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ArtigoGM,

Santos TC, Amorim Original


Bonomo/ Original Article
RCF, Franco M

Determinao da Atividade de CMCase e FPase da Estipe Fngica Rhizopus sp. Atravs da


Bioconverso do Resduo de Seriguela (Spondias purpurea L.)

Evaluation of CMCase Activity and FPase of Rhizopus sp. Stipe Through the
Bioconversion of Red Mombin Residue (Spondias Purpurea)

Tamires Carvalho dos Santosa; Graziella Marques Amorimb; Renata Cristina Ferreira Bonomob; Marcelo Francoa*

a
Engenharia Ambiental, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, BA, Brasil
b
Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, BA, Brasil
*E-mail: marcelofranco@pq.cnpq.br

Recebido: 07 de fevereiro de 2011; Aceito: 20 de maio de 2011.

Resumo
O objetivo deste trabalho foi quantificar a atividade enzimtica das enzimas celulticas (CMCase e FPase) produzidas por meio da fermentao
em estado slido, utilizando a espcie fngica Rhizopus sp. e o resduo proveniente do beneficiamento da seriguela como substrato. As
condies tempo de fermentao e atividade de gua foram determinadas em funo da resposta da atividade enzimtica de fermentao (24, 48, 72,
96 e 120 horas) e atividade de gua (0,943, 0,970, 0,985), em funo da atividade enzimtica. As fermentaes foram realizadas a 35 C em
estufa bacteriolgica. Os resultados demonstram que a maior produo para a CMCase foi de 11,06 U/g em 72 horas de fermentao, enquanto
que para a FPase a atividade mxima ocorreu em 96 horas de fermentao com uma produo enzimtica de 25,15 U/g, ambas as enzimas
apresentaram maior atividade em 0,971 de atividade de gua. O fungo sintetizou ambas as enzimas sem a necessidade de qualquer indutor ou
suprimento alm da celulose presente no resduo e gua em diferentes concentraes.
Palavras-chave: Fungos. Desenvolvimento Sustentvel. Fermentao.
Abstract
The objective of this study was to quantify the enzymatic activity of celulticas enzymes (CMCase and FPase), produced way of the fermentation
in solid state, using the fngica species Rhizopus sp. e the residue proceeding from the improvement of seriguela as substratum. The conditions
time of fermentation and activity of water had been determined in function of the reply enzymatic activity of fermentation (24, 48, 72, 96
and 120 hours) and activity of water (0,943, 0,970, 0,985), in function of the enzymatic activity. The the 35 fermentations had been carried
through oC in bacteriological greenhouse. The results demonstrate that the biggest production for the CMCase was of 11,06 U/g in 72 hours
of fermentation, whereas for the FPase the maximum activity occurred in 96 hours of fermentation with an enzymatic production of 25,15 U/g,
both the enzymes had presented greater activity in 0,971 of activity of water. Fungo synthecized both the enzymes without the necessity of any
inductor or suppliment beyond the present cellulose in the residue and water in different concentrations.
Keywords: Fungi. Sustainable Development. Fermentation.

1 Introduo possibilidades de desenvolvimento para estas economias


historicamente fragilizadas.
A fruticultura brasileira tem se mostrado como o mais
A relevncia do estmulo a esse setor produtivo a
dinmico setor da economia, cresce ano a ano, supera
barreiras fitossanitrias e cambiais e consolida-se como possibilidade de absoro de mo-de-obra e gerao de
grande vetor de desenvolvimento do pas. Nos ltimos anos, emprego e renda nessas regies2. H crescente demanda
aumentou sua rea em nveis inditos na histria, ampliando por produtos originados de frutas exticas, com destaque ao
suas fronteiras em direo regio Nordeste, em que gnero Spondias, pertencente famlia das Anacardiceas,
condies de luminosidade, umidade relativa e temperatura dentre estas a seriguela (Spondias purpurea L.). Seus frutos
so muito mais favorveis do que nas regies Sul e Sudeste so drupas elipsides de colorao amarelo ou avermelhada
onde at ento eram desenvolvidas1. Estima-se que deste e possuem polpa de pequena espessura ao redor de um
processamento, aproximadamente 40% so considerados grande caroo. So consumidos in natura ou como sucos,
resduos agroindustriais compostos de restos de polpa, casca, refrescos, licores, entre outros3. A fruta madura apresenta
caroos ou sementes. aproximadamente 7% de acares redutores, 1% de amido,
Observa-se que o Nordeste tem papel relevante no 70% de rendimento mdio de polpa, 21 Brix, 0,7% de acidez
desempenho da fruticultura do Brasil. Ao mesmo tempo, titulvel (expressa em cido ctrico), com ndice de maturao
a fruticultura uma atividade intensa que contribui (SST/ATT) de 34 e pH 3,54.
muito para a economia da regio. As frutas tropicais so Aps o despolpamento para fins industriais ocorre a
principalmente produzidas nas reas semiridas, abrindo gerao do resduo que pode acarretar problemas ambientais.

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Determinao da Atividade de CMCase e FPase da Estipe Fngica Rhizopus sp. Atravs da Bioconverso do Resduo de Seriguela (Spondias Purpurea L.)

Infelizmente, a maior parte desses resduos agroindustriais as regies cristalinas mais expostas s celulases; -glicosidases
disposta diretamente ao ambiente5. Os resduos compostos (EC 3.2.1.21): enzimas que tm a propriedade de hidrolisar
por materiais lignocelulsicos so os mais abundantes no celobiose e oligossacardeos solveis (com menos de sete
mundo e esta biomassa apresenta potencial biotecnolgico unidades monomricas) em glicose12.
para a obteno de produtos de interesse industrial como Atualmente a ateno dos investidores em bioenergia
bioetanol, glicose, protenas, enzimas, compostos de aroma, volta-se para a etapa de hidrlise enzimtica dos
entre outros7,8. Esses resduos so fontes de carboidratos e sua polissacardeos. Esta fase decisiva tanto para o custo quanto
bioconverso tem recebido grande ateno nos ltimos anos. para a eficincia do processo de bioconverso. O emprego de
Processos utilizando esse tipo de resduo como substrato podem enzimas especficas para degradao de biomassa vegetal
minimizar a dependncia do homem por combustveis fsseis muito mais interessante que a hidrlise cida diante do alto
atravs da energia renovvel na forma de glicose6. A produo custo e risco ao ambiente apresentado por este ltimo13. As
global anual de biomassa vegetal de aproximadamente 2 x celulases podem ser utilizadas em indstrias: de alimentos;
1011 toneladas, sendo que a lignocelulose responde por 90% txtil; de papel e celulose; e no tratamento de resduos, entre
deste valor9. outras14-17.
Normalmente a composio dos materiais lignocelulsicos O trabalho foi realizado com o objetivo de determinar o
pode variar de acordo com a espcie vegetal, porm a efeito do tempo de fermentao e da atividade de gua sobre a
composio mdia consiste em 50% de celulose, 25% cintica de produo de celulases atravs da fermentao em
de hemicelulose e 25% de lignina. Os dois primeiros so estado slido (FES) do resduo de seriguela.
carboidratos resultantes da polimerizao de acares,
2 Material e Mtodos
enquanto a lignina um polmero aromtico produzido a
partir de precursores fenlicos, no contendo acares. Visto 2.1 Materiais
que a celulose responde por cerca de metade da composio O microrganismo utilizado foi o fungo filamentoso
e que a degradao deste homopolmero libera glicose a ser Rhizopus sp. proveniente do Laboratrio de Reaproveitamento
prontamente fermentada, torna-se ento este substrato alvo de de Resduos Agroindustriais - LABRA da UESB campus
intensas pesquisas10. de Itapetinga. O resduo foi cedido por uma agroindstria
A fermentao em estado slido (FES) demonstra-se um de beneficiamento de polpa de frutas localizada na regio
processo vantajoso para o crescimento de fungos filamentosos, sudoeste da Bahia, seco em estufa de secagem e esterilizao
uma vez que simula o habitat destes microorganismos. Essa SOLAB a 70 oC por 24 horas, triturado em moinho tipo Wiley
vantagem estendida produo de enzimas, proporcionando na granulomtrica aproximada de 1,2 mm (20 mesh).
maior produtividade quando comparada ao processo de
fermentao submersa. Alm disso, as enzimas produzidas 2.2 Obteno da soluo de esporos
pela FES so menos susceptveis a problemas de inibio por A cultura esporulada (em PDA HIMEDIA acidificado)
substrato e tambm possuem estabilidade maior a variaes foi suspensa em soluo de Tween 80 VETEC a 0,01% e
de temperatura e pH11. submetida contagem do nmero de esporos em suspenso,
O conjunto de enzimas envolvidas na degradao da utilizando cmara de Neubauer dupla espelhada e microscpio
celulose denominado complexo celulase. Esse complexo binocular BIOVAL L1000.
divido em trs grupos: Endoglucanases (EC 3.2.1.4): enzimas
responsveis por iniciar a hidrlise e pela rpida solubilizao 2.3 Fermentao em estado slido
do polmero celulsico, as quais hidrolisam randomicamente as As fermentaes foram realizadas em frascos Erlenmeyers
regies internas da estrutura amorfa da fibra celulsica, liberando contendo 10 g de resduo, adicionando uma suspenso contendo
oligossacardeos e, consequentemente, novos terminais, sendo 107 de esporos por grama de substrato. Foram adicionados
um redutor e um no redutor; Exoglucanases: enzimas divididas volumes de gua estril at os seguintes valores de atividade de
em celobiohidrolases (CBHs) e glucanohidrolases (GHs). gua 0,943, 0,970 e 0,985, determinada em aqualab BASEQ,
As GHs (EC 3.2.1.91), embora raras, possuem estratgia de representando 40, 50 e 60% de umidade, respectivamente. Os
hidrlise da fibra celulsica de elevada importncia, pois so cultivos foram conduzidos a 35 C em estufa bacteriolgica
capazes de liberar glicose diretamente do polmero. J as CBHs modelo SL 101 SOLAB.
(EC 3.2.1.91) so responsveis pela liberao de celobiose
2.4 Extrao dos compostos enzimticos
(dmero de glicose) a partir de extremidades da celulose. As
exoglucanases participam da hidrlise primria da fibra e so Aps o processo fermentativo realizou-se a extrao
responsveis pela amorfognese, que um fenmeno que envolve mecnica do extrato enzimtico com soluo tampo de citrato
ruptura fsica do substrato, acarretando na desestratificao das de sdio VETEC com o pH 4,8 a 50 mM. O extrato enzimtico
fibras, pelo aumento das regies intersticiais. A amorfognese provinente da fermentao foi recolhido e centrifugado a 1000
promove aumento na taxa de hidrlise da celulose, por tornar rpm por 10 minutos em centrfuga CETRIBIO modelo 80-2B.

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2.5 Anlises das atividades enzimticas (0,943, 0,970 e 0,985) variando com o tempo de fermentao
2.5.1 Enzima CMCase (24, 48, 72, 96 e 120 horas) e elaborou-se um delineamento
inteiramente casual (DCL), com trs repeties amostrais.
Para a atividade de CMCase, que representa a dosagem
Os dados foram ajustados a um modelo quadrtico completo
de endoglucanases, foi realizado com a dosagem de acares
(todos os efeitos linear e quadrtico principal e todas as
redutores produzidos pela degradao de carboximetilcelulose
interaes de duas vias), atravs da Equao 1, utilizando o
(CMC) CROMOLINE a 2% p/v diludo previamente na soluo
software SAEG estatstica. A significncia estatstica de todos
citrato de sdio VETEC com o pH 4,8 a 50 mM. Os ensaios
reacionais foram conduzidos adicionando em tubo de ensaio os fatores foi ento avaliada por uma anlise de varincia
0,5 mL de soluo tampo de citrato de sdio com o pH 4,8 a (ANOVA), usando um teste estatstico de Fisher.
50 mM, 0,5 mL de extrato enzimtico e 0,5 mL de CMC. Em
outro tubo foram adicionados 0,5 mL da mesma soluo tampo
e 0,5 mL de extrato enzimtico comparado ao controle reao. K = 0 + i X i + i X i2+ ij X i X j (1)
O branco continha 0,5 mL de DNS e 0,5 mL de soluo tampo.
As amostras foram incubadas em estufa bacteriolgica QUIMIS
a 50 oC por 10 minutos, e a reao foi interrompida com a adio
Representam o efeito constante no processo bo, bi, bii, bij,
de 0,5 mL DNS. Os tubos foram submergidos a gua fervente
o efeito linear e quadrtico de Xi e o efeito de interao entre
por 5 minutos, logo aps foram adicionados 6,5 mL de gua
destilada para posterior medio de absorbncia em de 540 nm Xi e Xj na produo das enzimas.
realizada em espectrofotmetro BEL PHOTONICS 2000 UV. A anlise de varincia (ANOVA) para os modelos foi
realizada e a importncia do modelo foi examinada pelo teste
2.5.2 Enzima FPase estatstico de Fisher (teste F).
A atividade FPase, ou seja, atividade de papel de filtro,
3 Resultados e Discusso
abrange uma mistura de exoglucanases e endoglucanases,
determinada a partir da degradao de uma tira de papel Durante o processo de fermentao em estado slido
de filtro Whatman n 1 medindo 1,0 cm x 6,0 cm. No tubo ocorre a sacarificao, esse processo consiste na converso
contendo o ensaio reacional foi adicionado 1,0 mL de soluo enzimtica de polissacardeos em acares fermentveis. A
tampo de citrato de sdio com o pH 4,8 a 50mM, 0,5 mL de celulose hidrolisada inicialmente pelas endoglucanases,
extrato enzimtico e uma tira de papel filtro. No outro tubo o essas enzimas ao decomporem os polissacardeos, de
controle da reao foi efetuado adicionando 1 mL da mesma forma aleatria, produzem terminais para as exoglucanases
soluo tampo e 0,5 mL de extrato enzimtico, no terceiro atuarem19. Na tabela 1 so apresentados os valores obtidos
tubo foi adicionado 1,5 mL de soluo tampo e uma tira de
durante o experimento.
papel filtro, este foi comparado ao controle.
As amostras foram incubadas em estufa a 50 oC por uma
hora e a reao foi interrompida com a adio de 3 mL DNS. Tabela 1: Atividades das enzimas CMCase (endoglucanase)
Os tubos foram alocados em gua fervente por 5 minutos, e FPase (complexo endoglucanase e exoglucanase) em cinco
logo aps foram adicionados 20 mL de gua destilada para tempos e trs atividades de gua, medias das trs repeties
posterior medio de absorbncia em de 540 nm. amostrais

CMCase (U/g) FPase (U/g)


2.5.3 Curva de calibrao Tempo
(h) 0,943 0,971 0,985 0,943 0,971 0,985
A curva padro foi feita a partir da determinao de (aw) (aw) (aw) (aw) (aw) (aw)
glicose nas concentraes de 0,2 a 1,0 g/L pelo mtodo do 24 2,132 3,164 2,625 6,080 10,926 10,567
cido 3,5-dinitrossaliclico DNS18. A unidade de atividade 48 2,783 3,366 3,052 7,000 11,733 10,993
enzimtica (U) foi definida como a quantidade de enzima
72 4,510 11,060 8,234 8,211 16,467 13,416
capaz de liberar 1 mol de acares redutores, por minuto
96 2,895 6,058 5,452 8,952 25,754 20,886
a 50 C, onde a atividade enzimtica expressa em U por
grama de substrato (U/g). A absorbncia foi medida no 120 2,468 4,241 3,635 7,000 20,146 18,373
espectrofotmetro a 540 nm.

2.6 Anlises estatsticas Na tabela 2 encontram-se os resultados dos modelos


A anlise da produo de enzimas foi realizada verificando reduzidos para cada atividade de gua, bem como os
o tempo de fermentao e a atividade de gua. Para determinar coeficientes de variao para cada equao. Os dados indicam
o efeito dessas variveis sobre a produo de enzimas, o que todos os modelos so estatisticamente significativos (F>
experimento foi conduzido em trs nveis de atividade de gua valor crtico, valor P <0,05).

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Determinao da Atividade de CMCase e FPase da Estipe Fngica Rhizopus sp. Atravs da Bioconverso do Resduo de Seriguela (Spondias Purpurea L.)

Tabela 2: Modelos de ajuste de dados obtidos a partir da ANOVA - 0,99 em geral, e o valor ideal para o crescimento fngico
Atividade Coeficiente situa-se entre 0,90 e 0,9920. No presente estudo foi observado
Equao R2
de gua de Variao que abaixo da atividade de gua de 0,95 e acima de 0,98,
CMCase houve diminuio na produo das enzimas. Fato que pode
0,943 -0,0007x + 0,1014x - 0,0261
2
0,7195 13,054 estar relacionado com a inibio do fungo, marcado pela
-3.10-5x3 + 0,0035x2 - 0,0339x extrapolao do nvel de gua ideal para o desenvolvimento
0,971 0,7056 2,264
+ 1,7865 da linhagem selecionada, o que poderia estar influenciando
0,985
-2.10-5x3 + 0,0034x2 - 0,0699x
0,8536 32,252
no metabolismo responsvel pela produo da enzima. A
+ 2,3563 umidade fator crtico para o crescimento de fungos em
FPase substrato slido. Como a quantidade de gua sempre
0,943 -0,0008x + 0,1268x + 3,2042
2
0,8215 2,375 limitada, o controle do nvel de umidade essencial para a
-0,0001x + 0,0235x - 1,2592x
3 2
otimizao do processo em estado slido. O teor de umidade
0,971 0,9628 1,384
+ 29,478 adequada para o substrato deve permitir a formao de um
-7.10-5x3 + 0,0155x2 - 0,8605x filme de gua na superfcie, para facilitar a dissoluo e a
0,985 0,9447 2,514
+ 23,551
transferncia de nutrientes e oxignio. Entretanto, os espaos
entre as partculas devem permanecer livres para permitir a
Nas figuras 1 e 2 esto representados os pontos mdios difuso de oxignio e a dissipao de calor20,21.
de cada experimento realizado e o arranjo experimental para Durante o processo fermentativo as endoglucanases
as enzimas CMCase e FPase respectivamente, em funo da hidrolisam preferencialmente as ligaes internas no polmero
atividade enzimtica (U/g), atividade de gua (aw) e tempo de da celulose, produzindo oligossacardeos de menor peso
fermentao (h). molecular. As endoglucanases clivam as ligaes -(1-4)-
glicosdicas em regies amorfas da celulose ou na superfcie
das microfibrilas. As exoglucanases iniciam a hidrlise nas
12
0,943
extremidades da cadeia. Esse comportamento pode explicar
Atividade enzimtica (U/g)

10
0,971 os valores otimizados em relao variao de tempo, para
8 0,985 a CMCase (endoglucanases) o tempo timo foi 72 horas de
fermentao com a atividade de 11,060 U/g, j para FPase
6
(endoglucanases e exoglucanases) o tempo otimizado foi de
4 96 horas de fermentao para uma atividade enzimtica de
2 25,754 U/g.
O fungo sintetizou a enzima sem a necessidade de
0
0 20 40 60 80 100 120 140 qualquer indutor ou suprimento alm do resduo de seriguela
Tempo de fermentao (h) e gua em diferentes concentraes, demonstrando que uma
Figura 1: Atividade de CMCase (endoglucanse) em funo do enzima constitutiva.
tempo e variao da atividade de gua A modelagem matemtica de processos fermentativos
pode ser definida como a tentativa de representar, por
30
equaes matemticas, os balanos de massa, associados s
0,943
transformaes bioqumicas que ocorrem no processo e s
Atividade enzimtica (U/g)

25 0,971
velocidades com que essas transformaes se processam.
0,985
20
4 Concluso
15
Os resultados indicam que a estirpe de Rhizopus sp.
10
bastante promissora, no que se diz respeito obteno de
5 enzimas celulsicas, a anlise obtida indica que para a CMCase
0
o tempo timo foi de 72 horas de fermentao com estimativa
0 20 40 60 80 100 120 140 de produo de 11,06 U/g para a CMCase, j para FPase indica
Tempo de fermentao (h)
que a otimizao do bioprocesso encontra-se entre 96 horas
Figura 2: Atividade de Fpase(complexo enzimtico de fermentao para uma produo enzimtica de 25,15 U/g.
endoglucanase e exoglucanase) em funo do tempo e variao Em ambas as enzimas estudadas a atividade de gua 0,971
da atividade de gua
foi a que obteve melhor produo das espcies enzimticas. A
FES uma tecnologia capaz de propor caminhos alternativos
De acordo com a literatura o intervalo de atividade de para a reutilizao dos resduos gerados, diminuindo passivos
gua em que ocorre o desenvolvimento microbiano varia 0,60 ambientais bem como a valorizao econmica desses rejeitos.

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Santos TC, Amorim GM, Bonomo RCF, Franco M

O fungo sintetizou a enzima sem a necessidade de qualquer by thermophilic fungus Myceliophthora sp. IMI 387099.
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