Diagnostico microbiolgico

El diagnstico microbiolgico es el conjunto de procedimientos y tcnicas complementarias

empleadas para establecer la etiologa del agente responsable de una enfermedad infecciosa y
poder as proceder a su tratamiento y a tomar, en caso de que fuera necesario, las medidas
correspondientes para evitar la diseminacin del patgeno. Para llevarlo a cabo, se parte de la
informacin acumulada por el mdico y que se recoge en la historia clnica del paciente en
forma de sntomas, signos y diagnstico clnico ms probable a su entender.
El diagnstico microbiolgico en bacteriologa puede clasificarse en distintos tipos:

Directos: Implican la demostracin del agente patgeno, sus metabolitos o alguno de sus
componentes antignicos en los fluidos orgnicos del paciente.

Indirectos: Implican la demostracin de la huella que el agente patgeno ha dejado en su

contacto con el sistema inmunocompetente del paciente.
A la hora de llevar a cabo la identificacin es imprescindible la labor del laboratorio, que nos
aportar datos preliminares o definitivos sobre los agentes patolgicos causantes de la
afeccin. Para ello, se lleva a trmino un procedimiento ordenado que comprende:

1.- Toma de muestras (esputo, sangre, heces, orina, tejido, LCR, etc) que dependern de la
sospecha de procedencia de la afeccin.

2.- Observacin al microscopio, si procede, de la muestra (fresco, coloracin )

3.- Cultivo: Obtencin de colonias aisladas.

4.- Identificacin del gnero y de la especie mediante test bioqumicos, genticos,

inmunolgicos.

5.- Test de sensibilidad (punto de corte, MIC).

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1.- A la hora de tomar las muestras microbiolgicas, debemos de hacerlo con el mayor rigor
posible, siendo para ello muy importante el cumplimiento de los siguientes requisitos que
permitirn garantizar el resultado correcto del estudio:

1. Elegir el material que refleje el proceso patolgico.

2. Evitar contaminacin con la flora del paciente.
3. Obtener volumen suficiente para observacin microscpica y cultivo.
4. Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia antimicrobiana.
5. Transportar la muestra rpidamente al laboratorio.

Las muestras deben ser identificadas con una etiqueta adherida al envase y los datos anotados
deben coincidir exactamente con los de la solicitud de examen dado por el mdico tratante.
Una vez tenemos las muestras adecuadas, podemos comenzar a realizar las tcnicas
diagnsticas correspondientes. Dentro del diagnstico microbiolgico incluiremos:

A.- Mtodos Directos:

Observacin microscpica
Cultivo e Identificacin
Tcnicas Inmunolgicas: inmunofluorescencia, aglutinacin, ELISA
Tcnicas moleculares: hibridacin molecular (PCR)

2.- Examen microscpico (fresco, tincin): La visualizacin de los microorganismos

patgenos es la tcnica ms evidente. Sin embargo, debido a su pequeo tamao y a la
similitud estructural existente entre algunos de ellos, se generan numerosas complicaciones.
Para evitar el problema del tamao, se utilizan sistemas de ampliacin de imagen como
microscopios. Las tinciones diferenciales y especficas, nos permitirn paliar el problema de la
similitud.
Habitualmente, la visin microscpica de los agentes patgenos no nos ofrecer un diagnstico
definitivo, sino una orientacin diagnstica.

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Los microscopios pticos permiten ver bacterias, hongos y protozoos. Para ver virus es
necesaria una resolucin mucho mayor que slo alcanza el microscopio electrnico.
Tincin de gran : A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tincin de gram es la
ms utilizada en el diagnstico microbiolgico. De tal modo que la informacin que ofrece de la
composicin de la pared bacteriana es la base de todas las clasificaciones en este reino. Se
trata de una tincin diferencial que distingue entre bacterias con pared gruesa (gram
positivas= teidas de violeta) y bacterias con pared fina y membrana externa (gram
negativas= tie de rojo). Sin embargo, no todas las bacterias se tien mediante esta tcnica,
ya que hay algunas que son resistentes a ella, como las que se nombran a continuacin:-
Mycobacterias, ya que estn encapsuladas- Mycoplasmas, porque no tienen pared - Formas L,
por la prdida ocasional de la pared

Gram negativas (fucsia) Gram positiva(azul)

Tincin de Ziehl-Neelsen: Tambin es una tincin diferencial. Se denomina tincin cido-

alcohol resistente y es especfica para unas bacterias con estructura de pared nica, las
micobacterias. La pared de las micobacterias no est basada en peptidoglicano como las
bacterias gram positivas y gram negativas, sino en cidos miclicos. Esta particularidad las
hace resistentes a la decoloracin con cido y alcohol que no se produce en casi ningn otro
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tipo bacteriano. La tincin de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la

fucsina que tie toda la preparacin de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la
preparacin con el colorante. La solucin decolorante elimina el colorante primario excepto el
los bacilos cido alcohol resistentes. (BAAR). Por ltimo el azul de metileno tie de azul el resto
de la preparacin. Esta tincin es til en la deteccin de bacterias del gnero Micobacterium en
muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnstico
casi definitivo de tuberculosis.

3.- Crecimientos en cultivos e identificacin: Denominamos cultivo al proceso de laboratorio

por el que se induce el crecimiento cuantitativo de los agentes patgenos. Para conseguir su
crecimiento de manera artificial es necesario un aporte nutritivo suficiente as como las
condiciones fsicas adecuadas para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de cultivo.
Por lo general, todos los microorganismos necesitan unos elementos imprescindibles que
incluyen fuentes de energa, de carbono, algunas sales y elementos y por supuesto agua.
Algunos requieren adems otras sustancias adicionales como vitaminas o aminocidos
esenciales para cada especie. Al igual que ocurre con su nutricin, no todos necesitan las
mismas condiciones fsicas para crecer, por lo que hay que individualizar la temperatura, la
humedad, el pH y otras caractersticas si queremos que nuestros cultivos salgan adelante.
En los laboratorios de microbiologa podemos encontrar medios de cultivo lquidos y slidos.

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Inmunofluorescencia directa (ID): Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms

difundido en el laboratorio clnico. El principio bsico de la inmunofluorescencia directa .
Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan
secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especficos marcados con isotiocianato de
fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos
(Ag) . La reaccin antgeno anticuerpo (Ag-Ac) se visualiza con el microscopio de fluorescencia,
por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana. Sin embargo la realizacin de la
reaccin es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio
de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnstico certero, as
como una recoleccin y preparacin de la muestra adecuada.
Aun as, el mtodo, en manos de una persona con experiencia resulta til para la identificacin,
ya que nos proporciona un diagnstico etiolgico en el curso de una jornada de trabajo.
Adems puede estudiar varias muestras simultneamente.

TEST DE AGLUTINACION El test de aglutinacin es un mtodo simple, de un solo paso,

que a veces se usa para la deteccin de antgenos en muestras clnicas. Los ensayos de
aglutinacin, dependen de la fijacin inicial de anticuerpos especficos sobre eritrocitos o
partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga
el antgeno y las partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente. Estas
pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al
elevado porcentaje de reacciones inespecficas.

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ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA) Los EIA para la deteccin de antgeno se basan

habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida,
en general el pocillo de una microplaca o una pequea esfera de plstico. El antgeno presente
en la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno se
detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima. La enzima
conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas vara. En
la reaccin con la peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto
qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un color caracterstico.
Por esta tcnica se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida y automatizada,
no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen
por medio de espectrofotmetros especialmente diseados (lectores de ELISA) , siendo
entonces una tcnica ms objetiva.

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Una nueva tcnica, llamada Reaccin

en Cadena de la Polimerasa (PCR), para incrementar el nmero de molculas de DNA blanco
en las muestras. La tcnica consiste en la deteccin de microorganismos. Recordemos que
cuenta con su propio acido nucleido, lo que permite disitinguirlos a travs de un fragmento de
acido nucleido sintetizado y marcado, denominado SONDA, que posee una secuencia
complementaria a las secuencias especificas buscadas . Esta sonda adems puede ser
marcada con sustancias radioactivas, fluorescentes u otros marcadores. Tiene una sensibilidad
tan alta que puede amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia de genes puede ser
extrada.

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B. Mtodos indirectos: Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o

celular) por parte del husped: . Deteccin de anticuerpos especficos por tcnicas
inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin de anticuerpos in vitro.
Evidencia indirecta del crecimiento, en lugar de buscar el antgeno busca el anticuerpo (AC)
la huella inmunolgica que el agente microbiano dejo en el organismo.
En el curso de una infeccin varan las poblaciones de anticuerpos frente al agente
infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el
transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentracin
residual y, en cambio, aumentan las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM es de
utilidad para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola muestra de suero
extrada en el perodo agudo de la enfermedad.
La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces o ms observado
en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra se obtendr en el perodo agudo
de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 das despus de la primera, en el perodo de
convalesencia.
La seroconversin es til para establecer el diagnstico retrospectivo, pero no para el
diagnstico temprano de una infeccin, puesto que debemos esperar al perodo de
convalecencia para obtener la segunda muestra del suero.

Mtodos:
- I. F.I
- ELISA indirecta

Inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una variante de IF que mide la cantidad de

anticuerpo en una muestra.

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WESTERN BLOT (WB)

Las tcnicas inmunolgicas de Inmunoblot estn encontrando amplias aplicaciones en el

diagnstico virolgico. Son particularmente tiles para el diagnstico del HIV.
La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son
posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la
presencia de anticuerpos especficos contra cada una de esas protenas.

3.- Test de sensibilidad:

Pruebas de sensibilidad Antimicrobiana: para bacterias
El antibiograma es la prueba microbiolgica que se realiza para determinar la
sensibilidad de una colonia bacteriana a un antibitico o grupo de antibiticos.
El antibiograma, una vez realizado, da la siguiente informacin:
Grado de sensibilidad de la colonia bacteriana a un determinado antibitico.
Diferencia de sensibilidad por parte de la colonia a diferentes antibiticos.
Con esta informacin, se clasifica el efecto del antibitico sobre esa determinada
colonia en: Resistente (R), Intermedio (I) y Sensible (S).
En el mbito clnico, el estudio sobre la bacteria causante de la infeccin y sobre el
antibiograma es entregado al mdico responsable del paciente. Este ltimo es quien se
encarga de decidir el tipo de antibitico adecuado, dependiendo de los resultados del
antibiograma y de otros factores procedentes del paciente, como por ejemplo alergia a la
penicilina.
La cuantificacin de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evala
habitualmente mediante algunas de las variantes de los mtodos de dilucin. La Concentracin
Mnima Inhibitoria (CIM) se define como la mnima concentracin de antimicrobiano (en g/mL)
que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo despus de 24 horas de incubacin a
37C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros mtodos que evalan
susceptibilidad antimicrobiana; adems de confirmar resistencias inusuales, da respuestas
definitivas cuando el resultado obtenido por otros mtodos es indeterminado
La Concentracin Mnima Bactericida (CBM), se define como la mnima
concentracin de antimicrobiano que elimina a ms del 99,9% de los microorganismos viables

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despus de un tiempo determinado de incubacin (generalmente 24 horas) (8,9). En ocasiones

se hace necesario determinar la actividad bactericida de un agente antimicrobiano, como es el
caso de endocarditis, osteomielitis, meningitis o infecciones en pacientes inmunosuprimidos,
existe la necesidad de establecer mtodos de laboratorio que definan la actividad de estos
agentes

Pruebas de sensibilidad a antifngicos tienen como objetivo conocer si los microorganismos

ensayados son sensibles o resistentes a los antifungico y sirven para elegir de forma
ptima el tratamiento .

Prueba de sensibilidad antivirales: es realiza igual con antiretrovirales

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