Prctica: Evaluacin de la Integridad de la Membrana

Plasmtica del Espermatozoide

Objetivos:
a) Evaluar como la membrana plasmtica responde a soluciones de diferente Tonicidad.

Teora:
Las membranas son sistemas bio (fsico) qumicamente activos, responsables de
fenmenos tales como el transporte selectivo de molculas. Adems membranas diferentes
a menudo presentan diferentes caractersticas de permeabilidad, de all que el proceso de
transporte a travs de las membranas puede ocurrir de acuerdo a diferentes mecanismos.
Cuando se expone la parte extracelular de un espermatozoide a soluciones de
diferente tonicidad, el espermatozoide responder en un intento de llegar al equilibrio
osmtico. La cola del espermatozoide es especialmente susceptible a cambios de
osmolaridad; as por ejemplo en un schock hipo-osmtico, al principio la cola se hinchara,
como respuesta al transporte de agua, lo cual a su vez es un indicador de la integridad
funcional de la membrana.
Se considera una muestra normal de espermatozoide cuando el porcentaje de colas
hinchadas es mayor del 60%.

Material y Reactivos:
1. Microscopio compuesto
2. Contmetro
3. Bao de mara a 37C
4. Fructosa
5. Citrato de sodio
6. Buffer Isotnico, Fosfato de Dulbecco (DPB), mg/L, 280-285 mOsm/Kg de agua.
Reactivo A
7. Perxido de hidrgeno al 30% en DPB. Reactivo B
8. Buffer Hipo-Osmtico, 150mOsmol/Kg agua. Reactivo C

Procedimiento:
Montar el siguiente set de trabajo:
Reactivos Tubo N1 Tubo N2 Tubo N3 Tubo N4
Reactivo A (mL) 0,9 ---- ---- ----
Reactivo B (mL) ---- 0,5 ---- ----
Reactivo C (mL) ---- ---- ---- 0,9
Muestra de Semen (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1
Mezclar. Incubar a 37C/ 30 min.
Retirar los tubos
Reactivo C (mL) --- 0,9 0,9 ---
Mezclar. Incubar a 37C/ 30 min
Mg. ANA GUTIRREZ ROMN 1
LBBM - FCCNM- UNFV anaisabelflor@gmail.com
a) De los tubos 1 y 4 se extrae una gota de cada uno de los tubos y se coloca en una
lmina porta-objeto, por separado y se cubre con una laminilla cubre-objeto.
b) Observar en el microscpio, y contar en varios campos los espermatozoides con colas
hinchadas as como aquellos que no se hincharon, hasta completar un nmero de 100
espermatozoides.
c) Al trmino del tiempo indicado, se retiran los tubos 2 y 3 y se procede como los pasos
a) y b).

Tabla de Cambios Morfolgicos Inducidos

A B C D E F G

Total
Esporas
Esporas por
categora

% del total
100

Comentarios Adicionales:...................................................................
Fecha: .....................Analista:.............................Cdigo:...................
El resultado de la prueba se expresa como el porcentaje de espermatozoides con cola
hinchada en relacin al total de espermatozoides examinados. Se considera normal al
individuo cuando ms del 60% de espermatozoides presentan hinchamiento de la cola
despus del estmulo hiposmtico.

En la tabla de cambios morfolgicos inducidos, se deber colocar el nmero de

espermatozoides que se contaron para cada categora de espermatozoides observados de
acuerdo a la morfologa que presenten. En a seccin de comentarios, se debe explicar si la
muestra observada tiene una respuesta al estmulo hiposmtico normal o anormal.

Referencias Bibliogrficas
Caiza de la C., F. Pujol, M.; Rigau, T.; Bonet, S.; Mir, J.; Briz, M.; Rodriguez-Gil, J.
1997. Resistance to osmotic stress of horse spermatozoa: The role of ionic
pumps and their relationship to cryopreservation success. Theriogenol. 48:947-
968.
Correa, JR.;Zavos,P.M. 1994. The hipoosmotic swelling test: its employment as an
assay to evaluate the functional integrity of the frozen-thawed bovine sperm
membrane. Theriogenol. 42:351-360.

Mg. ANA GUTIRREZ ROMN 2

LBBM - FCCNM- UNFV anaisabelflor@gmail.com
Fuller, S.; D. Whittingham. 1997. Capacitation-like changes occur in mouse
spermatozoa cooled to low temperatures. Mol. Reprod. Dev. 46: 318-324.
Jeyendran, R.S.; Van der, HH.; Prez-Pelez, M.; Crabo, BJ.; Zaneveld, LJ. 1984.
Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm
membrane and its relationship to other semen characteristics. J. Reprod. Fertil.
70:219-228.
Madrid-Bury, N. 2004. Relacin entre los mtodos de valoracin seminal in vitro y la
fertilidad in vivo del semen descongelado de toros frisones. Universidad
Complutense de Madrid. Espaa. Tesis Doctoral. 1-164 pp.

Mg. ANA GUTIRREZ ROMN 3

LBBM - FCCNM- UNFV anaisabelflor@gmail.com