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XIX SIMPSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS

X SIMPSIO DE HIDRLISE ENZIMTICA DE BIOMASSAS


30 de julho-02 de agosto de 2013
Foz de Iguau, PR, Brasil

AUMENTO DA ESTABILIDADE TRMICA DE DUAS LIPASES DE


Fusarium verticillioides: PURIFICAO EM CASCATA E
IMOBILIZAO EM SUPORTES HIDROFBICOS

F.D.A. FACCHINI1, M.P. GIMENEZ2, A.C. VICI1, M. FILICE3, B.C. PESSELA3, J.M.
GUISAN3, M.L.T.M. POLIZELI2
1
Universidade de So Paulo, FMRP, Departamento de Bioqumica e Imunologia
2
Universidade de So Paulo, FFCLRP, Departamento de Biologia
3
Universidad Autonoma de Madrid, Consejo Superior de Investigacines Cientficas
E-mail para contato: f.facchini@usp.br

RESUMO as lipases so um grupo de enzimas com importante potencial biotecnolgico,


devido a sua ampla capacidade cataltica. Dentro desse contexto, o objetivo desse trabalho foi
imobilizar e purificar duas lipases secretadas no extrato bruto do fungo Fusarium
verticillioides quando cultivado em fermentao submersa. Para tanto, as duas lipases do
extrato bruto foram imobilizadas em diferentes suportes hidrofbicos, dessorvidas com Triton
X-100 0,3-0,5% e purificadas. As lipases apresentaram massas moleculares estimadas de 30
kDa e 65 kDa, aproximadamente. Ambas obtiveram taxa de reteno no suporte octil e
decaoctil de 74,3%. As lipases imobilizadas mostraram estabilidade trmica maior quando
comparada a enzima livre (imobilizada em CNBr), aumentando a gama de aplicaes
biotecnolgicas.

1. INTRODUO
A aplicao de catalisadores nas indstrias vem aumentando medida que avanos
tecnolgicos propiciam o surgimento de novas enzimas ou novas aplicaes. Dentre os
diversos catalisadores existentes, as lipases so bastante conhecidas por suas diferentes
aplicaes e tambm pela incrvel quantidade de reaes que podem catalisar. As lipases so
de grande interesse na qumica orgnica devido a sua ampla especificidade para diferentes
substratos, em alguns casos, com alta regio e enantioseletividade. Estas propriedades as
tornaram muito utilizadas nos processos de biotransformaes (Kamal et al., 2002).

Os processos de imobilizao em suportes hidrofbicos tem sido importantes para a


purificao e separao de diversas lipases. Neste contexto, quando estas enzimas so
adsorvidas nestes suportes, e esto em equilbrio com o sistema, algumas propriedades
catalticas podem ser alteradas, como a estabilidade trmica (Palomo et al., 2004; Cunha et
al., 2009). Assim, uma vez que a imobilizao de lipases assume um importante papel na
biotecnologia aplicada, o objetivo desse estudo foi imobilizar e purificar as lipases do fungo
Fusarium verticillioides utilizando para essa finalidade a imobilizao em diferentes suportes
hidrofbicos, visando aumentar a estabilidade das mesmas para possveis aplicaes
biotecnolgicas.

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1 Produo de lipase por F. verticillioides


XIX SIMPSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS
X SIMPSIO DE HIDRLISE ENZIMTICA DE BIOMASSAS
30 de julho-02 de agosto de 2013
Foz de Iguau, PR, Brasil

O meio de cultura utilizado para crescimento do fungo e produo de lipase foi


composto por peptona 0,2%, MgSO4 0,05%, fosfato de sdio monobsico 0,1% e leo de
girassol 1%, incubados a 30C, 100 rpm. O filtrado denominado FVL (Fusarium
verticillioides lipase) foi submetido a ensaios enzimticos para determinar a atividade
lipoltica e a quantidade de protena.

2.2 Ensaio enzimtico e quantificao de protena


A atividade enzimtica foi estimada cineticamente atravs do aumento da absorbncia
a 348nm, durante 5 minutos, onde se determina a absorbncia do p-nitrofenol liberado pela
hidrlise de p-nitrofenil butirato (pNPB). A unidade (U) est definida como a quantidade de
enzima necessria para hidrolisar um mol do substrato em um minuto (mols/min), nas
condies de ensaio. A quantificao de protenas foi determinada de acordo com o mtodo
descrito por Bradford (1959).

2.3 Adsoro da FVL em suportes hidrofbicos


A adsoro foi realizada nos suportes Butil Toyopearl, Hexil Toyopearl e Fenil
Toyopearl, Octil Sepharose e Decaoctil Sepabeads (C18). 1g de cada suporte foi adicionado a
10 mL de uma soluo de FVL em tampo fosfato de sdio 10 mM, pH 7,0 (1:1 v/v), a 25C,
durante o tempo necessrio para se estabilizar a adsoro. Periodicamente, eram retiradas
alquotas da suspenso e sobrenadante, e dosadas a atividade lipoltica at estabilizao da
imobilizao.

2.4 Purificao da FVL


Para a purificao da FVL foram selecionados os dois suportes hidrofbicos com os
melhores resultados de adsoro. Dessa forma, foi realizada uma purificao sequencial na
qual 10 mL de extrato bruto equilibrado em tampo fosfato de sdio 10 mM, pH 7,0 (1:1 v/v)
foram adicionados a 1 g do suporte octil Sepharose. Em seguida esse mesmo sobrenadante foi
adicionado a 1 g do suporte C18 at estabilizao da imobilizao. Ambos os derivados foram
lavados com gua destilada, seguido de uma concentrao baixa de Triton X-100 e filtrados.
Para verificar se esse procedimento de purificao era vlido, foi realizado um gel de
eletroforese SDS-PAGE 12% (Laemmli, 1970). Para isso, 0,1 g de derivado foi ressuspendido
em 0,5 mL de tampo de ruptura e fervido por 5 minutos. O sobrenadante foi imediatamente
retirado para a anlise eletrofortica. O gel foi corado com nitrato de prata.

2.5 Imobilizao em CNBr e estabilidade trmica dos diferentes derivados


Foi realizada uma imobilizao em CNBr, a 4C, durante 15 minutos, de modo a
comparar os derivados com a enzima livre. Em seguida, as diferentes preparaes foram
incubadas em tampo fosfato de sdio 25 mM, pH 7,0, de 40C a 60C para medir a
estabilidade trmica. Alquotas foram coletadas em tempos de 1, 2, 4, 6 e 24 horas com uma
ponteira cortada e sob intensa agitao de forma a obter uma amostra homognea da
suspenso. A atividade lipoltica foi medida imediatamente aps a coleta como previamente
descrito.

3. RESULTADOS E DISCUSSO
3.1 Imobilizao em suportes hidrofbicos
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A imobilizao do extrato bruto em suportes hidrofbicos foi utilizando baixa fora


inica (10 mM tampo fosfato de sdio, pH 7,0). Os melhores resultados foram obtidos com
os suportes mais hidrofbicos octil e decaoctil como indicado na Tabela 1.

Tabela 1 - Imobilizao do extrato bruto de F. verticilliodes em suportes hidrofbicos

Suporte Protena oferecida Imobilizao Protena imobilizada


(g/L) (%) (g/L)
Butil Toyopearl 43,0 28,2 12,1
Fenil Toyopearl 80,0 50,0 40,0
Hexil Toyopearl 80,0 59,6 47,7
Octil Sepharose 50,0 74,3 37,1
Decaoctil Sepabeads 50,0 74,3 37,1

3.2 Purificao sequencial utilizando suportes octil e C18


Antes de iniciar o processo de purificao, constatou-se que aps a imobilizao no
suporte octil, o sobrenadante ainda apresentava atividade lipoltica. Estes resultados sugeriram
a presena de uma segunda lipase no extrato bruto. Na sequencia, esta forma enzimtica
(lipase I) adsorveu em decaoctil, um suporte mais hidrofbico. Portanto, para a purificao
enzimtica, inicialmente o extrato bruto foi adicionado ao suporte octil Sepharose at
estabilizao da adsoro e em seguida, o sobrenadante foi adicionado ao segundo suporte
C18. Em seguida, ambos os derivados foram lavados com gua e incubados com diferentes
concentraes de Triton X-100 (dados no mostrados) de modo a testar a dessoro das
mesmas e chegar a uma concentrao na qual somente as protenas contaminantes fossem
dessorvidas. Assim, as lipases do Fusarium veriticillioides denominadas FVLI e FVLII foram
dessorvidas com 0,3% e 0,5% de detergente. Para visualizar se as mesmas se encontravam
puras nos derivados, foi realizada uma nova imobilizao e uma dessoro utilizando uma
concentrao mais baixa de Triton X-100 de forma a dessorver as protenas contaminantes e
em seguida, foi realizado um gel de eletroforese em condies desnaturantes (SDS-PAGE)
mostrado na Figura 1.

Figura 1 SDS-PAGE 12% referente purificao das lipases corado com prata (M- marcador
molecular; 1- Extrato bruto; 2- Derivado Octil; 3-Derivado decaoctil; 4-Sobrenadante decaoctil).

A Figura 1 indica que a lipase proveniente do suporte octil foi purificada, com massa
molecular aproximadamente de 30 kDa. A lipase proveniente do C18, com massa molecular
aproximada de 65 kDa, foi parcialmente purificada devido presena de um contaminante de
massa molecular muito prxima.
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3.3 Estabilidade trmica dos derivados


A Figura 2 mostrou que a imobilizao da FVL1 aumentou de 20 a 40% a estabilidade
enzimtica, a 40 e 50C, quando comparadas com a enzima livre representada pelo CNBr. A
60C apenas o suporte octil foi estvel at 50% em 4h. Dessa forma, os suportes octil e C18
estabilizaram melhor as lipases, uma vez que os outros suportes por serem menos
hidrofbicos podem dessorver mais facilmente a enzima, devido ao aumento da temperatura,
e essa dessoro, consequentemente pode acarretar em uma mudana na estrutura da mesma,
apresentando uma menor estabilidade.

Figura 2 - Estabilidade trmica dos derivados hidrofbicos e CNBr. Smbolos: -- Butil; --


Hexil;-- Fenil; -- Octil, -- Decaoctil, -- CNBr FVL1, CNBr FVL2.

Contudo, a imobilizao das lipases foi fundamental para muitas aplicaes, pois
aumentou a estabilidade das enzimas. Alm disso, essa tcnica ainda permite melhorar as
propriedades catalticas das lipases, ampliando sua possibilidade de uso e tornando-as
indispensveis biotecnologia (Palomo et al., 2004).

6. REFERNCIAS
BRADFORD, M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein- Dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976.

CUNHA, A.G.; FERNNDEZ-LORENTE, G.; GUTARRA, M.L.E.; BEVILAQUA, J.V.;


ALMEIDA, R.V.; PAIVA, L.M.C.; FERNNDEZ-LAFUENTE, R.; GUISN, J.M.; FREIRE,
D.M.G. Separation and immobilization of lipase from Penicillium simplicissimum by selective
adsorption on hydrophobic supports. Appl Biochem Biotechnol. 156:563575, 2009.

KAMAL, A.; SANDBHOR, M.; RAMANA, K.V. One-pot lipase-catalyzed synthesis of enantiopure
secondary alcohols from carbonyl compounds: a new protocol for lipase mediated resolution.
Tetrahedron: Asymmetry. 13, 815-820, 2002

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nat. 227, 680-685, 1970.

PALOMO, J. M.; SEGURA, R. L.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; PERNAS, M. ; RUA, M. L.;


GUISAN, J. M.; FERNANDEZ-LAFUENTE, R. Purification, immobilization, and stabilization of
a lipase from Bacillus thermocatenulatus by interfacial adsorption on hydrophobic supports.
Biotechnol. Prog. 20, 630-635, 2004.