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Bioensaio toxicolgico utilizando Artemia salina: fatores envolvidos em

sua eficcia
Ariele Cardoso Bueno (1); Marcel Piovezan(2)

(1)
Discente; Instituto Federal de Santa Catarina, Campus Lages; Lages, Santa Catarina; arielecardoso@outlook.com
(2)
Docente; Federal de Santa Catarina, Campus Lages; Lages, Santa Catarina; marcel.piovezan@ifsc.edu.br

RESUMO
A toxicologia estuda o efeito de determinadas substncias em organismos vivos. O primeiro tipo de teste
toxicolgico a que so submetidos os compostos o agudo-letal, que consiste de uma anlise aps curta
exposio (24h 48h) do composto com o organismo bioindicador. Em toxicologia, dose letal mediana (DL 50
ou LD50, do ingls Lethal Dose) a dose necessria de uma dada substncia ou tipo de radiao para matar
50 % de uma populao em teste [normalmente medida em miligramas de substncia por quilograma de
massa corporal dos indivduos testados (mg/kg =ppm)]. A letalidade da Artemia salina utilizada para
identificar respostas biolgicas em diversas substncias, nas quais as variveis como a morte ou vida so
as nicas envolvidas. O presente trabalho teve como principal objetivo realizar o bioensaio toxicolgico com
Artemia salina em diferentes substncias. Utilizou-se a metodologia de Meyer e colaboradores (1982)
adaptada. Entretanto, diversos fatores ambientais como luz, umidade, temperatura e concentrao das
subtncias influenciaram na eficinicia dos resultados.
Palavra Chave: toxicologia; teste agudo-letal; DL50.
INTRODUO
A toxicologia envolve diversas reas, como, por exemplo, sociais,
biolgicas, qumicas e forense. A toxicologia estuda o efeito de determinadas substncias em organismos
vivos. Muitas pessoas utilizam diversas substncias sem ao menos ter conhecimento sobre as suas
propriedades. Segundo Machado (2008), o conceito de substncias txicas bastante relativo, pois depende
da dosagem e do indivduo.
Os testes de toxicidade so elaborados com o objetivo de avaliar ou prever os efeitos de substncias
txicas nos sistemas biolgicos e averiguar a toxicidade relativa das substncias que so preponderantes na
avaliao do ambiente (BAROSA, 2003). Dentre as vrias tcnicas existentes, sempre compreendem uma
srie de dados que podem ser obtidos por meio de microrganismos e animais de laboratrio ou seres
humanos, visando classificar a toxicidade de uma ou mais substncias qumicas. Em outras palavras trata-
se de um bioensaio preliminar, mas essencial no estudo de substncias com atividade biolgica a fim de
avaliar suas possveis interaes com o organismo (FREITAS DE OLIVEIRA, 2008).
O primeiro tipo de teste toxicolgico a que so submetidos os compostos o agudo-letal, que consiste
de uma anlise aps curta exposio (24h 48h) do composto com o organismo bioindicador, geralmente
ratos ou coelhos. Mas, os testes que utilizam esses animais apresentam desvantagens, como a grande
quantidade de amostras utlizadas e os custos elevados (RIOS, 1995; FREITAS DE OLIVEIRA, 2008; BARO -
SA, 2003). Em toxicologia, dose letal mediana (DL 50 ou LD50, do ingls Lethal Dose) a dose necessria de
uma dada substncia ou tipo de radiao para matar 50 % de uma populao em teste [normalmente medi -
da em miligramas de substncia por quilograma de massa corporal dos indivduos testados (mg/kg =ppm)].
Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), so consideradas txicas substncias que apresentam
DL50 abaixo de 1000 ppm em Artemia salina (MEYER et al., 1982).

A Artemia salina uma espcie de microcrustceo da ordem Anostraca, encontrado em guas salgadas
(CARVALHO et al., 2008). utilizada como alimento vivo para peixes, sendo seus ovos encontrados em lo-
jas de aquaristas. Essa espcie de microcrustceo marinho tem sido utilizada em experimentos laboratoriais
como um bioindicador, sendo o seu grau de tolerncia em relao a um fator ambiental reduzido e especfi -
co, de modo que apresenta uma resposta ntida frente a pequenas variaes na qualidade do ambiente
(ABEL, 1989). A letalidade desse organismo tem sido utilizada para identificao de repostas biolgicas, nas
quais as variveis como a morte ou vida so as nicas envolvidas (MEYER et al., 1982).

A Artemia salina (Figura 1) foi utilizada no projeto como o bioindicador. Ela utilizada em testes de toxici-
dade aguda devido sua capacidade para formar cistos dormentes, sua praticidade de manuseio e cultivo,
por ser um mtodo rpido e barato, aplicvel como bioindicador em uma avaliao toxicolgica pr-clnica
(FREITAS DE OLIVEIRA et al, 2008; CARVALHO, C. A. de. et al. 2009).
Diversos ensaios de toxicidade tm sido realizados testan-
do diferentes substncias, em Artemia sp (FOGUEL, 2010). A ca-
fena um frmaco, que pode ser descrito como um p branco ou
cristais aciculares que comporta-se como uma base fraca, pois
seus sais dissociam-se facilmente na gua (FARMACOPIA,
1996). A toxicidade e os efeitos adversos da cafena tm sido ob-
jeto de intensos estudos. O aafro-da-terra uma especiaria co-
nhecida, cultivada e apreciada desde a antiguidade em toda a ba-
cia mediterrnica, como corante, aromatizante e medicinal (FAR-
MA, 2000). Em trabalho realizado por Prez e colaboradora
(2001) o valor do DL50 para o dicromato de potssio foi de 12,5
mg L-1.O objetivo deste trabalho foi adaptar e aplicar um bioen-
saio toxicolgico utilizando Artemia salina como bioindicador para
avaliar a toxicidade da cafena, do dicromato de potssio e do ex-
trato aquoso de aafro-da-terra.
Figura 1. Artemia salina. Fonte: http://goo.gl/Vz8I77

METODOLOGIA

Ecloso dos ovos


Foi utilizada a metodologia de Meyer e colaboradores (1982) adaptada. Preparou-se uma soluo sali-
na (com sal grosso e gua mineral) na concentrao de 30 gL -1. O pH foi ajustado entre 8,0 9,0 adicio-
nando-se gotas de uma soluo 0,1 mol L -1 de NaOH. Os ovos de Artemia salina foram colocados para eclo-
dir na soluo salina, por 48 horas, com aerao constante e temperatura
controlada de 25 C em um aqurio para ecloso (Figura 2). Aps ecloso,
os nuplios de artemia foram alimentados com soluo de espirulina (fitoplncton).

Aps a ecloso dos ovos, cerca de dez larvas de Artemia


salina foram transferidas com uma micropipeta para tubos de en-
saio contendo a soluo salina e amostras a serem testadas em
diferentes concentraes (Tabela 1). O teste foiacompanhado de
controle negativo para cada substncia a ser testada. As subs-
tncias testadas foram soluo aquosa estoque 5000 ppm de:
cafena , K2Cr2O7 e aafro-da-terra todos e. Para cada concen-
trao testada foi realizada em triplicata. Todo material para reali-
zao do teste foram previamente lavadas e descontaminadas.
Figura 2. Aqurio para ecloso dos ovos de Artemia salina.

Tabela 1. Concentrao e volume das substncias testadas, volume de soluo salina e quantidade de Artemia salina.
Concentrao das Volume de soluo Volume de Quantidade de Artemia
Tubo de
substncias dassubstncias testadas soluo salina sp.
ensaio
testadas (mg kg-1) (mL) (mL) (unidades)
Controle 0 0 10,0 10
1 125 0,25 9,75 10
2 250 0,5 9,5 10
3 500 1,0 9,00 10
4 1000 2,0 8,00 10
5 1500 3,0 7,00 10

A contagem dos animais mortos e vivos foi realizada aps 24h (Tabela 2). A morte do microcrustceo
evidenciada pela sua sedimentao. Por se tratar de um crustceo ativo em gua salina, a falta de movi -
mento e sedimentao so os indicadores de morte do mesmo. Aps a contagem, calculou-se a mdia e o
desvio padro de acordo com cada concentrao e para os controles, seguido do clculo de porcentagem. A
LD50 deveria ser estimada a partir da regresso linear obtida da correlao entre a porcentagem de indiv -
duos mortos e a concentrao dos compostos testados.

RESULTADOS E DISCUSSO
Tabela 2. Mdia e porcentagem da quantidade de Artemias salinas mortas1
Concentrao de Mdia Mdia Mdia
Tubo de cafena K2CrO7 aafro
substncia testada cafena K2CrO4 aafro
ensaio (%) (%) (%)
(mg kg-1) (unidades) (unidades) (unidades)
Controle 0 7,3 1,16 7,3 1,16 7,7 0,59 0 0 0
1 125 10 10 9,0 1,4 36,9 36,9 16,8
2 250 9,7 0,82 10 9,3 0,59 32,8 36,9 21
3 500 10 10 8,7 1,16 36,9 36,9 13
4 1000 10 10 8,7 0,59 36,9 36,9 13
5 1500 10 10 9,3 0,59 36,9 36,9 21
1
Os valores de porcentagem foram obtidos descontando o valor da mdia das artemias mortas nos
controles, atravs da frmula: % mortas = (teste controle)x100/controle .

Obtendo-se o valor das porcentagens, construiu-se os grficos de concentrao vs porcentagem de


artemias mortas para realizar os clculos de LD50.
Figura 3. Concentrao de cafena vs artemias mortas

Figura 4. Concentrao de dicromato de potssio vs artemias mortas

Figura 5. Concentrao de aafro vs artemias mortas.

Tentou-se ralizar os clculos da DL50, atravs da equao y = ax + b , substituindo y por 50%. Porm, os
valores econtrados se mostraram distantes do esperado. Ao observar os grficos, percebe-se que no
houve linearidade, ou seja, no pode-se afirmar que medida que aumenta-se a concentrao da
substncia testada, aumenta o nmero de Artemias mortas.
Na cafena, somente na concentrao de 250 ppm houve menos mortes. Nas demais concentraes,
todas as artemias morreram, algo inesperado, pois nessas concentraes a cafena no considerada
txica, mas algumas alteraes das propriedades podem ter acarretado o grande nmero de mortes.
No dicromato de potssio, todas as artmias que estavam no tubo morreram, algo esperado, pois o
dicromato de potssio era a substncia txica de referncia.
No aafro-da-terra, nas concentraes de 500 e 1000 ppm houve diminuio das mortes, mas nas
demais concentraes, o nmero de mortes foi mais alto e praticamente igual.
Na tentativa de obter xito no teste, o mtodo foi realizado duas vezes. Na primeira tentativa de, todas
as artemias morreram nos tubos, inclusive nos controles negativos, que s estavam com gua salina. Vale
ressaltar que, em outras duas tentativas anteriores, os ovos eclodiram, mas as artemias no sobreviveram.
Por estas razes, na ltima realizao do teste, todas as vidrarias a serem utilizadas foram previamente
lavadas e descontaminadas. Alm disso, as artemias foram alimentadas diretamente no aqurio, no
somente nos tubos de ensaio; utilizou-se gua mineral, ao invs de utilizar gua destilada e a temperatura
de ecloso das artemias foi rigorosamente controlada (25C) em uma incubadora. Entretanto, outros fatores,
ainda no identificados, interferiram no teste de toxicidade com Artemia salina e desta forma ainda no foi
possvel determinar o valor de DL50 para as subtncias testadas.
Sorgeloos e colaboradores (1978) estudaram os efeitos de diferentes
condies geogrficas (San Francisco, Salt Lake City, Bulgria e China) na
aplicao do teste de toxicidade utilizando artemia. Verificaram que a ecloso dos ovos diferenciada, e
influenciada pela temperatura e salinidade, pois geram nuplios em diferentes fases de desenvolvimento.
Estas diferentes fases de desenvolvimento em estado mais avanado (apenas horas a mais) so mais
susceptveis morte que os recm eclodidos.
Como sugesto para trabalhos futuros est a preparao da gua de mar artificial seguindo frmula
de Dietrich & Kalle, que consiste em: para cada 1 L de agua destilada, 23 g de NaCl, 11 g de MgCl 2.6H2O,
4g de Na2SO4, 1,3 g de CaCl2 . 2H2O y 0,7 de KCl; ajustar o pH da soluo a 9,0 com Na 2CO3. As
concentraes das substncias testes devem ser reduzidas. Alm disso, o preparo das solues das
amostras a serem testadas deve ser feito com gua de mar artificial.

CONCLUSES
Muitos fatores interferem no xito do teste de toxicidade utilizando Artemia salina, como luz,
temperatura, alimentao da Artemia sp., tempo de ecloso dos ovos, gua utilizada no teste, contaminao
das vidrarias e das substncias.
Frente a todos os resultados, percebe-se a importncia de pesquisar mais para descobrir quais fatores
podem alterar os resultados dos testes de toxicidade, pois este teste utilizando Artemia salina considerado
eficiente por pesquisadores e, otimizado-o, pode ser uma alternativa aos testes de toxicidade que utilizam
ratos e coelhos.
AGRADECIMENTOS
Deus; ao meu orientador, Prof Dr. Marcel Piovezan, pela sua dedicao; aos animais, pincipalmente s
artemias utlizadas no teste; banca, por ter aceitado o convite; minha famlia e a todos que contriburam
de alguma maneira para a execuo deste projeto.

REFERNCIAS

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FOGUEL, Aline Feltrin et el. 2010. Araras, SP. ESTUDO COMPARATIVO ENTRE OS TEORES DE
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