Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Conceitos fundamentais de
Cromatografia a lquido de
Alto Desempenho (HPLC)
Ministrante: Ayrton Argenton
CEP Curso
Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com
Apoio
Prof. Ayrton Argenton: Qumico formado pela USP. Pesquisador Snior pela
REPUSA Petrobrs, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe de
Pesquisas e Laboratrio da CGS Instrumentao Ltda. Ministrou
treinamentos tcnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20
anos de experincia e especializao em treinamento de Cromatografia a
Lquido e a Gs em Inds. Qumicas, Farmacuticas, Alimentcias,
Destilarias e Usinas de Acar e lcool e Empresas relacionadas.
Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS Centro
de Educao Profissional www.cepcursos.com
IMPORTNCIA DA CROMATOGRAFIA
Velocidade
Poder de resoluo
Simplicidade da tcnica
DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA FLUXO
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA FLUXO
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA FLUXO
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA FLUXO
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA FLUXO
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFIA
PLANAR EM COLUNA
TCNICA
FASE
MVEL LQUIDO GS
FLUIDO
LQUIDO
SUPERCRTICO
FASE
ESTACIONRIA
LQUIDO SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA
Indstria Analitos
Qumica Polmeros
COMPARATIVO HPLC / CG
Fator CG HPLC
Tempo de anlise relativo Em geral mais rpidas que HPLC Em geral mais lentas que CG
10-9 g (UV)
Sensibilidade 10-12 g (DIC / DCE)
10-15 g (coulomtrico)
RESERVATRIO
INJETOR COLUNA DETECTOR
FASE MVEL
BOMBA AQUISIO
DE DADOS
tampa de teflon
CONSIDERAO IMPORTANTE 1:
A fase mvel no pode conter partculas para evitar danos bomba, injetor e
coluna, logo necessrio filtrao antes de armazenar a fase mvel no
reservatrio.
CONSIDERAO IMPORTANTE 2:
A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a formao de bolhas no processo
de separao o que pode interferir no desempenho da anlise.
Ultrasom
CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por HPLC. Alta presso necessria para
impulsionar o solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a enorme resistncia imposta pela fase
estacionria.
Normalmente se utiliza bombas recprocas com um ou preferencialmente dois pistes o que minimiza
pulsao.
Preferencialmente devem operar com programao de vazo e deve ser possvel a interrupo do
processo em presses fora dos limites mximos e mnimos pr-estabelecidos.
importante introduzir fatores de correo de compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os
lquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrrio, a vazo real pode diferir da selecionada.
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
BOMBEAMENTO ISOCRTICO
No caso de baixa presso utiliza-se uma nica bomba e a seleo do solvente a ser
utilizado d-se atravs de vlvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema.
J no caso do bombeamento de alta presso, cada solvente tem uma bomba especfica.
A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio para o a anlise por gradiente a baixa e
alta presso.
A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por anlises isocrtica e por gradiente.
ISOCRTICA GRADIENTE
A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com agulha sem ponta
e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de
injeo.
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
COLUNAS CROMATOGRFICAS
COLUNAS ANALTICAS E PRE-COLUNAS
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS:
Protege a coluna analtica contra contaminaes qumicas
Mesmo material de empacotamento da coluna
Comprimento Tpico: 25 mm
Descartveis
O uso de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica. A filtrao da
fase mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a eliminao de impurezas
prejudiciais coluna. Dependendo das caractersticas da fase estacionria e da natureza da
amostra, pode acontecer o que se chama de reteno irreversvel, ou seja, a afinidade do
contaminante pela coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros
centmetros do empacotamento. Retido na cabea da coluna, o contaminate pode provocar
perda da eficincia, aumento de presso e cauda nos picos. Com o uso da pr-coluna, o
contaminante no atingir a coluna analtica. Ao perceber os sintomas de contaminao (os
mais comuns so aumento de presso e elevao no nvel de rudo), o analista substitui a
pr-coluna, que em mdia custa 10 vezes menos que a coluna analtica.
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTORES
O detector um dispositivo conectado na sada da coluna que percebe a presena de componentes e emite um sinal
eltrico a ser registrado na forma de um pico cuja rea proporcional a quantidade do componente analisado.
Alta Sensibilidade
Estabilidade
Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel no devem alterar o sinal
Reprodutibilidade
Resposta Linear
A resposta do detector deve variar linearmente com a concentrao do analito numa extensa faixa
de concentrao
Resposta rpida aos analitos
No contribuir para o alargamento do pico
O volume da cela do detector deve ser o menor possvel para evitar a perda de eficincia do sistema.
Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade.
Confiabilidade
Facilidade de manuseio
No destrutivo
Condio necessria para cromatografia preparativa
Seletividade
Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro.
DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES
ndice de refrao
Espectrofotometira UV-Visvel
Fluorescncia
Eletroqumico
No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alterao do ndice
de refrao. Essa alterao em relao ao valor da fase mvel livre de analito detectada.
baixa sensibilidade
no permite a utilizao em anlises por gradiente (pois o IR varia com a composio da
fase mvel)
temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura)
APLICAO
Anlises de carbohidratos e acares em geral.
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTORES
ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS)
CONSIDERAES IMPORTANTES:
Espectrofotomtricos
DETECTORES
ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS)
Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente dispersada em uma grade
hologrfica e os comprimentos de onda resultantes so focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a
1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o auxlio de um computador,
pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir uma
srie de espectros em intervalos de tempo fixos.
40
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DETECTORES
REDE DE DIODOS: VANTAGENS EM
RELAO AO DETECTOR UV-VIS
No detector UV-VIS, seleciona-se o
comprimento de onda que pode no ser o
mais adequado para todos os
componentes da amostra. Isso resulta na
perda de sensibilidade de alguns
componentes da amostra.
A figura ao lado ilustra a diferena de
intensidade do pico para um composto
em funo do comprimento de onda.
TIPOS DE DETECTORES
Amperomtrico
O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das espcies
eletroativas oxidada ou reduzida (15-20%).
Coulomtrico
O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente
100% das espcies eletroativas so oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade
muito maior (10-15 mol = fentomol) .
ELETROQUMICOS COULOMTRICO
Espectrofotometria UV-
ndice de Refrao VIS Fluorescncia Eletroqumico
Mudana do IR da fase Absorbncia de luz UV- Excitao com luz produz Oxidao ou reduo em
Princpio de operao
mvel VIS emisso fluorescente um potencial fixo
Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo
Quantidade mnima
Micrograma Nanograma < picograma Fentograma
detectvel
Faixa de linearidade 103 104 104 105 103 105 105
Volume da cela
3-15 1-20 8-25 5-10
(microlitro)
Sensibilidade a
Alta Baixa Baixa Mdia
temperatura
Compostos que
Compostos ou derivados Espcies que oxidam ou
Aplicaes Geral absorvem na regio UV-
que fluorescem reduzem
VIS
Charged Aerosol
UV
Evaporative Light
Scattering
Chemiluminescence
Nitrogen
Refractive Index
Armazenar e registrar
SEPARAO CROMATOGRFICA
Adsoro
Partio
Troca inica
Excluso
Bioafinidade
ADSORO
A fase estacionria um slido contendo grupos (stios ativos) que podem adsorver certas
substncias.
Na adsoro tem-se o seguinte equilbrio:
[adsorvido na FE]
Kads =
[desorvido na FM]
Compostos com diferentes constantes de adsoro so separados.
FM FE
SEPARAO CROMATOGRFICA
PARTIO
[dissolvido na FE]
Kpart =
[dissolvido na FM]
PARTIO
FM FE
TROCA INICA
+
- -
+
+
POR EXCLUSO
BIOAFINIDADE
TEMPO DE RETENO
FATOR DE RETENO
FATOR DE SEPARAO
NMERO DE PRATOS
RESOLUO
TEMPO DE RETENO
Fator de reteno k = tr / to
Fator de separao = tr2 / tr1
Nmero de pratos N = 16 ( tr / Wb )2
Resoluo Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)
Outra medida da eficincia da coluna dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um
prato terico.
L onde L = comprimento da coluna
H= N = nmero de pratos
N
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
PARMETROS CROMATOGRFICOS
RESOLUO
Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)
EFICINCIA DA COLUNA
EFICINCIA DA COLUNA
10
H
5
Vazo
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
FASES ESTACIONRIAS
SLICA
A slica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si-
OH vicinal e germinal. Os grupos silanol so os mais
importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o
composto, maior a reteno.
A ordem de eluio em slica : hidrocarbonetos saturados <
olefinas < aromticos < teres< steres < aldedos cetonas
< lcoois < aminas < amidas < cidos carboxlicos.
Dependendo do procedimento de produo da slica, suas
caractersticas, como volume de poro, dimetro de poro, rea
superficial, nmero de grupos silanol, variam resultando em
reteno varivel.
APLICAES:
Epxidos Proteinas
Poliestirenos Enzimas
Borracha natural cidos Nucleicos
Silicones Lipdios
Colunas de permeao de gel fabricadas com sais de clcio ou chumbo de resinas sulfnicas
com dimetro de poro controlado, so usadas nas anlises de dextrana, oligossacardeos e
acares.
Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de troca inica so:
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
Grupos silanis so responsveis por retenes no especficas que
provocam alargamento dos picos.
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA
Para a produo das Fases Quimicamente Ligadas, a slica gel submetida a um
processo de hidrlise formando grupos silanis SiOH, grupo quimicamente ativo
no qual se ligar o grupo funcional atravs de reaes de silanizao, utilizando
organosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais,
dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fase
monomrica ou polimrica.
SLICA DE ALTA PUREZA(slica tipo B) maior que 99.995%, com menos de 50ppm de
metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente cidos).
slica TIPO C slica HIDRETO desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de slica
ultra pura(baixo teor de metais), atravs de uma tecnologia prpria, a slica tipo B
convertida em slica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contm menos de 3% de
grupos SiOH. Por isso no forma ligaes fortes com gua o que permite utiliza-la como
fase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e at Agua/Acetonitrila com excelente
preciso.
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
FASES ESTACIONARIAS NOVOS DESENVOLVIMENTOS
ADSORVENTES DE
HPLC E
CARACTERSTICAS
DIOL
CIANO
AMINO
Custo
FASE MVEL
Viscosidade
Compressibilidade
Presso de vapor
Toxidez
ndice de Refrao
Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV-VIS
Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes
Fora dos Solventes
94
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
FASE MVEL
VISCOSIDADE
importante determinar o espectro de absoro do solvente antes de us-lo como FM, pois
eventuais impurezas podem alterar muito o valor do cut off.
Alm das propriedades discutidas, outros cuidados especiais devem ser tomados na escolha
dos solventes:
A interao das molculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) e
consequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes foras de
interao:
Disperso
Interao dieltrica
Dipolos
Pontes de hidrognio
FASE MVEL
Adicione gua
(incrementos de Utilizar Fase Normal
20%) at k = 5
injete amostra Adicione pequenas quantidades
de modificadores orgnicos
Ajuste a > 1.2 fortes
picos muito prximos
No bom cromforo
No bom fluorforo
No eletroquimicamente ativo
Nestes casos efetua-se reaes especficas, formando derivados que possam apresentar
algumas das seguintes propriedades:
registrador
bomba bomba
108
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda causam inmeros problemas, incluindo baixa resoluo, sensibilidade
reduzida , preciso e quantificao inadequada.
A figura 1 ilustra como a resoluo e sensibilidade da amostra afetada por picos com
cauda.
A figura 2 ilustra como a exatido e preciso de uma anlise pode sofrer devido a inabilidade
dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MVEL OU
MVEL REDUZA A FORA DO SOLVENTE
SUBSTITUA A COLUNA.
VAZIOS NA COLUNA TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS
RARAMENTE VALE A PENA.
A anlise de compostos com carga tem sido obtida por supresso de ion (ajuste
cuidadoso do pH da fase mvel para resultar em analito no ionizvel.
Determinao do pH timo da fase mvel em supresso de ion frequentemente
requer trabalho extensivo no desenvolvimento do mtodo.
Para amostras contendo mais de um componente ionizvel, o mtodo
frequentemente nao adequado.
As limitaes da supresso de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma
metodologia mais adequada para a separao de componentes ionizados:
cromatografia por interao inica ion pair chromatography.
A tcnica envolve a adio de composto inico na fase mvel para promover a
formao de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes so
constituidos de uma cadeia alqulica com terminal ionizvel.
Quando usado com colunas hidrofbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem
ser usados para aumentar seletivamente a reteno de analitos carregados.
Quando um analito ionizado, ele torna -se menos hidrofbico e portanto sua reteno
diminui.
Portanto, nas separaes contendo cidos e/ou bases utilizando fase reversa, necessrio
controlar o ph da faxe mvel, usando um tampo apropriado para se obter resultados
reprodutveis.
126
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
128
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
ANLISE QUALITATIVA
Existem dois casos a serem considerados para anlise qualitativa com HPLC:
ANLISE QUANTITATIVA
ANLISE QUANTITATIVA
Ai
%i x100
Ai
Ai = rea do composto i
Ai = somatria das reas de todos componentes
Ai xFi
%i x100
Ai xFi
Ai = rea do composto i
Fi = fator de resposta do componente i
AiFi = somatria das reas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos
fatores de resposta
Padronizao externa
Padronizao interna
Ai
Ci
Nesta tcnica, se o volume injetado no for exatamente o mesmo ou se houver alterao de algum
parmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variao da intensidade
de luz do UV-VIS ou alterao na FM, as reas dos picos podero ser maiores ou menores daquelas
obtidas na calibrao e consequentemente os resultados sero incorretos.
ANLISE QUANTITATIVA
Dois grupos projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parmetros para caracterizar colunas
HPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas.
PROJETO USP Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersil-
Keystone, Waters
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Quelao de metais
Atividade do grupo silanol
Seletividade
Densidade de ligaes
Projeto Snyder/Dolan Grupo de trabalho Impurezas PQRI informao obtida em Wyeth, Eli Lilly,
FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Seletividade
Acidez pontes de H
Basicidade pontes de H
Capacidade de troca inica
Site: www.usp.org/USPNF/columns.html
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
DESENVOLVIMENTO DE MTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR
Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006
HPLC A practical users guide Marvin C. McMaster John Wiley & Sons - 2007
Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, nmero 3, junho 1998, Validao de mtodos cromatogrficos,
pg. 12
Agradecimentos
Dentro das diversas reas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentao e Desenvolvimento Analtico,
Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, Assuntos Regulatrios, Pesquisa e Desenvolvimento,
Microbiologia e Habilidades Gerenciais.
Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: 11 50539755