas do epitlio da bochecha, amostras de
bipsias de tecidos moles e ossos, e pelos e cabelos que contenham clulas
do bulbo capilar, entre outras. O DNA obtido tratado pela tcnica RFLP,
mtodo que se baseia em clivagens feitas por enzimas de restrio (enzimas
que clivam o DNA em determinados pontos especficos), gerando fragmentos
de DNA de diferentes tamanhos e sequncias especficas. Em seguida, esses
fragmentos so separados por eletroforese, marcados e analisados. O perfil
formado ser especfico de cada indivduo, dado que os fragmentos formados
pelas enzimas de restrio, os microssatlites, tm quantidade varivel de indi-
vduo para indivduo.
Essa tcnica revolucionou a cincia forense, pois permitia correlacionar com
preciso determinado vestgio de algum suspeito. Sua nica limitao era a gran-
de quantidade de DNA necessria, s conseguida em algumas amostras. Com
a descoberta da tcnica de PCR, esses fragmentos puderam ser amplificados,
ou seja, a quantidade de DNA obtida podia ser aumentada, permitindo que
amostras com pequenas quantidades de DNA tambm fizessem parte do rol
de amostras coletadas na cena do crime. Atualmente, uma quantidade de ape-
nas vinte clulas suficiente para a identificao do DNA. A quantidade de
DNA obtida de cerca de 1 a 20 ng.
Todo exame de DNA utiliza um clculo que determina a raridade da

combinao entre perfis encontrados nas amostras. Esse clculo determina a
probabilidade de o DNA da amostra combinar com o de determinado indi-
vduo. Esse clculo baseado na comparao do padro de polimorfismo
presena numa populao de uma ou mais formas de determinado gene ou de
determinada sequncia do genoma com bancos de dados de uma populao
especfica. Para essa anlise, deve-se conhecer com que frequncia a combina-
o de fragmentos ocorre no grupo onde se insere o indivduo suspeito, para
estimar assim a confiabilidade do exame.
Atualmente, a identificao por DNA utilizada pela percia tcnica para
elucidar diversos acontecimentos. uma tcnica fundamental na identificao de
suspeitos de crime sexual, pois capaz relacionar o DNA encontrado no smen
deixado na vtima com amostras de DNA de suspeitos. Em catstrofes, a anlise
de DNA permite a identificao de corpos carbonizados ou em estado muito
avanado de decomposio. Para essa anlise, utiliza-se o DNA mitocondrial,
que possui caractersticas oriundas somente da me, mas que tambm, quando
comparado ao DNA genmico, apresenta grande estabilidade. Tambm
possvel identificar cadveres mutilados e partes de rgos de determinados
indivduos, e relacionar objetos a determinado crime. Uma faca contendo sangue
pode ser fonte de identificao do DNA do agressor, que, ao segur-la sem o
uso de luvas, transfere elementos celulares para o cabo do instrumento.
Alm da identificao, a anlise de DNA tambm capaz de estabelecer
a paternidade de um indivduo, tcnica utilizada fora do mbito criminal. O
teste de paternidade possvel porque o DNA de um indivduo formado
por alelos do DNA da me e alelos do DNA do pai. Assim, os STRs tm
perfis que se assemelham, em parte, aos alelos do pai e, em parte, aos alelos
da me. Nesse tipo de teste, procede-se anlise dos DNAs do filho, da
me, do suposto pai e de uma mistura entre o DNA do filho e o do suposto
pai. O padro formado no gel de agarose do DNA do filho deve ter relao,
em parte, com o DNA de seus pais. Caso essa relao no ocorra, a pater-
nidade, e at mesmo a maternidade (procedimento utilizado no caso de troca
de bebs em maternidades) no sero confirmadas.
Apesar de muito til, essa tcnica possui vrias desvantagens. As amostras

utilizadas devem ser coletadas de forma tal a no se degradarem at a chegada
ao laboratrio e no se misturarem com outras amostras. Alm disso, preciso
impedir as trocas nos materiais coletados pelo perito. Por isso, fundamental
a preservao correta do local de crime, alm do treinamento para o aprimo-
ramento das tcnicas de coleta. Outra desvantagem do mtodo a expresso
da probabilidade de acerto em razo da averiguao em bancos de dados
com estatsticas sobre o DNA de determinada populao: o fato de duas
amostras possurem o mesmo perfil para um grupo de STRs no significa que
tenham origem comum. A interpretao dos testes depende das frequncias
populacionais para cada marcador gentico utilizado. Por isso, quando ocorre
o mesmo perfil para um grupo de STRs, preciso expressar numericamente a
sua significncia.
A maior limitao do teste de DNA a necessidade de haver suspeitos em
potencial para a comparao de amostras coletadas das vtimas ou do local do
crime. Muitos pases como Estados Unidos, Canad, Inglaterra, Alemanha
e Frana possuem bancos de dados genticos de indivduos anteriormen-
te condenados. Assim, quando se obtm determinada amostra de DNA,
possvel compar-la com todos os DNAs do banco de dados, o que permite
relacionar ao crime investigado suspeitos at ento inimaginveis.
Os bancos de DNA contm informaes genticas de determinados indiv-
duos e, em sua grande maioria, so de carter forense. Porm, o uso desses da-
dos pressupe contrabalanar os direitos do indivduo e os interesses coletivos.
Muitos so os aspectos a serem avaliados no uso de um banco de dados desse
tipo, j que muitos temores o circundam. E isso porque as informaes contidas
no DNA so muito mais amplas do que as contidas em impresses digitais.
Pelo estudo do DNA de um indivduo, podem-se estabelecer traos de sua
personalidade um exemplo disso o fato de homens com um cromossomo Y
a mais (XYY) possurem, na maioria dos casos, comportamento agressivo ou
revelar possveis doenas que sero desenvolvidas por uma pessoa como o
cncer ou patologias cardacas , o que pode levar discriminao gentica.
No Brasil, no h lei que regulamente o uso do exame de DNA para
fins de identificao criminal. Ainda est em discusso uma lei que permita
a incluso da anlise de DNA nos procedimentos de identificao utilizados

rotineiramente, como a fotografia e a papiloscopia, na identificao de de-
tentos indiciados ou acusados de crimes de homicdio doloso, de receptao
qualificada e contra a liberdade sexual, dentre outros.
2.15 Utilizaes complementares do DNA
2.15.1 Transgnicos
O desenvolvimento da engenharia gentica permitiu a retirada de genes

de uma espcie e sua introduo em um indivduo de espcie diferente.
Com essa nova ferramenta nas mos, o ser humano foi capaz de reproduzir
genes de interesse, criando o que chamamos de organismos geneticamente
modificados (OGMs).
A produo de OGMs parte da nova era da biotecnologia. No
Brasil, a lei n 11.105, de 24 de maro de 2005, estabelece normas de
segurana para atividades que envolvem organismos geneticamente modifica-
dos, definindo-os como organismos cujo material gentico (DNA ou RNA)
tenha sido modificado por qualquer tcnica de engenharia gentica. Esses
indivduos so constantemente confundidos com os organismos transgnicos,
porm nem todos os organismos geneticamente modificados so transg-
nicos. Os transgnicos so organismos que receberam em sua constituio
gentica genes de organismos de outras espcies. Aqueles organismos que
tiveram seus genes alterados apenas quanto sua posio ou expresso no
so considerados transgnicos.
Os transgnicos tm sido utilizados de forma mais significativa na agricultura,
pois com a tcnica da transgenia possvel criar plantas resistentes a pragas e a
agrotxicos, organismos resistentes a solos inadequados ou a condies clim-
ticas desfavorveis ou, at mesmo, organismos capazes de produzir nutrientes
especficos de interesse alimentcio ou industrial.
Muitas so as discusses acerca dos transgnicos, mas elas podem ser clas-
sificadas em quatro dimenses: sade, agricultura, meio ambiente e tica. No
que se refere sade, o maior problema a possibilidade de os organismos
transgnicos produzirem toxinas desconhecidas. A introduo de um novo
gene pode levar produo de uma protena no existente antes no alimento,
aumentando as chances de reaes alrgicas nova substncia.
Em relao agricultura, os problemas so vrios, como a dependncia
dos agricultores de indstrias qumicas que produzem sementes transgnicas
como as agrotxico-resistentes por exemplo, as sementes de soja da varie-
dade Roundup Ready, produzidas pela Monsanto, que resiste ao herbicida
Roundup, tambm produzido por ela. Alm disso, a disperso natural, pelo
vento ou pela chuva, de sementes transgnicas traz o risco de contaminao
de plantaes no transgnicas, acarretando problemas financeiros e jurdicos.
Os impactos ao meio ambiente ainda so muito discutidos entre produtores
de transgnicos e investigadores da rea. Por exemplo, o fato de ocorrerem
modificaes bioqumicas do solo (visto que qualquer ser vivo capaz de
intervir e modificar o meio em que vive) causadas por organismos transgnicos
e modificaes nas frequncias gnicas das populaes primitivas.
A questo tica permeia todas as demais discusses a respeito dos transg-
nicos. Os motivos que movem a sua utilizao so alvo de crticas cientficas e
religiosas, fazendo que a transgenia seja sempre um assunto polmico.
2.15.2 Projeto Genoma Humano
Aps a descoberta da molcula de DNA e de sua forma de funciona-

mento em processos como a sntese proteica, bem como na determinao das
caractersticas herdadas, grande parcela dos cientistas se dedicou a projetos
que visavam utilizao dos conhecimentos de gentica para o desenvolvi-
mento da espcie humana. Sem dvida, o mais ambicioso deles foi o Projeto
Genoma Humano, um consrcio internacional idealizado, no final da dcada
de 1980, por James D. Watson prmio Nobel de Medicina e Fisiologia
em 1962 e descobridor, ao lado de Francis Crick, da estrutura em dupla
hlice da molcula de DNA , com o objetivo de caracterizar todos os seres

humanos com base na sequncia de nucleotdeos de seu genoma. Acreditava-
se que, em virtude do seu papel essencial no processo de sntese proteica, o
DNA tinha enorme importncia na determinao de caractersticas bioqumicas
e fisiolgicas do organismo humano.
Alm dos Estados Unidos, vrios pases participaram do projeto, entre
eles Alemanha, Frana, Inglaterra e Japo. Nos Estados Unidos, que
centralizaram as pesquisas, houve a participao de duas frentes importantes:
uma pblica e outra privada. A frente pblica, representada pelo Consrcio
Internacional para o Sequenciamento do Genoma Humano, foi dirigida
por Francis Collins. A iniciativa privada ficou a cargo da empresa Celera
Genomics, liderada por Craig Venter. Mesmo no tendo sido harmnica
em todos os momentos, a colaborao entre essas duas frentes propiciou a
finalizao do projeto em 2003.
O termo genoma se refere ao conjunto de todos os genes existentes nos
23 pares de cromossomos da espcie humana. vlido lembrar que cada
espcie possui um nmero prprio de cromossomos, bem como de genes que
os compem, o que determina um genoma diferente para cada tipo de organis-
mo. Podemos chamar genmica o processo de mapeamento, sequenciamento
e anlise do genoma. A genmica trata de localizar os genes no conjunto de
cromossomos do organismo para posterior caracterizao da sequncia de ba-
ses nitrogenadas dos genes e elucidao de sua funo dentro do organismo.
A genmica pode ser dividida em estrutural e funcional: a genmica estru-
tural se refere fase na qual so construdos mapas genticos que fornecem a
localizao e a sequncia dos genes do organismo; a genmica funcional est
relacionada com a expresso gnica, ou seja, com as propriedades funcionais
dos conjuntos de genes.
O desenvolvimento tecnolgico contribuiu para o entendimento da com-
plexa constituio do genoma humano e s foi possvel com o sequenciamento
dos genomas de outras espcies, principalmente microrganismos. As espcies
foram selecionadas com base no interesse cientfico, mdico ou econmico.
Uma srie de instrumentos e tcnicas, como a PCR e os sequenciadores auto-
mticos, surgiram nesse momento.
O Brasil no ficou de fora desses avanos da era genmica. Em 1997,

a Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (Fapesp) de-
terminou o sequenciamento do genoma do microrganismo Xylella fastidiosa,
bactria responsvel por certos tipos de infeco das laranjeiras, importante
fonte econmica da regio. Esse primeiro sequenciamento teve como principal
objetivo a adequao dos laboratrios, com o fornecimento de equipamentos
e treinamento tcnico. Com o sucesso do projeto, outros mais ambiciosos
foram iniciados, como o financiamento do projeto de definio do transcrip-
toma humano. Atualmente, o Brasil se coloca como um dos pases que mais
produziu sequncias de organismos vivos no mundo.
Apesar de muitas das expectativas em relao a ele ainda no terem sido
realizadas, o PGH gerou importante conjunto de informaes para a comuni-
dade cientfica. Apenas 1,1 a 1,4% do genoma realmente codifica protenas,
sendo que 75% do DNA esto localizados entre os genes. Diferentes seg-
mentos de tamanhos variveis se repetem no decorrer no genoma, o que talvez
denuncie uma complexa histria evolutiva. Segundo estimativas, o conjunto de
genes da espcie humana varia entre 30 e 40 mil, nmero que apenas duas
vezes maior do que o nmero de genes da Drosophila melanogaster, a mosca-
da-fruta. No entanto, os genes humanos parecem ser muito mais complexos.
As principais diferenas entre os genomas de duas pessoas esto nas
modificaes especficas de uma nica base nitrogenada, chamadas poli-
morfismos ou SNP (do ingls single nucleotides polymorphisms, ou seja,
polimorfismos de base nica). As consequncias do mapeamento gentico
para a medicina so profundas, pois ele permitir o diagnstico mais preciso
e rpido, bem como o conhecimento prvio da suscetibilidade gentica de
uma pessoa ao desenvolvimento de determinada doena. preciso ressaltar,
no entanto, que o DNA no o nico responsvel pelo desenvolvimento
de doenas: os fatores ambientais e sociais possuem papel to prepon-
derante quanto o conjunto de genes que a pessoa apresente. Por isso,
imprescindvel, para a melhoria da sade da populao humana, a anlise
multifatorial dos determinantes patolgicos.
Muitas perguntas ainda esto sem resposta e muitos problemas ainda preci-
sam ser resolvidos com auxlio dos estudos e do desenvolvimento da gentica e
da biologia molecular. Entretanto, inegvel que os conhecimentos adquiridos

nessas reas colaboram na melhoria da qualidade de vida do homem, e que
muitas conquistas cientficas sero alcanadas a curto e mdio prazo por meio
da engenharia gentica.
Referncia bibliogrfica
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AZEVEDO, Maristella de Oliveira et al. Tcnicas bsicas em biologia molecular.
Braslia: Editora UnB, 2003.
HAUSMANN, Rudolf. Histria da biologia molecular. 2. ed. Ribeiro Preto:
FunpecRP, 2002.
RUMJANEK, Franklin David. Introduo biologia molecular. Rio de Janeiro:
mbito Cultural, 2001.
ZAHA, Arnaldo; FERREIRA, Henrique B.; PASSAGLIA, Luciane Maria P.
Biologia molecular bsica. 3. ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003.
Captulo 3
Hematologia
Paulo Roberto Soares Stephens
Jurandy Susana Patrcia Ocampo Lyra
Marcelo Pelajo Machado
Marcella Martins de Vasconcelos Vaena
A hematologia uma cincia da rea biomdica relacionada ao estudo da

formao, regulao e manuteno do sangue, assim como dos seus compo-
nentes. Por meio das alteraes quantitativas e qualitativas das clulas, dentre
outras molculas presentes no plasma, possvel sinalizar o diagnstico de
algumas patologias relacionadas ao sangue, tais como anemias, leucemias, sn-
dromes mieloproliferativas e distrbios da coagulao. Mediante a hematologia
laboratorial, associada clnica, possvel pesquisar causas de enfermidades,
monitorar tratamentos e definir ou direcionar o diagnstico.
3.1 A hematopoese
O processo de formao, desenvolvimento e maturao dos elementos figu-

rados do sangue (eritrcitos, leuccitos e plaquetas), a partir de um precursor
celular comum e indiferenciado, chamado hematopoese tem incio em torno do
segundo ms de embriognese, persistindo por toda a vida do indivduo. Nas

primeiras semanas de gestao, o embrio humano se localiza ao lado de uma
estrutura chamada saco vitelino, que se assemelha a uma grande bolsa. At a
terceira semana de gestao, a nutrio do embrio feita atravs da parede
do tero materno. A partir da, o embrio passa a obter do sangue materno,
atravs da placenta, os nutrientes necessrios ao seu desenvolvimento.
Com um ms, o embrio humano j possui um sistema de vasos semelhante
ao do indivduo adulto que permite a distribuio do sangue por todo o seu
organismo. A formao desses vasos se inicia nas ilhotas de Wolff e Pander
(fig. 3.1), em torno da terceira semana da gestao, na regio externa do saco
vitelino. A formao dessas ilhotas comea com pequenas massas celulares
visveis na regio, os hemangioblastos, que vo sofrendo transformaes. O
contorno dessa estrutura formado por clulas que vo originar os primeiros
vasos sanguneos. Os eritrcitos primitivos (hemocitoblastos) se formam a
partir das clulas mais internas das ilhotas de Wolff e Pander. Assim, tanto
os vasos sanguneos quanto os primeiros eritrcitos so formados da mesma
estrutura original, sendo, portanto, de origem extraembrionria.
Figura 3.1. Ilhotas de Wolff e Pander: local de formao dos vasos sanguneos.
Ao final de um ms, observa-se no embrio a presena de um corao

rudimentar, responsvel por bombear o sangue para o corpo que est sendo
formado. A partir do segundo ms de gestao, o embrio j apresenta as suas
prprias hemcias, leuccitos e plaquetas.
Aps a formao dos primeiros vasos sanguneos, deflagrado todo o
processo de gerao das clulas sanguneas, processo que ocorre de forma
Hematologia | 189
ininterrupta durante toda a vida do indivduo. As clulas recm-formadas no

interior dos vasos passam a ser responsveis agora pelo transporte e nutrio
do embrio. O saco vitelino perde progressivamente a sua funo e involui.
Os progenitores das clulas do sangue, produzidas pelo prprio organismo
mediante a hematopoese dita definitiva, oriundos do endotlio da aorta dorsal
da regio aorta-gnada-mesonefros (AGM), expandem-se no fgado fetal
e na medula ssea. A fase heptica da hematopoese, na qual tambm h
participao do bao, ocorre a partir do terceiro ms da gestao. Nessa fase,
as clulas imaturas proliferam entre os vasos sanguneos e os cordes hepatoci-
trios imaturos, de origem endodrmica.
A medula ssea comea a participar da formao do sangue aproxima-
damente na metade do perodo gestacional e, a partir da, por toda a vida
extrauterina. Em situaes em que exista necessidade de maior contribuio
de sangue quando h tumores, por exemplo , o bao e o fgado podem
retomar suas funes na hematopoese.
No nascimento, todos os ossos realizam hematopoese medular. A partir
do terceiro ano de vida, a medula dos ossos longos interrompe essa atividade,
que, no entanto, permanece nos ossos esponjosos: esterno, costelas, vrte-
bras, ilacos, escpula e pores proximais dos meros e fmures. Enquanto
no recm-nato quase a totalidade da medula est ativa, no adulto, est ativa
apenas a metade dela. O quadro 3.1 traz um sumrio da correlao entre fase
da vida, local da hematopoese e idade.
Quadro 3.1. Cronologia de eventos da hematopoese: sumrio da

correlao entre fase da vida, local da hematopoese e idade.
Fase da vida Local da hematopoese Idade
saco vitelino 19 dia a 6 semana
fgado e bao 6 a 24 semanas
Intrauterina
medula ssea 10 ou 11 semanas
medula ssea 24 semana*
a partir do nascimento at
medula ssea o incio da fase adulta
Infncia
a partir do nascimento at
praticamente todos os ossos o incio da fase adulta
cont.
a partir da fase adulta at o
esqueleto central
final da vida
vrtebras (28%), costelas
Adulta (8%), esterno (2%), crnio/
a partir da fase adulta at o
mandbula (13%), sacro e
final da vida
ilaco (40%), regio proximal
do fmur e mero (8%)
* A medula ssea ganha predominncia na hematopoese a partir da vigsima quarta semana.
Aps o nascimento, grande quantidade de clulas sanguneas produzida

diariamente pela medula ssea. Em adultos jovens, estima-se que sejam produ-
zidas 20 milhes dessas clulas por segundo. Essas clulas so originadas de
uma nica clula-tronco indiferenciada pluripotente (stem cell). As clulas
pluripotentes agrupam-se em unidades formadoras de colnias (UFCs) e,
sob a influncia de uma variedade de fatores estimulantes de colnias, dife-
renciam-se em progenitores comuns de eritrcitos, megacaricitos, linfoides e
mieloides. Durante esse processo sucessivo de diferenciao, as clulas geradas
vo adquirindo caractersticas especficas e se diferenciam cada vez mais ao
receber o estmulo de citocinas especficas para cada linhagem celular. Eis as
funes de algumas citocinas:
interleucina 1 (IL-1): est envolvida na ativao imunolgica,
bem como na resposta inflamatria;
interleucina 2 (IL-2): estimula a UFC de linfcitos T;
interleucina 4 (IL-4): promove o crescimento de linfcitos;
interleucina 5 (IL-5): age sobre a produo de eosinfilos
e linfcitos B;
interleucina 7 (IL-7): est associada ao desenvolvimento de
clulas imaturas.
No quadro 3.2, observamos alguns dos fatores envolvidos nas diversas eta-
pas da hematopoese, assim como algumas das suas respectivas funes. Esses
fatores so produzidos em diferentes locais e por diferentes clulas.
Hematologia | 191
Quadro 3.2. Fatores envolvidos nas diferentes etapas da hematopoese e

algumas das suas respectivas funes.
Fatores Atividade
Estimulao de colnias de granulcitos e
GM-CSF
macrfagos
Estimulao e diferenciao de colnias de
G-CSF
granulcitos
Eritropoetina Formao de eritrcitos
Regulao de linfcitos B e T e do pirognio
Interleucina 1 (IL-1)
endgeno, induo de outros fatores
Interleucina 2 (IL-2) Fator de crescimento de clulas T
Estimulao de mltiplos CSF, granulcitos,
eosinfilos, mastcitos, formao de colnias de
megacaricitos, interao com eritropoetina e
estimulantes de colnias eritroides
Proliferao de linfcitos B e secreo de
imunoglobulinas
Diferenciao de linfcitos B, secreo de
imunoglobulinas e diferenciao de eosinfilos
Diferenciao de linfcitos B, secreo de
imunoglobulinas e diferenciao de eosinfilos
Interleucina 7 (IL-7) Estimulao da produo de linfcitos pr-B
Formao de colnias eritroides e estimulao da
proliferao da linhagem dos megacaricitos
Interleucina 10 (IL-10) Inibio da sntese de citocinas pelos linfcitos T
Estimulao do linfcito B, do megacaricito e das
clulas-tronco
Estimulao da clula NK (natural killer),
Interleucina 12 (IL-12) proliferao do linfcito T auxiliar e produo de
interferon-gama pelo linfcito T e clula NK
Estimulao da proliferao de linfcitos T e
Interleucina 13 (IL-13) inibio da produo de citocinas inflamatrias
pelos moncitos
A hematopoese pode ser deflagrada por vrios estmulos. Na hipxia, por

exemplo, ocorre a produo de eritrcitos pela baixa concentrao de oxignio
no sangue. Certas infeces e processos inflamatrios tambm desencadeiam
maior produo, principalmente de neutrfilos e moncitos. Outro estmulo
importante para a hematopoese so as parasitoses e as alergias, que acarretam
maior produo de eosinfilos e basfilos. J os antgenos virais estimulam
principalmente a gerao de linfcitos T, linfcitos B e clulas NK (natural
killers). A figura 3.2 relaciona algumas clulas sanguneas, respectivas quanti-
dades e tempo de vida.
Figura 3.2. Correlao entre algumas clulas sanguneas,

vida mdia e quantidade no sangue.
3.1.1 A eritropoese
O processo de eritropoese consiste na produo de eritrcitos, tambm

denominados hemcias. Em adultos, a eritropoese ocorre na medula ssea; nos
fetos ou em situaes especiais, como anemias severas, pode ocorrer em outros
rgos, principalmente no fgado e no bao.
Na figura 3.3, observamos trs fases principais da eritropoese, sendo a
primeira caracterizada pela sntese de ribossomos, pelos eritroblastos preco-
Hematologia | 193
ces; a segunda, aquela em que ocorre um acmulo de hemoglobina pelos

eritroblastos tardios; e, na ltima, observamos a eliminao do ncleo pelos
normoblastos, alm da formao dos reticulcitos. Aps todas essas fases so
gerados os eritrcitos, que so as clulas maduras.
Figura 3.3. Sequncia de diferenciao de eritrcitos: a eritropoese.
O processo da eritropoese regulado por hormnios como a eritropoeti-

na, produzida principalmente pelas clulas justaglomerulares dos rins, capazes
de perceber a ocorrncia de hipxia. A eritropoetina secretada em maior ou
menor quantidade de acordo com a produo ou a diminuio de eritrcitos
na circulao sangunea. Na condio de hipxia, quando h pouca quan-
tidade de eritrcitos na circulao sangunea, a eritropoetina liberada em
maior quantidade pelos rins, a fim de que mais eritrcitos sejam produzidos.
J quando existe um grande aporte de eritrcitos para a circulao, observa-se
uma diminuio da produo do referido hormnio (fig. 3.4).
Figura 3.4. Mecanismo da eritropoetina.
3.1.2 A leucopoese
A origem e a maturao dos leuccitos chama-se leucopoese. Durante

esse processo, que ocorre na medula ssea, observamos clulas em diferentes
estgios de diferenciao, as quais apresentam morfologias variadas, assim
como atividade mittica. Algumas clulas completam seus processos de
diferenciao na prpria medula; outras necessitam migrar para os rgos
linfoides para finalizar esse processo. Dentre as clulas que participam do
processo da leucopoese, temos as clulas-fonte, que so autorrenovveis e
originam todas as clulas do sangue. Apesar da baixa capacidade proliferativa
dessas clulas, seu nmero sempre constante. As clulas-fonte se dividem de
forma simtrica durante a vida fetal ou em perodos ps-transplantao. Outros
fatores podem levar diviso dessas clulas: a morte celular programada
(apoptose), a mobilizao das clulas-fonte para a circulao sob a ao de
fatores estimulantes, ou a sua depleo na medula ssea em decorrncia de
radiao ou quimioterapia.
Hematologia | 195
As clulas-fonte so divididas em dois grupos: clulas totipotentes, tam-

bm conhecidas como clulas-tronco, e clulas pluripotentes, que se originam
das primeiras e apresentam mltipla capacidade de diferenciao. As clulas
pluripotentes se subdividem em mieloides e linfoides, grupos de clulas que
so capazes de se diferenciar ainda mais e gerar as clulas do sangue.
As clulas pluripotentes originam clulas formadoras de colnias (CFCs)
que no possuem capacidade de autorrenovao, mas apresentam grande capaci-
dade mittica. As CFCs so especficas para cada linhagem celular. Por exemplo,
a LCFC a clula linfoctica formadora de colnia, clula que chegou a esse
estgio principalmente sob a influncia da IL-7, liberada pelas clulas-fonte.
J as clulas multipotentes mieloides originam, na medula ssea, as clulas
formadoras de colnias megacariocticas, eritrocticas, eosinoflicas, basoflicas e
monocticas-granulocticas. Essas ltimas sofrem diferenciao ainda em clulas
formadoras de colnias monocticas e granulocticas. Todo esse processo de
diferenciao conduzido por diversas substncias, produzidas por diferentes
clulas. Dentre as principais substncias, temos as interleucinas (IL-1, IL-3
e IL-6) e os fatores estimulantes de colnias de moncitos e granulcitos
(GM-CFC).
Em relao ao processo de diferenciao dos linfcitos no qual a pre-
sena dos linfoblastos, encontrados na medula ssea e nos tecidos linfoides,
fundamental , temos a formao de trs grupos de clulas: linfcitos T,
linfcitos B e clulas NK. Os linfoblastos B se diferenciam em pr-linfcitos
B. Deles, muitos migram para os tecidos linfoides; j outros permanecem na
medula ssea, caso estejam l. A ltima etapa da diferenciao a formao
dos linfcitos B. O processo de diferenciao desse compartimento celular
influenciado por vrias citocinas, entre elas a IL-7.
Os linfoblastos T, predominantes no timo, sofrem diferenciao e originam
os pr-linfcitos T, os quais migram para o sangue e chegam ao bao. Nesse
rgo, formam o corpsculo de Malpighi. J nos linfonodos, os pr-linfcitos
T formam a zona paracortical. Nos rgos linfoides, os linfcitos T adquirem
diferentes grupos de diferenciao (CDs), diferenciando-se nos subtipos
Helper, citotxico e supressor. Os CDs so responsveis por diversas
funes imunolgicas realizadas pelas clulas que os possuem. Alm disso,
essas molculas tambm servem como marcadores celulares, sendo utilizadas na

identificao laboratorial de determinada clula.
A partir dos linfoblastos, tambm so formados os pr-linfcitos NK, os
quais sofrem seu processo de diferenciao na medula, mas no migram para
os rgos linfoides.
Ainda em relao leucopoese, o promoncito, derivado dos monoblas-
tos, origina os moncitos, os quais, por sua vez, migram para os tecidos,
diferenciando-se em macrfagos. Os moncitos formam todo o sistema mono-
ctico fagocitrio (SMF).
Os promielcitos originam os mielcitos, os quais so precursores de gra-
nulcitos especficos, como os eosinfilos, basfilos e neutrfilos. A partir dos
mielcitos neutrfilos, so gerados os metamielcitos, que se diferenciam em
neutrfilos maduros. O processo de diferenciao das referidas clulas ocorre
sob a influncia de diversas substncias, como IL-3, GM-CSF (do ingls
macrophage colony-stimulating factor, ou seja, fator estimulante de colnia de
macrfago) e G-CSF (do ingls granulocyte colony-stimulating factor, ou seja,
fator estimulante de colnia de granulcito).
Na figura 3.5 observamos um sumrio da sequncia de diferenciao dos
leuccitos granulcitos a partir do mieloblasto.
Figura 3.5. Sequncia da diferenciao dos leuccitos granulcitos

a partir dos mieloblastos.
Hematologia | 197
3.2 O sangue
O sangue, lquido necessrio manuteno da vida, circula nos vasos san-

guneos: as artrias e as veias. Sua colorao vermelha por causa da presena
predominante de hemcias.
A principal funo do sangue transportar diversas substncias, realizan-
do as trocas entre os diversos sistemas do organismo. Dessa forma, o sangue
contribui para a respirao, a excreo, a nutrio das clulas, a regulao do
balano hdrico, a hemostasia, a regulao trmica e do equilbrio inico e
cido bsico, a imunidade e a regulao da presso sangunea.
O tecido sanguneo constitudo por uma poro celular, que corres-
ponde a 45% do sangue total, e pelo plasma, que corresponde a 55%.
O hematcrito a correlao entre o volume total de sangue e o volume de
hemcias. Os diferentes tipos de clulas que compem a poro celular do
sangue apresentam caractersticas morfolgicas bastante distintas, assim como
funes biolgicas especficas. Por exemplo, as hemcias esto encarregadas
de transportar os gases respiratrios, como o oxignio e o dixido de carbono.
Os granulcitos e moncitos esto envolvidos nos processos inflamatrios e da
fagocitose. J as plaquetas so responsveis pela hemostasia.
Um indivduo adulto do gnero masculino e com peso aproximado de 75
Kg apresenta de 3,6 a 5,8 L de sangue; j os indivduos do gnero feminino
com aproximadamente 55 Kg apresentam de 2,9 a 4,4 L de sangue.
A composio qumica do sangue dissolvido no plasma bastante complexa.
Ele constitudo principalmente por sdio, cloro, potssio, clcio, fosfatos, sais
inorgnicos, cido rico, escrias nitrogenadas, glicose, colesterol, triglicerdeos,
enzimas, anticorpos, hormnios, vitaminas, albuminas, fibrinognio, protrombina,
aglutininas e outras protenas.
3.2.1 As clulas sanguneas
As clulas sanguneas, originadas na medula ssea, embora apresentem

grande diversidade estrutural e funcional, so todas necessrias manuteno
da sade do organismo. Essas clulas compreendem a srie vermelha (com-
posta pelas hemcias) e a srie branca (composta por leuccitos neutrfilos,

eosinfilos, basfilos, linfcitos, moncitos), alm de outras possveis clulas,
como os mielcitos e metamielcitos, e as plaquetas.
3.2.1.1 Srie vermelha: hemcias

A gerao das hemcias influenciada por vrios fatores, nas diversas fases
da eritropoese: eritropoetina, vitamina B12, folato1 e ferro.
As hemcias humanas so anucleadas e em forma de disco bicncavo
(fig. 3.6). Essa clula contm, no seu interior, a hemoglobina, constituda por
quatro grupos heme, cada um dos quais com um tomo de ferro. A funo
bsica das hemcias transportar oxignio (O2) dos alvolos pulmonares para
os tecidos e transportar dixido de carbono (CO2) dos tecidos para os alv-
olos pulmonares.
Ao deixarem a medula ssea, essas clulas perdem o seu ncleo e seguem
para a corrente sangunea. Ao serem coradas pelo Giemsa, as hemcias ad-
quirem colorao rseo-clara. Na corrente sangunea, clulas apresentam um
halo central mais claro, em consequncia da biconcavidade. O halo central nas
hemcias normais corresponde a um tero do seu dimetro, que varia de 6 m
a 8,5 m.
Figura 3.6. Hemcias.
1
Folato o cido flico, tambm chamado folacina ou cido pteroil-L-glutmico; conhecido como
vitamina B9 ou vitamina M. Trata-se de uma vitamina hidrossolvel necessria formao de hemo-
globina pertencente ao complexo B.
Hematologia | 199
Os eritroblastos so encontrados eventualmente no sangue perifrico, evi-

denciando demanda aumentada da produo de eritrcitos. Isso revela grande
estimulao da medula ssea, que lana para o sangue perifrico clulas ainda
muito jovens e no adequadamente amadurecidas. Isso ocorre, por exemplo,
no perodo neonatal e na anemia hemoltica. Nessas duas situaes, existe
destruio aumentada das hemcias. Em condies extremas, quando a ne-
cessidade ainda maior, encontramos a presena de reticulcitos, que so
precursores anucleados dos eritrcitos no sangue perifrico. O nmero aumen-
tado de reticulcitos indicativo de uma medula submetida a um estado de
ativao crtica, como no caso de grande perda sangunea. Os reticulcitos so
identificados pela colorao com azul de cresil brilhante (fig. 3.7).
Figura 3.7. Reticulcito corado pelo azul de cresil brilhante.
3.2.1.2 Srie branca: leuccitos

Diferentes leuccitos esto presentes no sangue perifrico. So eles os
neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfcitos e moncitos. Podem ser divididos
em granulcitos e agranulcitos, de acordo com a presena ou no de gra-
nulaes especficas no citoplasma. Dessa forma, os neutrfilos, eosinfilos e
basfilos so classificados como granulcitos, diferindo dos linfcitos e mon-
citos, que so agranulcitos.
Os neutrfilos so os leuccitos mais numerosos na circulao sangunea

e representam de 60 a 65% dos leuccitos do sangue circulante normal.
Apresentam em mdia 13 m de dimetro e possuem ncleo segmentado, ge-
ralmente com trs lbulos. No citoplasma, podem ser observadas granulaes
especficas, pequenas, finas e dispersas, de colorao vermelho-salmo.
Os neutrfilos bastonados esto presentes no sangue perifrico (fig. 3.8),
em meio maioria dos neutrfilos segmentados (fig. 3.9). A sua forma nuclear
mais grosseira em relao ao ncleo do neutrfilo segmentado, e os neutr-
filos bastonados no apresentam diviso lobular.
Figura 3.8. Neutrfilo bastonado.
A B
Figura 3.9. Neutrfilos segmentados no sangue perifrico:

A) dois segmentos; B) trs segmentos.
Os eosinfilos (fig. 3.10) so um pouco maiores que os neutrfilos: tm di-

metro entre 12 m e 17 m. O ncleo segmentado e apresenta, em geral, dois
Hematologia | 201
lbulos. As granulaes especficas no citoplasma so esfricas, com contorno

ntido e de cor laranja ou avermelhada (com aspecto refringente). Os eosinfilos
esto presentes no sangue perifrico na frequncia relativa de at 4%.
Figura 3.10. Eosinfilo.
Os basfilos (fig. 3.11) so os leuccitos circulantes mais raros, com

frequncia relativa de 0 a 1%. Apresentam ncleo segmentado e citoplasma
com granulaes especficas metacromticas, de forma e tamanho variados. Essas
granulaes, quando coradas por corantes panticos, apresentam cor violeta.
Figura 3.11. Basfilo.
Os linfcitos (fig. 3.12) podem ser classificados em grandes ou pequenos

linfcitos. Os grandes linfcitos apresentam dimetro entre 10 m e 15 m,
ncleo arredondado e excntrico, e com cromatina densa. O citoplasma ba-
soflico com granulaes azurfilas. A relao ncleocitoplasma menor que
nos pequenos linfcitos. J os pequenos linfcitos so clulas com dimetro
entre 7 m e 8 m; seu citoplasma basoflico, e o ncleo apresenta cromatina
densa, ocupando 90% do citoplasma (grande relao ncleocitoplasma).

Os linfcitos representam de 20% a 30% dos leuccitos na circulao.
Figura 3.12. Linfcito.
3.3 A coleta de sangue
As anlises laboratoriais do sangue podem levar a resultados no reais em

decorrncia no s da manipulao laboratorial inadequada, mas tambm de
falhas no procedimento de coleta. Antes de se iniciar a coleta, todo o material
deve ser separado, inclusive os anticoagulantes adequados; alm disso, devem
ser usados tubos identificados e especficos para cada tipo de anlise. A iden-
tificao de cada tubo com o nome do paciente de extrema importncia.
No ato da coleta, deve-se sempre confirmar com o paciente o seu nome, dado
que a troca de amostras pode ter consequncias muito graves. A seguir, so
relacionados os itens a serem checados antes da coleta de sangue.
3.3.1 Material a ser checado antes de proceder venopuno
So os seguintes os materiais que devem estar disponveis antes da coleta

de sangue:
a) aparatos de biossegurana, como luvas, jaleco e todo o equipamento
de segurana individual (EPI), para evitar possvel contato com micror-
ganismos que possam estar presentes no sangue do paciente;
Hematologia | 203
b) etiquetas para a identificao dos pacientes;

c) tubos, identificados adequadamente, de acordo com o tamanho, o
volume e o aditivo, e que devem estar acessveis em uma estante de
tubos (fig. 3.13);
d) adaptadores e agulhas apropriadas;
e) torniquete para a puno;
f) lcool a 70%, algodo, gaze estril e bandagem;
g) local para descarte apropriado de agulhas e seringas.
Figura 3.13. Estante contento tubos de diversos tamanhos,

com diferente cor das rolhas.
Alm da checagem de todo o material necessrio para a coleta, algumas

informaes so de grande valia para as futuras anlises dos resultados labo-
ratoriais. Seguem algumas informaes importantes que devem ser levadas em
considerao nos resultados encontrados nas anlises laboratoriais:
a) a amostra de sangue para exames de rotina deve ser obtida no perodo
da manh, antes de o indivduo realizar exerccios fsicos, de modo
a no alterar o metabolismo de carboidratos, lipdios, protenas etc.,
uma vez que essas molculas podem vir a ser alvo de investigao nos
referidos exames; alm disso, o indivduo deve estar em jejum de ao
menos 8 horas, ou at mesmo de 12 horas, dependendo do exame e
de acordo com a recomendao do mdico e do laboratrio;
b) as informaes acerca dos medicamentos ou vacinas de que o indiv-

duo faz/fez uso so de grande importncia para que se possa corre-
lacionar a esse fato as possveis variaes observadas nos resultados;
c) outras informaes dadas pelo indivduo, como a ingesto h menos
de 12 horas de alguns alimentos banana, caf, ch, chocolate,
refrigerante e lcool ou o fumo so teis, posto que anlises de ca-
tecolaminas, metanefrinas, cido homovanlico e cido vanilmandlico
apresentam tais restries;
d) finalmente, o material coletado deve ser conservado e transportado
adequadamente at o laboratrio onde sero realizados os exames.
3.3.2 Procedimentos para a venopuno
Em primeiro lugar, o indivduo deve sentar-se na cadeira de coleta de forma

adequada para a realizao do procedimento, mantendo o brao em linha reta,
desde o ombro at punho, permitindo que as veias fiquem mais visveis. Deve-
se evitar que o cotovelo fique dobrado e manter a palma da mo do indivduo
voltada para cima (fig. 3.14).
Figura 3.14. Palpao das veias a fim de selecionar a mais adequada para a puno.
A seleo da regio da puno deve ser feita examinando-se com bas-

tante ateno o brao do paciente e verificando-se visualmente ou mesmo
apalpando-se as veias. A preferncia da escolha deve ser das veias do brao
Hematologia | 205
para as da mo, pois as veias de maior calibre e menos sensveis dor encon-
tram-se no brao (fig. 3.15).
Figura 3.15. Seleo da veia para a venopuno.
De acordo com a Sociedade Brasileira de Patologia Clnica (SBPC) (2010),

a escolha do local da puno deve basear-se nas seguintes consideraes:
a) as amostras no devem ser coletadas de membros nos quais estejam
instaladas terapias intravenosas;
b) devem ser evitados locais com reas cicatriciais de queimadura;
c) reas com hematomas, qualquer que seja o seu tamanho, podem gerar
resultados errados; se outra veia, em outro local, no estiver disponvel,
a amostra deve ser colhida distalmente ao hematoma;
d) fstulas arteriovenosas, enxertos vasculares ou cnulas vasculares no
devem ser manipulados, para a coleta de sangue, por pessoal no
autorizado pela equipe mdica;
e) deve-se evitar puncionar veias trombosadas: elas so pouco elsticas,
tm as paredes endurecidas e se assemelham a um cordo;
f) no se deve aplicar, no momento da seleo venosa, o procedimento
de bater na veia com dois dedos; esse tipo de procedimento provo-
ca hemlise capilar, alterando, portanto, o resultado de certos analitos.
O garroteamento (fig. 3.16) tem a funo de tornar as veias proeminentes

durante toda a coleta. O garrote deve ser colocado a aproximadamente 10 cm
do local da puno. O fluxo arterial no pode ser interrompido; logo, preci-
so que se verifique a pulsao do paciente. O garrote deve ser mantido por no
mximo 1 minuto, evitando-se assim a congesto local e a hemoconcentrao.
O garrote deve ser afrouxado ou retirado logo aps a coleta.
Figura 3.16. Colocao do torniquete.
Segue abaixo a sequncia que deve ser seguida pelo coletor, a fim de se
realizar uma adequada venopuno:
a) Remover a tampa que recobre a borracha da agulha (fig. 3.17);
Figura 3.17. Remoo da tampa que recobre a borracha da agulha.

Hematologia | 207
b) Adaptar a agulha j selecionada ao adaptador de tubo (fig. 3.18);
Figura 3.18. Adaptao da agulha ao adaptador de tubo.
c) Colocar o torniquete no brao do indivduo por, no mximo, um minuto;

d) Fazer a assepsia no local da venopuno, utilizando antissptico adequado;
e) Manter o brao do paciente inclinado para baixo;
f) Remover a capa superior da agulha (fig. 3.19);
Figura 3.19. Retirada da agulha do adaptador aps a agulha ser encapada.
g) Proceder venopuno propriamente dita, mantendo o brao do pa-

ciente abaixado e a tampa do tubo o mais alto possvel (fig. 3.20);
Figura 3.20. Venopuno.

h) Remover o torniquete aps o sangue fluir para dentro do tubo; caso

necessrio, utilizar mais de um tubo: proceder troca de tubo seguindo
o mesmo procedimento feito para o primeiro tubo; deve-se evitar que
o sangue entre em contato com a tampa do tubo;
i) Remover cuidadosamente da veia do paciente o adaptador, juntamente
com a agulha;
j) Descartar a agulha em recipiente adequado para perfurocortantes
(fig. 3.21);
k) Comprimir com algodo o local da puno e colocar bandagem.
Figura 3.21. Descarte para material perfurocortante.
3.3.3 Cuidados com a amostra coletada
A coleta de sangue venoso em geral feita em tubos contendo anticoagu-

lante, sendo o mais usado o cido etilenodiaminotetractico (EDTA), anti-
coagulante recomendado para hematologia por preservar melhor a integridade
das clulas sanguneas. O sangue contendo anticoagulante deve ser conserva-
do a 4C por no mximo 24 horas, dado que, aps esse perodo, comea
a ocorrer alterao morfolgica das clulas, lembrando-se que, idealmente, as
anlises devem ser realizadas logo aps a coleta do sangue.
Para cada tipo de anlise sangunea, necessrio utilizar reagentes dife-
rentes: nos exames bioqumicos de modo geral, pode-se usar o plasma ou o
Hematologia | 209
soro; no hemograma completo e tipagem sangunea, requerido o sangue total

com EDTA; na anlise de glicemia, necessrio utilizar plasma com fluoreto;
j para analisar os fatores da coagulao sangunea, necessrio utilizar plasma
com citrato de sdio. No quadro 3.3, observamos a correlao entre a cor da
tampa do tubo, o anticoagulante e o respectivo exame.
Quadro 3.3. Correlao entre a cor da tampa do tubo,

o tipo de anticoagulante e o seu uso respectivo.
Cor da tampa* Anticoagulante Exemplos de uso
exames que requerem soro: bioqumica
Vermelha nenhum
e sorologia, por exemplo
Lils EDTA hematologia e tipagem sangunea
exames de coagulao: TAP, TTPa,
Azul claro citrato de sdio
fibrinognio
Cinza fluoreto de sdio glicose
exames especiais, tais como avaliao
Verde heparina de fragilidade dos glbulos vermelhos e
gasometria
* Cores de tampas conforme a ISO 6710.2
3.4 O hemograma
No hemograma, examinamos o sangue por meio de um esfregao ou de

distenso sangunea sobre a superfcie de uma lmina. Isso permite analisar o
aspecto morfolgico das clulas. Tal exame utilizado rotineiramente pelo
mdico, como exame laboratorial adicional, o qual acrescenta informaes im-
portantes investigao clnica inicial. O hemograma contribui com a anlise
quantitativa e qualitativa dos elementos figurados sanguneos: clulas das s-
ries branca e vermelha, contagem de plaquetas, reticulcitos, ndices hema-
timtricos e parmetros hematolgicos. As alteraes das clulas sanguneas
refletem diretamente s variaes internas do organismo.
O lquido sanguneo possui dois componentes: plasma e clulas. Esses

componentes podem ser vistos facilmente aps centrifugao de um volume
sanguneo qualquer e da colocao da amostra em um tubo de ensaio comum,
quando notamos que h fracionamento daquele volume em duas partes: a
superior, formada por lquido amarelado citrino, translcido o plasma; e a
poro inferior, constituda por uma camada avermelhada onde se encontram
os elementos figurados do sangue as clulas. H, ainda, uma fase interme-
diria, composta por um anel esbranquiado, rico em leuccitos e plaquetas,
denominado buffy coat (fig. 3.22).
Figura 3.22. Tubos ilustrando sangue total e aps a centrifugao: A) Sangue fresco
recm-coletado; B) Aps a centrifugao do sangue, o sangue se divide em plasma e
hemcias, e o buffy coat apresenta-se como um anel esbranquiado.
A avaliao sangunea requer a quantificao de cada elemento celular, me-

diante a utilizao de mtodos manual e automatizado. Ao se utilizarem mto-
dos automatizados, preciso lembrar que o equipamento deve ser apropriado
e estar calibrado. Alm disso, importante entender que os resultados obtidos
pelos mtodos automatizados traduzem a mdia das caractersticas apresen-
tadas pelo total das clulas da amostra, mas no descrevem adequadamente
os valores individuais das clulas dispostas em torno da mdia apresentada.
O exame microscpico desse espcime sanguneo tambm necessrio para
a anlise complementar, por meio da filmagem do sangue ou da avaliao do
espraiado sobre uma lmina de esfregao sanguneo.
Hematologia | 211
3.4.1 Avaliao automatizada
3.4.1.1 Srie vermelha

A anlise das hemcias envolve trs parmetros quantitativos: o hemat
crito correlao entre o volume total de sangue e o de hemcias; a quantida-
de total da hemoglobina; e a quantidade de hemcias por unidade de volume,
que nos permite avaliar as caractersticas da populao celular. A contagem
de hemcias utiliza corriqueiramente um mtodo automatizado eletrnico cujo
resultado o mais prximo da realidade, pois a equao permite descontar os
erros matemticos de clculo. No quadro 3.4, esto descritos os valores nor-
mais dos parmetros das hemcias. Nesse mesmo quadro, podemos observar
que os valores da hemcia, da hemoglobina e do hematcrito variam de
acordo com a idade e o sexo.
Quadro 3.4. ndices normais de hemcias, hemoglobina e hematcrito.

Hemcias Hemoglobina Hematcrito
Idade
(x106/mm3) (x106/mm3) (%)
Recm-nascidos (a termo) 4 a 5,6 13,5 a 19,6 44-62
Crianas (3 meses) 4,5 a 4,7 9,5 a 12,5 32-44
Crianas (1 ano) 4 a 4,7 11 a 13 36-44
Crianas (10 a 12 anos) 4,5 a 4,7 11,5 a 14,8 37-44
Mulheres grvidas 3,9 a 5,6 11,5 a 16 34-47
Mulheres no grvidas 4 a 5,6 12 a 16,5 35-47
Homens 4,5 a 6,5 13,5 a 18 40-54
Fonte: Extrado de Verrastro e Lorenzi, 2005, com modificao dos valores normais para eritrcitos,
hemoglobina e hematcrito.
Trs outros ndices qualitativos se somam anlise rotineira das hemcias,

tais como o volume corpuscular mdio (VCM), a hemoglobina corpuscu-
lar mdia (HCM) e a concentrao de hemoglobina corpuscular mdia
(CHCM) (quadro 3.5).
Os mtodos analticos calculados pelos aparelhos automticos permitem
alto grau de preciso nos resultados, em comparao com a anlise realizada
por mtodos manuais.
Quadro 3.5. ndices hematimtricos.
ndice valores normais clculo (exemplo)
hematcrito x 10/hemcias 6.100.000

VGM (volume globular mcrons cbicos hemcias e Ht 46%
mdio) VGM=46x10/6,1
valores normais: 80-100 VGM=75,41
Hemoglobina x 10/ 6.200.000

HGM (hemoglobina hemcias picogramas hemcias e Hb16
globular mdia) HGM=16x10/6,1
valores normais: 27-32 HGM=26,23
CHGM (concentrao hemoglobina x 100/ Hb 16 e Ht 46

hemoglobnica globular hematcrito % CHGM=16x100/46
mdia) valores normais: 33-37 CHGM=34,7%
Hematcrito (Htc) = volume total de sangue/volume das hemcias

Esse ndice diz respeito ao volume ocupado pelas hemcias em deter-
minada amostra sangunea. Podemos observar facilmente quando, aps
a centrifugao de um volume de sangue fresco, obtemos o soro e um
volume de hemcias: isso nos traduz o hematcrito.
O hematcrito no corresponde massa total das hemcias, apenas
mede a concentrao dessas clulas. Assim, um paciente que tenha
perdido grande volume sanguneo pode apresentar valores normais ou
altos ndices de hematcrito, por causa da perda de importante quan-
tidade de hemcias em relao ao seu percentual normal por volume.
O hematcrito expresso em porcentagem por volume: um hematcrito
de 35% significa que h 35 mL de eritrcitos em 100 mL de sangue.
Concentraco de hemoglobina
A hemoglobina um pigmento proteico, de colorao vermelha. Seu
valor obtido pela tcnica de espectrofotometria. Essa protena se
encontra no sangue sob diversas formas oxihemoglobina, carboxihe-
Hematologia | 213
moglobina etc. e passa a expressar uma forma estvel de hemoglobina:

a cianometaglobulina.
Contagem de hemcias
Na anlise hematolgica, tanto as hemcias quanto os leuccitos so ob-
tidos aps diluio de todo o volume sanguneo em soluo isotnica.
Observamos, ento, que o nmero total de hemcias excede em muito
o nmero total de leuccitos (1:500 ou mais).
Volume corpuscular mdio (VCM) = Hmt (L/L) x 1.000/nmero

total de hemcias (1.012/L)
A mdia do volume das hemcias representa a mdia do volume (tama-
nho) das hemcias; um parmetro importante utilizado na classificao
das anemias e que pode evidenciar alteraes prprias de doenas eri-
trocticas.
Hemoglobina corpuscular mdia (HCM) = hemoglobina (g/L)/

nmero total de hemcias (1.012/L)
A HCM representa a mdia do contedo de hemoglobina por hem-
cia. Pode ser calculada tanto por mtodos automatizados quanto por
mtodos manuais. A HCM expressa a massa de hemoglobina.
Concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM) =

hemoglobina (g/dL)/Htc (L/L)
A CHMC representa a mdia da concentrao de hemoglobina em
volume sanguneo; esse parmetro expresso em gramas.
RDW (do ingls red cell distribution width, ou seja amplitude da dis-
tribuio de clulas vermelhas)
O coeficiente RDW indica a anisocitose (variao de tamanho) das
hemcias, representando a percentagem de variao dos volumes obti-
dos. Os valores de referncia do ndice so 11,5% a 15. O valor ideal
13%.
3.4.1.2 Srie branca: leuccitos

Podemos analisar os leuccitos tanto por mtodos manuais (erro entre
6,5% e 15%) quanto por mtodos automatizados (erro entre 1% e 3%).
A contagem leucocitria feita mediante a diluio do sangue na presena de
tampo de lise (comumente cidos ou detergentes). O valor de referncia para
a contagem de leuccitos totais em homens e mulheres de 5.000 a 10.000
leuccitos/L de sangue (5-10.103/L); o valor igual para homens e mulhe-
res, pois o nmero total de leuccitos no sangue no depende do sexo.
3.4.1.3 Anlise de plaquetas

As plaquetas so identificadas microscopia de luz, pelas suas caractersti-
cas de impedncia e mediante colorao por Giemsa.
3.4.2 Anlise morfolgica das clulas sanguneas
Uma avaliao muito criteriosa de um espraiado de sangue sobre superfcie

de vidro a etapa mais importante na anlise de doenas hematolgicas.
Preparao do esfregao ou distenso sangunea

Uma gota de sangue colocada no centro de uma lmina previamente
limpa. O tamanho da gota pode influenciar no resultado. Se a gota
for muito grande, pode resultar em uma distenso sangunea muito
espessa, impossibilitando a leitura; se, ao contrrio, a gota for muito
pequena, o resultado ser prejudicado por causa do escasso exemplar
de clulas sanguneas.
O esfregao ou distenso sangunea se faz com a utilizao de outra
lmina, colocada sobre a primeira, em um ngulo de 45, trazendo o
sangue, de modo firme, rpido e com movimentos leves (fig. 3.23).
Produz-se, assim, um filme de 3 a 4 cm de extenso, com uma amostra
homognea e bastante representativa.
Em situaes nas quais h poucas clulas por exemplo, no fluido
espinhal , a utilizao de tcnicas de centrifugao mais apropria-
da. A distenso sangunea traz melhor resultado, nesses casos, quando
Hematologia | 215
processada por tcnico bem experiente em mtodos automatizados. A

colorao utilizada azul de metileno e eosina, uma colorao bsica.
Figura 3.23. Desenho esquemtico mostrando a sequncia do esfregao,

ou distenso sangunea.
O sangue deve ser examinado ao microscpio ptico, em objetivas de

10X a 20X, para a anlise eficaz da distribuio celular e dos contrastes que
as clulas apresentam aps a colorao. Esse aumento nos permite analisar
as clulas da srie branca, assim como a presena de clulas imaturas e/ou
alteradas que porventura estejam presentes. J as objetivas de 40X e 100X
(imerso) permitem a anlise diferencial e detalhada dos leuccitos.
importante analisar todo o sangue espraiado em uma lmina, principal-
mente nos limites externos, mais do que na regio central, pois h uma ten-
dncia de as clulas grandes, entre as quais esto os leuccitos, agregarem-se
mais nessas regies.
3.5 O hemograma alterado
Como j mencionado anteriormente, ratificamos aqui o hemograma como um

exame laboratorial complementar clnica, o qual pode auxiliar nos diagnsticos
no apenas de anemias, leucemias e outras alteraes da medula ssea, mas tam-
bm de muitas outras alteraes clnicas por exemplo, a presena de infeces.
A anlise quantitativa das sries vermelha e branca e das plaquetas, juntamente
com a observao cuidadosa das alteraes morfolgicas presentes na lmina de
sangue perifrico, podem oferecer indcios importantes para o diagnstico de
diversas doenas. Abaixo discutimos algumas das principais alteraes.
3.5.1 Alteraes da srie vermelha
3.5.1.1 Anemia por deficincia de ferro

A anemia por deficincia de ferro a causa mais comum de anemia no
mundo. O ferro faz parte da formao da hemoglobina e est presente nas
hemcias. Esse tipo de anemia ocorre quando a sntese de hemoglobina fica
prejudicada pela carncia de ferro.
A anemia ferropriva caracteriza-se inicialmente por baixo estoque de fer-
ro na medula ssea (ferritina2 baixa < 30 ng/mL) com hemcias de tamanho
e forma normal, evoluindo a seguir para anemia microctica (VCM < 80) e
hipocrmica. Na fase inicial, o RDW (ndice de anisocitose) encontra-se au-
mentado. Na anemia crnica, quando a maior parte das hemcias microctica
(fig. 3.24), o valor do RDW pode estar normal.
Figura 3.24. Hemcias hipocrmicas ou microcticas.
Na lmina de sangue perifrico, verifica-se, alm de microcitose e hipo-

cromia, a poiquilocitose (fig. 3.25) (alterao na forma das hemcias) e a
anisocitose (variao no tamanho das hemcias), podendo tambm ocorrer
trombocitose.
2
Protena que serve de reserva de ferro e que est envolvida na sntese de compostos que contm
ferro, como os precursores eritroides, e no metabolismo e reserva do ferro, estando presente em
clulas como os hepatcitos e macrfagos.
Hematologia | 217
Figura 3.25. Anisopoiquilocitose.
A deficincia de ferro pode decorrer de carncia alimentar, falha na ab-

soro ou perdas ocasionadas por sangramento mais frequente em mulheres
com distrbios menstruais. As parasitoses intestinais e a gravidez tambm
podem ser causa de anemia ferropriva. Uma vez diagnosticada, deve-se
investigar a causa dessa anemia para que, alm da reposio de ferro, seja
feito tratamento adequado.
3.5.1.2 Anemia megaloblstica

A anemia megaloblstica deve-se na maioria das vezes deficincia de
vitamina B12 (cobalamina) e/ou de cido flico. Essas duas substncias
so necessrias para a formao do DNA da clula, e a anemia ocorre como
resultado da eritropoese ineficaz.
No sangue perifrico, h hemcias macrocticas (fig. 3.26) (VCM > 100),
com macrovalcitos e neutrfilos plurissegmentados (fig. 3.27). A anemia
megaloblstica costuma cursar com reticulocitopenia e em casos mais graves
pode levar a leucopenia e trombocitopenia.
A principal causa de deficincia de cobalamina a anemia perniciosa pela
presena de anticorpo antifator intrnseco no estmago, que impede a absor-
o adequada da cobalamina. Outras causas de deficincia dessa vitamina so
deficincia diettica ps-gastrectomia ou cirurgia baritrica. A deficincia de
cobalamina pode acarretar alteraes neurolgicas.
A deficincia de cido flico pode decorrer de carncia causada por al-
coolismo, por exemplo, ou ser resultante do aumento da necessidade, como
ocorre durante a gestao e em anemias hemolticas em geral. Alguns medi-

camentos como trimetoprim, metotrexato e AZT tambm podem estar
relacionados a essa deficincia. O tratamento feito por meio da reposio
oral de cido flico e reposio intramuscular de vitamina B12.
Figura 3.26. Hemcia macroctica.
Figura 3.27. Neutrfilo plurissegmentado.
3.5.1.3 Anemia associada a doenas crnicas

Esse tipo de anemia geralmente est associado a doenas crnicas, pro-
cessos inflamatrios ou cncer, e causado por citocinas que interferem no
metabolismo do ferro, na sobrevida das hemcias e na resposta dos precursores
Hematologia | 219
eritroides, a eritropoetina. O sangue perifrico apresenta hemcias normocti-

cas e normocrmicas, e a contagem de reticulcitos normal. O ferro srico
est diminudo e a ferritina, por ser uma protena de fase aguda, tende a estar
aumentada, embora no reflita os estoques de ferro da medula ssea.
3.5.1.4 Anemia decorrente de defeitos na membrana eritrocitria

A membrana eritrocitria composta por lipdios e protenas e fornece
hemcia sua caracterstica de elasticidade/resistncia e deformabilidade. Alguns
defeitos genticos na membrana podem levar anemia hemoltica, quando
ocorre a destruio das hemcias e o aumento da bilirrubina, um produto da
degradao da hemoglobina.
3.5.1.5 Esferocitose hereditria

Caracteriza-se por ser uma doena autossmica dominante na qual, em
decorrncia de uma anormalidade na espectrina uma protena da membrana
eritrocitria , ocorre a produo de hemcias com forma esfrica (fig. 3.28)
e sem a palidez central no sangue perifrico. As hemcias no deformveis so
destrudas no bao.
As manifestaes clnicas variam, mas pode haver anemia (que varia com o
grau de alterao), aumento da bilirrubina indireta, reticulocitose e esplenome-
galia associada esferocitose, no sangue perifrico. As hemcias apresentam
fragilidade osmtica aumentada. O tratamento para os casos graves consiste em
esplenectomia (retirada cirrgica do bao).
Figura 3.28. Esfercitos.

3.5.1.6 Eliptocitose
A eliptocitose caracterizada pela presena de hemcias de forma elptica
(fig. 3.29) ou oval no sangue perifrico por causa de um defeito no exoesque-
leto da membrana eritrocitria. Cursa com hemlise mais discreta e, em alguns
casos, no causa anemia.
Figura 3.29. Eliptcitos.
3.5.1.7 Acantocitose e estomatocitose

A acantocitose caracterizada por anormalidades na composio
lipdica da membrana eritrocitria. Os eritrcitos apresentam-se contrados
e com projees na membrana (fig. 3.30). Podem ser vistos em pacientes
hepatopatas graves ou em portadores de abetalipoproteinemia, uma doena
autossmica recessiva que cursa com alteraes neurolgicas e doena celaca.
A intensidade de hemlise geralmente no clinicamente significante e no
necessita de tratamento especfico.
Figura 3.30. Acantcitos.

Hematologia | 221
A estomatocitose est associada a alteraes hereditrias na permeabilidade

da membrana eritrocitria. Cursa com anemia hemoltica leve a moderada
e macrocitose (VCM > 100). Pode haver hemcias em alvo no sangue
perifrico.
3.5.1.8 Anemia devido deficincia enzimtica

As hemcias contam com um arsenal de enzimas capazes de gerar energia
por meio da gliclise. A falta dessas enzimas pode causar aumento da suscep-
tibilidade hemlise, com diminuio da vida mdia da hemcia.
3.5.1.9 Deficincia de piruvatoquinase

A deficincia de piruvatoquinase uma anemia hemoltica no esferoctica
de quadro clnico varivel. Cursa com anemia, esplenomegalia e ictercia. Deve
ser investigada em recm-nascidos com anemia hemoltica, mediante dosagem
da enzima. No h tratamento especfico, mas a esplenectomia pode estar
indicada em casos de hemlise mais grave.
3.5.1.10 Deficincia de G-6-PD

A deficincia de G-6-PD acarreta quadros de anemia hemoltica aguda,
precipitados por infeces ou por ingesto de substncias oxidantes como
derivados de sulfa, alguns analgsicos e antimalricos. Tem incio sbito e ge-
ralmente autolimitada. O hemograma apresenta microesfercitos e hemcias
mordidas (bite cells), alm de reticulocitose.
3.5.1.11 Doena falciforme

A doena falciforme uma alterao na hemoglobina (hemoglobinopa-
tia) autossmica recessiva. Em decorrncia de uma alterao gentica, forma-
se uma hemoglobina anormal chamada S (do ingls sikcle, que significa foi-
ce). Essa hemoglobina HbS pode polimerizar-se, levando a uma alterao em
forma de foice da membrana da hemcia, o que pode desencadear hemlise

ou episdios vaso-oclusivos, dado haver perda na deformabilidade da clula.
Nos Estados Unidos, 8% dos negros so portadores do

gene da HbS. No Brasil, cerca de 0,2% da populao negra
portadora da HbS, sendo a alterao mais prevalente no
estado da Bahia.
A doena falciforme varia desde o trao falcmico quando h heterozigose

HbAS , com quase nenhuma repercusso clnica, at a anemia falciforme
homozigose HbSS , que cursa com anemia hemoltica crnica e ictercia, po-
dendo evoluir com crises dolorosas, em decorrncia da vaso-ocluso, que pode
resultar de diversos fatores como desidratao, infeco ou hipoxemia e
evoluir com complicaes insuficincia renal, necrose isqumica ssea etc.
O diagnstico pode ser feito precocemente com base na eletroforese de
hemoglobina indicando a presena da hemoglobina anormal S. Cursa com
Hb em torno de 7%, reticulocitose, leucocitose e trombocitose. A lmina de
sangue perifrico apresenta hemcias em forma de foice, eritroblastos (hemcias
jovens nucleadas) e policromatofilia (fig. 3.31).
Figura 3.31. Hemcia em foice e eritroblastos.

Hematologia | 223
3.5.1.12 Anemia aplstica

A anemia aplstica definida como um distrbio na hematopoese
que ocorre na medula ssea, resultando em diferentes graus de anemia,
leucopenia e trombocitopenia. Cursa com baixa contagem de reticulcitos.
Pode ser de causa adquirida, como aps infeces pelo vrus Epstein-
Baar, ou por uso de alguns medicamentos, como cloranfenicol, ou heredi-
tria. Aproximadamente 65% dos casos so idiopticos. No apresenta
alteraes significativas na lmina de sangue perifrico, exceto pela pobre-
za de clulas e plaquetopenia.
3.5.1.13 Eritrocitose
A eritrocitose definida como o aumento do nmero de hemcias circu-
lantes. Pode ser primria ou secundria. A eritrocitose primria policitemia
primria ou policitemia vera uma doena mieloproliferativa em que ocorre
aumento na produo de hemcias, independentemente do estmulo da eritro-
poetina ou da quantidade de hemcias circulantes.
Na eritrocitose secundria policitemia secundria , o aumento do n-
mero de hemcias compensatrio. Por exemplo, nas altas altitudes, quando o
ar rarefeito, h aumento do nmero de hemcias para compensar a hipoxemia;
o mesmo acontece em cardiopatias e doenas pulmonares crnicas. Fumantes
tambm podem apresentar eritrocitose. O hematcrito geralmente > 51%
em homens e > 48% em mulheres, sendo a morfologia das hemcias normal.
3.5.1.14 Efeito rouleaux

Rouleaux o empilhamento de hemcias (fig. 3.32). visto na lmina de
sangue perifrico e na maioria das vezes est relacionado com doenas que cur-
sam com aumento de protena ou imunoglobulina circulante, como o mieloma
mltiplo. causa de aumento da velocidade de hemossedimentao (VHS)
e pode interferir em testes imuno-hematolgicos.
Figura 3.32. Hemcias em rouleaux (hemcias empilhadas).
3.5.2 Alteraes da srie branca
3.5.2.1 Leucocitose
A leucocitose o aumento do nmero de leuccitos circulantes
>10.000/L. Pode ser resultante de processos infecciosos ou de alteraes
medulares. importante avaliar a contagem diferencial, que pode indicar a causa
da alterao. A contagem de leuccitos geralmente expressa na seguinte ordem:
Em processos infecciosos bacterianos agudos, o nmero de neutrfilos ten-

de a aumentar. Em processos mais graves, a medula ssea libera formas mais
jovens bastes, metamielcitos, mielcitos para a defesa do organismo.
Dessa forma, quando um hemograma est alterado por infeco bacteriana
aguda, alm de leucocitose e neutrofilia, possvel observar o chamado desvio
para esquerda, isto , um aumento do nmero de formas mais jovens circulan-
tes. Observa-se, ainda, granulao txica dos neutrfilos.
Em alguns casos, pode acontecer a chamada reao leucemoide, com
contagens de leuccitos acima de 30.000, na maioria dos casos causada por
infeco e que deve ser diferenciada da leucemia aguda por meio dos dados
clnicos e de exames complementares.
Hematologia | 225
O uso de alguns medicamentos, como corticosteroides, tambm pode cau-

sar leucocitose e aumento do nmero de formas mais jovens circulantes, sem
infeco. Na gestao, h tambm tendncia leucocitose.
As infeces virais, em sua maioria, cursam com leucopenia e linfocitose; j
as infestaes por parasitas e alergias em geral podem cursar com eosinofilia.
A basofilia pode estar presente em situaes clnicas especficas, como
doena de Hodgkin (um tipo de linfoma) e leucemia mieloide crnica.
Outras causas de leucocitose esto relacionadas com doenas malignas,
como os diversos tipos de leucemias que, alm de acarretarem aumento no
nmero total de leuccitos, podem apresentar clulas blsticas clulas
muito jovens, clonais, com relao ncleo-citoplasma alterada no sangue
perifrico. Essas clulas clonais invadem a medula ssea. Muitas vezes, o
paciente apresenta leucocitose, porm com anemia e trombocitopenia, uma
vez que toda a produo da medula ssea desviada para as clulas leu-
cmicas. As leucemias podem ser agudas ou crnicas, tendo, nesse ltimo
caso, curso clnico mais brando.
3.5.2.2 Leucopenia
A leucopenia a diminuio da contagem global de leuccitos circulantes.
Pode estar associada diminuio da contagem de clulas especficas, como
linfcitos ou neutrfilos. A linfopenia, diminuio do nmero de linfcitos,
pode ocorrer em algumas infeces virais ou bacterianas e em doenas autoi-
munes, como o lupus eritematoso.
A neutropenia (neutrfilos <1.500/L) a diminuio da contagem de
neutrfilos, que pode ser consequncia de doenas que infiltram a medula
ssea, como leucemias e linfomas, ocorrer aps tratamentos de quimioterapia
ou uso de alguns medicamentos, como anti-inflamatrios e medicamentos para
a tireoide, ou ser de causa infecciosa ou mais raramente hereditria. Pacientes
neutropnicos esto em grande risco para infeces em geral e devem ser cui-
dadosamente investigados e acompanhados.
3.5.3 Alteraes das plaquetas
3.5.3.1 Trombocitose
Trombocitose (fig. 3.33) o nome que se d ao excesso de plaquetas no
sangue (>400.000/L), que pode ter diferentes causas. Como as plaquetas
possuem importante papel na coagulao do sangue, frequente o apareci-
mento de trombocitose aps alguma hemorragia j debelada ou nas duas pri-
meiras semanas do ps-operatrio. Sendo as plaquetas destrudas pelo bao,
pacientes esplenectomizados podem manifestar trombocitose.
Algumas condies podem apresentar elevao plaquetria, por exemplo,
pacientes adultos com doenas inflamatrias crnicas ou crianas pr-escolares,
aps inflamao aguda. Pode tambm ser uma manifestao paraneoplsica de
portadores de cncer ou, mais raramente, ocasionada por doena mieloproli-
ferativa crnica, sendo a trombocitose primria (e no reacional) denominada,
nesse caso, trombocitemia essencial.
Figura 3.33. Trombocitose.
3.5.3.2 Trombocitopenia
a baixa contagem de plaquetas no sangue circulante (<150.000/L),
um achado bastante frequente no hemograma. A avaliao da lmina de san-
Hematologia | 227
gue perifrico importante para confirmar trombocitopenia, pois, em alguns

casos, as plaquetas podem formar grumos, o que impede a sua contagem
correta pelos mtodos automticos.
A trombocitopenia possui diversas causas associadas: como as plaquetas
so formadas na medula ssea, doenas hematolgicas proliferativas, como as
leucemias, podem afetar a produo de plaquetas, assim como a quimioterapia
e a radioterapia antiblsticas. Sendo o bao o responsvel pela destruio
plaquetria, a esplenomegalia (crescimento do bao) ou o hiperesplenismo
(aumento de sua atividade) podem levar trombocitopenia.
A contagem plaquetria diminui fisiologicamente de 10% a 30% na gravi-
dez. Condies patolgicas que cursam com a trombocitopenia podem variar,
ocorrendo desde viroses comuns at quadros graves como hemorragias, sep-
ticemia ou coagulao intravascular disseminada, quando as plaquetas so con-
sumidas no processo. Existem ainda doenas autoimunes em que as plaquetas
so atacadas por anticorpos do prprio paciente, como a prpura trombocito-
pnica imunolgica. Por ltimo, necessrio lembrar que vrios medicamentos
de uso corriqueiro como anti-inflamatrios no esteroidais podem causar
trombocitopenia como efeito colateral.
3.6 Hemostasia e coagulao
3.6.1 Componentes principais
Endotlio
Os vasos sanguneos e linfticos so revestidos internamente por uma cama-
da de clulas, ditas endoteliais, as quais, juntamente com o tecido conjuntivo
imediatamente subjacente subendotlio , constituem a denominada tnica
ntima desses vasos. Em artrias, arterolas, veias e vnulas, as clulas endote-
liais formam um revestimento contnuo. Em capilares, no entanto, podem se
apresentar de trs formas distintas: contnua, fenestrada (as clulas endoteliais
apresentam pequenas fenestras, mas a membrana basal contnua) ou des-

contnua (tanto as clulas quanto a membrana basal possuem fenestras), forma
encontrada, por exemplo, no bao, na medula ssea e no fgado.
Em um indivduo humano adulto de cerca de 70 Kg, essas clulas chegam
casa dos trilhes (1 a 6 x 1013), cobrindo uma rea total de 1 a 7 m2 e
pesando cerca de 1 Kg. Possuem grande heterogeneidade de fentipo, tanto
em forma quanto em expresso de molculas em sua superfcie, dependendo
do stio onde se encontram. No possuem estruturas similares a desmossomos,
unindo-se entre si mediante ligaes intercelulares dos seguintes tipos: tight
(por meio de ocludinas); de adeso (caderinas, em especial a VE-caderina);
gap (conexinas); e syndesmos (desmoplaquina interagindo com VE-caderina
ou caderina-5). Essas interaes so fundamentais para a determinao de
aspectos relacionados permeabilidade vascular, bem como na transferncia
de sinais intracelulares.
As clulas endoteliais no so inertes. Pelo contrrio, so altamente ativas
metabolicamente e possuem vrias funes, as quais podem variar segundo a
regio onde elas se encontram. Destacadamente, atuam no controle da perme-
abilidade vascular, na transmigrao leucocitria, na regulao do tnus vascu-
lar, na angiognese e na hemostasia.
Plaquetas
Presentes habitualmente no sangue perifrico na quantidade de 150.000
a 450.000/m, as plaquetas so derivadas da fragmentao citoplasmtica de
megacaricitos na medula ssea. Diariamente, formam-se cerca de 100 bilhes
de novas plaquetas, que possuem tempo de vida de 8 a 14 dias, quando so,
ento, removidas da circulao por macrfagos.
Morfologicamente, quando no ativadas, so estruturas discoides, com
aproximadamente 3 m de dimetro e 1 m de espessura, estrutura essa mantida
custa da disposio circunferencial de microtbulos e filamentos de actina.
Na membrana plasmtica, expressam principalmente GPIb-IX (glicoprotena
rica em leucina), integrinas (VLA-2, VLA-5 e VLA-6), GPIIb-IIIa, CD31,
CD36 e P-selectina. Seu citoplasma possui mitocndrias, lisossomos, corpsculos
Hematologia | 229
densos (ricos em difosfato de adenosina ADP, trifosfato de adenosina ATP,

serotonina e clcio) e grnulos alfa. Esses ltimos secretam protenas adesivas,
como fibrinognio, fator de von Willebrand, fibronectina, vitronectina e
trombospondina, alm de possurem algumas protenas especficas, tais como
o fator 4 plaquetrio e a beta-trombomodulina, e de conterem protenas
associadas coagulao, como fatores de crescimento, albumina, P-selectina,
protena S e os fatores V e XI.
Funcionalmente, alm do papel referente hemostasia tradicionalmente
atribudo s plaquetas, elas tambm atuam em processos como inflamaes,
angiognese e metstase tumoral.
Protenas sricas
No plasma circulam uma srie de protenas que, juntamente com seus cofa-
tores, so produzidas majoritariamente no fgado e tm papel fundamental nos
processos de hemostasia, desde a adeso plaquetria at a formao completa
do cogulo. Essas protenas participam da adeso e da interao celulares,
bem como em complexos processos de interao molecular e em reaes de
protelise que resultam na formao do cogulo de fibrina e, posteriormente,
na sua reabsoro.
Tradicionalmente, a coagulao apresentada como uma cascata de reaes
sequenciais na qual ocorreriam sucessivas ativaes de pr-enzimas por protea-
ses plasmticas, at a obteno de trombina, enzima que converte fibrinognio
em fibrina. Essa proposta delineia duas vias de reao: uma dita intrnseca,
com participao de fatores plasmticos, e outra, extrnseca, com participao
de fatores plasmticos e de componentes extravasculares.
Essas duas vias apresentam convergncia para um ponto comum: a ativao
do fator X.3 Nesse modelo, a via extrnseca ativaria o fator X pelo fator
VIIa fator VII plasmtico ativado pelo seu cofator, a tromboplastina,
tambm chamada de fator tecidual. A via intrnseca, por sua vez, comea
com a ativao do fator XII em XIIa, mediante seu contato com uma super-
fcie carregada negativamente na presena de pr-calicrena e cininognio
3
Por conveno, os fatores de coagulao so representados por algarismos romanos e, se ativados,
recebem a letra a logo a seguir.
de alto peso molecular. A partir da, so ativados sucessivamente os fatores

XI, IX e X.
No entanto, a evoluo do conhecimento vem mostrando que o modelo
de cascata dividida em duas vias no reproduz com exatido a fisiologia da
coagulao, pois: a) a ativao do fator IX no exclusiva da via intrnseca;
b) a via extrnseca a principal iniciadora da coagulao (deficincias de
fator VII provocam quadros hemorrgicos graves); e c) essas vias no funcio-
nam de maneira independente.
3.6.2 Fisiologia
O endotlio normal inibe a adeso plaquetria, bem como a ativao de

fatores de coagulao. Quando ocorre leso do revestimento endotelial por
trauma ou doena, e o sangue entra em contato com o conjuntivo subendotelial,
dispara-se o processo de hemostasia primria. Para esse processo, que ocorre
poucos segundos aps a leso, concorrem componentes do endotlio vascular
e plaquetas, resultando na formao, no local da leso, de tampo plaquetrio
cujo efeito hemosttico transitrio, porm fundamental, na interrupo do
extravasamento de sangue em capilares, vnulas e pequenas arterolas.
A hemostasia secundria (coagulao) demora vrios minutos e consiste
em reaes do sistema plasmtico de coagulao que resultam na produo de
filamentos de fibrina. Esses filamentos consolidam o tampo hemosttico pri-
mrio, formando o trombo. Por fim, aps a resoluo da leso, entra em ao
o sistema fibrinoltico, o qual dissolve gradativamente o cogulo e restabelece
o fluxo sanguneo normal.
Hemostasia primria
o processo pelo qual se forma um tampo plaquetrio no local do trau-
matismo vascular. O primeiro evento que ocorre na hemostasia primria a
vasoconstrio. Essa, embora efmera, importante e pode atingir at 60%
de reduo da luz original do vaso lesado. Alguns fatores endoteliais atuam
nesse momento, com destaque para a endotelina-1, que age promovendo o
Hematologia | 231
aumento do clcio intracelular e, subsequentemente, do tnus da musculatura

lisa vascular, e o fator ativador de plaquetas (PAF).
Tambm de forma muito aguda (poucos segundos aps a leso), as plaque-
tas aderem diretamente ao colgeno fibrilar subendotelial exposto por meio da
integrina VLA-2 (GPIa/IIa), que expressa em sua membrana plasmtica. A
esse colgeno ligam-se tambm molculas do fator de von Willebrand, que,
por sua vez, ligam-se GPIb/IX das plaquetas, formando uma ponte entre as
plaquetas e o colgeno subendotelial que estabiliza a interao entre esses dois
elementos. Essa associao se d com grande rapidez, de maneira que viabiliza a
adeso plaquetria mesmo em locais de circulao em alta velocidade do sangue.
adeso, seguem-se a ativao das plaquetas, que perdem sua forma
discoide e se tornam arredondadas, e a secreo de produtos contidos em
seus grnulos, especialmente tromboxano A2, heparinase, ADP, fator Va,
trombospondina, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF),
fator de von Willebrand, fator 4 plaquetrio, fibronectina e fibrinognio.
Alguns desses elementos so agregantes e vo provocar a ativao de outras
plaquetas, e consequente agregao plaquetria.
Terceiro momento da hemostasia primria, a agregao plaquetria de-
pendente da ao do complexo GPIIb/IIIa, o qual se liga habitualmente
ao fator de von Willebrand. No entanto, o ADP induz uma modificao
conformacional nesse complexo, o qual passa a ligar fibrinognio. Tanto o fator
de von Willebrand quanto o fibrinognio (em especial esse ltimo) levam
agregao plaquetria ao formar pontes entre complexos GPIIb/IIIa de pla-
quetas diferentes.
Coagulao
Consiste na ativao sequencial em cascata de vrias protenas plasmticas
que culminam na formao de fibrina, aumentando e solidificando o tampo
plaquetrio inicial. Durante a formao do tampo hemosttico, as protenas
plasmticas relacionadas coagulao (hemostasia secundria) esto sendo
ativadas, disparando a via da coagulao que produzir trombina a qual, por
sua vez, converter fibrinognio em fibrina por meio de uma srie de reaes
que dependem de um complexo ligado a substrato (membrana celular) e da
ativao de pr-enzimas por proteases, em processo clcio-dependente que

necessita de cofatores celulares e solveis. Alguns fatores da coagulao (II,
VII, IX e X) so dependentes de vitamina K.
Cabe ressaltar que o incio desse processo de ativao se d pela exposi-
o do fator tecidual ausente no endotlio e em leuccitos, mas presente,
por exemplo, em fibroblastos subendoteliais ao ambiente intravascular. A
essa exposio, segue-se a formao de um complexo entre o prprio fator
tecidual, fator VIIa e clcio. Esse complexo ativa, por clivagem, os fatores
IX e X, formando os fatores IXa e Xa. O fator Xa, por sua vez, forma outro
complexo com o fator Va, convertendo protrombina (fator II) em trombina
(fator IIa), o que ocorre sobre a superfcie de plaquetas ativadas e/ou c-
lulas endoteliais. Alm do seu principal papel de converter fibrinognio em
fibrina, a trombina assim formada tambm induz a agregao e a secreo
plaquetrias, alm de ativar os fatores V, VIII e XIII esse ltimo essen-
cial na estabilizao do cogulo de fibrina.
Todo o processo de coagulao descrito resumidamente acima possui
sistemas reguladores, constitudos por diversas protenas inibitrias, como a
protena C que inativa os fatores Va e VIIIa por clivagem , a protena S
cofator no enzimtico dessas reaes e a antitrombina, tambm chamada
antitrombina III. Essa ltima inibe a ao dos fatores IXa, Xa e XIa, alm de
ser um inibidor primrio da trombina e catalisar a dissociao da interao
entre o fator tecidual e o fator VIIa (fig. 3.34).
Hematologia | 233
Figura 3.34. Ilustrao das vias de coagulao.
Fibrinlise
Logo aps a formao do cogulo definitivo, inicia-se a lise do mesmo e o
reparo do vaso, processo realizado pelo sistema fibrinoltico, o qual regula a
gerao de plasmina a partir da sua forma inativa, o plasminognio. O evento
comea com a liberao, pelas clulas endoteliais, do ativador do plasmino-
gnio tecidual (tPA) e do ativador do plasminognio do tipo uroquinase
(uPA). Ambos penetram o cogulo de fibrina e hidrolisam uma ponte pep-
tdica do plasminognio, convertendo-o em plasmina, a qual degrada prin-
cipalmente a fibrina, gerando produtos de degradao da fibrina (FDPs,
do ingls fibrin degradation products), embora tambm tenha ao sobre o
fibrinognio e os fatores V e VIII.
3.6.3 Avaliao laboratorial
Hemostasia primria
Os principais testes para avaliar a hemostasia primria so tempo de sangra-
mento, contagem de plaquetas e avaliao da funo plaquetria.
O tempo de sangramento (TS) precisa ser realizado por tcnico
experiente, uma vez que h certa subjetividade na apurao do resultado.
Porm, se corretamente realizado, esse teste uma abordagem sensvel e
confivel da funo plaquetria in vivo. No entanto, o mtodo Duke o
mais frequentemente empregado, apesar de possuir baixa sensibilidade. Nele,
feita uma pequena perfurao no lbulo auricular seguida de observao da
parada do sangramento. Esse procedimento, porm, possui sensibilidade bem
menor que o mtodo de Ivy, realizado com pequena inciso no antebrao,
feita com bisturi apropriado aps garroteamento com esfignomanmetro
insuflado at 40 mmHg. O emprego do mtodo de Ivy mandatrio em
pacientes sob investigao de sangramento anormal, trombopatias e doena de
von Willebrand. Em algumas situaes, como nesse ltimo caso, um TS normal
demanda repetio, por conta de variaes plasmticas cclicas do fator de
von Willebrand. H controvrsias sobre a aplicabilidade do TS como teste de
avaliao pr-operatria, mas h certo consenso de que o teste no deve ser
empregado sozinho nessa abordagem.
Tempos de sangramento maiores que 10 minutos indicam risco aumentado
de sangramento, que se acentua quando esse valor passa dos 15 minutos.
Como habitualmente existe uma correlao quase linear entre o tempo de san-
gramento e a contagem de plaquetas, fundamental correlacionar esse dado
com a avaliao quantitativa e qualitativa das plaquetas. Cabe mencionar que
pacientes com trombocitopenia autoimune muitas vezes apresentam TS muito
curto, decorrente da intensa atividade das plaquetas imaturas circulantes.
A contagem de plaquetas habitualmente realizada em equipamentos au-
tomatizados, os quais utilizam sangue total anticoagulado com EDTA, que age
como quelante de clcio. Muitos desses aparelhos so capazes de avaliar o
volume plaquetrio, identificando a presena de macroplaquetas. No entanto,
algumas vezes pode ocorrer a chamada falsa trombocitopenia, decorrente da
Hematologia | 235
ao conjunta de certas protenas plasmticas que, na presena de EDTA,

provocam aglutinao plaquetria. Assim, recomenda-se a repetio de uma
contagem alterada de plaquetas, com amostra obtida de nova coleta, e que, ao
menos nesses casos, seja realizada contagem manual em lmina pelo mtodo de
Fonio, que oferece menor preciso quantitativa, mas permite a anlise direta da
morfologia plaquetria. At o limite inferior a 100 mil plaquetas por microlitro,
no costuma haver manifestaes clnicas e nem alteraes no TS. Entre 50
e 100 mil, pode ocorrer ligeira alterao do TS, mas sem repercusso clnica
importante, exceto em situaes de trauma ou cirurgia. Abaixo de 50 mil
plaquetas por microlitro, podem ocorrer equimoses e, quando esse nmero
inferior a 30 mil, os sangramentos podem ocorrer espontaneamente, inclusive
em territrios nobres, como o encfalo.
A funo plaquetria pode ser abordada pelos testes de agregao, os
quais avaliam in vitro diferentes vias de ativao plaquetria. Aps o ensaio
com agente agregante (ADP, adrenalina ou colgeno), coloca-se a suspenso
de plaquetas em um aparelho denominado agregmetro, capaz de medir o
percentual de transmisso de luz atravs dela. Eventualmente, podem-se em-
pregar, em vez de agentes agregantes, molculas que s induzam a agregao
em situaes anormais, como o caso da ristocetina, que s aglutina plaque-
tas na presena de fator de von Willebrand ou de GPIb, de maneira que o
teste pode ser empregado, respectivamente, na investigao de doena de von
Willebrand ou prpura de Bernard-Soulier. Da mesma forma, outras doenas
podem ser avaliadas com base em tcnicas de citometria de fluxo utilizando
marcadores especficos para protenas plaquetrias que possam estar ausentes,
normais ou superexpressas.
Coagulao plasmtica
Quanto funo da coagulao plasmtica, os testes mais empregados so
tempo de protrombina (TAP), tempo de tromboplastina (PTT), tempo de
trombina (TT) e dosagem do fibrinognio srico. Todos esses mtodos so
coagulomtricos, ou seja, baseiam-se na formao de cogulos de fibrina com
posterior anlise fotomtrica em coagulmetros. Esses testes so especficos
para certos fatores de coagulao, de modo que so muito teis no diagnstico
de doenas relacionadas s reaes bioqumicas da coagulao, bem como no

acompanhamento e monitoramento de tratamentos que interfiram nessas vias.
Para a execuo desses testes, utiliza-se plasma livre de hemcias, leuccitos
e plaquetas, obtido por meio de coleta cuidadosa e minimamente traumtica
de sangue perifrico em frasco ou seringa contendo citrato de sdio na exata
proporo de volume de 9:1 (sangue/citrato), seguida de pronto processamen-
to da amostra a demora na realizao dos testes pode alterar os resultados.
O TAP um teste que aborda a coagulao pela via dependente do fator
tecidual, medindo o tempo de formao do cogulo de fibrina aps a adio
de fator III (tromboplastina tecidual) e clcio, os quais, em conjunto, ativam
o fator VII. Esse, uma vez ativado (VIIa), ativa o fator X, disparando a via
comum de coagulao, levando produo de trombina e, subsequentemente,
de fibrina. Assim, um mtodo apropriado para a avaliao dos fatores de
coagulao dependentes de vitamina K (II, VII e X), e seu resultado normal
indica bom funcionamento da estimulao dependente do fator tecidual, bem
como a integridade da via comum. O TAP o teste mais aplicado no controle
de terapia de anticoagulao oral com cumarnicos, para o qual se utiliza um n-
dice, denominado INR, que relaciona o TAP do paciente com o TAP normal.
O PTT tambm avalia a via comum, mas, por sua vez, juntamente com
os fatores da dita via intrnseca da coagulao (fatores XII, XI, IX, VIII,
cininognio de alto peso molecular e pr-calicrena). Dessa feita, o tempo de
formao do cogulo (expresso por meio da proporo entre o tempo obtido
com o plasma em teste e aquele obtido com o plasma controle) medido aps
a adio de cefalina e de um ativador de contato. Esse um teste ideal para
o monitoramento de heparinizao plena.
O TT aquele medido aps a introduo de trombina em baixa concen-
trao no plasma puro, sendo, portanto, dependente da concentrao de
fibrinognio e de inibidores de formao de fibrina, como a heparina. A con-
centrao de fibrinognio pode ser aferida pelo tempo de coagulao do plas-
ma aps a introduo de alta concentrao de trombina (mtodo de Clauss).

Hematologia | 237
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Captulo 4
Hemoterapia bsica na prtica transfusional
Paulo Marcelo T. Cotias
4.1. Histrico
At chegar aos dias atuais, a hemoterapia passou por vrias fases, e cada
descoberta facilitou o desenvolvimento da tecnologia que temos hoje. Desde
a Antiguidade o homem sabe que a perda de sangue pode levar morte ou,
quando no, provocar fraqueza e desnimo. Com isso, consolidou-se a ideia
de que o sangue sinnimo de vida e fora.
Ainda que durante muitos sculos se tenha tentado realizar transfuses de
sangue como mtodo teraputico, o uso do sangue para curar doenas foi
totalmente infrutfero, quando no resultou na morte imediata do paciente. Um
caso bastante conhecido o do papa Inocncio VIII, que, em 1492, contraiu
grave enfermidade que o deixou beira da morte. Com o intuito de salv-lo,
os mdicos da poca teriam administrado transfuses de sangue de trs jovens
no pontfice. Como no eram conhecidos os mecanismos da circulao san-
gunea, o sangue foi bebido pelo paciente, que, meses depois, veio a falecer.
Os trs doadores tambm morreram logo aps a doao, acredita-se que por
hipovolemia,1 pois no havia controle acerca da quantidade de sangue que
podia ser retirada de cada doador.
A histria da transfuso de sangue pode ser dividida em trs perodos: pr-
histrico, pr-cientfico e cientfico. No primeiro perodo, a maioria das trans-
fuses consistia na ingesto de sangue dos inimigos derrotados nos campos
de batalha, ou nas lutas de gladiadores, sendo encontrados relatos mdicos
em procedimentos da Grcia Antiga e do Imprio Romano. O perodo pr-
cientfico comea com a descoberta da circulao sangunea, descrita, em
1628, por William Harvey (1578-1657), e do papel central do corao
nela, o que levou ao desenvolvimento da prtica de injees intravenosas. Essa
tcnica deu incio infuso no s de medicamentos, mas tambm de sangue
na veia dos pacientes.
As primeiras transfuses datam de meados do sculo XVII. Nelas, em
geral, utilizava-se o sangue de animais. Os resultados dessas transfuses nem
sempre eram satisfatrios, o que fez a Academia National de Medicina da
Frana proibir, em 1670, qualquer tipo de infuso de sangue. Pouco tempo
depois, passou-se a utilizar sangue humano. Porm, como no se conheciam
os sistemas sanguneos, muitas transfuses acabavam em tragdia; j outras, por
casualidade, eram bem-sucedidas, havendo visvel recuperao do paciente.
O perodo cientfico caracterizado pela descoberta dos grupos sanguneos
por Karl Landsteiner (1868-1943), pesquisador austraco que, em 1900,
descobriu o sistema ABO, e, posteriormente, por Philip Levine (1900-1987)
e Rufus E. Stetson (1886-1967), que, em 1939, descobriram o fator Rh.
Em 1911, Reuben Ottenberg (1882-1959), baseado nos grupos sanguneos
ABO descritos por Landsteiner, torna-se o primeiro indivduo a selecionar
sangue compatvel para transfuso. Ottenberg estabeleceu o postulado de
que a transfuso s possvel quando o soro do receptor no aglutina as
hemcias do doador. A partir da, foram descobertos vrios sistemas de grupos
sanguneos, e as pesquisas relacionadas aos antgenos e anticorpos eritrocitrios
foram sendo desenvolvidas para que se alcanasse a segurana transfusional.
Surge, ento, o conceito de compatibilidade sangunea e a necessidade de
1
Diminuio do volume sanguneo.
Hemoterapia bsica na prtica transfuncional | 241
respeit-lo, evitando assim que o sangue transfundido seja destrudo por

incompatibilidade ABO.
No entreguerras, foi desenvolvida uma soluo anticoagulante base de
citrato de sdio que permitiu a conservao e a estocagem do sangue em seu
estado lquido e o estabelecimento de bancos de sangue.
Durante o perodo cientfico, so descobertos vrios procedimentos transfu-
sionais. possvel caracterizar as etapas desse processo de descobertas em trs
fases: fase do brao a brao, fase do frasco e fase da bolsa plstica. Essas fases
revelam a evoluo da hemotransfuso desde o momento em que a infuso era
realizada diretamente do doador para o paciente, passando pelo perodo em
que o hemocomponente era coletado em frascos contendo anticoagulante,
at evoluir, posteriormente, para as bolsas de plstico especiais, usadas
atualmente.
A medicina transfusional, denominao moderna da hemoterapia, estuda
e avalia, para fins teraputicos, os componentes e derivados do sangue, cha-
mados respectivamente hemocomponentes e hemoderivados. Os hemocom-
ponentes so obtidos por processos fsicos. Entre eles, esto os concentra-
dos de hemcia (CH), o plasma fresco concentrado (PFC), o concentrado
de plaquetas (CP) e o crioprecipitado. Os hemoderivados, obtidos do plasma
humano por processos fsico-qumicos, so industrializados. Os principais so
albumina, imunoglobulinas, fatores de coagulao (VII, VIII, IX, complexo
protrombnico), cola de fibrina e antitrombina III.
4.2. Imuno-hematologia: conceitos bsicos
Antgenos
Antgeno um fragmento de uma protena estranha ao organismo que
capaz de desencadear uma resposta imune.
a) Propriedades dos antgenos

Imunogenicidade: a capacidade do antgeno de induzir a formao de
uma resposta imune.
Antigenicidade: a capacidade de uma substncia ser reconhecida pelo

sistema imune.
Obs.: Nem todo antgeno um imungeno,

mas todo imungeno um antgeno.
b) Estrutura bsica do antgeno

Determinante antignico ou eptopo: o sitio do antgeno ao qual a
molcula de anticorpo se liga.
c) Categorias de antgenos
Aloantgenos: so antgenos comuns a uma mesma espcie. Ex.: antgenos
eritrocitrios.
Heteroantgenos: so antgenos pertencentes a espcies diferentes.
Autoantgenos: so protenas, eritrocitrias ou no, do prprio indivduo
que j no so reconhecidas por ele. Ex.: anemia hemoltica autoimune.
d) Estrutura qumica
Segundo a sua estrutura qumica, os antgenos se distribuem em trs grupos:
Protenas, como o sistema Rh;
Polissacardeos, como o sistema ABO;
Lipdios e cidos nucleicos.
Anticorpos
Os anticorpos so protenas plasmticas (imunoglobulinas) secretadas por
plasmcitos clulas derivadas dos linfcitos B , aps contato com qualquer
antgeno estranho no organismo.
a) Categorias de anticorpos
Aloanticorpos: so aqueles produzidos contra um antgeno no prprio,
diante de um estmulo imune.
Autoanticorpos: so anticorpos dirigidos contra antgenos prprios.

Heteroanticorpos: so anticorpos produzidos contra antgenos de indi-
vduos de espcies diferentes. Ex: produo de uma antiglobulina humana,
mediante a imunizao de coelhos por um anticorpo humano.
b) Isotipos de imunoglobulinas
Existem cinco classes de imunoglobulinas (Ig) nos lquidos corporais huma-
nos. So elas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Cada classe de imunoglobulina
difere de outra em peso molecular, contedo de carboidratos, atividade biol-
gica e meia-vida plasmtica. Cerca de 80% das imunoglobulinas sricas so
IgG, 13% so IgA, 6% so IgM e 1% so IgD. J a IgE normalmente
est presente em quantidades apenas desprezveis, cerca de 0,004%.
c) Fentipos e gentipos eritrocitrios

Fentipo: a expresso, na membrana da hemcia, da carga gentica.
Ex.: presena de antgeno A na superfcie da hemcia, no grupo sanguneo A.
Gentipo: diz respeito estrutura gentica herdada pelo indivduo.
Ex.: o indivduo que apresenta o antgeno A na sua superfcie pode ter os
gentipos AA ou AO.
4.3. O sistema ABO
O sistema ABO foi descoberto por Karl Landsteiner, a partir de estudos

realizados em amostras de sangue de diversas pessoas. Landsteiner separou
o soro de cada indivduo, misturou as hemcias de um com o soro do outro
e observou a ocorrncia de aglutinao em alguns casos e sua ausncia em
outros. Os indivduos que no apresentavam aglutinao foram classificados
como O. Os outros foram classificados como A e B. Em 1902, dois
anos depois da descoberta de Landsteiner, seus colaboradores Alfred von
Decastello (1872-1960) e Adriano Sturli (1873-1964) identificaram e
classificaram o grupo AB. Os grupos O, A e B so os mais comuns; o
grupo AB o mais raro.
Com essas descobertas, foram estabelecidos os preceitos bsicos da imuno-

hematologia, os quais preconizam que, em condies gerais, o soro dos indi-
vduos normais s contm anticorpos contra antgenos que no esto presentes
na superfcie de suas hemcias.
Frequncia dos grupos sanguneos na populao

grupo O: 45%
grupo A: 41%
grupo B: 10%
grupo AB: 4%
4.3.1 Estrutura dos antgenos do sistema ABO
Os antgenos do sistema sanguneo ABO so formados estruturalmente por

molculas de carboidratos, os quais so determinados pela ao de enzimas
chamadas glicosiltranferases, que adicionam monossacardeos a um substrato
precursor. A enzima fucosiltransferase adiciona uma fucose, dando origem ao
chamado antgeno H. A enzima N-acetilgalactosaminiltransferase adiciona o
monossacardeo N-acetilgalactosamina ao antgeno H, formando o antgeno A;
a enzima galactosiltransferase, por sua vez, adiciona galactose, formando o an-
tgeno B do sistema ABO. O grupo sanguneo AB apresenta atividade dessas
duas enzimas. O grupo sanguneo O no possui glicosiltransferase A ou B, mas
apresenta o antgeno H em grande quantidade nas superfcies das hemcias.
4.3.2 Herana dos grupos sanguneos ABO
O grupo sanguneo de cada indivduo determinado pela herana de um

gene de cada um dos pais. As combinaes desses genes resultam em quatro
principais fentipos: A, B, O, AB. O gene O, por ser amorfo, no ocasiona
a produo de nenhum antgeno. Os genes A e B resultam, respectivamente,
na produo dos antgenos A e B, e sua expresso depende da herana do
gene H. O fentipo AB condiciona a produo de ambos os antgenos A e

B. Os indivduos O possuem o antgeno H em maior quantidade.
4.3.3 Antgenos do sistema ABO
A expresso dos antgenos ABO na superfcie das hemcias determinada

por genes localizados no brao longo do cromossomo 9. Esses genes codificam
a produo de enzimas chamadas glicosiltransferases, que adicionam diferentes
carboidratos (acares) a uma substncia precursora denominada H. A subs-
tncia H est presente na superfcie das hemcias e tem a sua sntese codificada
pelos alelos H e h. A herana de pelo menos um gene H (HH ou Hh) leva
produo de uma enzima, a fucosiltransferase, que adiciona o acar fucose
na superfcie das hemcias, dando origem ao antgeno H. Esse antgeno vai ser
transformado nos antgenos A e/ou B pela ao de enzimas determinadas pelos
genes A e B. A substncia H um precursor obrigatrio para a expresso dos
alelos A ou B. A fucosiltransferase necessria para a produo da substncia
H controlada pelo gene H, localizado no cromossomo 19.
Figura 4.1. Antgenos do sistema ABO nas hemcias.
O gene A codifica a produo da enzima N-acetilgalactosaminiltransferase,

que adiciona o acar N-acetilgalactosamina ao antgeno H, formando o
antgeno A.
O gene B codifica a produo da enzima galactosiltransferase, que, por sua
vez, adiciona o acar D-galactose, formando o antgeno B. O grupo san-
guneo AB possui atividade dessas duas enzimas. O grupo sanguneo O no

possui glicosiltransferases A ou B, mas apresenta, na superfcie das hemcias,
o antgeno H em grande quantidade.
Figura 4.2. Expresso dos antgenos ABO nas hemcias.
4.3.4 Fentipo de Bombaim
O fentipo de Bombaim (hh, Hnulo, Oh) muito raro. Foi encontrado

pela primeira vez em 1952, em Bombaim, na ndia. Esse fentipo ocorre em
indivduos nos quais as hemcias no tm as caractersticas de grupos deter-
minados pelos genes A e B, ainda que esses genes tenham sido herdados
por eles, e apresentam ausncia total da substncia H, ou seja, so des-
providos dos antgenos ABH normais. Por isso, no aglutinam com anti-A,
anti-B e anti-AB, o que sugere serem essas pessoas do tipo O. No entanto,
hemcias do tipo O reagem com o anti-H, o que no ocorre com o fentipo
de Bombaim. O soro desses indivduos contm anti-A, anti-B, anti-AB e
anti-H. Como o antgeno H comum a todos os grupos sanguneos ABO,
o sangue Bombaim incompatvel com todos os doadores ABO.
4.3.5 Interao dos genes Hh e ABO
O gene H evoca uma enzima L-fucosiltransferase que transfere o carboidra-

to L-fucose para a galactose terminal da cadeia precursora. comum na popu-
lao (99,99%), sendo o fentipo hh (fentipo de Bombaim), extremamente

raro, sem expresso dos genes ABO.
O gene A codifica a produo de N-acetilgalactosamiltransferase, transfe-
rindo acetilgalactosamina para a estrutura H.
O gene B codifica a produo de D-galactosiltransferase para a substncia H.
O gene O no apresenta carboidratos na sua estrutura; possui, portanto,
elevada concentrao de substncia H.
4.3.6 Formao dos antgenos solveis A, B e H
Os antgenos solveis A, B e H podem ser encontrados em hemcias, linf-

citos, plaquetas, tecidos epiteliais, medula ssea, rins e em secrees orgnicas
e lquidos biolgicos saliva, lgrima, urina, suco gstrico, bile, leite, lquidos
amnitico, pleural, peritoneal e pericrdico, cisto ovariano e cisto hidtico.
O aparecimento da especificidade ABH nas secrees regulado pelo
gene secretor Se. Indivduos com gentipo SeSe ou Sese so denominados
secretores, e indivduos com gentipo sese so denominados no secretores.
Os antgenos ABH secretados so glicoprotenas, ao contrrio dos glico-
lipdios, encontrados na superfcie das hemcias.
4.3.7 Interao de genes Sese, Zz e ABH
Os genes Sese e Zz so herdados de forma independente dos genes

ABO e H. Sese denominado secretor e regula a formao do antgeno H,
subsequentemente aos antgenos.
O sistema Zz regula a produo do antgeno H nas hemcias; na ausncia
desse sistema, de ocorrncia rara, nenhum antgeno H formado.
Quadro 4.1. Caractersticas do sistema ABO.

Antgeno
Anticorpos Gentipos
Grupo ABO ABO
(soro/plasma) possveis
(hemcia)
O nenhum anti-A, anti-B, anti-AB OO
A A anti-B AA, AA, AO
B B anti-A BB, BO
AB A e B nenhum AB
anti-B,
A A AA, AO
eventualmente anti-A
nenhum;
AB A e B AB
eventualmente anti-A
4.3.8 Subgrupos de ABO
Subgrupos de A
Os subgrupos mais comuns dos antgenos A so A1 e A2, que correspon-
dem a 99% dos indivduos do grupo A. Os mais raros so os subgrupos A3,
Ax, Aterminal, Am, Ay e Ael. Aproximadamente 80% dos indivduos do grupo
A e AB so respectivamente A1 e A1B; e 19% so A2 e A2B.
As diferenas qualitativas e quantitativas principais entre A1 e A2 so:
A1 tem A2, mas A2 no tem A1;
A1 apresenta os antgenos A, A1 e A2, ao passo que A2 possui
apenas um antgeno;
A1 possui menor quantidade da substncia H em relao a A2;
a lectina anti-H, produzida a partir do extrato Ulex europaeus, seme-
lhante ao anti-H humano, aglutina as clulas A2 e O;
o anti-A1 encontrado no soro de 1 a 8% dos indivduos A2 e em
22 a 35% dos indivduos A2B;
as hemcias A1 reagem somente com soros anti-A1 lectina anti-A1
(Dolichos biflorus); quando no reagem, so denominadas A2.
Obs.: Os anticorpos anti-A1 e anti-A2 so anticorpos frios.2
Subgrupos de B
Os subgrupos de B B3, Bx, Bm e Bel so menos frequentes que os
subgrupos de A; eles tambm possuem uma lectina para classific-los, deno-
minada Bandeiraea simplicifolia, preparada para diferenciar as variantes de B.

4.3.9 Anticorpos do sistema ABO
Os anticorpos do sistema ABO so naturais, ou seja, existem no soro dos

indivduos sem que os mesmos tenham sido expostos ao antgeno correspon-
dente. Considera-se que os anticorpos naturais so formados pela imunizao
por antgenos semelhantes, presentes em alimentos e microrganismos. Esses an-
ticorpos so, em geral, imunoglobulinas IgM, que no atravessam a barreira
placentria. No material para exame, os anticorpos encontram-se no plasma
ou no soro das amostras estudadas. Por causa de estmulos bacterianos, po-
dem estar presentes no trato intestinal, pois alguns acares produzidos pelas
bactrias so imunodominantes e possuem caractersticas similares aos antgenos
A e B. Alm das bactrias, outros fatores externos alimentos, poeiras e
cosmticos podem estimular a produo de anticorpos desse sistema.
Os anticorpos podem ser classificados em naturais e imunes.
So classificados como naturais quando no identificamos um estmulo an-
tignico especfico. Na sua grande maioria, so imunoglobulinas do tipo IgM.
So classificados como imunes quando resultam de estmulo antignico es-
pecfico. Essa imunidade pode ser resultado de heteroimunizao, infeces
bacterianas principalmente intestinais , soros antidiftricos ou tetnicos (ani-
mal/bacteriano), aloimunizao quando, durante a gestao, o beb recebe
os anticorpos da me ou transfuso ABO incompatvel. Quase sempre so
2
Anticorpos frios so aqueles que se encontram a 4C.
imunoglobulinas do tipo IgG. No indivduo com 3 a 6 meses de idade j

se encontram quantidades pequenas de anticorpos A e B, os quais atingem
produo mxima entre os 5 e os 10 anos de idade. Aps os 65 anos de
idade, os ttulos desses dois anticorpos decrescem.
4.4. Sistema RH
O sistema Rh (Rhesus) foi descoberto em 1939 por Levine e Stetson, a

partir da observao do caso clnico de uma mulher que, depois de ter dado
luz uma criana com doena hemoltica perinatal (DHPN), ou doena
hemoltica do recm-nascido (DHRN), apresentou reao transfusional grave
aps ter sido transfundida com sangue ABO compatvel com o do marido. O
soro dessa mulher aglutinava as hemcias de seu marido e de cerca de 80% dos
doadores caucasianos ABO compatveis. No ano seguinte, Karl Landsteiner e
Alexander Wiener (1907-1976) relataram que o soro de coelhos imunizados
com hemcias de macacos do gnero Rhesus aglutinava cerca de 85% das
hemcias humanas. Inicialmente pensaram que esses anticorpos identificavam
o mesmo antgeno o antgeno Rh (Ag Rh) da superfcie dos glbulos
vermelhos humanos e do macaco Rhesus. Posteriormente, demonstrou-se que
o anticorpo anti-Rh produzido nos animais no era idntico ao anti-D humano,
mas o termo de grupo sanguneo Rh j estava consagrado pelo uso. Sendo
assim, o heteroanticorpo passou a ser chamado de anti-LW e o aloanticorpo
humano foi renomeado anti-D.
O antgeno Rh(D) altamente imunognico. Entre os indivduos Rh(D)
negativo que tenham contato com hemcias Rh(D) positivo, mais de 80%
desenvolvero anticorpos especficos contra esse antgeno.
Depois do sistema ABO, o sistema Rh o sistema sanguneo mais im-
portante, com 49 antgenos descritos; deles, os antgenos D, C, c e e so
responsveis por quase 99% dos problemas clnicos associados ao sistema,
relacionados a reaes transfusionais e DHRN/DHPN.
4.4.1 Variantes fenotpicas do antgeno D
A expresso fenotpica do antgeno D pode variar, com a ocorrncia de

alteraes qualitativas/quantitativas:
D positivo: no indivduo D positivo, o antgeno D um mosaico
de subunidades proteicas com todos os seus eptopos, ou seja, com
todos os seus determinantes antignicos at agora estudados. Portanto,
do ponto de vista qualitativo e quantitativo, esse considerado o D
normal.
D fraco: por muitos anos conhecido como variante Du, no D fraco
as hemcias examinadas reagem somente na tcnica de Coombs indireto,
quando o soro anti-D testado em fase de antiglobulina humana. Na
atualidade, a determinao sorolgica do D fraco depende no apenas
do ttulo do reagente, mas tambm da tcnica empregada. Essa variao
est de acordo com o valor quantitativo do antgeno D, expresso na
protena RhD da membrana eritrocitria, que diretamente proporcional
poro intramembranar do antgeno. Indivduos com esse fentipo
no produzem anti-D no caso de receberem transfuso de hemcias D
positivo ou normal. Estima-se que a frequncia de D fraco na populao
seja inferior a 1%, sendo mais comum entre os negros. Indivduos que
expressam o antgeno D fraco so fenotipicamente Rh positivo.
D parcial: os antgenos D parcial so caracterizados pela ausncia
de um ou mais eptopos do antgeno D, ocasionada por substituies de
aminocidos promovidas por mutaes de ponto missense3 ou por rear-
ranjos gnicos entre genes RHD e RHCE, que alteram qualitativamente
a protena RhD na poro extracelular. Sorologicamente, na prtica de
rotina, so de difcil distino, podendo ser detectados por antissoros
monoclonais.
Os antgenos D parcial so classificados em categorias, de acordo com
os eptopos ausentes. A categoria VI a mais frequentemente encontrada
entre os indivduos Rh positivo que so D parcial. Em alguns casos, podemos
encontrar no soro de indivduos previamente transfundidos ou com gestaes
3
Pontos missenses do RhD so pontos de mutaes em diferentes xons do gene RHD.
e/ou abortos prvios que se apresentam sorologicamente como D normal a

presena do anticorpo anti-D, podendo tratar-se ento de um D variante. Esses
indivduos podem produzir anticorpos anti-D aps transfuso ou gravidez,
anticorpos que so formados contra alguns eptopos que esto ausentes.
Algumas categorias so identificadas como D fraco; no caso do DIII, os
indivduos se apresentam sorologicamente como D normal.
Obs.: Indivduos que expressam o antgeno D fraco

so fenotipicamente Rh positivo.
4.4.2 Recomendao transfusional
Transfusionalmente, a conduta ainda controversa, mas, em geral:

doadores RhD fraco devem ser considerados Rh positivo, pois po-
dem sensibilizar receptor para anti-D, ou mesmo reagir com anti-D pre-
viamente formado.
receptores RHD fraco e/ou D parcial: a regra para evitar imuniza-
es transfusionais ou feto-maternas de indivduos D parcial fraco e/ou D
fraco transfundir sangue RhD negativo em indivduo D fraco e realizar
a preveno de imunizao da me D fraco com imunoglobulinas anti-D.
receptores RHD parcial: devem receber transfuso de hemocompo-
nentes RhD negativo.
Rh null: no apresenta antgeno do sistema Rh nas hemcias; esse
fentipo causado por gene relacionado a esses antgenos suprimidos.
Os antgenos do sistema Rh so passados geneticamente pelos pais. A

gentica molecular mostrou que dois genes controlam a produo das protenas
do sistema Rh: o gene RHD, que codifica a produo da protena RhD; e
o gene RHCE, que possui vrios alelos RHCe, RHcE, RHce, RHCE e
codifica a produo da protena RhCE. Existem duas teorias para explicar a
formao gentica dos antgenos desse sistema:
Teoria de Fisher e Race: afirma que h um gene para cada antgeno,

e em cada par de cromossomos homlogos h trs lcus intimamente
ligados, cada um deles ocupado por um gene do sistema Rh.
Teoria de Wiener: afirma que existe um gene para um complexo
antignico, e em cada cromossomo de um par de homlogos existe um
gene responsvel por um aglutinognio com mltiplas especificidades
sorolgicas.
Os antgenos do sistema Rh somente esto presentes nas hemcias, ou

seja, esto ausentes no plasma, no soro, nos leuccitos e nas secrees. Esses
antgenos esto bem desenvolvidos no nascimento.
Figura 4.3. Esquemas representativos das teorias de formao gentica dos antgenos.
4.4.3 Anticorpos do sistema Rh
A maioria dos anticorpos do sistema Rh produzida aps estmulo com

antgenos Rh especficos, mas tambm h casos de anticorpos naturais, como o
anti-E. A temperatura ideal para a reao dos anticorpos do sistema Rh de
37C; grande parte dos anticorpos do sistema Rh constituda por anticorpos
incompletos do tipo IgG, os quais no fixam complemento e nem causam
hemlise in vitro.
4.5. Outros sistemas de grupos sanguneos
4.5.1 O sistema Lewis
O sistema Lewis (Le) se diferencia dos outros sistemas de grupos san-

guneos pelo fato de seus antgenos no estarem inteiramente interligados s
hemcias, mas serem adsorvidos do plasma pelas hemcias com antgenos Lea
e Leb positivo.
Os antgenos do sistema so codificados pelo gene Le, que age sobre um
substrato substncia precursora transformada em substncia H sob a ao
do gene H e o converte no fator Lea, presente no plasma, nas secrees e,
subsequentemente, nas hemcias.
A produo do fator Leb, alm de depender da presena do gene Lea,
tambm depende dos genes H e Se, relacionados com o sistema ABO. Se
algum desses genes estiver ausente, nenhuma substncia Leb estar presente
no plasma, nas secrees ou nas hemcias, pois a substncia Le somente
transformada em Leb na presena de pelo menos um desses dois genes. Ao
nascimento, a expresso de antgenos desse sistema nas hemcias reduzida: a
maioria dos recm-natos Le(a-b-).
Observam-se trs fentipos na populao caucasiana:
Le(a+b-);
Le(a-b+);
Le(a-b-).
Obs.: O fentipo Le(a+b+) raro.
4.5.1.1 Anticorpos do sistema Lewis

Os anticorpos do sistema Lewis so geralmente naturais (IgM), isto , apa-
recem nos indivduos cujo respectivo antgeno se encontra ausente. O anti-Lea
o anticorpo mais frequentemente encontrado. de ocorrncia natural (IgM)
e em geral no possui importncia clnica. Apenas em raros casos, quando
ativo a 37C, pode determinar reao transfusional.
o antgeno Lea no est desenvolvido no nascimento e, portanto, esse

anticorpo no determina a ocorrncia de DHRN/DHPN;
o anti-Leb um anticorpo de ocorrncia natural, encontrado com mais
frequncia em negros com fentipo Le(a-b-). Em geral no determina
reao transfusional mesmo que ativo a 37C e no est relacionado
com a ocorrncia de DHRN/DHPN;
em geral, o anti-Leb uma aglutinina fria que determina aglutinao
direta com hemcias Leb;
o anti-Lex um anticorpo incomum, de ocorrncia natural, mais
encontrado no soro de indivduos Le(a-b-). Em geral, no determina
reao transfusional, exceto em alguns raros casos em que ativo a
37C. Anti-Lex no est relacionado com a ocorrncia de DHRN/
DHPN. Anti-Lex reage com todas as hemcias exceto com as Le(a-b-),
porm no uma mistura de anti-Lea e anti-Leb.
4.5.2 O sistema MNS
O sistema MNS, tambm chamado MN, foi o segundo sistema a ser

descrito. Semelhante em tamanho e complexidade ao sistema Rh, o sistema
MNS est localizado na membrana das hemcias, em duas glicoprotenas
ricas em cido silico, no cromossomo 4. Seus antgenos mais relevantes so
M, N, S, s e U.
O sistema MNS possui caractersticas clnicas importantes, e os seus an-
tgenos esto bem desenvolvidos no nascimento. Os antgenos M e N esto
formados na 9 semana de gestao, e os antgenos S e s, na 12 semana.
Os antgenos M, N, S e s so destrudos por enzimas proteolticas, como
a papana, a bromelina e a tripsina. O antgeno U no destrudo pelo
tratamento enzimtico.
O antgeno U de alta frequncia na populao; casos de U negativo so
raros, e sempre ocorrem em indivduos negros. Os indivduos U(-) so tambm
S(-)s(-), porm nem todos S(-)s(-) so U(-).
4.5.2.1 Anticorpos do sistema MNS

Os anticorpos do sistema MNS podem ser naturais ou imunes. Muitos
exemplos de anti-M tm sido reconhecidos, a maioria de ocorrncia natural e
sem importncia transfusional. Apenas em raros casos, pode ser uma potente
imunoglobulina IgG, ativa a 37C, determinando reao transfusional impor-
tante. Apesar de encontrado em pacientes politransfundidos como resultado
de aloimunizao transfusional, raramente determinam hemlise transfusional ou
DHRN/DHPN.
O anti-N um anticorpo raro e no determina hemlise transfusional ou
DHRN/DHPN, podendo ser ignorado na seleo de unidades de concen-
trados de hemcias.
O anti-S pode ser de ocorrncia natural ou imune. Pode determinar reao
transfusional, e poucos exemplos de DHRN/DHPN foram relatados. Anti-S
pode determinar reaes direta ou apenas pela tcnica da antiglobulina huma-
na com hemcias S positivo. Aproximadamente 56% dos doadores de sangue
so S negativo.
O anti-s pode estar associado hemlise transfusional e DHRN/DHPN.
Frequentemente reage por meio da tcnica da antiglobulina humana com he-
mcias s positivo.
O anti-U um raro anticorpo encontrado na raa negra. No h relato de
alo-anti-U em caucasianos. Esse anticorpo pode determinar reao transfusio-
nal e ocasionar casos graves de DHRN/DHPN.
De forma geral, anti-U uma imunoglobulina IgG que reage pela tcnica
da antiglobulina humana com hemcias U positivo.
Associaes patolgicas
M pode servir como receptor de cepas de Escherichia coli.
MN ou Ss facilitam a penetrao do Plasmodium, o parasita da malria, na
invaso da hemcia.
4.5.3 O sistema P
P1 foi o primeiro antgeno do sistema P a ser descrito por Landsteiner e

Levine, em 1927, mediante a imunizao de coelhos com hemcias humanas.
Em 1935, foram descobertos os antgenos P e PK. Atualmente, apenas o
antgeno do sistema P1 (001) faz parte do sistema P, sendo os demais obso-
letos. O fentipo raro pp est associado formao de anti-Tja, de ocorrncia
natural, porm ativo a 37C, determinando reao transfusional e abortamento
prematuro em mulheres.
4.5.3.1 Anticorpos do sistema P

Anti-P1 um anticorpo de ocorrncia natural e no determina reao
transfusional ou DHRN/DHPN. Apenas em raros casos, trata-se de potente
IgG ativa a 37C, com importncia transfusional. Os antgenos P1 e P2 so
anlogos a A1 e A2.
Por no apresentarem hemolisinas potentes, os anticorpos do sistema P so
clinicamente sem significado.
Os antgenos P so detectados precocemente, com at 12 semanas de
idade, ao passo que os antgenos P1 so detectados mais tarde, por volta
dos 7 anos de idade, atingindo a sua potncia com reatividade variando em
cada indivduo.
4.5.4 O sistema I
O sistema I composto pelos antgenos I e i. Tanto I quanto i so ant-

genos de alta frequncia populacional. O antgeno I pouco desenvolvido ao
nascimento. Esses antgenos so encontrados na membrana de leuccitos, em
plaquetas, hemcias, plasma, saliva, leite humano e soros de adultos e neona-
tos, no sendo encontrados em outras clulas.
Os neonatos apresentam grandes quantidades de i, sendo I praticamen-
te indetectvel neles. Durante os primeiros 18 meses de vida, a quantidade
de i decresce lentamente, enquanto a de I aumenta. Eritrcitos de adultos
so ricos em I.
Fentipo i1: predominante em indivduos brancos.

Fentipo i2: predominante em indivduos negros.
Os antgenos I e i so constitudos por uma srie de carboidratos na por-

o interna das cadeias oligossacardicas dos antgenos ABH.
O antgeno Ii est localizado abaixo dos antgenos ABH, e a atividade de
I aumenta quando se retira a atividade ABH por meio de enzimas.
Os antgenos anti-I so autoanticorpos comuns, mas fracos, encon-
trados na maioria dos indivduos normais e saudveis. A produo de auto-
anticorpos I pode ser estimulada por microrganismos portadores de antgenos
semelhantes por exemplo, a bactria Mycoplasma pneumoniae.
4.5.4.1 Anticorpos do sistema I

O anti-I um autoanticorpo comum, habitualmente uma imunoglobulina
IgM. Na maioria dos casos, os anticorpos do sistema I no tm importncia
clnica. O anti-i raro, mas pode ser detectado em pacientes com mononu-
cleose infecciosa.
Os anticorpos associados a patologias podem apresentar-se em ttulos mui-
to elevados e promover destruio celular in vivo. Assim, deve-se fazer trans-
fuso aquecida: sangue aquecido a 37C, mantendo-se o paciente com as
extremidades aquecidas. Geralmente no causam DHRN/DHPN.
Associaes patolgicas
Anti-I no reage com hemcias de cordo.
Anti-I est associado Mycoplasma pneumoniae.
Anti-i est associado mononucleose infecciosa e a doenas do sistema
reticuloendotelial, tais como reticulose, leucemias mieloides e cirrose alco-
lica. O antgeno anti-i difere do anti-I por no ser considerado benigno
em indivduos saudveis. Anti-i uma IgM que reage melhor a 4C.
O anticorpo anti-i IgG foi associado a DHRN/DHPN, leucemia
aguda, anemia hipoplstica, anemia megaloblstica, anemia sidero-
blstica, hemoglobulinopatia, anemia hemoltica crnica, pacientes
flebotomizados e leucemia aguda.
4.5.5 O sistema Kell
Em 1946, foi descoberto o primeiro antgeno do sistema Kell (K), a

partir do uso da antiglobulina humana; o sistema foi denominado Kell por
ter sido detectado no soro da Sra. Kellacher, sendo responsvel por DHRN
de seu filho. A partir da, foram descobertos vrios outros anticorpos, de
alta e baixa frequncia. Em 1949, foi relatado o seu parceiro antittico
(parceiro simular) de alta frequncia k (cellano). Em 1957, foi descrito
Kpa e, em 1958, foi relatado o seu parceiro antittico Kpb. Tambm em
1957, foi descrito Jsa, e, em 1963, Jsb. O fentipo nulo, tambm des-
crito em 1957, designado por Ko, contribuiu para associar outros antgenos
do sistema Kell. Em condies patolgicas graves, quando o sistema Kell
est com expresso enfraquecida, o fentipo McLeod, descrito em 1961,
evidencia-se.
So 23 os antgenos do sistema Kell, sendo os mais importantes K, k,
Kp , Kpb, Kpb e Kpb. O gene Kell (autossmico) anlogo ao Rh, com lcus
a
intimamente ligado.
Na rotina de banco de sangue, os genes Kk, Kpa, Kpb so os mais impor-
tantes. J o gene Ko raro, silencioso, sendo a combinao mais frequente
KKpb, Jsb e K11.
4.5.5.1 Bioqumica e gentica

Os antgenos do sistema Kell so codificados pelo gene KEL, localizado
no brao longo do cromossomo 7. A expresso desses antgenos tambm
controlada por um gene regulador XK, localizado no brao curto do cromos-
somo X.
O gene ligado ao cromossomo X controla a expresso dos antgenos de
alta frequncia Kx nas hemcias e, possivelmente, nos macrfagos neutrfilos
e moncitos. Foi sugerido que Kx fornece uma protena precursora ou base
na qual os antgenos Kell autossmicos so acrescentados; medida que isso
acontece, Kx torna-se menos acessvel. Kx bem expresso nos casos de Kell
nulo, mas fracamente expresso em hemcias normais.
Os antgenos do sistema Kell so glicoprotenas e esto bem expressos

nas hemcias fetais e ao nascimento; no adulto, esses antgenos se desenvol-
vem cedo nas hemcias em maturao e podem ser detectados precocemente
no estgio de eritroblasto.
Observam-se diferenas segundo a raa na frequncia desses antgenos:
KEL1 caracterstico de caucasianos, menos frequente em negros e raro em
mongis; KEL6 est presente em 19,5% dos negros e ocorre em menos de
1% dos caucasianos.
4.5.5.2 Antgenos e anticorpos Kell na rotina do banco de sangue

Com exceo do Kx, todos os antgenos do sistema Kell so encontrados
nas hemcias. Ao nascimento, esses antgenos se encontram bem desenvolvi-
dos, e contribuem tambm para a DHRN/DHPN. Esses antgenos no so
desnaturados por enzimas, podendo ser destrudos pela combinao de trip-
sina e quimiotripsina. Em caso de estudo de diferenciao para identificao
do anticorpo Kell, usado o ditiotreitol, o qual desnatura todos os antgenos
Kell, exceto Kx e Km.
Os antgenos k, Kpb, Jsb so de alta frequncia.
Os antgenos K, Kpa, Jsa so de baixa frequncia.
Antgenos K e k
Os antgenos K e k so muito imunognicos, porm menos do que o an-
tgeno D do sistema Rh; no entanto, a frequncia de indivduos K+ baixa.
Antgenos Kpa, Kpb e Kpc

Existe semelhana entre o Kpa e o antgeno C do sistema Rh, pois ambos
podem suprimir a expresso de k, Jsb, K11, K14 e K18, o que no ocorre com
os outros antgenos Kpb e Kpc.
Frequncia dos antgenos Jsa e Jsb

Jsa de baixa frequncia.
Jsb de alta frequncia
4.5.5.3 Anticorpos do sistema Kell

Os anticorpos do sistema Kell geralmente se apresentam aps exposio
transfuso ou gravidez; esses anticorpos so imunoglobulinas IgG reativas a
37C, sendo melhor detectados na fase da antiglobulina humana.
Anti-K determina reao hemoltica transfusional e pode causar DHRN/
DHPN. Anti-K geralmente uma IgG melhor detectada pela tcnica de Coom-
bs. O anti-K natural foi associado Escherichia coli e ao bacilo da tuberculose.
Anti-k determina reao hemoltica transfusional e est relacionado
DHRN/DHPN. Anti-k uma IgG melhor detectada pela tcnica de
Coombs. Como o antgeno k de alta frequncia, difcil selecionar unidades
compatveis na presena desse anticorpo.
Anti-Kpa pode determinar, em raras ocasies, reao hemoltica transfu-
sional e estar relacionado a casos moderados de DHRN/DHPN. Anti-Kpa
geralmente uma IgG e melhor detectado pela tcnica de Coombs.
Anti-Kpb um anticorpo contra antgeno de alta frequncia e determina
reao hemoltica transfusional e DHRN/DHPN moderada. Esse anticorpo
geralmente uma IgG melhor detectada pela tcnica de Coombs.
Anti-Jsa pode determinar reao hemoltica transfusional e causar DHRN/
DHPN. Anti-Jsa geralmente uma IgG melhor detectada pela tcnica de
Coombs.
Anti-Jsb um anticorpo contra antgeno de alta frequncia e determina
reao hemoltica transfusional e DHRN/DHPN moderada. Esse anticorpo
geralmente uma IgG melhor detectada pela tcnica de Coombs.
Caractersticas gerais dos anticorpos Kpa, Jsa e de outros de baixa

frequncia
Os anticorpos Kpa, Jsa e outros anticorpos de baixa frequncia so raros e
fceis de detectar. Para fins transfusionais, difcil encontrar doador compatvel
para esse tipo de sangue, justamente por ser de baixa frequncia.
Expresso antignica alterada

Indivduos Kell negativo podem adquirir um antgeno semelhante ao Kell
aps infeco por Micoplasma pneumoniae.
Autoanticorpos
Os autoanticorpos do sistema Kell em geral so K, Kpb e K13. Muitos pa-
cientes com anti-K tiveram leses cranianas ou tumores cerebrais, sugerindo uma
possvel associao entre K e o tecido cerebral. Usualmente, os autoanticorpos
do sistema Kell so benignos ou hemolticos.
4.5.6 O sistema Duffy
O sistema Duffy (Fy) foi descoberto em 1950, no soro de um homem

hemoflico politransfundido de sobrenome Duffy. Na poca, foram descober-
tos dois antgenos, Fy1 e Fy2, com seus respectivos anticorpos, sendo que a
maior parte desse fentipo se encontrava em indivduos brancos. Em 1970,
trs outros anticorpos desse sistema foram identificados: Fy3, Fy4 e Fy5.
Os antgenos do sistema Duffy so codificados por genes localizados no
cromossomo 1. Os dois principais antgenos do sistema so Fya (FY1) e Fyb
(Fy2). A presena ou ausncia desses antgenos define quatro fentipos:
Fy(a+b+), Fy(a+b-), Fy(a-b+) e Fy(a-b-).
4.5.6.1 Anticorpos do sistema Duffy

Os anticorpos do sistema Duffy so moderadamente imunognicos, ocor-
rendo trs vezes menos que o anti-K. So IgG, comumente IgG1, e reagem
melhor em antiglobulina humana. Mesmo aps estmulo secundrio, poucos
so da classe IgM. Uma vez identificado o anticorpo, o sangue administrado
deve ser fenotipado para antgeno negativo. So os anticorpos de maior inci-
dncia na clnica hemoterpica, como tambm os mais importantes. So detec-
tados nas hemcias no incio da vida fetal e esto ligados a uma glicoprotena.
Eles so desnaturados por enzimas proteolticas e tm boa conservao no
plasma, mesmo quando congelados; sua conservao ainda melhor quando
se utiliza o soro.
Anti-Fya um anticorpo frequente, determina reao hemoltica transfusional
e raramente est relacionado a casos de DHRN/DHPN moderada ou grave.
Anti-Fya geralmente uma IgG, e detectado apenas pela tcnica de Coombs.
Anti-Fyb um anticorpo incomum. Em raros casos, pode determinar reao

hemoltica transfusional e ocasionalmente est relacionado DHRN/DHPN
moderada ou grave. Anti-Fyb geralmente uma IgG, e detectado apenas
pela tcnica de Coombs. Esse anticorpo parece ter baixa imunogenicidade e
geralmente encontrado em pacientes politransfundidos que j apresentam
outros anticorpos.
Anti-Fy3 um anticorpo raro, produzido por indivduos Fy(a-b-), que
reage com hemcias tanto Fya(+) quanto Fyb(+). Pode determinar reao
hemoltica transfusional e raramente est envolvido na DHRN/DHPN.
Anti-Fy3 geralmente uma IgG detectada pela tcnica de Coombs. Fy3
no desnaturado por enzimas proteolticas.
O fentipo Fy(a-b-) frequente em negros determina resistncia ao Plasmo-
dium vivax e Plasmodium knowlesi.
Sumrio gentico
O lcus do sistema Duffy, como no sistema Rh, pertence ao cromossomo
1, porm seus genes so separados independentemente.
Associao entre o sistema Duffy e a malria

Foi demonstrado que indivduos negros com hemcias Fy(a-b-) geralmente
so resistentes a infeces com parasitos da malria (Plasmodium knowlise).
Em estudo com 16 indivduos expostos ao Plasmopdium vivax, cinco deles
Fy(a-b-) foram resistentes a infeco, mas seis negros Fy(a+b-) e cinco brancos
Fy(a-b+) contraram a doena.
No Vietn, outros estudos demonstraram que 13 negros tipados como
Fy(a+b-) e Fy(a-b+) foram contaminados, enquanto outros com tipagem
Fy(a-b-) no foram infectados.
4.5.7 O sistema Kidd
O sistema Kidd (Jk) foi descoberto em 1951 aps a implantao da

tcnica de Coombs em uma paciente (Sra. Kidd) que gerara um feto com
DHRN/DHPN causada por um anticorpo ento denominado anti-Jka, o
qual, posteriormente, revelou ser anti-Jkb. Em 1959, foi descrito o fentipo
nulo em uma mulher com reao transfusional importante causada por anti-Jka
+ anti-Jkb posteriormente renomeado anti-Jk3.
O sistema Kidd mais simples constitudo pelos antgenos Jka, Jkb e Jk3 e
pelo fentipo nulo Jk(a-b-). Os antgenos Jka e Jkb so mais comuns em 77%
dos indivduos brancos, sendo que 91% dos negros e 50% dos chineses so
portadores de Jk(a+).
Os Jka so detectados em hemcias de fetos com 11 semanas e contribuem
para DHRN/DHPN. Existem trs microrganismos que se assemelham espe-
cificidade do antgeno eritrocitrio Jkb: Streptococcus faecium, Micrococcus
spp. e Proteus mirabilis.
O fentipo Jk null extremamente raro em caucasianos e negros e est
associado populao chinesa e polinsia, aos ndios do Mato Grosso e a
hindus e japoneses.
4.5.7.1 Anticorpos do sistema Kidd

A imunogenicidade dos anticorpos do sistema Kidd fraca e de difcil
deteco; a principal caracterstica dos anticorpos do sistema o fato de se
ligarem ao complemento, alm de estarem associados a outros anticorpos.
Anti-Jka o anticorpo que determina severa reao hemoltica transfu-
sional, imediata ou tardia. Em raras ocasies, est relacionado a casos de
DHRN/DHPN. Anti-Jka uma IgG e reage melhor com antiglobulina hu-
mana poliespecfica ou soro de Coombs. Em geral, fixa complemento. Em
alguns casos, determina ligeira hemlise ou aglutinao direta com hemcias
tratadas por enzimas.
Anti-Jkb pode determinar reao hemoltica transfusional imediata ou tar-
dia e raramente est relacionado com DHRN/DHPN. Geralmente uma IgG,
principalmente IgG3, mas existem relatos de que pode apresentar-se como
IgM; melhor detectado pela antiglobulina humana poliespecfica. Com a
substncia de baixo peso molecular (LISS) e certas enzimas proteolticas

como a ficina e a papana , estimula a atividade da reao antgenoanticor-
po, levando formao da lise das hemcias.
Anti-Jk3 um raro anticorpo produzido por indivduos Jk(a-b-). Pode
determinar reao hemoltica ps-transfusional e DHRN/DHPN. Anti-Jk3
geralmente uma IgG detectada pela tcnica de Coombs.
Do ponto de vista laboratorial, para estudo do sistema Kidd, a amostra
deve ser manuseada imediatamente, porque os anticorpos do sistema Kidd
se enfraquecem muito rapidamente in vitro, no que se diferenciam dos an-
ticorpos dos outros sistemas. O estudo de identificao de anticorpos do
sistema Kidd pode levar vrias semanas ou meses; assim, importante que os
servios de hemoterapia registrem os dados do paciente para que, caso ele seja
positivo, possam ser evitadas reaes transfusionais futuras.
Autoanticorpos
Os autoanticorpos Jka podem estar relacionados ao uso de medicamentos
base de clorpropamida.
4.5.8 O sistema Lutheran
O sistema Lutheran (Lu) foi descoberto em 1945 por causa da presena de

anti-Lua (antgeno de baixa frequncia) no soro de um paciente aps transfuso.
Os antgenos do sistema Lutheran so, respectivamente, Lua e Lub. O
antgeno Lub+ de alta frequncia na populao.
Os antgenos Lua e Lub no esto desenvolvidos no indivduo ao nasci-
mento; seu desenvolvimento muito demorado, e apenas na idade adulta
possvel identific-los.
Os genes do sistema Lutheran esto localizados no cromossomo 19, liga-
dos ao gene Se. Apenas um gene, In(lu), evita a expresso normal de todos
os antgenos Lutheran. O fentipo Lu(a-b-) ou Lu null muito raro, podendo
resultar de trs circunstncias genticas: de um gene inibidor In(Lu), dominante
fora do lcus Lutheran, o que ocorre na maioria dos casos este gene suprime
tambm i, P, Aua, Anton e An/Wj; da herana de um gene amorfo recessivo

-LuLu; e do inibidor recessivo, ligado ao sexo, que no se enquadra em ne-
nhum dos dois anteriormente citados. chamado lcus XS, com XS1 (alelo
comum) e XS2 (alelo raro).
Pode-se detectar um inibidor recessivo transportado por X, ligado ao sexo,
para o sistema Lutheran. A maior probabilidade de Lu(a+b+) para o sexo
feminino e h uma probabilidade mais evidente de Lu(a-b-) para o
sexo masculino.
4.5.8.1 Anticorpos do sistema Lutheran

O anti-Lua no est relacionado com a reao transfusional e raramente est
envolvido em DHRN/DHPN. Apesar de no apresentar importncia trans-
fusional, devemos evitar transfuses incompatveis para prevenirmos reaes
inesperadas. A frequncia aproximada do antgeno Lua de 8%. Anti-Lua
geralmente uma IgG ativa a 37C, e demonstrado pela tcnica de anti-
globulina humana; no entanto, podemos observar em alguns casos aglutinao
direta com hemcias Lu(a+).
O anti-Lub est relacionado a reao transfusional e DHRN/DHPN. um
antgeno de alta frequncia (99,9%), geralmente uma imunoglobulina IgG ativa
a 37C, e demonstrado pela tcnica de antiglobulina. O anti-Lub muito raro,
pois poucas pessoas so Lub negativo; sempre evidenciado a 37C na fase de
antiglobulina humana; geralmente uma IgG (IgG4), podendo ser tambm IgM
e IgA. Pode causar DHRN/DHPN branda, sendo considerado clinicamente
significativo, por ocasionar destruio lenta e progressiva das hemcias.
As enzimas proteolticas no alteram a reao antgenoanticorpo.
O anti-Lu3 um anticorpo raro encontrado no soro de indivduos
Lu(a-b-). Esse anticorpo est relacionado com reao transfusional tardia e est
envolvido na DHRN/DHPN. Em geral, anti-Lu3 uma IgG ativa a 37C, e
demonstrado pela tcnica de antiglobulina humana.
Os anticorpos Lutheran so encontrados raramente; isso resulta no s do
fato de os antgenos serem de tal forma comuns na populao que a produ-
o de anticorpos correspondentes no possvel, mas tambm da reduzida
frequncia antignica.
4.5.9 O sistema Diego
O sistema Diego (Di) envolve dois antgenos, Dia e Dib. Raramente en-
contrados na populao branca, esto presentes em 36% da populao in-
dgena da Amrica do Sul e em 2 a 10% das populaes monglicas. Os
anticorpos anti-Dia e anti-Dib, de origem imunolgica, so detectados pela
tcnica de antiglobulina humana.
4.5.10 O sistema Cartwright
O sistema Cartwright (Yt) apresenta dois antgenos, Yta e Ytb, de fre-

quncia relativamente baixa. O antgeno Yta potente e capaz de imunizar
indivduos, tendo sido descritos anticorpos Yta imunes e tambm naturais. Os
anti-Yta e anti-Ytb so identificados por tcnicas de antiglobulina humana.
4.5.11 O sistema Colton
O sistema Colton (Co) representado pelos antgenos Coa (alta frequncia)

e Cob (baixa frequncia). Os anti-Coa e anti-Cob so de origem imune e reagem
com a AGH; o anti-Coa tambm reage com hemcias tratadas com papana.
4.5.12 O sistema Scianna
O sistema Scianna (Sc) apresenta dois antgenos: Sc1, um antgeno de

alta frequncia, e Sc2, um antgeno de baixa frequncia. O antgeno Sc2 pa-
rece ser bastante potente, causando imunizao em indivduos Sc1-2-. Os dois
anticorpos so imunes e detectados por tcnica de antiglobulina humana.
4.5.13 O sistema Dombrock
O sistema Dombrock (Do) consiste de dois antgenos: Doa e Dob. O

antgeno Doa est presente, com potncia variada, nas hemcias de indivduos
adultos, em 64% das pessoas brancas. O Dob est presente em 82% da

populao branca; esse antgeno pode mostrar efeito de dose,4 ou seja, a
variao da expresso do antgeno est relacionada com a condio de o gene
estar em homozigose ou heterozigose. Os anticorpos Doa e Dob so anticor-
pos imunes e reagem pelo teste de antiglobulina humana, por meio do uso
de hemcias papainizadas. As clulas com antgeno Doa, sem tratamento com
papana, geralmente reagem fracamente pelo teste de antiglobulina humana;
nem todos os soros AGH so capazes de detectar o anticorpo Doa.
4.5.14 O sistema Xg
O sistema Xg foi descoberto em 1962, quando se descreveu um anticorpo

presente em um homem politransfundido que reconhecia um gene localizado
no cromossomo X; por isso, recebeu o nome de Xga. Alm de estar presente
em hemcias humanas, tambm foi encontrado em macacos gibes e parece
estar associado ao sexo. Cerca de 89% da populao feminina e 66% da
populao masculina expressam Xga. O antgeno reage mais fracamente em
sangue de cordo. O anticorpo anti-Xga de origem imunolgica.
Sabemos que o indivduo Xga no facilmente imunizado. O sistema Xg
detectado pela tcnica de antiglobulina humana. Podem ser encontradas
reaes de campo misto;5 j foi detectado em uma mulher grvida. A sua
temperatura de reao 37C.
Apresenta classe de imunoglobulinas IgG e no faz hemlise in vitro sem
fixar complemento. encontrado raramente na clnica hemoterpica. Foram
relatados muitos exemplos de transfuses incompatveis em indivduos por-
tadores de anti-Xga, sem que tenham ocorrido reaes transfusionais; pode
causar DHRN/DHPN . Sua grande relevncia diz respeito sua relao com
o cromossomo X, que oferece possibilidades para o campo da gentica, como
importante marcador gentico.
4
Diferena na intensidade da reatividade do anticorpo nas hemcias reativas.
5
Aparecimento de dupla populao de hemcias na reao, que pode ocorrer por vrios motivos,
entre eles reao transfusionais ou quimeras imuno-hematolgicas.
4.6 Doenas associadas aos grupos sanguneos
4.6.1 DHPN ou DHRN por Rh(D)
A doena hemoltica do recm-nascido ou doena hemoltica perinatal

caracteriza-se por ser uma doena imunolgica singular, cuja principal evidncia
a destruio eritrocitria durante a vida fetal, causada pela incompatibilidade
sangunea materno-fetal. Consiste na destruio dos eritrcitos do feto e neonato
por anticorpos produzidos pela me. Uma me Rh negativo com pai Rh positivo
pode ocasionar o desenvolvimento do aloanticorpo anti-D, que se dirige contra
as hemcias do neonato, caso ele tenha herdado o antgeno do pai sendo,
portanto, Rh positivo. A frequncia desse tipo de ocorrncia de 1:10. A
DHRN/DHPN tambm pode ocorrer por outros sistemas de grupos sanguneos;
contudo, a mais comum decorre do anti-D do sistema Rh. No sistema ABO, os
sintomas associados DHRN/DHPN so brandos ou subclnicos.
Novos avanos da cincia foram aplicados para se evitar a DHRN/DHPN,
principalmente para a preveno da doena. Um mtodo importante a imu-
nossupresso de anticorpos para se evitar a imunizao RhD em uma me
Rh negativo. A imunossupresso de anticorpos consiste na administrao de
imunoglobulinas anti-Rh (D) me aps o nascimento de um concepto Rh
positivo a fim de se prevenir a imunizao pelo antgeno D e, consequente-
mente, a formao de anticorpos anti-D. Em geral, a doena s se manifesta
em gestaes posteriores.
Principais condies para que ocorra a DHRN/DHPN

a) Exposio antignica
A exposio antignica mais comum a que ocorre no momento do parto.
Em 50% dos partos, h entrada de hemcias fetais na circulao materna. Na
maioria dos casos, o volume da hemorragia feto-materna pequena; porm,
1% das hemcias fetais j pode imunizar a me.
A maior prevalncia de imunizao para o antgeno D, mas tambm
ocorrem imunizaes com outros antgenos; assim, C, E, e c, alm de Kell, so
bastante imungenos, mas tm incidncia percentualmente menor.
b) Produo de anticorpos
A produo de anticorpos ocorre de 6 a 8 semanas aps a estimulao.
Para que o anticorpo seja sorologicamente detectvel, necessria uma exposi-
o antignica secundria, que corresponde a uma resposta de memria. O nvel
de anticorpos produzidos proporcional ao volume da exposio antignica.
Classificao e especificao do anticorpo

Para que os anticorpos maternos ocasionem DHRN/DHPN, eles devem
atravessar a placenta e reagir com os antgenos das hemcias fetais, iniciando a
sua destruio.
importante salientar que das trs principais classes de imunoglobulinas IgA,
IgM e IgG apenas IgG (IgG1 e IgG3) capaz de produzir DHRN/
DHPN, pois, ao contrrio das outras classes de imunoglobulinas, a nica
transportada atravs da placenta.
Classificao das DHRN/DHPN

DHRN/DHPN por RhD ou por outros antgenos do sistema Rh: pode
ser causada por anti-D sozinho ou, em menor frequncia, combinado com
anti-C ou anti-E.
DHRN/DHPN por ABO: usualmente causada por anti-AB e, com me-
nor frequncia, por anti-A ou anti-B.
DHRN/DHPN por outros sistemas de grupos sanguneos: anti-c e anti-
K esto mais implicados na DHRN/DHPN que envolve outros sistemas.
Efeitos da destruio das hemcias

O desencadeamento da imunizao ocorre durante o segundo trimestre
gestacional e pode ocasionar destruio das hemcias. A hemlise provocada
no concepto causa anemia e bilirrubinemia, e, indiretamente, leva a hepatoes-
plenomegalia, esplenomegalia e cardiomegalia acompanhada de ascite.
Diagnstico
a) A deteco do anticorpo na gestante deve ser feita durante o pr-natal.
A partir do primeiro trimestre de gestao, so realizados testes de tipagem
sangunea do sistema ABO, do sistema Rh e de D fraco e fenotipagem CDE.

Aps o nascimento de criana com suspeita de DHRN/DHPN, deve-se
coletar sangue do cordo umbilical e realizar os seguintes testes: fenotipagem
ABO/Rh, teste de antiglobulina direto (TAD) ou teste de Coombs direto,
dosagem de bilirrubina, hematcrito, hemograma, dosagem de hemoglobina
e contagem de reticulcitos.
b) Titulao do anticorpo: tcnica em que o soro diludo de forma se-
riada e testado contra as hemcias fenotipadas, a fim de se determinar a mais
alta diluio do anticorpo especfico.
c) Teste de Coombs direto ou prova de antiglobulina humana:6 o teste
isolado para a pesquisa de anticorpo intravascular o mais importante para a
avaliao da ocorrncia de DHRN/DHPN aps o nascimento. Um resultado
positivo indica que os anticorpos esto revestindo as hemcias do neonato in
vivo, o que pode ser detectado mesmo quando a doena subclnica.
d) Eluato: um eluato preparado das hemcias do neonato demonstrar
a presena de anticorpos maternos; isso pode ser evidenciado mesmo com
AGH direta negativa, ainda na fase inicial.
Utilizam-se no eluato tcnicas de aquecimento, congelamento,
descongelamento, ter ou outras tcnicas de eluio preconizadas; o anticorpo
prontamente eludo das hemcias do neonato e pode ser identificado.
Quando o teste de AGH pela tcnica direta positivo, deve-se realizar
a pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) e, em caso positivo, identificar o
anticorpo presente, mediante a identificao de anticorpos irregulares (IAI).
Em caso da PAI ser negativa, deve-se fazer o eluato, embora se preconize que
o mesmo deve ser feito de qualquer maneira.
e) Teste de compatibilidade: no teste de compatibilidade, as hemcias
escolhidas para a transfuso do neonato devem ser sempre compatveis com a
me, porque o neonato apresenta anticorpos maternos circulantes. A prefe-
rncia para as amostras a serem utilizadas nesses testes o soro da me e as
hemcias do neonato. Nos casos em que no se tenha disponvel uma amostra
de sangue da me, o neonato deve ser transfundido com sangue do grupo O.
6
Exame utilizado para identificar imunoglobulinas que j esto ligadas s hemcias, ou seja, identi-
ficar hemcias que, in vivo, se sensibilizaram.
f) Amniocentese: o procedimento diagnstico intrauterino mais impor-

tante para avaliar a DHRN/DHPN. Esse exame baseia-se na concentrao de
pigmentos gerados pelo feto e no ttulo do anticorpo materno formado. Uma
agulha inserida no saco amnitico fetal, coletando-se uma quantidade de
lquido amnitico para que se avaliem os nveis de bilirrubina, jogando-se esses
valores em um grfico de Liley.
Por meio da aminocentese tambm se avalia se o feto pode ou no ser
submetido hemotransfuso intrauterina.
Tratamento e preveno
a) Hemotransfuso intrauterina: a finalidade da transfuso intrauterina
corrigir a anemia severa e evitar a possvel morte in utero quando existe risco de
parto prematuro. Injeta-se um concentrado de hemcias, atravs de uma agulha
de calibre 22 mm, na veia umbilical fetal. Todo o procedimento monitorado
por aparelho de ultrassom (fig. 4.4).
Figura 4.4. Transfuso intravascular intrauterina direta.
b) Exame ultrassonogrfico: usado para orientar a realizao da transfu-

so intrauterina e tambm para detectar sintomas de hidropisia, tais como ascite
fetal, edema subcutneo ou derrame de pericrdio.
c) Exossanguineotransfuso: utilizada para o tratamento da anemia derivada

do aumento do ttulo do anticorpo e da hiperbilirrubinemia. Quantidades
pequenas de sangue compatvel so transfundidas, e, ao mesmo tempo, so
retiradas quantidades iguais de sangue do neonato. Nesse processo, so extrados
do plasma do neonato a bilirrubina e os anticorpos maternos circulantes, alm de
ser feita a substituio dos eritrcitos revestidos por anticorpos.
Seleo do sangue para exossanguineotransfuso: o sangue deve ser ne-
gativo para todos os antgenos das hemcias; deve tambm ser ABO e Rh
compatvel com o grupo sanguneo materno; como ltimo recurso, no caso de
no ser possvel obter amostra igual ao grupo sanguneo da me ou do grupo
O, podem ser usadas hemcias com a mesma tipagem sangunea do neonato.
d) Fototerapia: a exposio do neonato luz ultravioleta, que decom-
pe a bilirrubina. Essa tcnica utilizada quando os nveis dessa substncia
ainda esto baixos.
e) Preveno da DHRN/DHPN com imunoglobulina anti-D: a imuno-
globulina anti-D humana concentrada e purificada atua como um imunossupres-
sor; ela administrada em mes Rh negativo que geram neonatos Rh positivo.
As mes tratadas evitaro a sensibilizao anti-D em gestaes subsequentes.
A imunoglobulina anti-D administrada me 72 horas aps o parto, en-
quanto as hemcias fetais ainda circulam, para que haja fixao do antgeno
anticorpo e, dessa forma, esse complexo seja retirado da circulao materna.
Indicao: administrao intramuscular de 30 g de RhIG 72 horas aps
o parto ou o aborto. Mulheres que j produziram anti-D no devem ser sub-
metidas imunoglobulina anti-D.
Falha no tratamento com RhIG: o tratamento com RhIG apresenta taxa
global de falha de 1% a 2%, sendo sua principal causa o sangramento mater-
no-fetal; outra causa tambm importante a administrao de RhIG em doses
insuficientes. Assim, fundamental o controle laboratorial imuno-hematolgico
a fim de se determinar a neutralizao do anticorpo pela imunoglobulina.
Outras aplicaes do uso de RhIG: essa imunoglobulina pode ser ad-
ministrada em qualquer indivduo Rh negativo, mas deve ser administrada em
especial s mulheres Rh negativo em idade frtil.
Por no existir antiglobulina especfica, o tratamento profiltico no est

disponvel para outros anticorpos que tambm causam DHRN/DHPN.
4.6.2 DHRN/DHPN por ABO
A proporo de ocorrncia de DHRN/DHPN por ABO de 1:5 ges-

taes, e menos de 10% dos neonatos necessitam de tratamento.
Etiologia
A IgG na DHRN/DHPN por ABO de ocorrncia natural, pois os anticor-
pos se manifestam na ausncia de qualquer estmulo eritrocitrio conhecido os
anticorpos so produzidos a partir de estmulos ambientais. Ocorre em menor
porcentagem em neonatos de mes do grupo O, apresentando forma clnica
branda, com destruio celular mnima.
Sorologia ABO
de difcil confirmao, exigindo testes trabalhosos que, no mximo, de-
monstram a presena de IgG materno. Em geral, utiliza-se AGH e 2-mercap-
toetanol para tratamento prvio do soro.
Teste de antiglobulina humana direto (TAD) ou teste de Coombs direto

O teste de antiglobulina direto (TAD) por incompatibilidade ABO pode
ser fracamente positivo ou at negativo em crianas clinicamente afetadas, di-
ferentemente do que ocorre nos casos da doena hemoltica por incompatibi-
lidade Rh, nos quais o TAD pode ser fortemente positivo, sem ser observado
nenhum sinal clnico da doena.
Eluato
O procedimento o mesmo j comentado quando se tratou da DHRN/
DHPN por Rh(D); preciso acrescentar que nesse sistema mais difcil de-
tectar o anticorpo presente.
Consequncias e tratamento
A DHRN/DHPN por ABO pode ocasionar ictercia neonatal. A des-
truio eritrocitria comea no perodo intrauterino. H aumento do nvel de
bilirrubina ps-natal que, em muitos casos, se normaliza. raro na DHRN/
DHPN por ABO a ocorrncia de natimortos e hidropisia fetal.
4.7 Prtica imuno-hematolgica
4.7.1 Classificao direta do sistema ABO
A classificao direta do sistema ABO ou teste de Beth-Vincent tem

como objetivo pesquisar e classificar os antgenos nas hemcias do paciente ou
do doador.
Consiste em pr em contato soros-teste conhecidos anti-A, anti-B e
anti-AB (fig. 4.5) com glbulos vermelhos a serem testados, a fim de se
identificar se esto ou no presentes os antgenos A e B. Com essa classifica-
o, definem-se os grupos sanguneos A, B, AB e O.
Procedimento
1) Identificar trs tubos da seguinte maneira: A, B e AB;
2) Preparar uma suspenso das hemcias a 5%;
3) Colocar nos tubos identificados, respectivamente, duas gotas dos soros
anti-A, anti-B e anti-AB;
4) Adicionar em cada tubo uma gota da suspenso das hemcias;
Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto;
5) Fazer a leitura, agitando levemente o tubo, a fim de deslocar o boto de
hemcias do fundo do tubo, anotando os resultados obtidos.
Figura 4.5 Classificao direta ABO em tubos.
Interpretao
Nas tcnicas imuno-hematolgicas em tubo, as leituras so realizadas
aps centrifugao. Em geral, a velocidade utilizada na centrifugao de
1.000 rpm durante 1 minuto. Devemos ressuspender o boto de hemcias
formado, balanando-o gentilmente.
A intensidade da reao padronizada segundo a anlise do boto quanto
formao de agregados ou aglutinados. A figura 4.6 estabelece a graduao
das reaes antgenoanticorpo.
Figura 4.6. Padro de leitura em intensidade de cruz (0 a 4+)

das reaes antgenoanticorpo.
Figura 4.7. Interpretao da classificao ABO direta.
Quadro 4.2 Classificao ABO direta.

Tubos
Resultados
A B AB
+ 0 + A
0 + + B
+ + + AB
0 0 0 O
O resultado encontrado nessa tcnica deve ser confirmado pela classifica-

o reversa.
4.7.2 Classificao reversa do sistema ABO (ou prova de Simonin)
Tem como objetivo a pesquisa dos anticorpos naturais, no soro, do pacien-

te ou do doador. Consiste em colocar o soro a ser testado em contato com
glbulos vermelhos fenotipados A1 e B (fig. 4.8), que, por possurem seus

respectivos antgenos especficos, permitem reconhecer a presena ou no de
anticorpos existentes no plasma ou soro a ser testado.
Obs.: A utilizao de hemcias A2 no obrigatria,

porm auxilia nos casos de discrepncia ABO.
Procedimento
1) Identificar dois tubos: A1 e B;
2) Colocar nos tubos identificados duas gotas dos respectivos soros em
estudo;
3) Adicionar, no tubo A1, uma gota de suspenso das hemcias A1 feno-
tipadas e, no tubo B, uma gota de suspenso das hemcias B fenotipadas;
4) Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto;
Figura 4.8. Classificao reversa em tubos.
Interpretao
A figura 4.9 mostra graficamente a reao da prova reversa da classifica-
o ABO de acordo com a prova reversa. A aglutinao significa a presena
do antgeno. As reaes devem ser anotadas de acordo com o seu grau de

intensidade.
Figura 4.9. Interpretao da classificao ABO reversa.
Quadro 4.3. Classificao ABO reversa.

Tubos
Resultados
A1 B
0 + A
+ 0 B
0 0 AB
+ + 0
Obs.: As duas provas direta e reversa devem ser

realizadas preferencialmente por dois tcnicos diferentes,
cada teste servindo para checar o outro; o resultado da
prova reversa s tem validade diante do resultado da prova
direta. O confronto dos antgenos encontrados com os
anticorpos presentes confirma a classificao ABO.
validao dos testes = concordncia dos resultados
Na interpretao da tipagem ABO, dizemos que h concordncia quan-

do a presena do antgeno significa ausncia do anticorpo correspondente
e vice-versa.
Figura 4.10. Interpretao da classificao ABO direta e reversa.

4.7.3 Pesquisa de subgrupos do sistema ABO
Tem como objetivo determinar em qual subgrupo do sistema ABO o in-

divduo est inserido, sendo realizada logo aps a classificao ABO, caso o
indivduo seja do grupo A.
A tcnica para determinao de subgrupos do antgeno A possui como
soros reagentes as lecitinas Dolichos biflorus e Ulex europaeus. Para a pesquisa
dos demais subgrupos do sistema ABO, utiliza-se a mesma tcnica, mudando-
se apenas as lecitinas, quando no forem necessrias tcnicas mais especializa-
das ou conjuntos de tcnicas para a sua elucidao.
Procedimento
1) Identificar dois tubos da seguinte maneira: A1 e H;
2) Fazer suspenso de hemcias a 5% da amostra a ser examinada;
3) Adicionar a cada tubo duas gotas de sua respectiva lecitina:
A1 Dolichos biflorus,
H Ulex europaeus;
4) Adicionar a cada tubo uma gota da suspenso de hemcias;
Obs.: Para determinar os subgrupos do antgeno B utiliza-

se a lecitina Bandeiraea simplicifolia; de acordo com o
escore obtido nas aglutinaes, identifica-se o subgrupo.
4.7.4 Classificao RhD
A tipagem do Rh refere-se somente ao antgeno D do sistema Rh. Geralmente,

quando o antgeno D negativo, importante fazer uma pesquisa de D fraco, pois
alguns indivduos apresentam expresso do antgeno D fraca, e necessrio fazer a
determinao com tcnica do Coombs indireto para que possamos identific-los.
Denomina-se Rh positivo ao indivduo Rho(D) positivo e Rh negativo,

quele em que a tipagem para Rh(D) e D fraco foi negativa. Contrariamente
ao sistema ABO, no h prova reversa.
Os indivduos no apresentam naturalmente anticorpos sricos contra o
antgeno D. O soro anti-Rh(D) contm anticorpos imunes, IgG, anti-D e
potencializadores que provocam aglutinao rpida e visvel desses anticorpos
com os antgenos D. Em virtude desse meio ter alto peso molecular, podem
ocorrer reaes falso-positivas. Por isso, a determinao do tipo Rh(D) exige a
utilizao, em paralelo, de um controle negativo: o controle Rh.
Controle Rh: reagente que contm o meio macromolecular utilizado na
fabricao de soro anti-Rho(D), mas que imunologicamente inerte, isto ,
no contm anticorpos.
Obs.: Os meios macromoleculares contidos no soro anti-D

variam segundo o fabricante, ocorrendo, portanto, variao
no controle Rh. Assim, como testemunho negativo, ele deve
ser do mesmo fabricante do anti-D. No usar albumina bovina
como controle negativo. A albumina bovina foi, durante
muitos anos, utilizada com esse objetivo, mas no fornece a
potencializao na unio antgenoanticorpo fornecida pelo
controle Rh.
Procedimento
1) Identificar dois tubos da seguinte maneira: Rh e Controle de Rh;
2) No tubo Rh, colocar duas gotas do soro anti-D;
3) No tubo Controle de Rh, colocar uma gota do soro controle Rh anti-D;
4) Colocar nos dois tubos uma gota de suspenso de hemcias a 5%;
Interpretao
Se houver aglutinao, o paciente Rh positivo; se no houver, proceder
pesquisa de D fraco. O controle de Rh deve sempre dar negativo, porque o soro
no tem em sua composio o anti-D; se o mesmo for positivo, indicao de
que houve algum erro na tcnica, mas, caso o paciente a ser classificado j no
tenha indicao clnica, alguma doena intercorrente deve ser pesquisada.
Procedimento para a pesquisa em caso de controle de Rh positivo

1) Repetio da tcnica; caso permanea a positividade, prosseguir com a
investigao;
2) Avaliar as possveis causas clnicas;
3) Dependendo das concluses tiradas, realizar classificao Rh com soro
salino, pesquisa de anticorpos irregulares (PAI), teste de Coombs direto
(TAD), dosagem de protenas e autoprova.
4.7.5 Pesquisa de D fraco
Proceder com essa tcnica caso tanto a classificao RhD quanto o controle
de Rh sejam negativos.
1) Incubar dois tubos (D e CTL) por 15 minutos em banho-maria a 37C;
2) Lavar as hemcias de cada tubo trs vezes, em soluo salina fisiolgica;
decantar completamente por inverso rpida dos tubos, aps a ltima lavagem;
3) Acrescentar duas gotas de soro antiglobulina humana (soro de Coombs)
em cada tubo;
4) Centrifugar a 3.400 rpm por 15 segundos ou a 1.000 rpm por 1
minuto;
5) Ressuspender o boto de hemcias, por agitao delicada, e examinar
para aglutinao macroscpica;
6) Colocar nos tubos onde no houve aglutinao 1 gota do reagente das
hemcias controle de Coombs;7
7
O controle de Coombs composto de hemcias sensibilizadas por anticorpos; ao ser adicionado
amostra de hemcias, torna a reao positiva (presena de aglutinados). Portanto, um controle positivo.
7) Centrifugar e ressuspender delicadamente o boto; se o teste tiver sido

feito corretamente, deve ocorrer aglutinao.
Interpretao
Quando ocorrer aglutinao apenas no tubo marcado D, o sangue deve ser
classificado como D positivo ou Rh positivo.
Havendo ausncia de aglutinao em ambos os tubos, devemos fazer a
pesquisa da variante fraca de D. Se no ocorrer aglutinao em nenhum dos
tubos, o sangue deve ser classificado como D negativo ou Rh negativo.
Havendo aglutinao no tubo marcado D, o sangue deve ser classificado
como D positivo fraco ou D fraco. Se ambos os tubos, D e CTL, aglutinarem,
o indivduo no deve ser considerado como Rh positivo, e sim como tendo um
teste de Coombs direto positivo, provavelmente por sensibilizao de algumas
hemcias ou autoanticorpos (fig. 4.11).
Quando no houver tempo de realizar estudos mais aprofundados na vi-
gncia de uma transfuso de urgncia, escolher para essa transfuso um sangue
Rh negativo.
Figura 4.11. Interpretao dos resultados da determinao do Rh(D).

Se houver aglutinao, o paciente Rh positivo com D fraco; se no hou-

ver, o paciente Rh negativo. Caso haja oportunidade, importante realizar
a fenotipagem CDE.
4.7.6 Fenotipagem CDE
1) Colocar duas gotas do soro anti-CDE em um tubo;

2) Adicionar uma gota da suspenso de hemcias a 5%;
3) Agitar gentilmente;
5) Fazer a leitura.
Interpretao
Se o resultado for negativo, o paciente no possui os antgenos CDE; se
o resultado for positivo, os antgenos C ou E podem estar presentes. Sendo
assim, deve-se fenotipar com soro anti-E ou anti-C.
4.7.7 Teste de antiglobulina humana ou teste de Coombs
O teste de antiglobulina humana foi descrito em 1945 por Robin Coombs,

Arthur Mourant e Robert Race. Em 1946, Coombs descreveu o uso de
antiglobulina humana para detectar a sensibilizao in vivo de hemcias por
anticorpos, tornando possvel o diagnstico da DHRN/DHPN. Com a
descoberta do teste de AGH, foram detectados outros anticorpos IgG,
com seus respectivos antgenos. Isso levou descoberta e caracterizao de
muitos sistemas de grupos sanguneos por exemplo, foi encontrado o primeiro
anticorpo do sistema Kell e seu respectivo antgeno. Coombs produziu soro
de antiglobulina humana injetando soro humano em coelhos. Como resposta
imunolgica, ocorreu a produo de anticorpo contra a globulina humana.
O uso da antiglobulina humana para detectar a sensibilizao de hemcias
in vitro uma tcnica de duas fases chamada teste de antiglobulina indireto
(TAI), tambm conhecida como teste de Coombs indireto. A sensibilizao

in vivo detectada por procedimento de uma fase chamada de teste de anti-
globulina direto (TAD), tambm conhecida como teste de Coombs direto.
O TAI e o TAD continuam sendo os procedimentos mais

comuns e de grande importncia na sorologia de grupos
sanguneos.
O teste de Coombs baseado no princpio de que as globulinas anti-

humanas obtidas de espcies no humanas imunizadas ligam-se a globulinas
humanas incompletas (IgG ou IgM), aps fixadas em hemcias. A tcnica
de Coombs revela anticorpos bloqueadores ou incompletos que, mesmo em
altas concentraes, no aglutinam em meio salino, apesar de se fixarem na
superfcie das hemcias.
O soro anti-humano preparado a partir do soro de coelhos imuni-
zados com componentes purificados do soro humano, isto , gamaglobulinas
ou betaglobulinas. Na preparao do soro antiglobulina humana, utilizam-se
colnias de coelhos para a imunizao e a obteno do soro, mediante coletas
sucessivas de sangue total do animal, com ttulo acima de 1:1.024. Esse soro
absorvido de seus anticorpos, utilizando-se hemcias humanas dos grupos A,
B e O; com isso, o soro est pronto para a determinao de seu ttulo, sua
avidez e sua especificidade.
Para a utilizao do soro, tambm preciso investigar se as hemcias
esto ou no sensibilizadas por anticorpos incompletos, isto , se elas esto
ou no com stios antignicos bloqueados por molculas de anticorpo.
Tipos de antiglobulina humana

Poliespecfica: soro anti-IgG mais anticomponentes do complemento.
Monoespecfica: soro anti-IgG humano.
O teste de antiglobulina direto ou tcnica de Coombs direto empregado

nos seguintes casos:
DHRN/DHPN;
reao hemoltica transfusional (RHT);
anemia hemoltica imune (AHI);
anemia hemoltica autoimune (AHAI);
anemia hemoltica induzida por drogas (PHID).
Procedimento
1) Preparar uma suspenso a 5% de hemcias que tenham sido bem lavadas;
2) Identificar dois tubos da seguinte maneira: T (teste) e CC (controle de
Coombs);
3) Colocar em ambos os tubos duas gotas da antiglobulina humana (soro
de Coombs);
4) Adicionar no tubo T numa gota da suspenso de hemcias a pesquisar;
6) Adicionar no tubo CC uma gota do reativo de hemcias do controle
de Coombs;
7) Esperar 5 minutos;
9) Fazer a leitura.
Interpretao
A aglutinao no tubo T indica que existem anticorpos cobrindo as he-
mcias; no caso de no aglutinao, pode ou no haver anticorpos contra as
hemcias. A reao deve ser analisada ao microscpio para certificao da pre-
sena ou ausncia de aglutinao das hemcias. Caso existam indcios clnicos,
deve ser feito um eluato.
O controle de Coombs deve aglutinar, porque as hemcias do controle de
Coombs sempre esto sensibilizadas por um anticorpo.
4.7.8 Teste indireto de antiglobulina humana ou tcnica de Coombs

indireto
Tem como objetivo identificar a presena, no plasma, de anticorpos cir-

culantes capazes de se ligar a antgenos de hemcias, causando uma reao
antgeno/anticorpos (sensibilizao) que no leva aglutinao em meio salino
e que necessita do soro de antiglobulina humana para que haja a aglutinao.
empregada nos seguintes casos:
pesquisa de anticorpos desconhecidos e identificao, utilizando-se c-
lulas eritrocitrias com antgenos conhecidos (painis);
pesquisa de D fraco;
provas de compatibilidades;
fenotipagem.
Procedimento
Usam-se dois grupos de hemcias fenotipadas, geralmente identificados
como I e II, com a caracterizao dos antgenos dos principais sistemas san-
guneos que possuem significado clnico e representados em um diagrama que
compe essas hemcias.
Fase salina
1) De acordo com as hemcias usadas, identificar trs tubos da seguinte
maneira: I, II e AP (autoprova);
2) Colocar duas gotas do soro nos tubos identificados;
3) Colocar uma gota das hemcias fenotipadas I, II e a pesquisar (suspen-
so a 5%), respectivamente;
5) Fazer a leitura e anotar os resultados no diagrama.
Fase albuminosa
1) Colocar duas gotas em cada tubo de albumina ou de substncia de
baixo peso molecular (LISS) para diminuir o potencial zeta, reduzindo
as foras de repulso das hemcias, induzindo a aproximao entre elas e

favorecendo a visualizao da aglutinao;
Fase de incubao a 37C

1) Incubar a 37C por 15 minutos;
3) Fazer a leitura e anotar os resultados;
4) Lavar trs vezes as hemcias com soluo salina para a retirada das
fraes inicas e diminuio do potencial zeta; escoar e secar bem aps a
ltima lavagem.
Fase antiglobulina humana ou AGH

1) Colocar duas gotas do soro de Coombs ou AGH nos trs tubos;
Interpretao
A aglutinao indica a presena de anticorpo irregular, que ser demonstra-
da pela pesquisa de anticorpos irregulares (PAI).
Sem aglutinao, o resultado pode ser negativo, desde que a viso mi-
croscpica e os dados clnicos do paciente sejam compatveis com o achado.
Existem casos em que necessrio utilizar outras tcnicas, como a de eluio, a
fim de retirar o anticorpo preso membrana das hemcias. Nesse caso, deve-se
fazer um teste de Coombs direto.
Nos resultados negativos em que no ocorre aglutinao com AGH, acres-
centar ao tubo uma gota de hemcias controle de Coombs que, aps centri-
fugao, deve apresentar aglutinao , de forma a avaliar o soro de Coombs
ou AGH.
4.7.9 Testes de compatibilidade
Os testes de compatibilidade, ou provas cruzadas, devem predizer

a capacidade biolgica de um anticorpo causar destruio, imediata ou
tardiamente, de eritrcitos incompatveis. A prova de compatibilidade maior
feita testando-se os glbulos vermelhos do doador contra o soro/plasma
do receptor; da mesma maneira que a PAI, o teste de compatibilidade maior
realizado nas seguintes fases: salina, incubao a 37C e antiglobulina. A
prova de compatibilidade menor feita testando-se o soro/plasma do doador
contra as hemcias do receptor. Atualmente essa prova est em desuso.
Os principais testes de compatibilidade so:
1) Doador: reclassificao ABO e Rh(D)
Receptor: ficha hemoterpica e imuno-hematolgica do paciente
2) Classificao ABO
3) Classificao Rhesus Anti(D)
4) PAI
5) Prova cruzada maior
Ficha hemoterpica
No usual que os servios de hemoterapia elaborem pronturios imuno-
hematolgicos dos pacientes; no entanto, caso eles existam, importante que
sejam avaliados para que se determine a evoluo dos procedimentos e a
necessidade de novos exames.
Prova cruzada maior

A prova cruzada maior realizada para assegurar a compatibilidade entre
as hemcias do doador e o soro do receptor, usando a tcnica do Coombs
indireto. Consiste em colocar em contato, antes da transfuso, o soro do
receptor com as hemcias do doador, a fim de assegurar ao receptor um
sangue compatvel. A tcnica utilizada deve revelar anticorpos sensibilizantes,
aglutinantes e hemolisantes.
Procedimento
1) Fazer a suspenso de hemcias do doador a 5%;
2) Identificar dois tubos da seguinte maneira: PC (prova cruzada) e AP
(autoprova);
3) Colocar, em cada tubo, duas gotas do soro do receptor;
4) Colocar uma gota da suspenso da hemcia do doador no tubo PC;
5) Colocar uma gota da suspenso da hemcia do receptor no tubo AP;
6) Incubar por 5 minutos temperatura ambiente (TA);
8) Fazer a leitura por meio de movimentos lentos, tendo o cuidado de
deslocar suavemente o boto das hemcias, e anotar o resultado.
Obs.: Essa fase pode identificar anticorpos do

tipo completo (frio) e erros de tipagem sangunea.
9) Adicionar duas gotas de albumina 22% ou LISS; centrifugar a 1.000

rmp por 1 minuto;
deslocar suavemente o boto de hemcias, e anotar o resultado;
11) Levar os tubos ao banho-maria a 37C durante 15 minutos;
deslocar suavemente o boto das hemcias, e anotar o resultado;
14) Fazer trs lavagens com soluo salina fisiolgica e centrifugar a
2.000 rpm por 2 minutos;
15) Decantar o sobrenadante o mximo possvel, tomando o cuidado de
secar bem o tubo, com papel-filtro, na ltima lavagem;
16) Adicionar duas gotas de antiglobulina humana ou de soro de Coombs;
deslocar suavemente o boto das hemcias, e anotar o resultado.
Interpretao
A transfuso ser compatvel quando o resultado dos dois tubos for negativo.
A transfuso ser incompatvel se o resultado do tubo PC for positivo e o
da autoprova for negativo, ou se o resultado de ambos os tubos for positivo.
No caso de resultado negativo na prova cruzada e positivo na autoprova, a
transfuso ser compatvel, com restries a serem esclarecidas.
S fazer a autoprova no caso de a mesma no ter sido includa na PAI.
Quando no ocorrer nos resultados aglutinao com AGH, no esquecer de
acrescentar ao tubo uma gota de hemcias do controle de Coombs tubo
que, aps a centrifugao, dever apresentar aglutinao , de forma a avaliar
o soro de Coombs ou soro AGH.
Identificao de anticorpos irregulares (IAI)

Inicialmente, feita a pesquisa do anticorpo irregular (PAI) pela tcnica de
Coombs indireto. So utilizadas duas hemcias fenotipadas I e II, formando o
que se chama de painel de triagem. Caso qualquer das hemcias tenha resul-
tado positivo, deve-se fazer a identificao de anticorpos irregulares. A IAI
realizada tambm por meio de um painel contendo, em mdia, 11 hemcias
fenotipadas, que chamado painel de identificao.
Princpio
Usa-se a tcnica de Coombs indireto ou da antiglobulina humana indireta
para a identificao do anticorpo irregular no soro, por meio de um diagrama
de antgenos de vrios sistemas sanguneos de maior significado clnico.
Procedimento
1) Usando um painel de identificao de onze hemcias, identificar onze
tubos com o nmero das hemcias tipadas e um com AP (autoprova);
2) Colocar em cada tubo duas gotas do soro a ser estudado;
3) Adicionar uma gota das suspenses de hemcias em cada tubo, e a
suspenso do paciente estudado (5%) no tubo AP;
5) Fazer a leitura dos tubos por meio de movimentos lentos, tendo o cui-
dado de deslocar suavemente o boto das hemcias, aglutinado ou no, e
anotar os resultados no diagrama anexo ao reativo das hemcias fenotipadas
(painel de identificao);
6) Adicionar duas gotas de albumina bovina a 22% ou LISS, de acordo
com o procedimento indicado no laboratrio;
dado de deslocar suavemente o boto das hemcias, aglutinado ou no, e
9) Levar os tubos ao banho-maria ou a banho seco a 37C por 15 a 60
minutos;
dado de deslocar suavemente o boto das hemcias aglutinado ou no, e
12) Mesmo que haja aglutinao, lavar trs vezes as hemcias com soluo
fisiolgica, centrifugando a 2.000 rpm por 2 minutos;
13) Decantar o sobrenadante o mximo possvel, tomando o cuidado de
secar bem o tubo, com papel-filtro, na ltima lavagem;
14) Adicionar duas gotas de antiglobulina humana;
16) Deslocar o boto de hemcias, suavemente, do fundo do tubo; anotar
os resultados no diagrama anexo ao reativo das hemcias fenotipadas (pai-
nel de identificao).
Colocar em todos os tubos onde no houve aglutinao com AG (negati-

vos) uma gota de hemcias do controle de Coombs, os quais, aps centrifu-
gao a 1.000 rpm por 1 minuto, devem apresentar aglutinao. Essa uma
forma de avaliao do soro de Coombs ou da AGH.
Resultados
De acordo com as aglutinaes em cada etapa do processo, pode-se dire-
cionar a pesquisa para anticorpos frios e quentes8 do sistema Rh ou de outros
sistemas sanguneos, revelados com antiglobulina humana.
A presena do antgeno est representada no diagrama do painel de iden-
tificao de anticorpos de hemcias por uma cruz (+); a ausncia est repre-
sentada por um zero (0).
Deve-se comparar a representao do referido painel com o resultado en-
contrado, ou seja, presena ou ausncia de aglutinao de hemcias que indi-
car a possvel caracterizao de um anticorpo.
Pode haver uma mistura de anticorpos; nesse caso, importante que, alm
das aglutinaes, analise-se tambm a intensidade dessas reaes de aglutina-
o, buscando identificar uma possvel sobreposio de anticorpos.
Podem ser usadas enzimas para reforar ou anular a reao de aglutinao.
Isso facilita a identificao dos anticorpos mediante suas propriedades de re-
agirem ou no com enzimas proteolticas, tais como a bromelina e a papana.
O kit do painel de identificao tem um diagrama que permite caracterizar
o(s) anticorpo(s); ele est composto por onze hemcias de doadores, genoti-
pados e fenotipados para os nove principais sistemas sanguneos Rh, Duffy,
Kell, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran e Xg , ou melhor, caracterizados para
os principais antgenos desses sistemas.
Estruturalmente, as colunas horizontais no diagrama caracterizam os antge-
nos presentes em cada doador das hemcias desse painel, apresentando seus
gentipos (sistema Rh) e fentipos (outros sistemas). As colunas verticais do
diagrama caracterizam o anticorpo em relao aos antgenos de cada sistema.
Alm disso, o diagrama fornece a reatividade qumica dos anticorpos em re-
lao s protenas usadas como a albumina, a antiglobulina e as enzimas
proteolticas. Em outros diagramas de outros fabricantes de painis, indica-se a
reatividade em relao temperatura de alguns anticorpos e sistemas.
8
Anticorpos frios, como mencionado, so os que se encontram a 4C; anticorpos quentes encon-
tram-se temperatura de 37C.
Assim, o fato de se ter o gentipo do paciente facilita a identificao de

um anticorpo do sistema Rh, pois possvel encontrar no diagrama quais os an-
tgenos que no existem no gentipo formado (coluna horizontal) e, com isso,
o anticorpo dever ser referente ao antgeno que o soro estudado no possui
em seu gentipo ou fentipo dos sistemas sanguneos existentes. Comparando
com as colunas verticais do diagrama das onze hemcias dos doadores, os ant-
genos presentes caracterizam o provvel anticorpo buscado, para identificao.
O conhecimento do fentipo tambm ajuda na identificao de outros
sistemas sanguneos da mesma forma descrita acima, pois diminui o nmero de
antgenos a serem consultados.
Como mencionado, o resultado dado de acordo com as aglutinaes for-
madas pelo anticorpo diante do seu antgeno, que deve estar entre as hemcias
tipadas do painel de identificao. Os que aglutinam so positivos e os que
no aglutinam, negativos.
4.7.10 Tcnicas de separao de anticorpos
Adsoro de anticorpos
Tem como objetivo adsorver (fixar) o anticorpo a fim de se obter um
soro puro, com ausncia do anticorpo absorvido. Nesse procedimento, so
utilizadas hemcias contendo o antgeno relacionado ao anticorpo a ser absor-
vido. Se quisermos, por exemplo, adsorver o anti-A do soro de um indivduo
do grupo B, utilizamos hemcias que contenham o antgeno A, ou seja, uma
hemcia do grupo A.
Essa tcnica de grande importncia na preparao de reativos imuno-
hematolgicos, auxiliando na identificao de anticorpos irregulares, pois por
meio dela possvel eliminar os anticorpos identificados na amostra e manter o
anticorpo a ser identificado.
Procedimento
1) Lavar as hemcias contendo os antgenos relacionados ao anticorpo a
ser adsorvido com soluo salina fisiolgica por 5 minutos, centrifugando a
3.000 rpm esse procedimento deve ser repetido pelo menos seis vezes;
2) Em um tubo, colocar uma parte de hemcias lavadas para duas partes

de soro ou plasma;
3) Deixar o tubo contendo o soro com hemcias em descanso por, no
mnimo, 30 minutos;
4) Centrifugar a 3.000 rpm por 5 minutos;
5) Separar o soro das hemcias e test-lo com hemcias tipadas contendo
o antgeno referente ao anticorpo, a fim de verificar se o mesmo foi total-
mente absorvido.
Resultado
O resultado deve ser sempre negativo para o antgeno formado. A posi-
tividade indica que o anticorpo ainda est presente e no foi retirado, sendo
necessrio realizar uma segunda absoro.
Observaes
1) Antes de fazer a adsoro de um anticorpo, necessrio avaliar o ttulo
(potncia) do mesmo com o seu antgeno respectivo, de forma que, ao
final da adsoro, possa fazer-se a comparao do soro absorvido, a fim de
se observar se houve ou no queda no ttulo do anticorpo.
2) Para se ter certeza de que j no existem anticorpos no soro ou plasma,
alm de verificar em tubo se houve ou no aglutinao das hemcias,
preciso observar a reao ao microscpio. Caso no seja visualizado ne-
nhum aglomerado de hemcias, e sim a sua disperso, o anticorpo estar
completamente absorvido.
Tcnica de eluio por ter

Procedimento
1) Lavar 2 a 3 mL de sangue total seis vezes; caso as hemcias tenham
sido obtidas de cordo umbilical, necessitaro de tantas lavagens quanto
suficiente para remover a geleia de Wharton; guardar a ltima soluo salina
de lavagem;
2) Retirar 2 mL de hemcias lavadas e suspender com 50% de volume
em soluo salina;
3) Adicionar ter em volume igual ao da suspenso;

4)Agitar vigorosamente o tubo, que deve estar bem fechado, por 15
segundos;
5) Misturar por inverso durante 1 minuto;
6) Remover a tampa cuidadosamente, para retirar o ter voltil;
7) Centrifugar a 3.000 rpm por 10 minutos;
8) Retirar cuidadosamente a camada formada no fundo do tubo, tendo o
cuidado de introduzir uma seringa conectada a uma agulha ou uma pipeta
de Pasteur para remover o eluato; introduzir a seringa ou a pipeta na cama-
da de estroma com suavidade;
9) Caso necessrio, centrifugar, durante 10 minutos, o eluato obtido, a fim
de retirar o estroma residual;
10) Colocar o eluato em banho-maria por 5 minutos a 56C ou por 15
minutos a 37C, at que o ter residual evapore; agitar, ocasionalmente,
com um basto, tendo o cuidado de que no se forme espuma; caso ocorra
precipitao de estroma, proceder centrifugao, retirando com cuidado
o sobrenadante, que ser o eluato, obtido sem resduo de ter ou estroma;
11) Usar o eluato para pesquisa de anticorpo irregular (PAI) no painel de
seleo e identificao; testar tambm, comparando, no painel de seleo,
a ltima soluo salina, reservada no passo 1, da lavagem das hemcias.
4.8. Controle de qualidade de reagentes usados em imuno-

hematologia
O controle de qualidade de reativos imuno-hematolgicos, tais como soros
e hemcias fenotipadas, tem como objetivo a avaliao dos reativos no que diz
respeito a avidez, ttulo, especificidade e potncia.
Avidez
Avalia a quantidade necessria de soro que depende da qualidade do
anticorpo especfico do material a ser testado para que ocorra uma reao
de aglutinao ntida.
Procedimento
1) Usar suspenso de hemcias lavadas trs vezes em soluo salina a 0,9%;
2) Preparar a suspenso de hemcias a 10% em soluo salina a 0,9%;
3) Colocar em uma lmina de 2x2 cm uma gota da suspenso de hemcias
e uma gota do reativo a ser testado;
4) Misturar as hemcias e o reagente com o auxlio de outra lmina ou
basto;
5) Acionar o cronmetro;
6) Observar e anotar o tempo de incio da reao;
7) Movimentar a lmina, de forma que as hemcias sofram mistura constante;
8) Observar o desenvolvimento da aglutinao durante 2 minutos;
9) Anotar os resultados em intensidade de cruzes (de 1 a 4).
Obs.: Para caracterizar boa avidez, o soro deve apresentar ao final desse
teste um escore de 10 a 12, correspondente a 4+.
Ttulo
O ttulo avaliado pelas reaes obtidas no soro que contm o anticor-
po, em diluies seriadas 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256,
1:512... , contra hemcias especficas. O resultado expresso pela reao
de maior diluio para uma reao de 1+.
Procedimento
1) Numerar tubos de hemlise 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128,
1:256, 1:512 e reserva;
2) Nos tubos 1 e 2, colocar 50 L do reagente;
3) Nos tubos 2 e posteriores, colocar 50 L de soluo salina a 0,9%;
4) Realizar diluies sucessivas do soro em soluo salina a 0,9% (1:2 a
1:512), transferindo 50 L de cada tubo para o tubo seguinte, at o tubo
reserva;
5) Aps a diluio, acrescentar a cada tubo 50 L das hemcias selecio-
nadas e homogeneizar levemente;
6) Centrifugar a 3.400 rpm por 15 segundos;
7) Anotar os resultados;
8) O resultado expresso pela reao de maior diluio para uma reao

de 1+;
9) Determinar o escore segundo o quadro 4.4.
Quadro 4.4. Escore das reaes de aglutinao

(utilizado na clnica e no controle de qualidade dos reativos).
Intensidade de aglutinao Escore de reao
4+ 12
3+ 10
2+ 8
1+ 5
W ou (+) 2
0 0
Especificidade
Especificidade uma caracterstica inerente ao anticorpo que o torna capaz
de reconhecer apenas as hemcias portadoras do antgeno correspondente.
A especificidade estabelecida testando antissoros (anti-A, anti-B, anti-AB)
com hemcias positivas e negativas em relao aos determinantes antignicos
especficos (A, B, AB).
O antissoro deve reconhecer somente o antgeno correspondente especi-
ficidade a que ele se prope.
Procedimento
1) Identificar quatro tubos de hemlise da seguinte maneira: A, B, I e II;
2) Adicionar em cada tubo duas gotas do soro a ser testado e uma gota
de sua respectiva hemcia fenotipada (A, B, I e II);
4) Fazer a primeira leitura;
5) Dar continuidade mediante a utilizao da tcnica de Coombs indireto.
Obs.: Para que o soro seja especfico, ele s deve aglutinar no tubo que
contenha o seu antgeno-alvo. Em caso de soro anti-D ou de soros raros, deve-
se, alm de test-lo pela tcnica acima, proceder identificao do anticorpo
correspondente ao soro indicado pela tcnica de Coombs indireto, mediante
a identificao de anticorpos irregulares (IAI).
Potncia
A potncia de um soro verificada por meio da titulao do seu anticorpo.
Procedimento
1) Numerar dez tubos de 1 a 10 para fazer a titulao de 1:2 at 1:1.024;
2) Adicionar mais um tubo (nomeando-o remanescente), no qual sero
gotejadas as ltimas trs gotas aps a titulao, e cujo contedo servir para
dar continuidade titulao, caso necessrio;
3) Adicionar trs gotas de soluo salina em todos os tubos, exceto no
remanescente;
4) Adicionar trs gotas do soro a ser testado no primeiro tubo;
5) Passar trs gotas do primeiro tubo para o segundo, homogeneizando
delicadamente a soluo, para que no forme espuma (agente dispersante);
6) Repetir o processo at o ltimo tubo;
7) Adicionar em cada tubo, exceto no remanescente, uma gota de hemcia
tipada especfica para o soro testado;
9) Fazer a leitura, anotando o escore de cada aglutinao; o tubo corres-
pondente ao ttulo menor ser o ltimo a apresentar aglutinao visvel.
Obs.: Quando se testa soro anti-D ou outros soros albuminosos, a titula-
o obtida com albumina bovina a 22%, e no com soluo salina.
4.9. Controle das hemcias fenotipadas
Devem ser realizados os testes descritos acima, juntamente com a classifica-

o ABO e Rh, alm do teste de Coombs direto, para certificar-se de que as
hemcias no possuem anticorpos contaminantes em sua estrutura.
4.10. Controle da albumina bovina a 22%
Dosar por mtodos bioqumicos as protenas totais e a albumina, e proce-

der ao teste de especificidade, pois esse reativo no deve apresentar nenhum
tipo de anticorpo ou antgeno.
4.11 Hemocomponentes usados em hemoterapia
Na hemoterapia, so usados dois grupos de elementos para a transfuso:

hemocomponentes e hemoderivados. Os primeiros consistem em concentra-
dos especficos, obtidos por mtodos fsicos (centrifugao, congelamento e
descongelamento) e afrese. Os segundos abrangem os derivados sanguneos
produzidos por processos fsico-qumicos, mediante a industrializao de fra-
es do plasma: albumina, imunoglobulinas e fatores da coagulao fator
VII, fator VIII, fator IX , alm de complexos protrombnicos.
4.11.1 Principais hemocomponentes utilizados em hemoterapia
Neste item sero abordados os hemocomponentes preparados mediante

processos fsicos (centrifugao, congelamento e descongelamento) nos bancos
de sangue. Todos esses hemocomponentes devem passar por rigoroso controle
de qualidade, a fim de serem monitoradas todas as suas etapas de produo.
Concentrado de hemcias
O concentrado de hemcias (CH), de colorao vermelho-escura, pode
ser obtido de uma unidade de sangue total (ST), em bolsa de coleta simples
ou no, por meio de puno venosa, sendo centrifugado posteriormente. Seu
volume varia de 220 mL a 280 mL. Deve ser preparado logo depois da coleta
do sangue total ou at 8 horas aps a mesma, no mximo. Quando coletado em
locais mais distantes, a bolsa de sangue total deve ser armazenada, imediatamente
aps a coleta, temperatura de + 4C a 2C, a fim de serem conservados
os fatores de coagulao. Visando minimizar a hemlise, as bolsas devem ser
transportadas suspensas, em cestas de metal adequadas a esse fim.
A transfuso de concentrado de hemcia deve ser realizada visando tratar
ou prevenir iminente e inadequada liberao de oxignio (O2) para os tecidos,
como em casos de anemia ou em hemorragias agudas.
De modo geral, a transfuso deve ser feita por indicao mdica, principal-
mente nos casos em que o paciente esteja precisando de oxignio tecidual.
Plasma fresco congelado

O plasma fresco congelado (PFC) constitudo de sdio, potssio, glico-
se, citrato, lactato e fator VIII. O plasma separado de uma unidade de sangue
total por centrifugao e totalmente congelado at 8 horas depois da coleta.
O plasma deve ser armazenado temperatura de, no mnimo, 20C a
temperatura ideal de 30C. O tempo de validade do PFC varia de acordo
com a temperatura em que foi armazenado.
So restritas as indicaes do plasma fresco congelado para uso teraputi-
co, pois se leva em conta o risco de transmisso de doenas virais e a existncia
de hemoderivados. Est indicado no tratamento de algumas coagulopatias
(distrbios de coagulao) e desordens hemorrgicas, atribudas quase
sempre a defeitos da coagulao e/ou plaquetas, e nas deficincias de
baixas protenas totais.
Plasma isento de crioprecipitado

o plasma obtido sem o crioprecipitado (fator VIII), o qual foi retirado
ainda em sistema fechado. Esse plasma deve ser armazenado temperatura
igual ou inferior a 20C, e pode ser consumido em at cinco anos. Em geral,
recomendado para indivduos com dficit de albumina.
Crioprecipitado
O crioprecipitado (crio) uma fonte concentrada de algumas protenas
plasmticas insolveis temperatura de 1C a 6C. O crioprecipitado contm
fator VIII, fator de von Willebrand, fibrinognio, fator XIII e fibronectina.
preparado a partir do descongelamento do plasma fresco congelado (PFC),
temperatura de 1C a 6C, por 18 a 24 horas. Depois de descongelado,
o plasma centrifugado; o sobrenadante, que nada mais do que o plasma
isento de crio, transferido para outra bolsa, deixando-se nela a protena
precipitada com 10 a 15 mL de plasma. O crioprecipitado deve ser imedia-
tamente congelado temperatura de 20C ou inferior.
O crioprecipitado pode ser utilizado para tratar deficincias de fator VIII
e de fibrinognio.
Concentrado de plaquetas (CP)

O concentrado de plaquetas (CP) pode ser obtido a partir de unidade
de sangue total (ST), coletado em bolsa tripla, ou por afrese. Para a ob-
teno de concentrado de plaquetas, recomendado o tempo mximo de
doao de 12 minutos. Para a preparao do concentrado de plaquetas, o
sangue total deve ser armazenado temperatura de 20C a 24C, e deve ser
preparado at 8 horas aps a coleta do sangue total.
A transfuso de plaquetas usada em pacientes com baixa contagem de
plaquetas (plaquetopenia) e disfuno plaquetria que apresentam san-
gramento ativo (uso teraputico) ou que se encontrem em risco srio de
apresentar sangramento.
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imunologia eritrocitria. Rio de Janeiro: Editora Mdica e Cientfica, 1999.
Este livro foi impresso pela Suprema Grfica Editora, para a Escola
Politcnica de Sade Joaquim Venncio e o Instituto Oswaldo Cruz, da
Fundao Oswaldo Cruz, em outubro de 2013. Utilizaram-se as fontes
Geometr231 BT e Geometr415 MT na composio, papel plen bold
70g/m2 no miolo e carto supremo 250g/m2 na capa.

Bioquímica, Bio Molecular e Hematologia Resumo FioCruz

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Captulo 2. Biologia molecular.......................................133

Captulo 4. Hemoterapia bsica

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Quando Joaquim Venncio faleceu em 27 de agosto de 1955, teve seu

Os captulos oferecem a histria da tcnica, os seus fundamentos, a maneira

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As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem como

e os professores realizam permanentemente parcerias entre si. Muitos de ns,

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1.1 Introduo s biomolculas

A bioqumica a cincia que congrega o estudo da qumica e da biologia.

da metade do peso seco das clulas. Os cidos nucleicos so os responsveis

Quadro 1.1. Mtodos de anlise de biomolculas.

A gua uma substncia fundamental para a vida no planeta. As inmeras

Em termos percentuais, aproximadamente 75% da massa de um indivduo

Figura 1.1. Estrutura qumica da molcula da gua e ligaes

1.2.2 Sais minerais

Os sais minerais participam de inmeras reaes qumicas que ocorrem no

Quadro 1.2 Principais funes bioqumicas dos ons.

As protenas, substncias essenciais para os seres vivos, so constitudas

cadeia lateral). Todas as protenas existentes so formadas pela combinao

Figura 1.2. Frmula geral de um aminocido.

Quadro 1.3. Classificao dos aminocidos segundo a sua necessidade.

De acordo com as suas cadeias laterais, os aminocidos podem ser classifica-

Em solues aquosas, os aminocidos esto ionizados, podendo agir como

Figura 1.3. Curva de titulao da glicina.

Os aminocidos ligam-se entre si por meio das ligaes peptdicas, for-

Figura 1.4. Ligao peptdica.

A maioria das protenas contm apenas aminocidos em sua estrutura, po-

Figura 1.5. Estrutura primria de uma protena.

A estrutura secundria uma estrutura tridimensional formada mediante

Figura 1.6. Estruturas secundrias organizadas das protenas.

As protenas globulares so protenas com estrutura terciria bem definida.

Figura 1.7. Estrutura terciria da cadeia de globina mostrando grupamento heme.

Quando a protena se encontra em sua conformao mais estvel ou seja,

Figura 1.8. Estrutura quaternria da hemoglobina mostrando os grupos hemes.

A grande variedade de funes exercidas pelas protenas no organismo