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Intergovernmental Manuals and Guides 59

Oceanographic
Commission

Gua para el diseo y puesta en marcha de un plan


de seguimiento de microalgas productoras de
toxinas
Proyecto ARCAL RLA 7/014

Beatriz Reguera, Rosalba Alonso, ngel Moreira y Silvia Mndez


Comisin
Oceanogrfica Manuales y Guas 59
Intergubernamental

GUA PARA EL DISEO Y PUESTA EN MARCHA DE UN PLAN DE


SEGUIMIENTO DE MICROALGAS PRODUCTORAS DE TOXINAS

Beatriz Reguera, Rosalba Alonso, ngel Moreira y Silvia Mndez

2011 UNESCO
Las denominaciones utilizadas en esta
publicacin y la presentacin de los datos
que figuran en ella no entraan por parte
de la Secretara de la UNESCO ni de la
COI ninguna toma de posicin acerca de
la condicin jurdica de los pases y
territorios ni de sus autoridades, ni con
respecto al trazado de sus fronteras o
lmites.

En referencias bibliogrficas, la
presente obra debe citarse de la
siguiente manera:

Reguera, B., Alonso, R., Moreira, A.,


Mndez, S. 2011. Gua para el diseo y
puesta en marcha de un plan de
seguimiento de microalgas productoras de
toxinas. COI de UNESCO y OIEA, Paris
y Viena 2011. Manuales y Guas de la
COI, 59 (espaol solamente)

 
 
Gua de monitoreo de microalgas txicas

Prefacio

Los eventos de floraciones algales nocivas (FAN) productoras de toxinas constituyen una amenaza para la salud
pblica y para la explotacin de recursos marisqueros y la pesca artesanal en zonas de arrecifes coralinos. Los
reportes de impactos socio-econmicos de las FAN en los pases de Amrica Latina y el Caribe estn creciendo
en paralelo con la creciente explotacin de sus zonas costeras por las actividades tursticas y la acuicultura.
En 1992, ante la alarma de los pases miembros de la Comisin Oceanogrfica Intergubernamental (COI) de la
UNESCO por el creciente impacto de las floraciones algales nocivas, se estableci el programa internacional
Harmful Algal Blooms (HAB). El objetivo global del programa HAB es promover el manejo efectivo y la investigacin
cientfica sobre las floraciones algales nocivas con el objeto de comprender sus causas, predecir su aparicin y mitigar sus efectos. El
programa HAB consta de elementos educativos, de investigacin y operacionales. Los objetivos de los elemen-
tos operacionales del programa son: a) Proteccin de los recursos: desarrollar y mejorar los mtodos que
minimicen las consecuencias ambientales y econmicas de las FAN; b) Monitoreo: promover y facilitar el
desarrollo e implementacin de programas adecuados de monitoreo y c) Salud Pblica y Seguridad Alimentaria:
proteger la salud pblica y asegurar la calidad de los productos marinos de consumo humano.
El OIEA ha desarrollado tcnicas radiactivas que constituyen potentes herramientas, muy sensibles y selectivas,
para la investigacin y control de las FANs. Estas tcnicas se transfieren a los estados miembros a travs de los
programas de Cooperacin Tcnica.
En el ao 2009, el OIEA inici un proyecto de 4 aos sobre Diseo e implementacin de sistemas de alerta temprana
y evaluacin de la toxicidad de los florecimientos de algas nocivas (FAN) en la regin del Caribe aplicando tcnicas nucleares
(RLA/7/014). El objetivo del proyecto es: Transferir el uso de tcnicas basadas en istopos radiactivos para su
aplicacin en: a) Deteccin temprana y cuantificacin de toxinas paralizantes (PSP) y ciguatera (CFP); b) Recons-
truccin de la historia de aparicin de eventos txicos en la regin mediante el fechado de sedimentos e
identificacin de quistes fsiles presentes en ellos. Este proyecto est alineado con los objetivos del OIEA en
medio ambiente, en particular facilitando el uso sostenible de los recursos naturales mediante la aplicacin de
tcnicas radioactivas que mejoren el conocimiento de sistemas naturales y que permita la prediccin de tenden-
cias futuras globales a partir del pasado y la evaluacin global de recursos. En el proyecto RLA/7/014 parti-
cipan Chile, Colombia, Costa Rica, Cuba, Repblica Dominicana, El Salvador, Hait, Honduras, Mxico, Nica-
ragua, Uruguay y Venezuela, con el apoyo de Espaa y Estados Unidos, y en colaboracin con la COI. Se
espera que los resultados del proyecto ayuden a reforzar las capacidades de los pases de Amrica Latina y el
Caribe para el manejo de las FAN y la mitigacin de sus efectos.
Este manual ha sido elaborado para los cientficos latinoamericanos responsables de implementar programas
de monitoreo de la presencia de microalgas potencialmente txicas en sus aguas dedicadas a explotaciones de
mariscos y peces, y de la presencia de las toxinas producidas por stas en los productos marinos destinados al
consumo humano. Constituye una introduccin a las tcnicas fundamentales a aplicar y a los criterios a conside-
rar para disear un plan homogneo de muestreo de microalgas (planctnicas y bentnicas) y factores ambien-
tales. Esto permitir obtener datos comparables entre los pases de la regin y una mejor evaluacin del riesgo
de episodios de algas potencialmente txicas.
Para ello, el OIEA organiz el Curso de formacin OIEA-COI sobre identificacin taxonmica de microalgas potencialmente
txicas y diseo e implementacin de programas de seguimiento. El curso se desarroll en la UNAM (Mxico, Mazatln),
coordinado por Ana Carolina Ruiz y Rosalba Alonso, del 26 de Octubre al 6 de Noviembre de 2009. Este
manual recoge las enseanzas prcticas impartidas as como los protocolos de muestreo acordados para el
diseo e implementacin del programa de monitoreo. Se utiliza un lenguaje sencillo y didctico de forma que
las actividades aprendidas se puedan reproducir fcilmente incluso por expertos colaboradores en el proyecto
que no tuvieron la oportunidad de asistir al curso.
El OIEA quiere expresar su agradecimiento a los expertos de Colombia (Laura Victoria Perdomo y Andrs
Leonardo Malagn), El Salvador (Jaime Espinoza) y Guatemala (Leonel Carrillo) por la revisin y crtica
constructiva de este manual. Al COI-IEO Centro Cientfico y de Comunicacin sobre Algas Nocivas (Vigo, Espaa) por
la edicin tcnica y montaje del documento. Germn Ramrez-Resndiz (UNAM, Mazatln) contribuy con su

1
Prefacio

pericia en informtica y estadstica a la comparacin de resultados de los conteos de microalgas durante el curso
y a la preparacin de anexos de este documento.
Agradecemos la revisin de algunos apartados del manual por los expertos Isabel Bravo (seccin 2.3), Jos M.
Franco y Pilar Riob (seccin 2.4) y Mnica Lion (seccin 2.2.5) de Vigo (Espaa).
Esta gua fue producida dentro del proyecto de cooperacin tcnica del OIEA Diseo e implementacin de sistemas
de alerta temprana y evaluacin de la toxicidad de los florecimientos de algas nocivas (FAN) en la regin del Caribe aplicando
tcnicas nucleares RLA/7/014 en colaboracin con la COI, con la Sra. Jane Gerardo-Abaya, del Departamento
de Cooperacin Tcnica de Viena, como Oficial de Manejo del Programa y la Sra. Florence Boisson, del
Laboratorio de Medio Marino del OIEA en Mnaco, como Oficial Tcnico.

Carlos M. Alonso-Hernndez
Coordinador Regional del Proyecto ARCAL RLA/7/014

Este documento no ha sido editado por el personal de los servicios editoriales del OIEA

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Gua de monitoreo de microalgas txicas

Gua para el diseo y puesta en marcha de un plan de monitoreo de


microalgas productoras de toxinas
Prefacio ........................................................................................................................................................ 1
ndice ........................................................................................................................................................ 3
1. Introduccin ......................................................................................................................... 5
1.1 Floraciones Algales Nocivas ................................................................................................................... 5
1.2 Floraciones Algales Nocivas en Amrica Latina y el Caribe ............................................................. 7
1.3 El Proyecto ARCAL RLA/07/014 y sus objetivos ............................................................................ 7

2. Diseo de un plan de monitoreo de microalgas potencialmente txicas. Criterios


generales ...................................................................................................................................................... 10
2.1 Seleccin de los sitios de muestreo ...................................................................................................... 10
2.2 Material y mtodos para el muestreo de fitoplancton y condiciones ambientales ....................... 12
2.2.1 Temperatura y salinidad. Sondas multiparamtricas y CTDs ......................................... 14
2.2.2 Transparencia: disco de Secchi ............................................................................................. 15
2.2.3 Redes de plancton .................................................................................................................. 16
2.2.4 Botellas oceanogrficas ......................................................................................................... 18
2.2.5 Mangueras muestreadoras ..................................................................................................... 19
2.2.6 Fijadores/conservantes de las muestras de plancton....................................................... 22
2.3 Material y mtodos para el muestreo de microalgas bentnicas ..................................................... 23
2.3.1 Colecta de la muestra sustrato (macroalgas)...................................................................... 23
2.3.2 Desprendimiento y conservacin de los dinoflagelados .................................................. 26
2.3.3 Recuento y estimacin de la densidad de los dinoflagelados bentnicos asociados a la
ciguatera ............................................................................................................................................. 27
2.4 Material y mtodos para el muestreo de fitoplancton y fitobentos para anlisis de toxinas ...... 30

3. Anlisis cuantitativo de fitoplancton. Consideraciones generales .......................................... 33


3.1 Conteos celulares con cmaras de Sedgewick-Rafter ....................................................................... 34
3.2 El mtodo Utermhl ............................................................................................................................... 37
3.3 Calibracin de los sistemas de conteo y control de calidad de los anlisis ................................... 42
3.3.1 Calibracin de los sistemas de conteo ................................................................................ 42
3.3.2 Control de calidad de los anlisis ......................................................................................... 42
3.4 Interpretacin de resultados .................................................................................................................. 42

4. Pasos que deben seguirse para la identificacin de las microalgas agentes de eventos
txicos ...................................................................................................................................................... 44
4.1 Anlisis de toxinas en los moluscos ..................................................................................................... 44
4.2 Anlisis de toxinas en el plancton ........................................................................................................ 44
4.3 Anlisis de toxinas en cultivos monoalgales ....................................................................................... 45
4.4 Interpretacin de resultados y relacin de errores frecuentes ......................................................... 45

ANEXOS
Anexo 1. Listado de especies de microalgas txicas consideradas en el proyecto RLA 7014
Anexo 2. Descripcin estaciones de muestreo y su localizacin
Anexo 3. Planilla de recoleccin de datos en los muestreos de microalgas
Anexo 4. Planilla (hoja Excel) para anlisis cuantitativos de microalgas
Anexo 5. Preparacin de carne de molusco para anlisis de toxinas
Gua de monitoreo

1. Introduccin nismos que viven fijos en el fondo (bentnicos). Se deno-


minan eutrficos a los sistemas de este tipo, en los que
existen desequilibrios por el exceso de produccin prima-
1.1. Floraciones Algales Nocivas ria en relacin con el consumo.

Se forman manchas en pequeas playas y bahas visitadas


Las microalgas pigmentadas del fitoplancton son los princi- por los turistas, creando contaminacin visual, y alarma
pales productores primarios y constituyen la base de las redes social si el pblico no est debidamente informado (Fig. 2).
trficas marinas. Las floraciones, o crecimiento explosivo del
fitoplancton, son un fenmeno natural que contribuye a sos- Si se desarrollan en zonas con cultivos de peces en jaulas, la
tener la produccin de bivalvos y de pequeos peces pelgicos, muerte de los peces puede sobrevenir por: a) cambios brus-
como la sardina y la anchoa. Mediante la fotosntesis, el cos de condiciones fsicoqumicas asociadas con la elevada
fitoplancton sintetiza materia orgnica a partir de la energa biomasa de microalgas, tales como anoxia,
solar, macronutrientes el CO2 atmosfrico y los nitratos, hiperoxigenacin, descenso del pH, excrecin de altas con-
fosfatos, silicatos, disueltos en el agua y oligoelementos centraciones de amonio; b) la excrecin de substancias
(metales traza, vitaminas). De esta forma, el crecimiento del mucilaginosas por las microalgas, que provoca un aumen-
fitoplancton acta como una bomba biolgica de carbono to de viscosidad del agua, atascos en la branquias y dificul-
que ayuda a mitigar el efecto invernadero. Adems, las pobla- tad en la adsorcin de oxgeno; c) la presencia de espinas y
ciones de fitoplancton excretan a la atmsfera dimetil-sulfuro otros apndices de las microalgas que erosionan las agallas
(DMS), gas que favorece la formacin de ncleos de conden- de los peces y aumentan su susceptibilidad a las infecciones
sacin de agua que dan lugar a las nubes, y por tanto contra- bacterianas y vricas.
rrestan el exceso de radiacin solar.
Algunas especies de microalgas producen potentes venenos o
Sin embargo, no todas estas floraciones son beneficiosas. Las toxinas. Cuando estas microalgas son filtradas por los
Floraciones Algales Nocivas (FAN, en ingls HAB = Harmful mejillones y otros bivalvos, las toxinas se acumulan en sus
Algal Blooms), es un trmino adoptado por la Comisin tejidos y se transmiten a niveles superiores de la red alimenta-
Oceanogrfica Intergubernamental (COI) de la UNESCO y ria, incluyendo a los seres humanos. Las toxinas son tan po-
aceptado internacionalmente para denominar cualquier proli- tentes, que incluso a bajas concentraciones de microalgas
feracin de microalgas (independientemente de su concentra- (103-104 cel L-1) y sin que se formen manchas en el agua, pue-
cin) percibida como un dao por su impacto negativo en la den convertir a los bivalvos en no aptos para el consumo. A
salud pblica, la acuicultura, el medio ambiente y las activida- estas proliferaciones, que raras veces van acompaadas de pro-
des recreativas. duccin de elevada biomasa, las denominaremos Episodios
de Algas Txicas. Se producen as las Intoxicaciones por
Las mareas rojas son coloraciones o manchas del agua de consumo de Bivalvos (Shellfish Poisoning), que en casos ex-
mar debido a la presencia de concentraciones elevadas 1 o tremos pueden causar hospitalizaciones e incluso prdida de
ms millones de clulas por litro de microalgas planctnicas vidas humanas. Las intoxicaciones o sndromes se clasifican
(Fig. 1). El color, que depender de los pigmentos de la de acuerdo con los efectos biolgicos en los organismos. Los
microalga, puede ser verdoso, pardo, rojizo, naranja, etc. En la ms conocidos en la regin son el PSP (Paralytic Shellfish
mayor parte de los casos, las mareas rojas estn formadas por Poisoning), el DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning), el ASP
microalgas inocuas y no constituyen ningn peligro para el (Amnesic Shellfish Poisoning) y el NSP (Neurotoxic Shellfish
ecosistema si se dan en zonas abiertas con buena tasa de reno- Poisoning).
vacin del agua. No obstante, stas pueden resultar perjudi-
ciales si se forman en bahas y ensenadas confinadas con escasa Los bivalvos no son los nicos vectores de toxinas
circulacin y se da alguna de las siguientes circunstancias: microalgales. Otra posible va de transmisin es la que, a tra-
vs de pequeos peces pelgicos planctfagos (sardinas, an-
La elevada biomasa de fitoplancton que no es consumida, choas), afecta a aves y mamferos marinos causndoles
sedimenta y se descompone, lo que conduce a la forma- intoxicaciones de distinta intensidad, desde efectos subletales
cin de fondos anxicos, pestilencias y a la muerte de orga- hasta la muerte. Adems, si bien no se trata de fitoplancton,

Fig. 1. Marea roja (izda.) del ciliado fotosinttico Mesodinium rubrum (dcha.) en la Baha de Mazatln, Sinaloa, Mxico. Esta discoloracin, sin
efecto nocivo aparente sobre la biota, se observ del 11 al 20 de enero de 2009 (Foto R. Alonso).

5
Introduccin

hay que mencionar que existen FANs causadas por microalgas Ciguatoxinas (CTX = Ciguatoxins), producidas por di-
bentnicas, que viven adheridas a macroalgas (epfitas) o a noflagelados bentnicos del gnero Gambierdiscus.
otro tipo de substratos. Las ms conocidas son las causantes
del envenenamiento por consumo de peces llamado Cigua- Cianotoxinas producidas por cianobacterias.
tera (CFP = Ciguatera Fish Poisoning), sndrome endmico de Existen tambin floraciones microalgales ictiotxicas,
regiones tropicales y subtropicales, causado por microalgas productoras de toxinas hemolticas o de substancias oxidantes
(Gambierdiscus spp.) que viven asociadas a los arrecifes de coral (ROS = Reactive Oxygen Species) que se liberan al medio y cau-
y se trasmiten, a travs de pequeos peces herbvoros, a peces san mortandades de peces silvestres o en cultivo. La prolifera-
comestibles de mayor tamao (barracudas y otros). Otro ejem- cin de estas especies puede tener efectos devastadores en las
plo de FAN bentnicas son las floraciones de Ostreopsis spp. granjas de peces cultivados en jaulas marinas. Son muy cono-
cuyas toxinas, liberadas al agua de mar, pasan al aerosol mari- cidas las mortandades de salmnidos y otros peces cultivados
no y causan irritaciones de la vas respiratorias y la piel de los causadas por floraciones de pequeas flageladas rafidofceas,
baistas. Por ltimo, hay que mencionar el impacto de las tales como Heterosigma akashiwo (conocidas en Chile como
floraciones de cianobacterias en ambientes dulceacucolas y marea caf) y varias especies del gnero Chattonella, causantes
salobres. de mortandades de peces en el Golfo de California (Mxico).
Los grupos de toxinas de origen microalgal causantes de los
Sobre la base de los daos que ocasionan, hacemos una clasi-
sndromes mencionados son:
ficacin de las FAN aqu comentadas, en:
Toxinas de tipo paralizante (PST = Paralytic Shellfish
Floraciones algales de elevada biomasa, no txicas, que
Toxins), producidas por dinoflageladas de los gneros
pueden causar daos de tipo fsico-qumico
Alexandrium, Gymnodinium y Pyrodinium.
Floraciones productoras de toxinas que se transfieren a
Toxinas lipoflicas (DST = Diarrhetic Shellfish Toxins, pec-
travs de la cadena trfica;
tenotoxinas y yesotoxinas). Las toxinas diarreicas (cido
ocadaico y dinophysistoxinas) son producidas por Floraciones algales ictiotxicas;
dinoflageladas del gnero Dinophysis y especies bentnicas
del gnero Prorocentrum; las pectenotoxinas por Dinophysis Floraciones de microalgas productoras de toxinas que se
spp. y las yesotoxinas por Gonyaulax spinifera, Lingulodinium transfieren a travs del aerosol marino y causan irritaciones.
polyedrum y Protoceratium reticulatum.
Floraciones de Cianobacterias (CHAB = Cyanobacterial
Toxinas de tipo amnsico (AST = Amnesic Shellfish Toxins), Harmful Algal Blooms)
producidas por diatomeas del gnero Pseudo-nitzschia.
Hay que sealar que algunas FAN pueden causar mltiples
Toxinas neurotxicas (NST = Neurotoxic Shellfish Toxins), efectos nocivos. El ejemplo ms notorio lo constituyen las
producidas por especies del gnero Karenia, tales como K. floraciones del dinoflagelado Karenia brevis en el Golfo de
brevis en el Golfo de Mxico. Mxico: sus neurotoxinas (NSP = Neurotoxic Shellfish Poisoning)
son transferidas a travs de la cadena trfica, causando incluso

Fig. 2. Marea roja de Noctiluca scintillans en Punta del Este, Uruguay, noviembre de 2003. Esta FAN no caus ningn dao aparente a los
humanos o la fauna marina pero s alarma social por tratarse de una importante zona turstica. (Foto M. Gallardo cedida por S. Mndez).

6
Gua de monitoreo

la muerte de mamferos marinos; sus floraciones de elevada En ms de una ocasin, la ignorancia sobre los organismos
biomasa causan muertes masivas de organismos marinos de causantes de eventos txicos ha disparado la alarma social y el
fondo y adems sus toxinas se transfieren al aerosol marino, cese de consumo de productos marinos ante la mera aparicin
causando irritaciones en las vas respiratorias y piel de los ba- de una mancha de plancton (constatada ms tarde como to-
istas (ver Informe de Mxico en IOCARIBE-ANCA 2007). talmente inocua) y el efecto alarmista de los medios de comu-
nicacin. Tal fue el caso tras la formacin de una marea roja (>
1.2. Floraciones Algales Nocivas en Amrica 2 106 cel L-1) del dinoflagelado Gonyaulax cf polygramma en la
Latina y el Caribe Baha de Cartagena (Colombia) en mayo de 2010 (Fig. 3). En
otros pases, los programas de monitoreo se limitan al con-
trol sanitario de los moluscos y peces destinados a la exporta-
Los reportes de impactos socioeconmicos de las FAN en los
cin, ya que la falta de controles estandardizados impedira el
pases de Amrica Latina y el Caribe estn creciendo en paralelo
ingreso de sus productos a los Estados Unidos, la Unin
con la creciente explotacin de sus zonas costeras por las acti-
Europea y otros mercados. Mientras tanto, la poblacin que
vidades tursticas y la acuicultura. En la regin se dan ejemplos
recolecta bivalvos y peces para su consumo familiar se expone
de todas las clases de FAN (IOCARIBE-ANCA, 2007; IOC-
a elevados riesgos sanitarios al consumir productos marinos
FANSA, 1995) citadas en el apartado anterior, pero las que
no controlados.
tienen un mayor impacto socioeconmico son las FAN pro-
ductoras de toxinas que, incluso a moderadas concentraciones
no formadoras de manchas, se acumulan en los bivalvos y los Uno de los principales retos a los que se han de enfren-
peces y se transfieren a travs de la cadena trfica. Estos even- tar los expertos es el hacer tomar conciencia a las autori-
tos de microalgas txicas constituyen una amenaza para la dades sanitarias y pesqueras de sus respectivos pases
salud pblica y para la explotacin de los recursos marinos. La sobre la naturaleza del problema y la necesidad de esta-
situacin puede ser especialmente grave: a) en zonas costeras blecer programas de alerta temprana. Estos programas
donde mariscos y peces son parte habitual de la dieta local y no contribuiran a:
existe un programa de salubridad (seguridad alimentaria) de
los productos de la pesca; b) si la falta de estos controles 1. Mejorar el manejo de los eventos txicos que conlle-
sanitarios dan lugar a una prohibicin de las exportaciones a van incluso la prdida de vidas humanas.
terceros pases (Estados Unidos, Unin Europea) con estric- 2. Disear planes de contingencia y mitigar el impacto
tas medidas regulatorias. de los eventos txicos en la explotacin de los recur-
La acumulacin de toxinas paralizantes en bivalvos (PST) aso- sos marisqueros, las pesqueras artesanales y el turis-
ciadas con las floraciones de Pyrodinium bahamense var. compressum mo.
en la costa Pacfica y de Gymnodinium catenatum, tanto en las
costas del Pacfico como en las del Caribe, han causado cientos
de casos de personas intoxicadas y cerca de cien vctimas mor- 1.3. El Proyecto OIEA-ARCAL RLA/7/014 y sus
tales en las ltimas dcadas (Mee et al. 1989, Rosales-Loessner
1989, IOCARIBE-ANCA 2007). La ciguatera, causada por el objetivos
consumo de ciertas especies de peces tropicales que se alimen-
tan en zonas de arrecifes coralinos, es sin duda la principal En 2009 se puso en marcha el proyecto OIEA-ARCAL RLA/
fuente de intoxicaciones humanas asociadas a productos ma- 7/014 sobre Diseo e Implementacin de Alerta Temprana y Eva-
rinos en la regin. La ciguatera es un sndrome endmico en el luacin de la Toxicidad de Floraciones Algales Nocivas en Amrica
Caribe donde constituye una seria amenaza para la salud p- Latina y el Caribe. Aplicacin de tcnicas nucleares avanzadas, evalua-
blica, las pesqueras locales y el turismo (Tester et al., 2009). ciones radioecotoxicolgicas y bioensayos en las costas de Chile,
Todos los aos se registran varios cientos de casos, pero mu- Colombia, Costa Rica, Cuba, Repblica Dominicana, El Sal-
chos otros pasan desapercibidos por el desconocimiento de vador, Hait, Honduras, Mxico, Nicaragua, Uruguay y Vene-
los mdicos y la poblacin en la identificacin de sus snto- zuela.
mas. Adems, la ciguatera es un sndrome recurrente en los
pacientes que lo sufren, y si bien raras veces es mortal, causa El principal objetivo de este proyecto de 5 aos de duracin,
trastornos gastrointestinales y neurotxicos a las vctimas y supervisado por el Departamento de Cooperacin Tcnica de
repercute econmicamente en considerables prdidas de jor- Viena con el apoyo del Laboratorio de Medio Marino del
nadas de trabajo (Tosteson en informe IOCARIBE-ANCA, OIEA en Mnaco es:
1998).

En algunos pases de la regin LAC (Latinoamerica y el Cari- Transferir el uso de tcnicas basadas en istopos
be) no existe ningn programa establecido de seguimiento o radiactivos para su aplicacin en:
monitoreo de microalgas potencialmente txicas y ficotoxinas
a) Deteccin temprana y cuantificacin de toxinas pa-
para garantizar la salubridad de los productos marinos y sal-
ralizantes (PSP) y ciguatera (CFP).
vaguardar la salud pblica. Con frecuencia, el apoyo espordi-
co de las autoridades y el esfuerzo de los expertos para llevar a b) Reconstruccin de la historia de aparicin de even-
cabo muestreos de fitoplancton y biotoxinas se ponen en tos txicos en la regin.
marcha demasiado tarde, es decir, cuando aparece una mancha
de plancton sospechosa o cuando tiene lugar un brote txico.
7
Introduccin

Fig. 3. Marea rojass ocurridas Colombia, 2010, ambas sin efectos nocivos sobre la salud humana o la fauna marina. A) Mancha producida por
Gonyaulax sp. en mayo, asociada con niveles de oxgeno, amonio y fosfatos altos respecto a los registros histricos. B) Marea roja de gran
extensin generada por Cochlodinium polykrikoides en el rea de la Baha de Santa Marta, en octubre. (Fotos INVEMAR).

Los mtodos que se desarrollarn son el radioensayo (Receptor identificacin taxonmica de microalgas potencialmente txi-
Binding Assay, RBA) y el fechado de sedimentos mediante el cas y diseo e implementacin de programas de seguimiento.
anlisis de quistes contemporneos y fsiles. Adems se me- El curso se desarroll en la UNAM (Mxico, Mazatln), del 26
jorarn las capacidades de los pases integrantes del proyecto de octubre al 6 de noviembre de 2009. Este manual recoge las
para el seguimiento de microalgas potencialmente txicas y enseanzas prcticas impartidas, as como los protocolos de
ficotoxinas. La informacin generada contribuir muestreo acordados para el desarrollo del proyecto. Los obje-
significativamente a mitigar los impactos socioeconmicos tivos parciales que se esperan alcanzar son:
causados por las intoxicaciones de tipo paralizante (PSP) y la
ciguatera en Latinoamrica.

Durante la primera reunin de coordinacin del proyecto


ARCAL RLA/7/014 (La Habana, Cuba, 27-30 de enero de
2009) se estableci un plan de trabajo para el proyecto, basado
en los informes nacionales presentados por las contrapartes, y - Puesta en marcha de un programa comn de segui-
la contribucin de expertos de la NOAA-Center for Coastal miento de microalgas potencialmente txicas y con-
Environmental Health and Biomolecular Research (Charleston, SC, diciones ambientales mediante muestreos mensua-
US), del Centro COI-IEO Cientfico y de Comunicacin so- les (mnimo), en dos estaciones fijas por pas.
bre Algas Nocivas (Vigo, Espaa) y del Grupo Regional COI-
- Obtener un listado de las especies potencialmente
ANCA (Algas Nocivas en el Caribe). Se aprob el establecimien-
txicas de la regin y su distribucin espacio-tem-
to de laboratorios de referencia debidamente equipados para
poral.
actuar como centros de demostracin y asesorar sobre la pues-
ta en marcha de tcnicas analticas, elaboracin de guas y capa- - Identificar los agentes de eventos txicos.
citacin de recursos humanos. La experiencia adquirida du-
rante un proyecto OIEA anterior en Chile, coordinado por el - Fomentar la cooperacin interregional sobre el tema
Prof. Benjamn Surez-Isla, formara parte de la transferencia y establecer una red de comunicacin que permita
de tecnologa a otros pases de Latinoamrica, convirtiendo el transmitir alertas entre pases vecinos.
proyecto ARCAL RLA/7/014 en un buen ejemplo de cola-
boracin Sur-Sur. Otra de las actividades fue la realizacin de
un curso de formacin, de dos semanas de duracin, sobre

8
Gua de monitoreo

Referencias ioc-unesco.org/hab/index.php?option=com_oe&task=
view DoclistRecord&doclistID=61
COI 1995. Segundo Taller Regional de Planificacin Cientfica Mee LD, Espinosa M, Daz G. 1986. Paralytic shellfish
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Floraciones de Algas Nocivas en IOCARIBE-ANCA. Isla 2009. Ciguatera Fish Poisoning in the Caribbean.
de San Andrs, Colombia, 22-24 Mayo de 2007. http:// Smithsonian Contributions to the Marine Sciences 38: 301-311.

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Diseo de un plan de monitoreo

2. Diseo de un plan de monitoreo Es importante recordar que el monitoreo de microalgas


de microalgas potencialmente no ofrece por s mismo una proteccin suficiente de la
salud pblica. Si el rea estudiada tiene una cobertura
txicas. Criterios generales espacio-temporal aceptable, permite dar una alerta tem-
prana a partir de la cual se intensifican los controles de
El principal objetivo del monitoreo a aplicar en el proyecto presencia de toxinas en los productos marinos.
RLA/7/014 es la alerta temprana de floraciones de microalgas
potencialmente txicas, cuyas toxinas se transfieren a travs de
la cadena trfica y afectan a la salud pblica. Para minimizar el
impacto negativo de este tipo de eventos, se pueden aplicar
2.1 Seleccin de los sitios de muestreo
dos estrategias de monitoreo:
El establecimiento de las estaciones primarias o puntos de
a) Control de la presencia de especies potencialmente txicas. muestreo permanentes, por ser considerados los ms repre-
sentativos debe tener en cuenta los siguientes factores:
b) Control de la presencia de toxinas en los recursos comer-
cializados. Registros histricos de eventos txicos, que proporciona-
rn una idea de los puntos calientes o zonas de riesgo
El diseo de un programa de monitoreo se basa en parte en el
donde ya se han registrados casos en el pasado.
conocimiento de la hidrografa y de la ecologa del fitoplancton
del rea costera que se va a controlar. Si no se dispone de Movimientos de las masas de agua: mecanismos fsicos
informacin previa, no existe otra alternativa que no sea co- conocidos de transporte desde un frente (de marea,
menzar un monitoreo extensivo que cubra la mayor parte del esturico, de afloramiento) alejado de la costa (cross-shelf), o
rea de estudio y que se ir ajustando a medida que se genere corrientes a lo largo de la costa (along-shore).
informacin apropiada.
Ubicacin de los frentes o zonas de frontera entre masas
de agua distintas.
Es esencial que el programa de monitoreo se disee de
forma que asegure: Si existen mecanismos de transporte conocidos, las estaciones
de muestreo se fijarn en sentido contra-corriente en la di-
la deteccin temprana de la presencia de especies reccin que va de las zonas de inters, tales como bancos natu-
potencialmente txicas y de sus toxinas en los pro- rales o zonas de cultivo, a los frentes o corrientes. As, por
ductos marinos que permita proteger la salud p- ejemplo, en un fiordo, estuario o baha, la deteccin de espe-
blica e implementar estrategias de manejo; cies problema en una estacin externa situada en la boca (parte
un programa rentable, es decir, que tenga una buena ms ancha) del sistema, en comunicacin con mar abierto,
relacin costo/valor del recurso que se pretende pro- permite avisar con antelacin sobre lo que se acerca a las zonas
teger. interiores donde se encuentran los cultivos o bancos natura-
les.

Los frentes de plataforma zona de encuentro entre aguas


Dado que la lista de especies dainas debera considerarse siem- exteriores estratificadas y aguas interiores mezcladas ofre-
pre abierta a la inclusin de nuevas especies txicas, el pro- cen condiciones ptimas para el desarrollo y/o acumulacin
grama ideal sera aquel que determinara la composicin de fsica de dinoflagelados (Carreto et al., 1986) y son zonas de
toda la comunidad fitoplanctnica, a lo largo del ao, en las elevada productividad. La presencia de estos frentes en mar
reas de importancia comercial y/o recreativa. Dado que esto abierto puede actuar como fuente de algas nocivas que sern
requiere un enorme esfuerzo humano, para el presente pro- transportadas a las zonas de cultivo bajo condiciones meteo-
yecto se propone un monitoreo cuidadoso de la lista de espe- rolgicas favorables. En zonas de circulacin esturica positi-
cies potencialmente txicas citadas para la regin, elaborada va es normal la presencia de frentes salinos, que se forman en
tras la revisin bibliogrfica y de informes nacionales por los la zona de encuentro entre las aguas salobres que salen por
expertos de los distintos pases, complementada por infor- superficie y las aguas exteriores, ms salinas, de la plataforma
macin previa recopilada por el Grupo COI de Algas Nocivas en adyacente. La deteccin de especies nocivas en los frentes per-
el Caribe y Regiones Adyacentes (ANCA). Al mismo tiempo se mite dar una alerta temprana del inicio de poblaciones que
ha tenido en cuenta la lista global de referencia de especies pueden alcanzar despus las zonas sensibles desde un punto
txicas preparada por el Task Team on Phytoplankton Taxonomy de vista socioeconmico. Un buen ejemplo de frente esturico
del Panel de Expertos de la COI (Moestrup et al. 2009) (vase es el originado por el Ro de la Plata, lmite sur de Uruguay,
Anexo 1). Los criterios que deben aplicarse a la identificacin que descarga agua dulce de una vasta cuenca de 3.200.000 km2
morfolgica de estas especies se explicaron en el transcurso del procedente de 5 pases. Frente a Uruguay se produce la Con-
OIEA-COI Curso Regional de Formacin sobre Taxonoma y vergencia Subtropical, un importante frente termohalino en-
Monitoreo de Microalgas Marinas Txicas (UNAM, Mazatln, tre aguas tropicales y subantrticas. La dinmica estacional de
Mxico, 26 octubre a 6 de noviembre de 2009) (vase Anexo 6, las principales especies productoras de toxinas paralizantes de
Taxonoma de Microalgas Txicas).

10
Gua de monitoreo de microalgas txicas

bivalvos (PST) en Uruguay est ntimamente relacionada con


la situacin de este frente. En resumen: es importante conocer dnde se sitan
los frentes, las zonas de discontinuidad de la columna
Otro ejemplo de frente vertical seran las termoclinas, o zo- de agua, y cmo se mueven las masas de agua en res-
nas de fuerte gradiente trmico que se forman en los meses de puesta a la meteorologa local (rgimen de vientos, llu-
mayor insolacin y las haloclinas, o zonas de mximo gradiente vias, etc.). Es imprescindible discutir la localizacin de
de salinidad, de especial importancia despus de fuertes llu- los puntos de muestreo con expertos que conozcan la
vias. La distribucin vertical de estos gradientes de densidad hidrodinmica local.
es de enorme importancia a la hora de determinar las profun-
didades de muestreo en cada estacin ya que son zonas pti-
mas de crecimiento y/o acumulacin de dinoflagelados y Durante el encuentro en Mazatln (octubre-noviembre de
diatomeas pennadas. 2009), hubo una sesin destinada a discutir las caractersticas y
la ubicacin recomendada de los puntos donde se llevaran a
cabo los muestreos peridicos del proyecto RLA/7/014. Los
puntos elegidos y sus caractersticas se resumen en el Anexo 2.

11
Material y mtodos para el muestreo

2.2 Material y mtodos para el muestreo 3. Se baja el disco de Secchi y se anota la profundidad (m) a la
de fitoplancton y condiciones ambientales que deja de verse.

4. Se hace el lance para arrastre vertical de red.


Material y equipo:
Listado de material y equipo (lista de cotejo) para prepara- 5. Abrir la llave/desenroscar el colector de la red, recoger el
cin del muestreo. arrastre en la jarra y:

Tabla de campo y estadillo (planilla) para anotacin de da- a) si el arrastre se va a observar poco tiempo despus (1-2 h),
tos (ver Anexo 3). verter el arrastre en el recipiente, con tapn de rosca, en el
que vaya a ser transportado.
Sondas multiparamtricas, CTD, u otro equipo disponi-
ble para toma de datos in situ de salinidad, temperatura, b) si se va a observar horas despus de la recogida, conviene
pH, oxgeno disuelto, clorofila, etc. (seccin 2.2.1). filtrar el arrastre a travs de malla de 150 m para eliminar
organismos zooplanctnicos que consumen el fitoplancton
Termmetro de inmersin con escala de 0.1C (en caso de y diluir el arrastre con agua de superficie para que se man-
fallo de la sonda). tenga en mejores condiciones.

Disco de Secchi con peso y cuerda marcada a cada 1 m y a c) si el arrastre no se va a poder observar hasta el da siguiente
cada 25 cm (2.2.2). y/o resulta difcil mantenerlo fresco, verter el arrastre en el
frasco con tapn de rosca donde ser transportado y fijarlo
Red de plancton de 20 m con un peso (plomo) para con formol (4% de concentracin final).
asegurar el descenso y soga, con nudos o cintas marcadoras
cada metro para conocer la profundidad a la que se baja 6. Lanzar la manguera muestreadora lentamente, con todas
durante el arrastre vertical (2.2.3). las llaves abiertas, hasta llegar a la marca de superficie (ver
seccin 2.2.5). Cerrar la llave de paso del extremo superior
Botella oceanogrfica (si ha sido escogido como mtodo e izar la manguera lentamente cerrando la llave de cada
de muestreo en vez de manguera) con cuerda y mensajeros segmento hasta recuperarla completamente en la superficie
(2.2.4). del barco.
Tubo o manguera muestreadora con los segmentos nece- 7. Vaciar el contenido de la manguera, abriendo la llave de
sarios para cubrir la longitud mxima de la columna de paso de cada seccin y vertiendo el contenido en el recipien-
agua de los sitios de muestreo (2.2.5). te de plstico con ayuda del embudo.
Recipiente de plstico de boca ancha con tapa de rosca (100- 8. Mover suavemente y tomar una alcuota (250-500 mL) en
200 mL) para la recogida del arrastre. el frasco etiquetado (fecha, estacin de muestreo, tipo de
muestra) y fijar con lugol.
Frasco lavador (pizeta) con agua de mar filtrada.
Consideraciones:
Malla de 150 m.
Se suministran los pasos para el muestreo bsico de
Recipientes de plstico para vaciar las muestras de la man- fitoplancton acordado para el proyecto ARCAL RLA/7/
guera. 014. Puede ser que algunos laboratorios dispongan de
medios para adems tomar muestras para medir otros
Frascos ahumados o resistentes al UV, etiquetados, para parmetros (nutrientes, clorofila, oxgeno disuelto, etc.)
muestras de agua destinadas a anlisis cuantitativo de que no se explican aqu.
plancton.
Los arrastres de red se deberan observar in vivo siempre
Pipetas (o dosificadores automticos) y soluciones fijadoras que fuera posible, ya que algunas especies desnudas son
(formol, lugol). difciles de reconocer en muestras fijadas. Las observacio-
nes de arrastres de red permiten hacer un listado cualitati-
Rotuladores o plumones indelebles y etiquetas. vo de las especies presentes. Esto es muy importante, ya
Recipiente con aislamiento trmico para transporte de que algunas especies potencialmente txicas pudieran estar
muestras. presentes en concentraciones por debajo del nivel de detec-
cin de los mtodos cuantitativos empleados. As pues,
Mtodo: permite tener elementos para una alerta temprana de la
1. Una vez situados en el sitio de muestreo se corroboran las presencia de especies peligrosas que se encuentren por de-
coordenadas con el GPS, y se anotan las posibles desvia- bajo del nivel de deteccin de los mtodos cuantitativos
ciones de las coordenadas del punto de muestreo. empleados.

2. Se anota la hora, estado de marea y toda la informacin Se acord que se tomara una sola muestra integrada de
meteorolgica posible (vientos, cobertura del cielo, lluvias manguera en cada estacin. No obstante, en la seccin 2.2.5
en das previos). se describe la manguera divisible de Lindahl (1986), que
consta de 4 segmentos de 5 m cada uno. La manguera de

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Gua de monitoreo de microalgas txicas

varios segmentos es ms fcil de manipular y da informa- Algunos participantes del proyecto han escogido estacio-
cin sobre diferencias entre el ambiente superficial y el de nes de muestreo muy someras (de unos pocos metros de
fondo. Adems, aqullos con ms inters/posibilidades profundidad) que debern ser muestreadas con tubos rgi-
de estudiar la ecologa de las FANs en su regin, pueden dos de PVC (1-2 m) con vlvula de retencin (vlvula check)
vaciar los segmentos de la manguera en recipientes separa- que permite la entrada de agua pero no la salida o un tapn
dos y tomar muestras de distintos rangos de profundidad de goma en la parte superior; con botellas oceanogrficas,
(0-5, 5-10, 10-15, 15-20 m) de la columna de agua. o incluso con un cubo si se trata de una zona de agua bien
mezclada.

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Temperatura y salinidad - Sondas multiparamtricas y CDTs

2.2.1 Temperatura y salinidad. Sondas nutrientes y el agua aflorada del fondo, mas fra y rica en
multiparamtricas y CTDs nutrientes.

Al hacer los muestreos de fitoplancton, es importante tener


La temperatura (T) y salinidad (S) son importantes parmetros en cuenta la distribucin vertical de T y S tpica de la localidad.
ambientales que afectan a la fisiologa de las microalgas. Cada Las capas con fuertes gradientes de densidad son importantes
especie tiene un rango ptimo de T y S dentro del cual su zonas de agregacin de microorganismos (por acumulacin
desarrollo es ptimo. Adems de los valores absolutos de T y fsica o por ser una capa de condiciones ptimas de crecimien-
S es muy importante conocer su distribucin vertical. Las ca- to) y de formacin de mximos de clorofila.
ractersticas termo-halinas del agua determinan su densidad, y
la tasa de variacin de la densidad con la profundidad (gradiente La toma de datos de T y S se puede hacer mediante (Fig. 1):
de densidad) determina la estabilidad esttica de la columna Mtodo tradicional: lance de botellas oceanogrficas con
de agua. termmetros de inversin. Se toma agua de la botella
Los mximos poblacionales (picos) de muchas especies FAN oceanogrfica en botellas de vidrio con tapa de rosca para
se han reportado en asociacin con marcados gradientes de determinacin de salinidad (S) en laboratorio.
densidad de la columna de agua tales como los observados Termmetro de inmersin (precisin de 0.1 C) y botella
en: oceanogrfica para toma de muestra de agua para determi-
a) Termoclinas o capas de agua con gradiente de temperatura nar S en laboratorio.
pronunciados que se forman en las pocas de mxima Sonda multiparamtrica (YSI 6600-2 u otras) con cable
insolacin. hidrogrfico de longitud suficiente para cubrir la profundi-
b) Haloclinas o capas de agua con gradiente de salinidad pro- dad deseada y con sensores para las variables contempla-
nunciado que se forman tras fuertes lluvias, o en zonas de das en el estudio.
aportes de agua dulce, tales como los estuarios. Sonda CTD (Conductivity, Temperature, Depth). Estos equi-
c) Picnoclinas o capas de agua con gradiente de densidad pro- pos brindan una mayor precisin que las sondas
nunciado. La nutriclina o capa de agua con gradiente de multiparamtricas en los datos para estudios oceanogrficos
nutrientes pronunciado suele coincidir con la picnoclina. y pueden incluir sensores para otros parmetros (fluores-
cencia in vivo, oxgeno disuelto, pH, turbidez, etc.). Re-
En zonas de afloramiento, la nutriclina es la zona de transi- quieren de un buen servicio de calibrado. Al sumergirlo en
cin entre la capa de agua de superficie, ms clida y pobre en el agua (lance) hay que dejarlo al menos 1 min en reposo
antes de hacerlo descender.

Fig. 1. Izda., uso de termmetro de inmersin introducindolo directamente en la botella oceanogrfica; Centro, sonda multiparamtrica
YSI para medir temperatura y salinidad; Dcha. Sonda multiparamtrica CTD (Conductivity, Temperature, Depth) colgada del torno del barco
antes de ser lanzada.

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Gua de monitoreo de microalgas txicas

2.2.2 Transparencia: disco de Secchi

El disco de Secchi es un sencillo instrumento artesanal uti-


lizado para estimar la penetracin luminosa o transparencia
del agua, que es inversamente proporcional a la turbidez de la
columna de agua. A su vez, la turbidez depende de la concen-
tracin de partculas en suspensin, tales como el fitoplancton, soga
sedimentos de erosin o resuspendidos del fondo, descargas
de efluentes de origen antropognico, etc. Este material en
suspensin causa dispersin (scattering) y absorcin de la luz
por las substancias coloreadas (pigmentos, substancias
hmicas disueltas).

Los componentes del disco de Secchi (Fig. 1) son:

Crculo de aproximadamente 30 cm de dimetro, preferen-


temente de polietileno, que puede llevar o no un refuerzo
de acero inoxidable; color blanco, o si se prefiere aumentar
el contraste, alternancia de color blanco y negro en el crculo
dividido en cuartos disco
Cuerda o soga atada al disco, que deber ir graduada (des-
tacando las marcas cada metro y otras intercaladas cada
25 cm);

Peso o plomo para el lastrado del disco.

Para la medicin de la profundidad de visin del disco Lastre o


Secchi, se baja el disco desde la embarcacin, a sotavento y en plomo
el lado de sombra para evitar reflejos en la superficie. El disco
debe ir bien lastrado, para conseguir la mxima
perpendicularidad del cabo que lo sujeta respecto a la superfi-
cie y minimizar la accin de la corrientes.

Se anota la profundidad a la que llega el disco justo cuando se


pierde de vista. Para hacer una medicin adecuada, se requiere
hacer ligeros largados y tirones del disco hasta ubicar la pro-
fundidad en la que deja de verse. Para mayor precisin de la
medida, repetir la operacin y anotar el valor promedio de las
dos medidas.

A partir de las medidas anteriores se puede estimar la profun-


didad de compensacin (aproximadamente 2.7 veces la pro-
fundidad de visin del disco de Secchi), profundidad a la que
el oxgeno producido por fotosntesis es igual al consumido
por respiracin. Esta es la capa donde la disponibilidad de la
luz permite la fotosntesis y por tanto la capa de agua apta
para el crecimiento del fitoplancton.

La medida de profundidad de visin del disco Secchi


(D) es de gran utilidad para elegir las profundidades
adecuadas de toma de muestras para anlisis de
fitoplancton. As pues, en aguas ocenicas muy trans-
parentes la capa ftica y profundidad de compensacin
(aprox. 2.7 x D) es mucho ms profunda que en aguas
costeras de elevada turbidez, y es necesario planear las
profundidades de toma de muestras en consonancia.

Fig. 1. Distintos modelos y partes de un disco de Secchi y aspecto


de un disco sumergido en aguas con abundantes pigmentos
verdosos.

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Redes de plancton

2.2.3 Redes de plancton Si fuera a transcurrir mucho tiempo (varias horas) desde la
colecta hasta la observacin, se recomienda fijar una alcuo-
ta de la muestra con formol (al 4% final), ya que las mues-
El fitoplancton se presenta normalmente en densidades mo- tras de arrastre se estropean rpido, en especial si son muy
deradas o bajas que dificultan su observacin directa al mi- densas y cuando la temperatura ambiente es elevada.
croscopio ptico, por lo que se necesita una concentracin de
la muestra. Las redes de plancton troncocnicas constituyen el
mtodo ms tradicional de muestreo empleado para concen- La muestras obtenidas con arrastres de red no son ade-
trar muestras de campo (Fig. 1). cuadas para anlisis cuantitativos, pues la red es un
mtodo selectivo (selecciona a las especies de tamao
superior a la abertura de malla y deja escapar gran parte
Para los muestreos rutinarios de programas de
de las pequeas). No obstante, la gran cantidad de agua
monitoreo de FANs se emplearn redes de plancton
filtrada con un simple arrastre vertical en la capa de agua
con una apertura de malla de 10-20 m. Se har un
iluminada, podr permitir la deteccin temprana de es-
arrastre vertical, desde la profundidad de la capa ftica
pecies potencialmente txicas que son poco abundan-
(estimada a partir de la profundidad de visin del disco
tes (ej. Dinophysis spp.) o que se encuentren en la fase
de Secchi) hasta superficie.
inicial de desarrollo de la floracin (ej.: Alexandrium spp)
en concentraciones inferiores al lmite de deteccin me-
Al llegar al sitio de muestreo, los pasos a seguir son: diante la tcnica de Utermhl (20-40 cel L-1 si se em-
plean columnas de sedimentacin de 25-50 ml).
Se baja la red de plancton de la embarcacin con su colector,
peso o plomo y cabo (soga) con marcas de longitud.

Se asegura que la red no haya acumulado bolsas de aire que Es muy aconsejable mantener la muestra de arrastre sin fijar
impiden su descenso vertical y la hacen flotar. En el ltimo para su observacin microscpica in vivo tan pronto como se
caso, purgar la red, es decir, hacer que entre agua por la llegue al laboratorio, ya que hay especies desnudas cuya identi-
boca y salga por el colector, izarla y bajarla de nuevo. ficacin es mucho ms fcil de esta manera. Las muestras se
mantendrn en frascos de vidrio y en un recipiente termoaislante
Cuando la red llega a la profundidad deseada, comenzar a porttil. Si la coloracin del arrastre denotara una elevada con-
izarla lenta y cuidadosamente (la malla es un material muy centracin de plancton, se diluir la muestra con agua de la
delicado que se rompe con facilidad). misma estacin hasta que adquiera una tonalidad muy ligera.
En el caso de manchas, se puede muestrear directamente con
Una vez recuperada la red, desenroscar (o desmontar) el
un recipiente (sin red) y conviene diluir con agua ms clara de
colector y verter el contenido en el recipiente donde ser
otra profundidad, si se pretende que las clulas lleguen vivas al
transportado in vivo al laboratorio.
laboratorio. Si por otra parte se observa una concentracin

Fig. 1. Izda. Red de plancton con colector con llave acoplada para la descarga de la muestra. Dcha. Red de plancton con colector o copo y
peso acoplado para el descenso en el agua (modelo suministrado a los participantes en el proyecto RLA/7/014).

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Gua de monitoreo de microalgas txicas

muy elevada de organismos zooplanctnicos, conviene pasar contrario, la malla se ir obstruyendo paulatinamente, y per-
la muestra por una malla de 150 m para eliminar a los gran- der eficiencia de filtrado. No se recomienda el uso de sopor-
des filtradores (si bien corremos entonces el riego de perder tes o aros metlicos, que acortan la vida de la red por proble-
dinoflagelados de gran tamao, como Noctiluca spp., o las mas de corrosin, siendo satisfactorios los soportes de PVC y
cadenas largas de algunos Alexandrium spp. y Gymnodinium la sujecin con fuertes hilos de algodn graso o de nylon. El
spp.). colector puede ser un cilindro de PVC, con fondo cerrado, que
causar menos friccin a las clulas que en el caso de colectores
Las redes se enjuagarn despus de su uso con agua dulce con con fondo desmontable de red. Existen diseos modernos
ayuda de una manguera. A veces puede ser necesario lavar la de red cuyo colector lleva una llave en el extremo inferior, lo
red (sin el colector y los aros de sujecin) con una pequea que facilita sobremanera la recolecta dela muestra.
cantidad de detergente neutro (o en una lavadora domstica
con un ciclo de lavado para prendas delicadas o lana). De lo

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Botellas oceanogrficas

2.2.4 Botellas oceanogrficas Las antiguas botellas Nansen llevaban pares de termmetros
de inversin acoplados. Cuando eran golpeadas por el men-
sajero giraban 180, lo cual haca que se cortara la columna de
Las botellas oceanogrficas son equipos diseados para to- mercurio del termmetro de inversin para que se mantuvie-
mar muestras de agua a una profundidad especfica de la co- ra la medida de temperatura tomada in situ. De esta forma, se
lumna de agua. La botella, que es un cilindro metlico o pls- obtena agua y se meda la temperatura de la misma a una
tico con dos tapas, se sujeta a un cable con sus dos tapas profundidad determinada. La diferencia de lectura entre el ter-
abiertas y sujetas de forma que se disparen y cierren cuando se mmetro encapsulado (resistente a la presin) y el otro no
presione el dispositivo de cierre por el mensajero. protegido, permita hacer estimaciones de presin. Actualmente
Los pasos a seguir son (Fig. 1): se usan las botellas Niskin, que no giran al ser golpeadas, y la
temperatura se mide con sondas multiparamtricas
Sujetar la botella al cable, con las dos tapas sujetas en modo (termosalinmetros, CTD, etc.). En campaas oceanogrficas
abiertas se usan las rosetas o dispositivos circulares que agrupan
hasta 24 botellas Niskin en un mismo lance (Fig. 1).
Hacer descender la botella en el agua mediante el cable; una
vez alcanzada la profundidad requerida, se lanza a travs
del cable un peso metlico denominado mensajero. Cuan- Las botellas oceanogrficas suministran muestras de
do el mensajero golpea el dispositivo de cierre, las dos agua apropiadas para anlisis cualitativo y cuantita-
tapas se cierran inmediatamente, y la botella atrapa el agua tivo de fitoplancton en una profundidad determi-
de la profundidad a la que se encontrab. nada de la columna de agua. Si se lanza un nmero
suficiente de botellas por estacin de muestreo, permi-
Izar el cable y recuperar la botella. Se pueden fijar en el cable ten describir la distribucin vertical de las especies
una secuencia de botellas y mensajeros a intervalos deter- fitoplanctnicas de inters y de los organismos que las
minados de forma que se tomen simultneamente, en un acompaan.
mismo lance, muestras de distintas profundidades.

Fig. 1. Izda., botella oceanogrfica armada antes de ser lanzada, con las tapas abiertas. b) Centro, botella recuperada tras lanzar el mensajero
e izarla. c) Dcha., roseta con 24 botellas oceanogrficas.

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Gua de monitoreo de microalgas txicas

2.2.5 Tubos y Mangueras muestreadoras

Las microalgas del plancton, y en especial los dinoflageladas


por su capacidad de desplazarse verticalmente en la columna
de aguapueden presentar una distribucin vertical muy
heterognea. Algunas especies pueden formar capas finas,
es decir, agregaciones de alta densidad en franjas muy estre-
chas (de unos centmetros a unos pocos metros) de la colum- Fig. 2. Detalle de las llaves de paso.
na de agua. Los mtodos de muestreo convencionales con
botellas oceanogrficas pueden no detectar estas altas densi- columna de agua, pero se pierde informacin sobre la distri-
dades si se encuentran en otras profundidades que las deter- bucin vertical de los organismos.
minadas para el muestreo. Esto supone un riesgo para los
programas de monitoreo que necesitan obtener resultados A continuacin se describe la preparacin y utilizacin de una
cuantitativos sobre las concentraciones de especies potencial- manguera divisible en segmentos de 5 m cada uno (Lindahl
mente txicas. 1986), cuyo uso en programas de monitoreo de fitoplancton
potencialmente txico fue recomendado desde 1986 por los
El muestreo adecuado de aguas estratificadas requiere tomar expertos del Grupo de Trabajo del CIEM sobre Fitoplancton y
muestras a distintas profundidades (4-5 por lo menos) con Gestin de sus Efectos. En estaciones ubicadas en aguas some-
botellas oceanogrficas, lo que multiplica sobremanera el tra- ras se puede sustituir la manguera divisible por un muestreador
bajo de anlisis. Una alternativa es el muestreo con mangue- de manguera de tramo nico (muestreador de Lund), o inclu-
ras, que proporcionan una muestra integrada de la columna so por un tubo de PVC con tapn en el extremo superior,
de agua. De esta forma, no se pierde ningn punto de que permite tomar muestra de un cilindro de la columna de
muestreo aunque se pierde informacin sobre la distribucin agua. Es recomendable aadirle una vvula de retencin del
vertical del plancton. No obstante, se puede preparar una agua (check) en el extremo inferior (Figs. 5 y 6)
manguera muestreadora divisible en tramos o segmentos,
cada uno de los cuales representa un intervalo de profundi- Preparacin y utilizacin de la manguera
dad de la columna de agua (Fig. 1).
muestreadora

Material y Mtodos

Manguera de jardinera de goma, de preferencia transpa-


rente, con un dimetro interno de 12-25 mm. (las de pls-
tico son menos recomendables, pues se ponen rgidas con
el fro). Importante: a la longitud deseada (que depende de
la profundidad de la estaciones de muestreo) hay que
sumar la distancia que va desde la superficie del agua (mar-
car con cinta aislante la marca de superficie) hasta la zona
de trabajo en la cubierta de la embarcacin (tramo de color
rojo en la Fig. 1). No se recomienda usar mangueras de
longitud superior a 20 m. Se puede variar la longitud (m)
y nmero de los segmentos.

Fig. 1. Muestreador de manguera divisible en 4 segmentos de 5m


cada uno, para muestreos integrados de la columna de agua
(Lindahl 1986). Ntese la marca de superficie y el tramo adicional
de manguera (marcado con rojo), desde la superficie del mar hasta
la cubierta del barco, que se debe sumar a la longitud (5 m) del
primer tramo.

Las muestras de manguera son apropiadas para anlisis cuali-


tativo y cuantitativo de fitoplancton. Permiten una gran re-
duccin de trabajo de anlisis, y aseguran la deteccin de espe-
cies nocivas que se encuentren agregadas en capas finas de la Fig. 3. Plomo con forma de disco que rodea el extremo inferior de
la manguera de muestreo (Foto R. Raine).

19
Mangueras muestreadoras

Manguera, sujeta por el extremo superior, Llave de paso preparada para su Operacin de largado de la manguera con las llaves
enrollada en la cubierta de la embarcacin. descenso en el agua, en posicin de de paso en posicin de abierto (Paso 1).
abierto.

Operacin de recuperacin/izado de la manguera llena de agua. Se Recipientes de plstico con rangos de profundidad marcados (0-5,
cierran las llaves de paso a medida que van apareciendo al izar la 5-10, 10-15, 15-20) para verter el contenido de los distintos tramos de
manguera. la manguera.

Vaciado de un tramo de manguera en el Toma de una alcuota, para anlisis cuantitatvo de fitoplancton u
recipiente que le corresponde, tras abrir la otros anlisis, en frasco debidamente etiquetado (fecha, estacin,
llave de paso. rango de profundidad).

Fig. 4. Pasos a seguir para la utilizacin de la manguera divisible.

20
Gua de monitoreo de microalgas txicas

Peso o plomo de 2 kg, que debe ir alrededor del extremo


inferior de la manguera de forma que no interfiera con la
circulacin de entrada del agua (Fig. 3).

Recipientes de plstico en los que se marca con tinta inde-


leble el rango de profundidad al que corresponde la mues-
tra de cada segmento de manguera que se vierte en ella.

Paso 1. Se hace descender lentamente la manguera, asegurn-


dose de que no est doblada por ningn sitio, a una velocidad
mxima de 20 m min-1, con todas las llaves de paso abiertas,
hasta llegar a la marca de superficie (Fig. 4).

Paso 2. Una vez la marca de superficie toca el agua, se cierra la


llave de paso superior. De esta forma, toda el agua que contie-
ne la manguera queda retenida por capilaridad.

Paso 3. Se empieza a recuperar la manguera, y se cierran las


llaves de paso a medida que aparecen.

Paso 4. Una vez en la cubierta de la embarcacin, se separan los


conectores y cada tramo o segmento se vaca en una garrafa de
plstico debidamente etiquetada. El extremo en el que se en-
cuentra la llave de paso deber estar en posicin elevada res-
pecto al resto para facilitar el vaciado; el recipiente para recoger
el agua deber ser amplio, de forma que permita agitar la mues-
tra antes de tomar las alcuotas para asegurarse de que se toma
una muestra representativa del intervalo de profundidad
muestreado.

Paso 5. Se toman alcuotas de agua en frascos debidamente


etiquetados y se fija inmediatamente la muestra con solucin
cida de Lugol (0.5 mL/100mL). La muestra fijada debe tener
un color similar al del whisky.

Referencias

Lindahl O. 1986. A dividable hose for phytoplankton


Fig. 5. Tubo muestreador (> 2 m), con vlvula de retencin del sampling. In: Report of the Working Group on on
agua en el extremo inferior, utilizada por INVEMAR (Colombia).
Exceptional algal blooms. International Council for the
Exploration of the Sea, C.M. 1986/L:26, Annex 3.
Conectores de presin, como los de PVC usados en jardi-
nera. Se recomienda aadir ganchos y cuerdas que sujeten Boltovskoy A. 1990. Muestreador de agua tubular con vlvula
los tramos de manguera adyacentes para evitar prdidas en de cierre autnomo. Revista de Hidrobiologa Tropical 23: 171-
caso de fallo del conector. 173. http://horizon.documentation.ird.fr/exl-doc/
pleins_textes/cahiers/hydrob-trop/34029.pdf
Llaves de paso (o grifos) de polipropileno, que permiten
abrir o cerrar la entrada de agua mediante un simple giro de
45 (Fig. 2).

Fig. 6. Detalles de la vlvula check de piso utilizada en los muestreos con el tubo de 2 pulgadas de dimetro (Foto INVEMAR, Colombia)

21
Fijadores/conservantes de las muestras de plancton

2.2.6 Fijadores/conservantes de las El formaldehdo es txico por inhalacin, irritante moderado


muestras de plancton por contacto directo con la piel, irritante severo para los ojos
y cancergeno por exposicin crnica. El uso de este conserva-
dor debe realizarse en reas ventiladas (en algunos pases se
Ante todo, es importante aclarar que no existe un fijador y exige la instalacin de extractores de aire encima de cada mi-
agente conservante universal adecuado para todos los tipos croscopio donde se trabaje con muestras fijadas con formol).
de microalgas, por lo que deben ser seleccionados dependien- Se debern usar guantes para la manipulacin y evitar expo-
do del objetivo de estudio (o fijar alcuotas de la muestra con nerse a sus vapores. La sedimentacin de muestras (para el
distintos fijadores para que sirva para mltiples propsitos). mtodo Utermhl) se har preferentemente bajo campana de
gases.
El fijador y conservante ms usado es la solucin de yoduro
potsico, conocida como solucin de de Lugol (cida, neutra o La concentracin del formol comercial es de 37-40%, lo cual ha
alcalina) (Tabla 1). Si las muestras se almacenan durante largos de tenerse en cuenta a la hora de hacer los clculos de la canti-
perodos de tiempo deben ser preservadas con formaldehdo dad que se aadir a las muestras para fijarlas. Si la concentra-
neutro (Tabla 2). cin final en la muestra fijada es del 4%, ello supondr diluir
10 veces la solucin comercial del 40%, o lo que es lo mismo,
La solucin de Lugol: se utiliza para perodos de conservacin
aadir 1 volumen de formol por cada 9 de muestra. El formol
cortos (unos pocos meses), no destruye los dinoflagelados
neutralizado es el ms apropiado para evitar el deterioro de las
atecados, pero destruye los cocolitofridos cuando la solu-
muestras de plancton.
cin es cida. El Lugol es el conservante ms recomendado
para el recuento del fitoplancton y microalgas bentnicas ya En el caso de muestras poco concentradas, basta con aadir 2-
que no presenta los inconvenientes de higiene y seguridad en 5 ml de la solucin de formaldehdo neutro por cada 100 mL
el trabajo que supone el uso de formol. de volumen final de muestra.
Tabla 1. Composicin de la solucin de Lugol (cido, alcalino y neutro) (Andersen & Throndsen, 2004).

cido Alcalino Neutro


20 g yoduro de potasio (IK) 20 g yoduro de potasio (IK) 20 g yoduro de potasio (IK)
10 g yodo (I2) 10 g yodo (I2) 10 g yodo (I2 )
20 g acido actico concentrado 50 g acetato de sodio 200 mL agua destilada
200 mL 200 mL agua destilada

Tabla 2. Receta para preparacin del formaldehdo neutro (Throndsen 1978; Andersen & Throndsen 2004). Filtrar despus de una semana
de preparado para eliminar precipitados.

Formaldehdo neutro Formaldehdo neutro


500 mL formaldehdo 40% 500 mL formaldehdo 40%
500 mL agua destilada 500 mL de agua destilada
100 g hexametilentetramida (C6H12N4) Neutralizar con una solucin de borato de sodio (Na2B4O710H2O) saturada
pH 7.3 7.9 pH 7-7.5

El lugol se degrada por foto-oxidacin, por lo que las mues- Referencias


tras se deben conservar en la oscuridad, en frascos ahumados, Andersen P, Throndsen J (2004) Estimating cell numbers.
y hay que controlar peridicamente la prdida de color de la In: Halle-graeff GM, Anderson DM, Cembella AD (eds)
muestra, aadiendo ms reactivo si fuera necesario. Alternati- Manual on Harm-ful Marine Microalgae. UNESCO, Paris,
vamente, existen frascos de vidrio (ms caros) impermeable a pp. 99-129.
los rayos UV, que permiten conservar las muestras fijadas con
Lugol sin que se pierda el color, durante largos perodos de Intergovernmental Oceanographic Commission of
tiempo. Para el conteo de la mayora de las microalgas (excepto UNESCO. 2010. Karlson, B., Cusack, C. and Bresnan,
para cocolitofridos) se recomienda el empleo de la solucin E. (editors). Microscopic and molecular methods for
cida de Lugol. quantitative phytoplankton analysis. Paris, UNESCO.
(IOC Manuals and Guides, no. 55.) (IOC/2010/MG/
Se recomienda una concentracin de 0.2 a 0.5 ml de la solucin 55), 110 pages. (English only) http://ioc-unesco.org/hab
de Lugol (color final como whisky; puede ser necesario aadir
ms en muestras con ms contenido de plancton) por cada Throndsen J (1978) Chapter 4. Preservation and storage. In:
100 mL de volumen final de muestra. Sournia A (ed.): Phytoplankton manual. UNESCO
Monogr. Oceanogr. Method. UNESCO. 6: 69-74
El Formaldehdo (formol, formalina, metanal o cido frmico
HCOH) es un fijador y conservador cido (pH 3-4.5). Es
agresivo para los dinoflagelados atecados o desnudos:
distorsiona la forma de las clulas, se pierden los flagelos, y en
algunos casos la clula se desintegra.

22
Gua de monitoreo de microalgas txicas

2.3 Material y mtodos para el muestreo de debe hacer nfasis en los estudios taxonmicos de estos orga-
microalgas bentnicas nismos (Litaker et al. 2009).

Existen algunas especies de dinoflagelados epibentnicos pro-


La ciguatera es una intoxicacin alimentaria, endmica de los ductores de toxinas que pertenecen a los gneros Prorocentrum
trpicos y subtrpicos, causada por la ingesta de peces porta- (cido ocadaico y derivados), Ostreopsis y Coolia (ostreocina,
dores de toxinas de la familia de la ciguatoxina y maitotoxina. palytoxinas, substancias causantes de irritaciones en las vas
Los agentes productores de las toxinas son dinoflagelados respiratorias a travs del spray marino) y Amphidinium spp.
epibentnicos del gnero Gambierdiscus que viven en detritus, (substancias hemolticas). As pues, a travs del mismo vector
fanergamas marinas y macroalgas asociadas a sistemas de se puede adquirir una compleja mezcla de toxinas causantes
arrecifes. Las toxinas son acumuladas inicialmente en los pe- de distintos sndromes y que antes se englobaban bajo el
ces herbvoros que se alimentan de las macroalgas. Por proce- trmino comn de ciguatera.
sos de bioacumulacin, a travs de la cadena alimenticia, las
toxinas se trasmiten desde los peces herbvoros hasta los car- El presente protocolo establece una metodologa para la co-
nvoros. lecta y conteo de dinoflagelados epibentnicos agentes de la
ciguatera u otros sndromes txicos (Yasumoto et al. 1977,
La ciguatera constituye un problema para la salud pblica. Las Quod et al. 1995, Hallegraeff et al. 2003, Laurent et al. 2005).
personas que consumen los peces intoxicados pueden sufrir El mtodo es simple, relativamente barato y bsicamente cons-
trastornos gastrointestinales, neurolgicos, cardiovasculares y ta de tres etapas:
en casos extremos, fallos respiratorios y muerte. Adems, se
trata de un sndrome recurrente: los pacientes quedan sensibi- 1. Colecta de la muestra sustrato (macroalgas).
lizados y sufren rebrotes txicos. Aunque la ciguatera es un 2. Desprendimiento de los dinoflagelados del sustrato y su
fenmeno natural, catalogada como una enfermedad rara va- fijacin.
rios siglos atrs, en la actualidad ha alcanzado proporciones 3. Recuento y estimacin de la densidad de dinoflagelados.
epidmicas en varias reas geogrficas principalmente en las
islas del Pacfico sur, y en menor medida en el Caribe. Existen 2.3.1 Colecta de la muestra sustrato (macroalgas)
evidencias de que el deterioro de los arrecifes coralinos por la
actividad humana y los huracanes propicia el establecimiento Equipamiento
de macroalgas oportunistas que constituyen el substrato id-
neo para los dinoflagelados epibentnicos. Proteccin del personal:
Botas
La descripcin de la especie tipo del gnero, Gambierdiscus toxicus Guantes
Adachi & Fukuyo, en 1979, en las islas Gambier (Polinesia
Francesa) permiti dilucidar el origen de la ciguatera. Poste- Chaleco salvavidas (para muestreo desde embarcacin).
riormente fueron descritas 5 nuevas especies productoras de Recoleccin de muestras (Fig. 1):
toxinas: G. belizeanus para el Caribe, y G. yasumotoi, G. australes, Equipo de buceo autnomo (SCUBA) para colectas en
G. pacificus y G. polynesiensis para el Pacfico. Est pendiente de reas profundas o equipo ligero de buceo (snorkelling) para
confirmacin el carcter toxgeno de otras especies del gnero, colectas en reas someras.
tales como G. carolinianus, G. ruetzleri, G. caribaeus y G. carpenteri.
Las investigaciones realizadas sobre el gnero han revelado Bolsas de plstico para la recoleccin de la muestra sustrato.
que las diferencias morfolgicas entre especies, con muy dis- Marcador indeleble para etiquetar las bolsas.
tinto potencial txico, son a menudo sutiles, por lo que se Botellas plsticas de tapn de rosca para anlisis qumico.

Equipo de buceo SCUBA.


Equipo ligero para buceo autnomo (snorkeling), bolsas plsticas y
marcador impermeable.
Fig. 1. Parte del equipamiento bsico para la ercoleccin de la muestra sustrato (macroalgas).

23
Muestreo de microalgas bentnicas

Comunidades de macroalgas en la regin intermareal.

Comunidades de macroalgas en zonas de arrecifes coralinos.


Fig. 2. Biotopos apropiados como sitios de muestreo.

Amphiroa fragilissima Turbunaria turminata Halimeda incrassata

Dichotomaria obtusata Sargassum sp. Dictyota menstrualis


Fig. 3. Macroalgas ms idneas como muestra sustrato.

24
Gua de monitoreo de microalgas txicas

Sonda multiparamtrica con sensores de temperatura, pH, se debe tomar rodeando la macroalga o especie sustrato con la
salinidad, oxgeno disuelto y clorofila a. bolsa de plstico antes de arrancarla para que no se pierda el
Sistema global de posicionamiento (GPS) para marcar los material adherido. Asegrese de que la bolsa est apropiada-
sitios de colecta. mente etiquetada (fecha, sitio de colecta, estacin) con tinta
indeleble. Selle la bolsa con la muestra de macroalgas y agua de
Embarcacin con el equipo de seguridad apropiado (para
mar circundante para su posterior procesamiento.
colectas en aguas alejadas de la costa).
Seleccin de las estaciones de muestreo (Fig. 2). Datos y muestras complementarios
Para la seleccin de los sitios de muestreo debe tenerse en Se considera importante tomar datos complementarios sobre
cuenta que sean sustratos representativos de las comunidades los factores ambientales en los sitios de muestreo:
bentnicas: arrecifes, pastos marinos, comunidades de ma-
croalgas, manglares, etc., segn las caractersticas del rea de
estudio. La ubicacin del sitio debe grabarse con un GPS. Para
definir el sitio de colecta, es importante tomar en cuenta la
informacin epidemiolgica de la ciguatera en las comunida-
des locales.

Frecuencia de muestreo
La periodicidad mensual de muestreo permite alcanzar un
nivel de descripcin aceptable. No obstante es deseable una
mayor frecuencia para estudios de dinmica del sistema.

Seleccin de la muestra-substrato (Fig. 3).


La mayora de los estudios han demostrado que las macroal-
gas calcreas articuladas y las carnosas son las mejores opcio-
nes como sustrato de los dinoflagelados bentnicos asocia-
dos a la ciguatera. Las macroalgas rojas (Rhodophyceae) de los
gneros Jania y Amphiroa; la macroalga parda (Phaeophyceae)
del gnero Turbinaria y las verdes (Chlorophyceae) calcreas
articuladas del gnero Halimeda son buenas elecciones como
sustratos, debido a que tienden a hospedar mayor nmero de
dinoflagelados bentnicos, son muy comunes en las zonas
arrecifales y dejan menos residuos que otras macroalgas en el
momento del desprendimiento. Otras macroalgas abundan-
tes en zonas arrecifales son las rodofceas del gnero
Dichotomaria y las feofceas de los gneros Sargassum y Dictyota
(Littler & Littler, 2000).

Conviene elegir una misma especie de macroalga para todas


las estaciones de muestreo, lo que permitir realizar compara-
ciones espacio-temporales precisas. No se recomienda
Colecta de forma manual de alrededor de 250 gramos de la
muestrear las macroalgas verdes foliosas y filamentosas (Ulva,
macroalga seleccionada.
Cladophora, Chaetomorpha) como sustrato debido a que tienen
un ciclo de vida efmero. En ausencia de macroalgas, se pue-
den seleccionar otros sustratos como corales muertos,
fanergamas marinas, detrito de manglar y superficie de sedi-
mento.

Toma de muestra (Fig. 4).


Las colectas se realizan en zonas del intermareal (siempre por
debajo de la zona de marea) o en zonas arrecifales ms pro-
fundas. Esto puede requerir el uso de equipos de buceo aut-
nomo (SCUBA). Por cada sitio de colecta (uno en 10 m de
longitud) se tomarn dos rplicas de cada muestra.

Para cada muestra, colectar de forma manual alrededor de 250


g de macroalga. Si existen datos preliminares que evidencien
una alta abundancia de los dinoflagelados, el peso de la mues-
Sellaje de la bolsa con la muestra de macroalgas y agua de mar
tra de macroalgas puede ser menor (50-100 g), con lo que se circundante.
evitar el exceso de detrito en el material colectado. La muestra
Fig. 4. Colecta de macroalgas en la regin intermareal.

25
Muestreo de microalgas bentnicas

Aspecto del agua (presencia de natas, espumas, acumula- Agregue Lugol cido (hasta obtener un color coac o whis-
ciones de algas). ky) para la fijacin de la muestra..
Temperatura, salinidad, turbidez, pH, oxgeno disuelto.
Macronutrientes y clorofila a.
Muestra-sustrato para su identificacin, fijada con formol
al 4% final.
Tngase en cuenta que la solucin comercial de formol es al
40%. Por tanto, una concentracin final al 4% se consigue
mezclando una parte de la solucin de formol comercial y 9
partes de la muestra.

2.3.2 Desprendimiento y conservacin de los


dinoflagelados

Equipamiento y reactivos (Fig. 5)


Tamices de 250 m, 150 m y 20 m de luz de malla.
Agua de mar filtrada.
Frasco lavador (pizeta) de plstico.
Probeta graduada (de 100 ml).
Viales de vidrio o plstico de 50-100 ml con tapn de
rosca. Reactivos (Lugol y formol)
Pipetas de 5 o 10 ml.
Balanza electrnica porttil.
Formaldehdo.
Solucin cida de Lugol.
El formaldehdo neutro al 4% de concentracin final es un
fijador que resulta agresivo para algunas estructuras celulares
(destruye los dinoflagelados bentnicos atecados, tales como
los del gnero Amphidinium). No obstante, es adecuado para la
conservacin permanente de las muestra de dinoflagelados
tecados. Dada la naturaleza txica de esta sustancia, se deben
tomar precauciones (trabajar en un ambiente bien ventilado,
usar guantes y recipientes bien cerrados) y para observacin al
microscopio, lavar con agua destilada previo a su anlisis para
eliminar el exceso de formol y resuspender en agua de mar
filtrada (un volumen final igual al de la muestra original).

La solucin de Lugol se utiliza para perodos de conservacin


cortos (unos pocos meses). Permite conservar los dinoflage-
lados atecados potencialmente txicos del gnero Amphidinium. Tamices con diferente luz de malla
Se recomienda utilizar Lugol (por ser menos txico) para fija-
cin de muestras dedicadas al recuento de los dinoflagelados.
No obstante, tngase en cuenta que es un fijador ms lbil y
puede ser necesario volver a aadir fijador para prevenir creci-
miento de bacterias.

Proceso de desprendimiento (Fig. 6):


Agite vigorosamente la bolsa durante 2 min para despren-
der los dinoflagelados asociados a las macroalgas.
Retire la macroalga y filtre la suspensin de agua de mar
contenida en la bolsa a travs de tres tamices superpuestos
de 250 m, 150 m y 20 m.
Lave con agua de mar filtrada con ayuda de un frasco lavador
(pizeta) y recupere el residuo contenido en el ltimo tamiz
Agua de mar filtrada y parte del equipamiento (probeta, pipeta,
(fraccin de 15020 m) hasta un volumen de alrededor
viales plsticos)
de 50 ml. Virtalo en una probeta y anote el volumen final. Fig. 5. Parte del equipamiento y reactivos necesarios.

26
Gua de monitoreo de microalgas txicas

Vierta el contenido de la probeta en un frasco de 50-100 ml


apropiadamente etiquetado y sellado para su almacena-
miento. Es importante anotar el volumen final de la mues-
tra contenida en el frasco. Todas las muestras fijadas se
conservarn protegidas de la luz y en lugar fresco.
Pese la muestra de macroalga contenida en la bolsa, des-
pus de haberle eliminado el exceso de agua con papel
absorbente, junto con el material retenido en la malla de
250 m que se recuperar con una cucharilla de plstico.
Para almacenamiento de largo trmino, se aadir formol (4%
final) a las muestras de Lugol.

Agitar vigorosamente la bolsa durante 2 minutos NOTA: Los tamices de 250 m y 150 m tienen la funcin de
limpiar la muestra del exceso de residuos (detrito, restos de
macroalgas, etc). En el caso de no contar con stos, se pueden
utilizar tamices de mayor luz de malla, incluidas mallas de uso
domstico. En el caso de no contar con el tamiz de 20 m,
toda el agua de mar filtrada en los tamices de 250 m y 150
m, se conservar y se medir su volumen para ser procesada
en el paso 3 (proceso de recuento)

2.3.3. Recuento y estimacin de la densidad


de los dinoflagelados bentnicos asociados
a la ciguatera

Filtrar sucesivamente a travs de tres tamices


(250 m, 150 m y 20 m) Equipamiento
Microscopio binocular
Microscopio invertido
Cmara de conteo Sedgewick-Rafter
Cmara de sedimentacin para microscopio invertido.
Cmara digital acoplada al microscopio
Formularios para anotar el recuento de las especies
Guas de identificacin e iconografas adecuadas al mbito
de estudio.
Se recomienda realizar una visualizacin previa de la muestra,
al microscopio binocular, antes de iniciar el recuento, con la
finalidad de confeccionar una lista de los taxones presentes en
la muestra, y tener una visin general de la densidad de los
dinoflagelados.
Lavar el residuo contenido en el tamiz de 20 m con agua de
mar filtrada Proceso de recuento
El anlisis cuantitativo de los dinoflagelados bentnicos se
realiza aplicando la misma metodologa empleada para los
anlisis cuantitativos de fitoplancton. Existen dos alternati-
vas para el recuento:

Recuento en microscopio binocular con cmara de conteo


Sedgewick-Rafter: Este mtodo es apropiado cuando la
densidad de dinoflagelados es alta y las especies son de
tamao grande.
Recuento al microscopio invertido con cmara o cubeta de
sedimentacin segn el Mtodo Utermhl. Se recomienda
cuando la densidad de dinoflagelados es ms baja, o bien
se realiza el recuento de una especie poco abundante, en
cuyo caso se debe realizar el recuento de la cmara de sedi-
mentacin completa.
Medir el volumen final de la muestra

27
Muestreo de microalgas bentnicas

Para estimar la concentracin de dinoflagelados bentnicos,


expresada en cel/g de macroalga, se harn los siguientes cculos:

Si se utiliza una cmara de conteo Sedgewick-Rafter (sec-


cin 3.1), se utilizar la siguiente frmula:
D = N ( 1000/ Cc ) (Vm/ Pm)

en la que:

D: densidad celular en cel/g

N: Nmero de clulas contadas de una especie determinada

Cc: Nmero de cuadraditos barridos


Verter la muestra en un frasco de 50-100 ml apropiadamente
etiquetado y sellado para su almacenamiento Vm: Volumen de la muestra (mL)

Pm: Peso hmedo de la macroalga (g)

Si se utiliza el Mtodo Utermhl (seccin 3.2), se utilizar


la siguiente frmula:
D = N ( S/s) (Vm/ Vs) (1/Pm)

en la que:

D: densidad celular en cel/g

N: Nmero de clulas contadas de una especie determinada

S: rea total de la cmara de conteo (mm2)

Agregar lugol cido para la conservacin de la muestra s: rea de la placa de sedimentacin barrida (mm2)

Vm: Volumen de la muestra

Vs: Volumen sedimentado en la cmara de conteo (mL)

Pm: Peso hmedo de la macroalga (g)

Almacenamiento de los datos


Los resultados de los anlisis cualitativos y cuantitativos de-
ben ser almacenados en hojas de clculo (hojas Excel). Esto
facilitar la representacin grfica de los resultados en estudios
sobre variacin espacio-temporal en relacin con los
parmetros ambientales.
Pesar la muestra de macroalgas
Fig. 6. Proceso de desprendimiento. Referencias
Adachi R, Fukuyo Y. 1979. The thecal structure of a marine
Clculo de la concentracin de dinoflagelados toxic dinoflagellate Gambierdiscus toxicus new-genus new-
bentnicos species collected in a ciguatera endemic area. Nippon Suisan
Gakkaishi 45: 6772.
Una vez estimada la concentracin de dinoflagelados por uni-
Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD. 2003. Manual
dad de volumen de la muestra analizada, se calcula la cantidad
on Harmful Marine Microalgae. Monographs on
de clulas correspondiente al volumen total de la muestra
Oceanographic Methodology 11, UNESCO, Paris, 793 pp.
obtenida. Este resultado (clulas) se divide por el peso hme-
do (g) total de la macroalga colectada. La concentracin final se Laurent D, Yeeting B, Labrosse P, Gaudechoux JP. 2005.
expresa en nmero de cel/g de macroalga hmeda. Ciguatera: a field reference guide. Secretariat of the Pacific
Community, 88 pp. http://www.spc.int/coastfish/
Es importante la identificacin correcta de la macroalga sustrato publications/340.html (English and French)
debido a que la relacin superficie/volumen y el peso (por el Litaker RW, Vandersea MW, Faust MA, Kibler SR, Chinain M,
contenido de agua o elementos calcreos) difiere entre distin- Holmes MJ, Holland WC, Tester PA. 2009. Taxonomy of
tas especies de macroalga. Esto se debe tener en cuenta al hacer Gambierdiscus including four new species, Gambierdiscus
comparaciones de abundancia de dinoflagelados bentnicos
presentes en distintas muestras-sustrato.

28
Gua de monitoreo de microalgas txicas

caribaeus, Gambierdiscus carolinianus, Gambierdiscus carpenteri Lassus, G Arzul, P Erard-Le Denn, P Gentien, C.
and Gambierdiscus ruetzleri (Gonyaulacales, Dinophyceae). Marcaillou-Le Baut (eds), Harmful Marine Algal Blooms.
Phycologia 48: 344390. DOI:10.2216/07-15.1 Lavoisier Intercept Ltd, Paris, pp. 815-820.
Littler DS, Littler MM. 2000. Caribbean Reef Plants: An Yasumoto T, Nakaijima I, Bagnis RA, Adachi R. 1977. Finding
identification Guide to the Reef Plants of the Caribbean, Bahamas, of a dinoflagellate as a likely culprit of ciguatera. Bulletin of
Florida and Gulf of Mexico. Offshore Graphics Inc., Flori- the Japanese Society of Scientific Fisheries 43: 10211026.
da, US, 542 pp.
Quod JP, Turquet J, Diogene G, Fessard V. 1995. Screening of
extracts of dinoflagellates from coral reefs (Reunion Island,
SW Indian Ocean) and their biological activities. In: P

29
Protocolo de recogida y transporte de muestras

2.4 Material y mtodos para el muestreo de 2. Se vierte el arrastre en una jarra con asa o similar y se pasa
fitoplancton y fitobentos para anlisis de por malla de 100-150 m para eliminar organismos gran-
des del microzooplancton que interfieren en el anlisis;
toxinas asegurarse de que el material est bien mezclado. Si la mues-
tra no se filtra a bordo, diluir el arrastre con agua de mar de
Protocolo 1 superficie, guardar el arrastre en un recipiente de vidrio y
mantener en nevera porttil o sitio fresco; de lo contrario
las clulas del arrastre pueden empezar a romperse y el
Este protocolo permite relacionar el contenido de toxinas de contenido de toxinas se libera al agua y se pierde.
la muestra recogida en un filtro con la concentracin estimada
de clulas potencialmente txicas por unidad de volumen del 3. Antes del filtrado se toma una alcuota (submuestra) de
material filtrado. As pues, permite llegar a una estimacin del 100 mL en frasco ahumado o protegido contra los rayos
contenido de toxina por clula. Las toxinas sern extradas UV, y se fija con solucin de Lugol al 0.5%. En caso de
por el qumico analtico en el mismo tubo de fondo cnico mancha o de cultivo se toma un volumen mucho menor
tipo Falcon (Fig. 1) en el que se guard la muestra. La muestra (10 mL). Esta muestra es para anlisis cuantitativo de las
de partida puede ser: microalgas.
a) Una muestra de plancton concentrado. La concentracin 4. Tomar un volumen fijo (medido con la probeta) de arras-
puede llevarse a cabo mediante arrastre de red de plancton; tre (o suspensin de bentnicos o de cultivo) y filtrarlo a
filtrado de agua tomada con bomba a travs de mallas travs de filtro de fibra de vidrio con bomba de vaco
superpuestas; filtrado de un volumen conocido de agua a (Millipore u otras) asegurndose de que la muestra final
travs de un filtro. haya filtrado bien toda el agua. Anotar el volumen (V)
filtrado. Apoyndose en el portafiltros, sujetar el borde del
b) Una mancha de plancton (marea roja), que debido a su filtro con la pinza, doblarlo sobre s mismo, 2 o ms veces,
densidad no necesita concentracin previa. y con la misma pinza, sujetar el filtro doblado e introdu-
c) Una muestra de dinoflagelados bentnicos resuspendidos cirlo cuidadosamente dentro de un tubo de fondo cnico
en agua de mar filtrada (ver seccin 2.3). y tapn de rosca (tipo Falcon).

d) Un cultivo de laboratorio. 5. Verter, hasta que el filtro quede bien empapado, un volu-
men medido de: a) metanol (p.a.) si se van a realizar anli-
Material sis de toxinas lipoflicas (DSP, Ciguatera, etc.) o b) solucin
Red de plancton de 20 m de apertura de malla y malla de clorhdrico (H Cl) 0.1 N si es para anlisis de toxinas
adicional de 100-150 m para eliminar el zooplancton. hidroflicas (PSP).

Frasco para toma de muestra de agua (alcuota para conteo


de plancton) y solucin de Lugol como fijador.

Recipiente (jarra de plstico con asa o similar) para recoger


el arrastre.

Probetas de laboratorio graduadas.

Filtros de fibra de vidrio (tipo Whatman GF/C, de 1.2 m


de poro).

Equipo de filtracin (bomba de vaco y portafiltros).

Pinzas de laboratorio.

Tubos de fondo cnico tipo Falcon o similar de polietileno,


de 15 mL para almacenar el filtro (Fig. 1). No usar tubos de
policarbonato.

Congelador de -20C.

Metanol (calidad p.a. = para anlisis) para toxinas


liposolubles (Ej. toxinas DSP) o solucin 0.1 N de H Cl
para toxinas hidrosolubles (ej. toxinas PSP).

Mtodo
1. Se hace un arrastre vertical de plancton con red de 20 m de
apertura de malla; en el caso de mancha de plancton (marea Fig. 1. Tubos Falcon de 15 ml y de 50 ml. Ideales para centrifugacin
roja) o cultivo monoalgal, se procesa la muestra directa- de muestra concentrada de plancton y tratamientos posteriores para
mente sin necesidad de concentracin previa. extraccin de toxinas. Tambin podemos utilizarlos para colocar en
ellos el filtro doblado.

30
Gua de monitoreo de microalgas txicas

6. Guardar inmediatamente la muestra en un congelador a (paso 3) horas antes de que se haga el filtrado (paso 4),
una temperatura de -20C hasta el momento de transpor- pues las clulas presentes en una y otra muestra no coinci-
te/anlisis. diran (clulas del arrastre o mancha que mueren y revien-
tan durante la espera).
7. Estimar la concentracin (C) en cel/mL (conteo con cma-
ra Sedgewik-Rafter; media de 3 conteos de 1 mL) de clulas En lugar del arrastre, se podran filtrar directamente mues-
potencialmente txicas por unidad de volumen de mues- tras de agua de mar. No obstante, si las clulas potencial-
tra de arrastre/mancha/resuspensin bentnicos/cultivo. mente txicas estn presentes en concentraciones bajas
(< 103 cel/L), o con mucho material acompaante, se nos
8. Estimar el nmero (N) de clulas potencialmente txicas pueden atorar los filtros mucho antes de haber filtrado
contenido en el filtro una cantidad de clulas txicas que permita su deteccin
con los sistemas de anlisis disponibles.
N=CxV
El equipo de filtracin y los filtros que se emplean en esta
donde N es el nmero de clulas potencialmente txicas con-
tcnica son los mismos (excepto el tamao de poro, que
tenidas en el filtro; V es el volumen filtrado (mL) y C es la
para clorofilas es de 0.45 m) que los que se emplean para
concentracin de clulas potencialmente txicas (cel/mL) pre-
filtracin de agua para anlisis de clorofilas. No obstante, si
sentes en la muestra filtrada.
no se dispone de este equipo, y sobre todo cuando se
Antes del transporte/envo: filtran muestras densas de cultivos de laboratorio, se pue-
Tapar la boca del tubo con parafilm para prevenir prdidas den utilizar pequeas bombas de filtracin manuales o
por evaporacin y cerrar con el tapn de rosca asegurndo- incluso montarse una trompa de vaci propia conectando
se de que queda bien apretado. el portafiltros a un grifo de agua corriente (Figs. 2 y 3).

Consideraciones importantes: Los tubos de policarbonato son muy frgiles y se resienten


Cuanto ms alta es la concentracin de clulas por unidad con la congelacin/descongelacin. Es bastante habitual
de volumen, menos volumen ser necesario filtrar; de lo que se agrieten y rompan mientras el analista los centrifuga.
contrario se atoran los filtros. Para anlisis cromatogrficos
sera suficiente una muestra de 10-20 mL si se trata de un Protocolo 2
cultivo monoalgal o de una densa mancha (marea roja).
En el caso de arrastres es ms complejo: puede haber mu- Igual en todo que el protocolo 1 excepto que la muestra de
cho material acompaante (diatomeas, detritus) que difi- concentrado de microalgas (arrastre/mancha/resuspensin
cultan la filtracin y pocas clulas potencialmente txicas. bentnicos/cultivo) se centrifuga en vez de filtrarse. As pues,
al llegar al paso 4 del protocolo 1 se procede de la siguiente
La alcuota del arrastre/mancha/cultivo que se fija con
manera:
Lugol es para estimar la concentracin de clulas potencial-
mente txicas (C) y as poder despus estimar el nmero 1. Centrifugar un volumen conocido de concentrado de
(N) de clulas que hay en el volumen (V) de arrastre/man- microalgas (arrastre/mancha/resuspensin bentnicos/
cha/cultivo filtrado. cultivo) durante 10 min. a 1000 rpm si se trata de especies
de microalgas desnudas (Ej. Gymnodiniun catenatum) que
Lo ideal es hacer el filtrado (paso 4) tan pronto como se
revientan con facilidad, y hasta 2000 rpm si se trata de
toma la muestra. De no ser posible, hay que asegurarse de
dinoflagelados tecados (Ej. Alexandrium spp., Pyrodinium
que la muestra llega en buen estado antes de filtrarla. No
bahamense) en tubos tipo Falcon de fondo cnico.
vale tomar la muestra para conteo que se fija con Lugol

Fig. 2. Equipo de filtracin (portafiltro) con trompa de vaco acoplada a la llave de agua del fregadero. La foto de la dcha. muestra la
coloracin del plancton acumulado en el filtro de fibra de vidrio. (Foto P. Riob)

31
Protocolo de recogida y transporte de muestras

2. Eliminar el sobrenadante, asegurndose de que la pellet Protocolo 3


queda bien escurrida de agua.

3. Resuspender la pellet con metanol (toxinas lipoflicas) o Igual en todo que el protocolo 1 excepto que la muestra de
con H Cl 0.1 N (toxinas hidroflicas) para extraer las toxi- concentrado de arrastre/mancha/resuspensin bentnicos/
nas en el mismo tubo donde se centrifug. cultivo se liofiliza. As pues, se sustituye el paso 4 del protoco-
lo 1 por la liofilizacin de un volumen conocido de concentra-
4. Guardar en congelador a -20C hasta el momento de an- do de microalgas (arrastre/mancha/resuspensin bentnicos/
lisis/transporte. cultivo).
Precauciones a considerar: Consideraciones:
Muy importante: examinar el sobrenadante al microsco- Muy cmodo para el transporte de muestra y altamente reco-
pio para asegurarse de que todas las clulas han sedimenta- mendado para procesar muestras voluminosas de carne de
do. En caso contrario, sera necesario cuantificar la concen- bivalvo. Para muestras pequeas de plancton, las muestras
tracin de clulas del sobrenadante y restarlos del nmero liofilizadas a veces presentan interferencias en el anlisis debi-
de clulas N que se estim que haba en la pellet. Si no se do a transformaciones de las protenas y lpidos durante la
cumpliera esta precaucin, no se obtendran estimaciones liofilizacin.
cuantitativas fiables de cantidad de toxina por clula.

Algunos dinoflagelados formadores de cadenas, tales como


G. catenatum, son muy buenos nadadores y cuando se so-
meten a centrifugacin suave (necesaria para no romper las
clulas) escapan nadando hacia la superficie del tubo.

Fig. 3. Izda., bomba de vaco manual. Dcha., sistema de filtracin con trompa de agua.

32
Gua de monitoreo de microalgas txicas

3. Anlisis cuantitativo. de que no quedan clulas en suspensin. Al igual que con la


concentracin mediante filtracin, permite una rpida obser-
Consideraciones generales vacin de la muestra.

La sedimentacin de un volumen conocido de agua, y en


El objetivo de los anlisis cuantitativos de microalgas es obte- especial el mtodo Utermhl (ver seccin 3.2), es el mtodo
ner una estimacin, lo ms precisa posible, del nmero de estndar ms empleado en los programas de investigacin y
organismos presentes de cada especie por unidad de volu- control que requieren efectuar anlisis cuantitativos del
men. fitoplancton. La aplicacin de este mtodo requiere el uso de
un microscopio invertido en el cual los objetivos estn situa-
Con frecuencia las especies microalgales se encuentran en las dos debajo de la platina donde se coloca la muestra (Fig. 1).
muestras de campo en concentraciones que hacen difcil su
observacin directa mediante mtodos tradicionales de Habitualmente se fijan las muestras de campo con distintos
microscopa ptica. Es necesario, pues, proceder a concentrar agentes fijadores/conservantes (ver seccin 2.2.6) que pueden
las muestras antes del anlisis. servir a un doble propsito: a) conservar la muestra hasta el
momento de anlisis; b) aumentar el contraste de las clulas,
Los mtodos habituales de concentracin son: muchas de ellas translcidas, para facilitar su observacin e
Filtrado a travs de mallas o filtros con una apertura de identificacin. Los microscopios, a su vez, pueden estar dota-
malla/poro que depender del tamao de los organismos dos de sistemas pticos que aumentan el contraste, tales como
objeto de estudio. Se anotar el volumen inicial (V) y el el contraste de fases, y el sistema Nomarski (DIC, contraste de
volumen final (v) para estimar el factor de conversin. interferencia diferencial). Adems, pueden llevar acoplado un
equipo de fluorescencia, que permite observar la
Centrifugacin de un volumen conocido de muestra (V), autofluorescencia in vivo de las especies pigmentadas, o la fluo-
eliminacin del sobrenadante (tras comprobar que no se rescencia debida a fluorocromos (calcoflor, DAPI, Sybr Green,
pierden clulas) y resuspensin del sedimentado (pellet) en etc.) que tien especficamente determinadas molculas que
un volumen menor (v) de agua. Se anotar el volumen conforman orgnulos y cubiertas celulares.
inicial (V) y el volumen final (v) para estimar el factor de
conversin (v/V). En este manual se explican los anlisis cuantitativos mediante
cmaras Sedgewick Rafter (seccin 3.1), que se pueden realizar
Sedimentacin de un volumen conocido de agua en una con microscopio compuesto directo (Fig. 2) o con microsco-
superficie calibrada. pio invertido y mediante la tcnica de Utermhl con cmaras
de sedimentacin (seccin 3.2).
Las filtraciones a travs de mallas o tamices son mtodos
selectivos que seleccionan a los organismos de un rango de
talla determinado. Pueden ser recomendables en el seguimien-
to y deteccin temprana de microalgas potencialmente txicas
de tamao medio (> 40-50 m) presentes en bajas concentra-
ciones.

La concentracin del microplancton mediante centrifugacin


puede ser apropiada para especies no delicadas (que pueden
reventar durante el proceso), pero este mtodo requiere un
procesado inmediato de la muestra viva tan pronto llega al
laboratorio, y la observacin del sobrenadante para asegurarse

Fig. 1. Microscopio ptico invertido con sistema de Fig. 2. Microscopio compuesto directo.
epifluorescencia acoplado.

33
 

      


 
 
  


 



     
 
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36

Conteos celulares con cmaras Sedgewick-Rafter


Fig. 2. Reticulacin (20 filas, 50 columnas) de una cmara Sedgewick-Rafter.
Gua de monitoreo de microalgas txicas

3.2 El mtodo Utermhl Frascos de muestras


Las muestras de agua para anlisis de fitoplancton se guardan
en frascos de boca ancha y tapn de rosca. Si las muestras estn
El mtodo Utermhl (1931, 1958) es el mtodo estndar ms fijadas con Lugol y se analizan rpido (pocos das despus de
empleado para la identificacin y cuantificacin de microalgas la toma de muestras) se pueden usar recipientes de plstico.
en muestras de agua. Est basado en la sedimentacin de una De lo contrario stos deben evitarse, pues el plstico absorbe
alcuota, de volumen conocido (5, 10, 25, 50, 100 mL), de una el Lugol y otros fijadores. Para muestras que se van a almace-
muestra de agua en una cmara de sedimentacin (Fig. 1). Las nar por ms tiempo, se deben usar recipientes de vidrio con
clulas, fijadas con agentes conservantes (formol, Lugol, etc.), tapa plstica. Puede ser vidrio transparente (que permite revi-
caen por gravedad y sedimentan en el fondo circular de la placa sar fcilmente si la muestra conserva su color de tincin carac-
de sedimentacin. Se asume que las partculas sedimentan terstico, o si es necesario aadir ms Lugol) o vidrio ahuma-
siguiendo una distribucin de Poisson. Las clulas sedimen- do. En cualquier caso, hay que procurar que la muestra no est
tadas se pueden identificar y enumerar al microscopio inverti- expuesta a la luz para evitar la degradacin del Lugol, por lo
do. La concentracin estimada se expresa en clulas por mL o que se deben almacenar en la oscuridad. Alternativamente, se
por L. pueden utilizar recipientes de borosilicato pyrex, que absor-
En la muestra sedimentada se presenta una mezcla de orga- ben la luz ultravioleta (proteccin contra la luz) y en los que se
nismos que sobre la base de su talla se clasifican en micro- (20- mantiene el Lugol en buenas condiciones durante meses, aun-
200 m), nano- (2-20 m) y picoplancton (0.2-2.0 m), y que que su precio es muy superior.
presentan abundancias crecientes. El conteo de taxones gran- Es importante asegurarse de que el tapn est perfectamente
des (50-100 m) y escasos requiere el barrido de todo el fondo cerrado para evitar prdidas por evaporacin. Si el recipiente
de la placa de sedimentacin a 100 aumentos. En el caso de no est completamente lleno, resulta ms fcil la
clulas pequeas (10-50 m) y abundantes, que se observan a homogenizacin de la muestra antes de verterla en las cmaras
250 o 400 aumentos, sera inviable contar todos los de sedimentacin.
especmenes sedimentados en el fondo de la placa por lo que
se cuentan los presentes en 1 o varios transeptos diametrales. Conservantes
Para el conteo de clulas pequeas (< 10 m) puede ser nece- El fijador a escoger depende del objetivo del estudio. No
sario el uso de objetivo de inmersin (1000 X) y se pueden existe un fijador universal que permita conservar en buen
contar los especmenes contenidos en varios cuadrados estado todos los grupos de microalgas. El ms utilizado es el
(retculos insertados en los oculares) en zonas elegidas al azar yoduro de potasio o solucin de Lugol cida, neutra o
en el fondo de la placa de un transepto diametral . alcalina (ver seccin 2.2.6). Para conservar muestras por largos
perodos de tiempo se debe utilizar solucin neutra de
formaldehdo (formol). Si se toman muestras para posterio-
res preparaciones para microscopa electrnica, el fijador reco-
Es necesario estimar la superficie (s) del transepto mendado es el glutaraldehdo.
diametral o la retcula barridos y qu fraccin (s/S) de la Cmaras de sedimentacin
superficie del fondo de la placa (S) representan. Es Las cmaras de sedimentacin constan de dos partes: la co-
decir, se necesita calibrar el microscopio y determinar lumna (o chimenea) y la placa de sedimentacin. La columna
unos factores de conversin (f) a aplicar para cada micros- suele ser de metacrilato, con un volumen de 5, 10, 25, 50 y 100
copio, retculas incorporadas en los oculares, superficie mL; el cristal de la base de la placa debe ser muy fino (0.2 mm)
de la placa de sedimentacin utilizada, volumen de para facilitar la observacin al microscopio invertido. Hay c-
muestra sedimentado y aumentos empleados. maras de sedimentacin simples y compuestas (Figs. 1 y 2).
En el caso de cmaras simples, el lquido de la muestra fijada
que se mantiene en la columna interfiere un poco con la visin

Fig. 1. Izda., cmaras de sedimentacin simples de 25, 10 y 5 mL; dcha. cmaras de sedimentacin compuestas: columnas de 10, 25, 50 y
100 mL y placa de sedimentacin con el cubre cuadrado (izda.) y llave (dcha.) para desenroscar el anillo metlico.

37
Mtodo Utermhl

Llenado de las cmaras, sedimentacin y vaciado de las


columnas
Se coloca la placa y columna de la cmara de sedimentacin,
sus bordes circulares alineados con precisin una sobre
otra, en una superficie lisa y nivelada.

Se procede al llenado de la cmara inmediatamente des-


pus de la homogenizacin de la muestra (no ms tiempo
que los pocos segundos que se tarda en abrir el recipiente),
pues de lo contario las partculas ms pesadas empiezan a
sedimentarse en el recipiente.

Se sujeta firmemente la cmara, sujetando la columna con


el dedo pulgar e ndice lo ms cerca posible de la base, y
presionando hacia abajo. En el caso de cmaras compues-
tas, se debe presionar hacia abajo la columna, bien colocada
sobre la placa, de forma que no se salga el lquido al verter-
lo.
Fig. 2. Distintas partes de las cmaras de sedimentacin compuestas.
Se llena la columna en exceso, para que al deslizar por su
parte superior el cubre circular grueso no se formen burbu-
de la muestra sedimentada en la placa. En el caso de las com- jas de aire en su interior. Se puede colocar un poco de papel
puestas, la columna se desliza y se elimina el lquido libre de de celulosa al lado de la base para que enjugue el lquido en
partculas (ya sedimentadas) antes de observar la placa, lo que exceso que se derrama al dar este paso. Algunos expertos
permite una visin ms ntida. untan ligeramente con vaselina la base de las columnas de
mayor tamao (100 mL) para asegurar que se mantengan
Las cmaras de sedimentacin disponibles comercialmente,
bien adheridas a la placa base.
en especial las compuestas, son muy caras. Distintos pases y
laboratorios consiguen a veces prepararse cmaras de sedi- El tiempo de sedimentacin depende de la altura de las
mentacin con artesanos locales a mucho menor precio. El columna y del fijador empleado (las partculas fijadas con
fino cristal de la base se puede conseguir en talleres de relojera. Lugol pesan ms que con otros fijadores). Una regla apro-
Lo importante es que el volumen de las cmaras est perfecta- piada es dejar sedimentar las muestras fijadas con Lugol
mente calibrado. El procedimiento a seguir es pesar las cma- tantas horas como la altura de la columna, en cm, multipli-
ras, primero vacas (la tara) y despus llenas de agua. La dife- cada por 3 (Cuadro I).
rencia (en gramos) ser igual al volumen (en mL) de agua
puesto a sedimentar.
Cuadro I. Mtodo Utermhl (cmaras de
Homogenizacin de las muestras
Antes de verter la muestra en la cmara de sedimentacin, hay sedimentacin)
que asegurarse de que las partculas suspendidas en el agua se
encuentren homogneamente distribuidas. Para ello, se suje- V de las cmaras (tamao muestra): 5-100 mL
tar el frasco firmemente y se voltear con suavidad, para
evitar rotura de colonias o formacin de burbujas, 30-50 ve- Tiempo de sedimentacin: 3 h x altura de la colum-
ces. Se pueden organizar ejercicios de control de la calidad de na en cm (en muestras fijadas con Lugol)
este paso para cada experto dispensando 3 alcuotas del mis-
Nivel de deteccin: 1000/V de la columna (ml)
mo recipiente y comprobando la variabilidad de las estimacio-
nes tras su conteo. Columna Nivel deteccin Factor

Concentracin/dilucin de las muestras 100 mL 10 cel/L x10


Algunas muestras pueden estar muy diluidas y el conteo sera 50 mL 20 cel/L x20
ms fcil tras un proceso de concentracin; otras pueden estar 25 mL 40 cel/L x40
muy concentradas y el conteo sera ms cmodo si se diluye-
10 mL 100 cel/l x100
ran. No obstante cada paso adicional supone aadir una nue-
va fuente de error. En general, es preferible usar cmaras de 5 mL 200 cel/L x200
sedimentacin (o barrido de transeptos) de distintos tama-
os segn la abundancia de las especies a contar. Excepcional-
Para el vaciado de las cmaras compuestas, colocar stas en
mente, para la deteccin temprana de especies potencialmente
un contenedor cilndrico u ortodrico, asegurndose de
txicas poco abundantes (por ej. Dinophysis spp.) se puede
que el orificio circular de vaciado est situado encima de un
aplicar una estrategia de muestreo adicional mediante concen-
lugar apropiado para el desage. Se coloca el cubre cuadra-
tracin por rango de tallas a travs de tamices y resuspensin
do a la derecha de la placa (un truco que ayuda al desliza-
en volmenes conocidos de agua de modo anlogo a lo ilus-
miento es aadir unas gotas de agua de mar filtrada en esta
trado para el muestreo de microalgas bentnicas (seccin 2.3).
zona) y deslizar, presionando con firmeza el cubre sobre la

38
Gua de monitoreo de microalgas txicas

placa, de derecha a izquierda, hasta que la columna quede fluorocromo calcoflor, ha supuesto un enorme avance para
situada encima del orificio de desage y la parte superior de la identificacin de especies tecadas. Las placas de celulosa tei-
la placa est perfectamente cubierta por el cubre cuadrado. das con calcoflor fluorescen color azul cuando se observan al
microscopio de epifluorescencia con un filtro de luz UV (ver
Las muestras deben dejarse sedimentar en un lugar a tempe- Anexo 6). Estas observaciones permiten describir detalles re-
ratura estable (controlada si fuera preciso), protegidas de ex- queridos para la identificacin de especie segn la nomencla-
posicin directa a los rayos solares, corrientes de aire etc. Cual- tura de placas.
quier perturbacin fsica podra crear corrientes de conveccin
en el lquido de la muestra, formacin de burbujas y otros Si no se dipone de sistema de epifluorescencia, el mtodo
inconvenientes que afectaran a la sedimentacin homognea alternativo (usado tradicionalmente) consiste en tratar la mues-
de las partculas. tra de clulas tecadas con hipoclorito sdico (leja) y observar-
las con campo claro al microscopio ptico.
Se recomienda ver las excelentes ilustraciones sobre este proce-
so presentadas en Villafae & Reid (1995) y disponibles en A la hora del conteo, resulta de gran ayuda disponer de un
I n t e r n e t : w w w. e f p u . o r g . a r / P D F _ p a p e r s / 1 9 9 5 / micrmetro ocular calibrado (para medir el tamao de los
Villafa%F1e95_Concepcion.pdf especmenes) y un ocular equipado con un accesorio que cons-
ta de dos lneas paralelas y otra perpendicular que delimitan
Limpieza de las cmaras de sedimentacin un transepto (para facilitar los barridos de un lado a otro de la
Las cmaras de sedimentacin se deben limpiar, inmediata- base de la cmara) (Fig 3A). Tambin es conveniente equipar
mente despus del anlisis de la muestra, para evitar la precipi- uno de los oculares con una retcula que facilita el conteo de
tacin de sales y el deterioro de los componentes metlicos de pequeas reas de organismos abundantes de muy pequeo
las mismas. Se utilizar un suave pincel, como los utilizados
en dibujo, y detergente neutro. El margen de la base circular de
la placa se puede limpiar con un palillo de dientes y si fuera
necesario, desenroscando el anillo metlico con la llave que se
suministra al comprar el conjunto de cmaras y sus accesorios.

Precauciones: hay que tener especial cuidado con la limpieza si


se han utilizado las cmaras para contar muestras con
microalgas productoras de muclagos, tales como dinoflagela-
dos bentnicos y algunas diatomeas formadoras de colonias.
Pueden permanecer adheridas al fino cristal de la placa incluso
tras el lavado.

El microscopio invertido

Los anlisis cuantitativos que utilizan cmaras de sedimenta-


cin se deben hacer utilizando un microscopio invertido de
buena calidad. La microscopia de contraste de fase (phase
contrast) o an mejor la Nomarski (microscopa de contraste de
interferencia diferencial, DIC = Differential Interphase Contrast)
aumentan el contraste y permiten identificar ms fcilmente
los rasgos morfolgicos de las clulas fitoplanctnicas, excep-
to en el caso de los cocolitofridos, que debido a su cubierta
calcrea se observan mejor con microscopa de campo claro
(LM Light microscopy). La microscopa de epifluorescencia,
que se utiliza para observar dinoflagelados teidos con el

Fig. 3. Accesorios que se colocan en los oculares para facilitar el Fig. 4. Arriba, micromtrico ocular, situado encima de una cadena
barrido y conteo de especmenes. A) Segmentos paralelos y uno de Cochlodinium sp., para medir los especmenes observados al
vertical para barridos diametrales. B) Retculos (Tomado de Edler & microscopio. Centro y abajo, micromtrico objetivo tal como se ve
Elbrchter 2010). desde el ocular y en la mano.

39
Mtodo Utermhl

tamao (pico- y nanoplanctnicos). Todos estos accesorios


de ayuda al conteo deben estar calibrados para cada aumento, Cuadro II. Estimacin de factores a
de cada microscopio, realizando las medidas con un aplicar en los conteos de microalgas en
micromtrico objetivo (Fig. 3B).
cmaras de sedimentacin
Protocolo de conteo
1. Hacer un rpido barrido de la placa de sedimentacin a 1. Estimacin de la superficie de la placa de sedi-
pocos aumentos (40X-100X) para hacerse una idea de la mentacin
densidad y distribucin de las clulas (Fig. 5). Esta rpida
ojeada permite:

Determinar si las clulas estn uniformemente distribui-


das. Las clulas agrupadas de forma heterognea podran r
indicar malas prcticas de laboratorio en el proceso de puesta
a sedimentar de la muestra (homogenizacin, vertido) o
que el mostrador de trabajo no est bien nivelado. S
Anotar las especies grandes y escasas que se enumerarn
barriendo toda la superficie de la placa.
S = 3.14 r2
2. Se identifican los organismos al nivel taxonmico ms (r = 13 mm)
bajo posible (gnero, especie o incluso estadios del ciclo S = 3.14 x 169 = 531 mm2
vital de una especie).
2. Clculo de la superficie de un transepto diametral
3. Se comienza por el conteo a bajo aumento (100X) de espe- de la placa
cies grandes y escasas (Dinophysis spp., Ceratium spp.) me-
diante barrido de toda la superficie de la placa. Este barrido
se hace mediante desplazamientos horizontales de izquier-
da a derecha y de derecha a izquierda (Fig. 5). Cada vez que
se llega al final de barrido de un transepto, a la derecha, hay
que descender, con ayuda del mando de desplazamiento
s h
coaxial, una distancia igual al dimetro del campo de visin S
o dimetro del ocular (considerar algn elemento de la
muestra en el borde de la cmara antes de desplazar el
campo de visin hacia abajo) para comenzar el barrido del s = 2r x h = 26 x h (mm2)
siguiente transepto de derecha a izquierda y as sucesiva-
h = anchura del campo de visin del ocular (o de la
mente hasta barrer todo el fondo de la cmara.
retcula marcada en el ocular)
4. A continuacin se hacen los conteos de especies de menor Estos parmetros se deben calibrar, para cada micros-
tamao y ms abundantes mediante barrido de transeptos copio, con sus distintos objetivos (aumentos) con un
diametrales a mayor aumento (400X). Para asegurarse de micromtrico objetivo.
que el barrido se hace diametralmente (pasando por el punto 3. Clculo del factor a aplicar cuando se cuentan
medio de la base), el extremo vertical del transepto debe transeptos diametrales

si en s hay n clulas
en S habr N
N = n x S/s = n x f
n es el n de clulas contadas en la superficie s del
transepto
N ser la cantidad estimada para todo el fondo de la
base (S)
El factor f (S/s) es distinto para cada objetivo del mi-
croscopio empleado
Una vez estimado el factor f , habr que multiplicar por
un factor de conversin, que vara segn el volumen de
la columna empleada, para estimar la concentracin en
Fig. 5. Arriba, esquema del recorrido a seguir con el objetivo clulas por litro:
durante el barrido de todo el fondo de la placa de sedimentacin. X 10 (columnas de 100 mL), X 20 (col. 50 mL), X 40
Abajo, esquema de distintas posibilidades de barridos: todo el
fondo de la placa (izda.), transeptos diametrales (centro) y una serie (col. 25 mL) o X 100 (col. 10 mL).
de cuadrculas (dcha.), (imgenes tomadas de Edler &
Elbrachter 2010).

40
Gua de monitoreo de microalgas txicas

Tabla 1. Relacin entre el nmero de clulas contadas y el lmite de to, desde el punto de vista estadstico, es decidir que las clulas
confianza, con un nivel de significacin del 95% (tomado de
en contacto con el borde superior del transepto se cuentan,
Andersen & Throndsen 2004).
mientras que las que se encuentran en el borde inferior se
omiten (o viceversa). En el caso de barrido de cuadrados,
contar las que tocan el lado superior y el izquierdo y obviar las
que tocan el lado inferior y el derecho (o viceversa).

Nivel de deteccin y precisin de los conteos en anlisis


cuantitativo de microalgas
Cuanto mayor sea el tamao de la muestra sedimentada (ta-
mao de columna), mayor ser el nivel de deteccin del
muestreo. Conocido el numero de clulas en todo el fondo de
la placa, se aplicar un factor (que depende del tamao de
columna empleado) para estimar la concentracin en cel/L.

Para obtener un resultado estadstico robusto del anlisis cuan-


titativo, es necesario contar un determinado nmero de clu-
las (o colonias, o filamentos). La precisin se expresa como
limite de confianza ( n%) con un nivel de confianza del 95%
(Tabla 1). As pues, si en una muestra contamos 50 clulas de
Pyrodinium bahamense, la precisin de nuestro conteo es de 28%,
si contamos 100, del 20%, si contamos 200, de 14%, y si
contamos 400, de 10%. El cientfico o agencia responsables
de supervisar la calidad de los conteos establecer sus normas
y la precisin que desea alcanzar en sus estimaciones. Puede,
por ejemplo, decidir que no compensa contar 400 (en vez de
200) clulas si con ello se gana un 4% (de 14 a 10%) de preci-
sin.

Referencias
Andersen P, Throndsen J. 2003. Estimating cell numbers. In:
GM Hallegraeff, DM Anderson, AD Cembella (eds). Ma-
situarse en la tangente de la placa de sedimentacin que se nual on Harmful Marine Microalgae. Monographs on
vea como una lnea recta (no curva), lo que indicar que nos Oceanographic Methodology 11. UNESCO, Paris, pp. 99-
encontramos en el extremo del dimetro. 129.
5. Por ltimo, se hace el barrido de varios cuadritos (retculas) Edler L, Elbrachter M. 2010. The Utermhl method for
para enumerar los especmenes de menor tamao. quantitative phytoplankton analysis. In B Karlson, C
Cusack, E Bresnan (eds). Microscopic and molecular methods
6. Se debe anotar cuidadosamente el nmero de clulas de
for quantitative phytoplankton analysis. IOC Manuals and
cada taxn y el factor a aplicar (que depender del rea barri-
Guides 55 (IOC/2010/MG/55), UNESCO, Paris, 110 pp.
da) en la hoja de clculo EXCEL para facilitar las estimacio-
(English only) http://ioc-unesco.org/hab.
nes de concentraciones celulares (Cuadro II).
Villafae EV, Reid FMH. 1995. Mtodos de microscopa para
Cuando se hacen conteos mediante barridos de toda la placa,
la cuantificacin del fitoplancton. In: K Alveal, ME Ferrario,
o de transeptos diametrales, es importante ser congruente en
EC Oliveira, E Sar (eds.). Manual de Mtodos Ficolgicos.
el criterio a aplicar sobre clulas que se encuentran en posicio-
Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile, pp. 169-
nes ambiguas (por ejemplo, con parte de la clula dentro y
185. www.efpu.org.ar/PDF_papers/1995/
parte fuera de los limites del transecto). El criterio ms robus-
Villafa%F1e95_Concepcion.pdf

41

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Anexos
Anexo 1: Listado de especies de microalgas txicas consideradas en el
proyecto RLA 7014

Anexo 2: Descripcin estaciones de muestreo y su localizacin

Anexo 3: Planilla de recoleccin de datos en los muestreos de microalgas

Anexo 4: Planilla (hoja Excel) para anlisis cuantitativos de microalgas

Anexo 5: Preparacin de carne de molusco para anlisis de toxinas


ANEXO 1. Listado de especies de microalgas txicas consideradas en el
proyecto RLA 7014
DIATOMEAS COL COS CUB ELS GUA MEX NIC DOM URU VEN

Amphora coffeaeformis
Nitzschia navis-varingica
Pseudo-nitzschia australis X
Pseudo-nitzschia calliantha
Pseudo-nitzschia cuspidata
Pseudo-nitzschia delicatissima X
Pseudo-nitzschia fraudulenta X
Pseudo-nitzschia galaxiae
Pseudo-nitzschia multiseries X
Pseudo-nitzschia multistriata ? X
Pseudo-nitzschia pungens ? X
Pseudo-nitzschia seriata
Pseudo-nitzschia turgidula
Pseudo-nitzschia grupo delicatissima X X X X X X
Pseudo-nitzschia grupo seriata X X X X X X

DINOFLAGELADOS COL COS CUB ELS GUA MEX NIC DOM URU VEN
Dinophysiales
Dinophysis acuminata X ? X
Dinophysis acuta X
Dinophysis caudata X X X X X X X
Dinophysis fortii X ? X
Dinophysis infundibulus
Dinophysis miles
Dinophysis mitra X X ?
Dinophysis norvegica
Dinophysis ovum X X X X X
Dinophysis rapa X
Dinophysis rotundata X X X X X
Dinophysis sacculus
Dinophysis tripos X X X X X
Gonyaulacales
Alexandrium acatenella
Alexandrium andersonii
Alexandrium balechii
Alexandrium catenella X X X
Alexandrium fundyense
Alexandrium hiranoi
Alexandrium minutum ?
Alexandrium monilatum X X
Alexandrium ostenfeldii ?
Alexandrium tamarense X X X X
Alexandrium tamiyavanichii X X
Alexandrium sp X X X
Coolia monotis ? X
Coolia sp. X
Gambierdiscus australes
Gambierdiscus pacificus
Gambierdiscus polynesiensis
Gambierdiscus toxicus X
Gonyaulacales (cont.) COL COS CUB ELS GUA MEX NIC DOM URU VEN
Gambierdiscus yasumotoi
Gambierdiscus spp X X X X X X X
Gonyaulax spinifera X X X
Lingulodinium polyedrum ? X
Ostreopsis lenticularis X X
Ostreopsis mascarenensis
Ostreopsis ovata X X X
Ostreopsis siamensis X X X
Ostreopsis sp. X X X X
Protoceratium reticulatum X
Pyrodinium bahamense X X X X
Pyrodinium bahamense var compressum X X X X X
Peridini/Prorocentr/Gymnodiniales
Azadinium spinosum ?
Heterocapsa circularisquama X ?
Heterocapsa sp X X
Pfiesteria piscicida
Pfiesteria shumwayae
Protoperidinium crassipes X X X
Prorocentrum arabianum
Prorocentrum arenarium
Prorocentrum belizeanum X
Prorocentrum borbonicum
Prorocentrum cassubicum
Prorocentrum concavum X X X
Prorocentrum emarginatum ? X X X
Prorocentrum faustiae
Prorocentrum hoffmannianum
Prorocentrum lima X X X X X X
Prorocentrum maculosum
Prorocentrum minimum X X X X
Prorocentrum rhathymum X X X X
Amphidinium carterae X
Amphidinium operculatum ?
Amphidinium operculatum var. gibbosum
Amphidinium sp X
Cochlodinium polykrikoides X X
Cochlodinium sp X ? X X X
Gymnodinium catenatum X X X X X X
Gyrodinium corsicum
Karenia bicuneiformis
Karenia brevis X X
Karenia brevisulcata
Karenia concordia
Karenia cristata
Karenia digitata
Karenia mikimotoi X
Karenia papilionacea
Karenia selliformis
Karenia umbella
Karenia sp X
Karlodinium armiger
Karlodinium veneficum
Takayama cladochroma
HAPTOFITAS COL COS CUB ELS GUA MEX NIC DOM URU VEN

Chrysochromulina leadbeateri
Chrysochromulina polylepis
Phaeocystis globosa
Phaeocystis pouchetii
Phaeocystis sp. X X
Prymnesium calathiferum
Prymnesium faveolatum
Prymnesium parvum
Prymnesium patelliferum
Prymnesium zebrinum

RAFIDOFITAS COL COS CUB ELS GUA MEX NIC DOM URU VEN

Chattonella antiqua
Chattonella globosa
Chattonella marina X
Chattonella ovata X
Chattonella subsalsa
Chattonella verruculosa
Fibrocapsa japonica X
Fibrocapsa sp X
Heterosigma akashiwo X

CIANOFITAS COL COS CUB ELS GUA MEX NIC DOM URU VEN

Anabaena circinalis X X
Anabaena cf spiroides X
Anabaena sp. X
Anabaenopsis X
Aphanizomenon flos-aquae ?
Cylindrospermopsis raciborskii X
Lyngbya majuscula X
Microcystis aeruginosa X X X X
Microcystis spp. X
Nodularia baltica spumigena X
Trichodesmium X X X X
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Anexo 3: Planilla de recoleccin de datos en los muestreos de
microalgas (Ej. Mazatln).
Muestreo con sonda YSI 63

Muestreo de Baha de Mazatln, enero a diciembre 2011. Fecha: _________

ESTACIN 1 Sur de la Baha


Ubicacin: 230948.3 N Lectura GPS: N
1062615.9 O O

Rumbo: 180 Hora inicial:


Profundidad de la estacin (m): Hora final:
Disco de Secchi (m): Profundidad de arrastre (min):
Oxgeno Temp Conduc Cond. Salini
Prof. Temp pH
tividad espec dad
sondaleza sonda Termm. Winkler sonda
#botella ml/l C S/cm
m ft C S
DBO
0.5 1.6
10 32
20 66
30 98

ESTACIN 2 Piedras Blancas


Ubicacin: 231111.6 N Lectura GPS: N
1062620.0 O O

Rumbo: 90 Hora inicial:


Disco de Secchi (m): Hora final:
Profundidad de la estacin (m): Profundidad de arrastre (m):
Oxgeno Temp Conduc Cond. Salini
Profundidad Temp pH
tividad espec dad
sondaleza sonda termm. Winkler sonda
#botella ml/l C S/cm
m ft C S
DBO
0.5 1.6
10 32

Participantes en la campaa:

Color o aspecto del agua (se puede aproximar el color sumergiendo unos centmetros el disco de
Secchi):
Intensidad de viento y direccin aproximada:
% de cobertura de nubes, neblina, bruma o lluvia durante el muestreo:
Problemas que se presentaron en la campaa:

Recomendaciones o reparaciones que atender para el siguiente muestreo:


 `4 $  8&0 -:  )     
 ! *

Estacin:
Tipo de muestra Fecha:
botella (profundidad en m)
Ttubo o manguera (tramo en m)
LISTA ESPECIES HAB

N clulas

Factor *

cel L-1
http://www.marinespecies.org
GRUPO
',$720($6

Amphora coffeaeformis 0
Nitzschia navis-varingica 0
Pseudo-nitzschia australis 0
Pseudo-nitzschia calliantha 0
Pseudo-nitzschia cuspidata 0
Pseudo-nitzschia delicatissima 0
Pseudo-nitzschia fraudulenta 0
Pseudo-nitzschia galaxiae 0
Pseudo-nitzschia multiseries 0
Pseudo-nitzschia multistriata 0
Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima 0
Pseudo-nitzschia pungens 0
Pseudo-nitzschia seriata 0
Pseudo-nitzschia turgidula 0

',12)/$*(/$'26
Order Dinophysiales
Dinophysis acuminata 0
Dinophysis acuta 0
Dinophysis caudata 0
Dinophysis fortii 0
Dinophysis infundibulus 0
Dinophysis miles 0
Dinophysis norvegica 0
Dinophysis ovum 0
Dinophysis rapa 0
Dinophysis rotundata 0
Dinophysis sacculus 0
Dinophysis tripos 0
Phalacroma mitra 0
Order Peridiniales incertae sedis
Azadinium spinosum 0
Heterocapsa circularisquama 0
Order Prorocentrales
Prorocentrum arabianum 0
Prorocentrum arenarium 0
Prorocentrum belizeanum 0
Prorocentrum borbonicum 0
Prorocentrum cassubicum 0
Prorocentrum concavum 0
Prorocentrum emarginatum 0
Prorocentrum faustiae 0
Prorocentrum hoffmannianum 0
Prorocentrum lima 0
Prorocentrum maculosum 0
Prorocentrum minimum 0
Prorocentrum rhathymum 0
Order Gymnodiniales
Amphidinium carterae 0
Amphidinium gibbosum 0
Amphidinium operculatum 0
Cochlodinium polykrikoides 0
Gymnodinium catenatum 0
Karenia bicuneiformis 0
Karenia brevis 0
Karenia brevisulcata 0
Karenia concordia 0
Karenia cristata 0
Karenia digitata 0
Karenia mikimotoi 0
Karenia papilionacea 0
Karenia selliformis 0
Karenia umbella 0
Karlodinium armiger 0
Karlodinium corsicum 0
Karlodinium veneficum 0
Takayama cladochroma 0
Order Gonyaulacales
Alexandrium acatenella 0
Alexandrium andersonii 0
Alexandrium balechii 0
Alexandrium catenella 0
Alexandrium cohorticula 0
Alexandrium fundyense 0
Alexandrium hiranoi 0
Alexandrium minutum 0
Alexandrium monilatum 0
Alexandrium ostenfeldii 0
Alexandrium peruvianum 0
Alexandrium tamarense 0
Alexandrium tamiyavanichii 0
Coolia tropicalis 0
Gambierdiscus australes 0
Gambierdiscus pacificus 0
Gambierdiscus polynesiensis 0
Gambierdiscus toxicus 0
Gambierdiscus yasumotoi 0
Gonyaulax spinifera 0
Lingulodinium polyedrum 0
Ostreopsis lenticularis 0
Ostreopsis mascarenensis 0
Ostreopsis ovata 0
Ostreopsis siamensis 0
Protoceratium reticulatum 0
Pyrodinium bahamense 0
+$372),7$6
Chrysochromulina leadbeateri 0
Chrysochromulina polylepis 0
Phaeocystis globosa 0
Phaeocystis pouchetii 0
Prymnesium calathiferum 0
Prymnesium faveolatum 0
Prymnesium parvum 0
Prymnesium patelliferum 0
Prymnesium zebrinum 0

5$),'2),7$6

Chattonella globosa 0
Chattonella japonica 0
Chattonella marina 0
Chattonella subsalsa 0
Fibrocapsa japonica 0
Heterosigma akashiwo 0
Heterosigma carterae 0

',&7,2),&($6

Pseudochattonella farcimen 0
Pseudochattonella verruculosa 0
ANEXO 5

Extraccin del tejido blando de organismos para anlisis de ficotoxinas

Para el monitoreo de toxinas marinas se utilizan preferentemente ejemplares de


moluscos bivalvos (mejilln, ostin, almeja). Si se trata de un evento txico, dependiendo
del tipo de toxinas, se pueden recolectar moluscos, peces, crustceos o algn otro grupo de
organismo que haya mostrado los efectos de la presencia de toxinas (ejemplo: pulpos). Se
recolectan los organismos en uno o varios puntos de muestreo. En el laboratorio se lavan
con un cepillo de cerdas plsticas, se les remueven otros organismos adheridos a la
superficie y se enjuagan con agua del grifo, se clasifican por especie y se ordenan en dos
grupos de mayor a menor tamao con el fin tener dos muestras similares de la poblacin.
Posteriormente se obtiene la talla (largo, ancho y espesor) de cada organismo, registrando
los datos en la bitcora (Fig. 1)

Figura 1. Distribucin de los organismos por talla.

El tejido blando se extrae con la ayuda de cuchillos de acero inoxidable y algunas


herramientas regionales que permitan romper la concha del molusco, o diseccionar rganos
segn sea el caso. Se recomienda conservar uno o dos juegos de conchas en el caso de
moluscos bivalvos para su identificacin o conservarlos en formol al 10% si se trata de
peces o crustceos para corroboracin de identificacin por especialistas.

Despus de extraer el tejido del primer organismo se coloca en un recipiente limpio


o bolsa con cierre hermtico y se registra el peso individual en la bitcora; de manera que
se tiene el peso hmedo por organismo, se eliminan los residuos de concha del tejido con
una pizeta con agua desionizada (Milli-Q), retirando el excedente de agua con una pipeta
Pasteur (Fig. 2).

Se homogenizan las muestras y una de las alcuotas se almacena en congelacin a


una temperatura menor a -20C, de ser posible de -40 a-70C Los anlisis de toxinas
paralizantes y amnsicas se realizan preferentemente en tejido fresco-congelado. Se debe
tomar la precaucin de que si se trata de toxinas amnsicas se deben mantener las muestras
en congelacin y a resguardo de la luz ya que el cido domoico es degradado rpidamente.

Figura 2. Procedimiento para extraccin de tejido y registro de peso

Homogenizacin y liofilizacin del tejido de ostin

Se recomienda liofilizar los tejidos para mayor seguridad en la conservacin de las


muestras sobre todo en zonas donde es frecuente la interrupcin de energa elctrica, la
degradacin del material y de las toxinas es menor en tejido liofilizado que en tejido fresco,

Despus de la congelacin por 72 horas, la muestra coloca en el interior de la


liofilizadora sin la tapa del recipiente o si se trata de bolsa, sta se abre completamente para
que se lleve a cabo la extraccin de la humedad de la muestra. Se coloca la tapa de la
liofilizadora cuidando que cierre hermticamente y que haga el vaco correctamente, las
muestras se dejan por 72 horas a 0.04-0-06 mbar y a -42 C. Posteriormente, se sacan las
muestras liofilizadas, se colocan las tapas correspondientes a cada bandeja y se registra el
peso seco en la bitcora del laboratorio. Se mantiene la alcuota fresca o liofilizada en
congelacin (-5C-20C) hasta su molienda (Fig. 3).

Figura 3. Proceso de licuado y liofilizacin del tejido

Molienda, empaque y sellado del tejido liofilizado

La muestra liofilizada se muele por medio de un molino elctrico o manual provisto


de un mortero y pistilo de gata o tefln. Esta es una etapa muy delicada, ya que si el
molino eleva la temperatura de la muestra las toxinas contenidas en ella podran
volatilizarse, por lo tanto, se debe cuidar la temperatura del molino, de observar
calentamiento, el proceso se debe interrumpir y esperar de 30 a 40 minutos para que baje la
temperatura (Fig. 4).

Para el empaque de las muestras, se utilizan bolsitas de polietileno previamente


etiquetadas con los datos correspondientes a cada muestra.
Figura 4. Proceso de molienda de tejido

El sellado de las muestras se hace por medio de una plancha o selladora elctrica, en
la cual, dependiendo de su tamao, se colocan 4 bolsas a la vez. Se debe cuidar que las
bolsas estn separadas unas de otras ya que el calor podra unir dos bolsas diferentes, el
planchando se hace rpida y suavemente para evitar que se queme la bolsa de la muestra.
Una vez terminado este proceso las muestras se colocan en bolsas con cierre hermtico
etiquetadas con los datos del muestreo, estas se mantienen en congelacin a una
temperatura de -4 a -20C hasta su anlisis. Resguardar de la luz si las muestras se
destinarn a anlisis de toxinas amnsicas.

Para el anlisis de toxinas en HPLC, los mtodos oficiales requieren de cantidades


pequeas tejido fresco-congelado para hacer las extracciones, 5 g de tejido fresco para la
tcnica de anlisis de toxinas paralizantes [AOAC 2005.06; Lawrence et al., 2005] y 10 g
para la tcnica de anlisis de toxinas amnsicas (Quilliam, 2003) o su equivalente en tejido
liofilizado:

5 g tejido fresco=5g*[1+(peso hmedo-peso seco/peso hmedo)]

10g de tejido fresco= 10g*[1+(peso hmedo-peso seco/peso hmedo)]


REFERENCIAS

AOAC Official Method 2005.06, 2005. Paralytic shellfish poisoning toxins in


shellfish: prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence
detection. Official Methods of Analysis of AOAC International.

Lawrence, J.F., Niedzwiadek, B., Menard, C., 2005. Quantitative determination of


paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish using prechromatographic oxidation and
liquid chromatography with fluorescence detection: collaborative study. J. AOAC Int 88,
1714-1732.

Quilliam, A.M. 2003. Chemical Methods for domoic acid, the amnesic shellfish
poisoning (ASP) toxin. In: G.M. Hallegraeff, D.M. Anderson & A.D. Cembella (Eds.),
Manual on Harmful Marine Microalgae, Monographs on Oceanographic Methodology,
Vol. 11, Chapter 9. Intergovernmental Oceanographic Commission (UNESCO), Paris, 247-
266.
IOC Manuals and Guides

No. Title

1 rev. 2 Guide to IGOSS Data Archives and Exchange (BATHY and TESAC). 1993. 27 pp. (English, French,
Spanish, Russian)
2 International Catalogue of Ocean Data Station. 1976. (Out of stock)
3 rev. 3 Guide to Operational Procedures for the Collection and Exchange of JCOMM Oceanographic Data.
Third Revised Edition, 1999. 38 pp. (English, French, Spanish, Russian)
4 Guide to Oceanographic and Marine Meteorological Instruments and Observing Practices. 1975.
54 pp. (English)
5 rev. 2 Guide for Establishing a National Oceanographic Data Centre. Second Revised Edition, 2008. 27 pp.
(English) (Electronic only)
6 rev. Wave Reporting Procedures for Tide Observers in the Tsunami Warning System. 1968. 30 pp. (English)
7 Guide to Operational Procedures for the IGOSS Pilot Project on Marine Pollution (Petroleum)
Monitoring. 1976. 50 pp. (French, Spanish)
8 (Superseded by IOC Manuals and Guides No. 16)
9 rev. Manual on International Oceanographic Data Exchange. (Fifth Edition). 1991. 82 pp. (French, Spanish,
Russian)
9 Annex I (Superseded by IOC Manuals and Guides No. 17)
9 Annex II Guide for Responsible National Oceanographic Data Centres. 1982. 29 pp. (English, French, Spanish,
Russian)
10 (Superseded by IOC Manuals and Guides No. 16)
11 The Determination of Petroleum Hydrocarbons in Sediments. 1982. 38 pp. (French, Spanish, Russian)
12 Chemical Methods for Use in Marine Environment Monitoring. 1983. 53 pp. (English)
13 Manual for Monitoring Oil and Dissolved/Dispersed Petroleum Hydrocarbons in Marine Waters and on
Beaches. 1984. 35 pp. (English, French, Spanish, Russian)
14 Manual on Sea-Level Measurements and Interpretation. (English, French, Spanish, Russian)
Vol. I: Basic Procedure. 1985. 83 pp. (English)
Vol. II: Emerging Technologies. 1994. 72 pp. (English)
Vol. III: Reappraisals and Recommendations as of the year 2000. 2002. 55 pp. (English)
Vol. IV: An Update to 2006. 2006. 78 pp. (English)
15 Operational Procedures for Sampling the Sea-Surface Microlayer. 1985. 15 pp. (English)
16 Marine Environmental Data Information Referral Catalogue. Third Edition. 1993. 157 pp. (Composite
English/French/Spanish/Russian)
17 GF3: A General Formatting System for Geo-referenced Data
Vol. 1: Introductory Guide to the GF3 Formatting System. 1993. 35 pp. (English, French, Spanish,
Russian)
Vol. 2: Technical Description of the GF3 Format and Code Tables. 1987. 111 pp. (English, French,
Spanish, Russian)
Vol. 3: Standard Subsets of GF3. 1996. 67 pp. (English)
Vol. 4: User Guide to the GF3-Proc Software. 1989. 23 pp. (English, French, Spanish, Russian)
Vol. 5: Reference Manual for the GF3-Proc Software. 1992. 67 pp. (English, French, Spanish, Russian)
No. Title

Vol. 6: Quick Reference Sheets for GF3 and GF3-Proc. 1989. 22 pp. (English, French, Spanish,
Russian)
18 User Guide for the Exchange of Measured Wave Data. 1987. 81 pp. (English, French, Spanish,
Russian)
19 Guide to IGOSS Specialized Oceanographic Centres (SOCs). 1988. 17 pp. (English, French, Spanish,
Russian)
20 Guide to Drifting Data Buoys. 1988. 71 pp. (English, French, Spanish, Russian)
21 (Superseded by IOC Manuals and Guides No. 25)
22 rev. GTSPP Real-time Quality Control Manual, First revised edition. 2010. 145 pp. (English)
23 Marine Information Centre Development: An Introductory Manual. 1991. 32 pp. (English, French,
Spanish, Russian)
24 Guide to Satellite Remote Sensing of the Marine Environment. 1992. 178 pp. (English)
25 Standard and Reference Materials for Marine Science. Revised Edition. 1993. 577 pp. (English)
26 Manual of Quality Control Procedures for Validation of Oceanographic Data. 1993. 436 pp. (English)
27 Chlorinated Biphenyls in Open Ocean Waters: Sampling, Extraction, Clean-up and Instrumental
Determination. 1993. 36 pp. (English)
28 Nutrient Analysis in Tropical Marine Waters. 1993. 24 pp. (English)
29 Protocols for the Joint Global Ocean Flux Study (JGOFS) Core Measurements. 1994. 178 pp . (English)
30 MIM Publication Series:
Vol. 1: Report on Diagnostic Procedures and a Definition of Minimum Requirements for Providing
Information Services on a National and/or Regional Level. 1994. 6 pp. (English)
Vol. 2: Information Networking: The Development of National or Regional Scientific Information
Exchange. 1994. 22 pp. (English)
Vol. 3: Standard Directory Record Structure for Organizations, Individuals and their Research Interests.
1994. 33 pp. (English)
31 HAB Publication Series:
Vol. 1: Amnesic Shellfish Poisoning. 1995. 18 pp. (English)
32 Oceanographic Survey Techniques and Living Resources Assessment Methods. 1996. 34 pp. (English)
33 Manual on Harmful Marine Microalgae. 1995. (English) [superseded by a sale publication in 2003, 92-3-
103871-0. UNESCO Publishing]
34 Environmental Design and Analysis in Marine Environmental Sampling. 1996. 86 pp. (English)
35 IUGG/IOC Time Project. Numerical Method of Tsunami Simulation with the Leap-Frog Scheme. 1997.
122 pp. (English)
36 Methodological Guide to Integrated Coastal Zone Management. 1997. 47 pp. (French, English)
37 Post-Tsunami Survey Field Guide. First Edition. 1998. 61 pp. (English, French, Spanish, Russian)
38 Guidelines for Vulnerability Mapping of Coastal Zones in the Indian Ocean. 2000. 40 pp. (French,
English)
39 Manual on Aquatic Cyanobacteria A photo guide and a synopsis of their toxicology. 2006. 106 pp.
(English)
40 Guidelines for the Study of Shoreline Change in the Western Indian Ocean Region. 2000. 73 pp.
(English)

2
No. Title

41 Potentially Harmful Marine Microalgae of the Western Indian Ocean


Microalgues potentiellement nuisibles de l'ocan Indien occidental. 2001. 104 pp. (English/French)
42 Des outils et des hommes pour une gestion intgre des zones ctires - Guide mthodologique, vol.II/
Steps and Tools Towards Integrated Coastal Area Management Methodological Guide, Vol. II. 2001.
64 pp. (French, English; Spanish)
43 Black Sea Data Management Guide (Cancelled)
44 Submarine Groundwater Discharge in Coastal Areas Management implications, measurements and
effects. 2004. 35 pp. (English)
45 A Reference Guide on the Use of Indicators for Integrated Coastal Management. 2003. 127 pp.
(English). ICAM Dossier No. 1
46 A Handbook for Measuring the Progress and Outcomes of Integrated Coastal and Ocean Management.
2006. iv + 215 pp. (English). ICAM Dossier No. 2
47 TsunamiTeacher An information and resource toolkit building capacity to respond to tsunamis and
mitigate their effects. 2006. DVD (English, Bahasa Indonesia, Bangladesh Bangla, French, Spanish,
and Thai)
48 Visions for a Sea Change. Report of the first international workshop on marine spatial planning. 2007.
83 pp. (English). ICAM Dossier No. 4
49 Tsunami preparedness. Information guide for disaster planners. 2008. (English, French, Spanish)
50 Hazard Awareness and Risk Mitigation in Integrated Coastal Area Management. 2009. 141 pp.
(English). ICAM Dossier No. 5
51 IOC Strategic Plan for Oceanographic Data and Information Management (20082011). 2008. 46 pp.
(English)
52 Tsunami risk assessment and mitigation for the Indian Ocean; knowing your tsunami risk and what to
do about it. 2009. 82 pp. (English)
53 Marine Spatial Planning. A Step-by-step Approach. 2009. 96 pp. (English). ICAM Dossier No. 6
54 Ocean Data Standards Series:
Vol. 1: Recommendation to Adopt ISO 3166-1 and 3166-3 Country Codes as the Standard for
Identifying Countries in Oceanographic Data Exchange. 2010. 13 pp. (English)
Vol. 2: Recommendation to adopt ISO 8601:2004 as the standard for the representation of date and
time in oceanographic data exchange. 2011. 17 pp. (English)
55 Microscopic and Molecular Methods for Quantitative Phytoplankton Analysis. 2010.114 pp. (English)
56 The International Thermodynamic Equation of Seawater2010: Calculation and Use of
Thermodynamic Properties. 2010. 190 pp. (English)
57 Reducing and managing the risk of tsunamis. Guidance for National Civil Protection Agencies and
Disaster Management Offices as Part of the Tsunami Early Warning and Mitigation System in the North-
eastern Atlantic, the Mediterranean and Connected Seas Region NEAMTWS (in preparation)
58 How to Plan, Conduct, and Evaluate Tsunami Exercises (in preparation)
59 Gua para el diseo y puesta en marcha de un plan de seguimiento de microalgas productoras de
toxinas. 2011. 70 pp. (Espaol solamente)

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