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1. PREPARACION DE LA MUESTRA
2. CARACTERES ORGANOLEPTICOS
3. INDICE DE COLOR A. B. T.
4. DENSIDAD
5. PRUEBA DEL FRIO
6. INDICE DE REFRACCION
7. PUNTO DE FUSION
8. HUMEDAD
9(a). HUMEDAD Y MATERIAS VOLATILES
9(B).2. MATERIAL Y APARATOS
10a. ACIDEZ INDICE DE ACIDEZ
10b. ACIDEZ INDICE DE ACIDEZ: potenciometra
11.a INDICE DE SAPONIFICACION
11(b). INDICE DE SAPONIFICACION(Mtodo potenciomtrico)
12. INDICE DE HIDROXILO
13. PREPARACION DE ACIDOS GRASOS INSOLUBLES
14. TITULO
15. INDICE DE ACIDOS VOLATILES SOLUBLES E INSOLUBLES
16(a). INDICE DE IODO
16(B). INDICE DE IODO
17. INDICE DE TIOCIANOGENO
18. INDICE DE POLIBROMUROS
19 INDICE DE DIENOS
20. ACIDOS OXIDADOS
21 INDICE DE PEROXIDOS
22 (a). INSAPONIFICABLE
22(B). INSAPONIFICABLE
23. INDICE DE ESCUALENO EN ACEITE DE OLIVA
24(a) DETERMINACION DE LA FRACCION DE ESTEROLES POR CROMATOGRAFIA EN
FASE GASEOSA
24(B). DETERMINACION CUANTITATIVA DE ESTEROLES
25. IMPUREZAS
26. CENIZAS
27. DETECCION DE COMPUESTOS CLORADOS
28(a).RECONOCIMIENTO DE AZUFRE (Benzoato de plata).
28(B). RECONOCIMIENTO DE AZUFRE (moneda de plata)
29 DETERMINACION DE JABON EN ACEITE DE OLIVA
30 RECONOCIMIENTO DE JABON EN ACEITE REFINADO
31. ABSORCION EXPECTROFOTOMETRICA ULTRAVIOLETA
32(a). INDICE DE BELLIER.
32(B). INDICE DE BELLIER
33. RECONOCIMIENTO DE ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA
34.DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LOS ACIDOS GRASOS
SITUADOS EN LA POSICION DE LOS TRIGLICERIDOS
35. RECONOCIMEINTO DEL ACEITE DE ORUJO DE ACEITUNA
36 TETRABROMUROS
37. MODIFICACION SYNODINOS-KONSTAS
38. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE ALGODON
39. RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE SEMILLA DE TE EN ACEITE DE OLIVA
40 RECONOCIMIENTO DEL ACEITE DE SESAMO
41. DETERMINACION DE ACIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA
42. DETERMINACION DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA DE LOS ALPECHINES
43. RECONOCIMIENTO DE STERES NO GLICRIDOS EN GRASAS COMESTIBLES POR
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
44. TEMPERATURA DE INFLAMACIN.
45. RECONOCIMIENTO DE ANTIOXIDANTES.
46. ACIDOS GRASOS DE CADENA CORTA.
47. FSFORO.
48. GRASA NEUTRA.
49.-ACIDOS DOCOSENOICOS.
50 (a). ANILINA (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
50 (B). ANILINA (POR CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA).
50 (C). ANILINA COMO ACETANILIDA (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
50 (D). ANILINA COMO ACETANILIDA (POR HPLC).
51. ANILIDAS GRASAS (POR CROMATOGRAFA DE GASES).
52. ANILIDAS GRASAS (POR HPLC).
53. COLORANTES ARTIFICIALES.
54. ACTIVIDAD DE ADSORBENTES PARA CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
55. CERAS EN ACEITES DE GIRASOL
56. TOCOFEROLES
57. ACEITE SEMISECANTE EN ACEITES DE OLIVA Y ORUJO
58. DETERMINACION DEL ERITRODIOL
59. DETERMINACIN DE CIDO ERCICO
APARTADO A
CROMATOGRAFIA EN FASE GASEOSA DE LOS ESTERES METILICOS DE ACIDOS
GRASOS
APARTADO B
METODO DE PREPARACION DE LOS ESTERES METILICOS DE ACIDOS GRASOS QUE
TENGAN SEIS ATOMOS DE CARBONO Y MAS
Por otra parte, la actuacin de los distintos ministerios en el mbito de sus respectivas
competencias, requiere el anlisis de idnticos componentes de los productos de
consumo humano, si bien en diferentes fases de elaboracin o comercializacin.
Por todo lo anterior, parece lgico unificar criterios y aunar esfuerzos mediante el
establecimiento de mtodos de anlisis oficiales nicos para todos los ministerios.
Segundo.- cuando no existan mtodos oficiales para determinados anlisis, y hasta que
sean estudiados por el grupo de trabajo correspondiente, podrn ser utilizados los
adoptados por organismos nacionales o internacionales de reconocida solvencia.
Tercero.- quedan derogadas las disposiciones de igual o inferior rango que se opongan a
la presente orden.
Anexo i
1. Preparacin de la muestra
1.1. Principio.
1.2. Procedimiento.
Para todas las determinaciones, antes de realizar la toma para ensayo, agitar la muestra
como medida de precaucin.
1.2.2.2. Para los dems mtodos colocar la muestra en estufa a 50 Grad. Cuando aquella
alcance esta temperatura, agitar enrgicamente. Dejar decantar. Filtrar sobre papel en la
estufa mantenida a 50 grad. C. El filtrado debe ser limpio.
1.3. Referencia.
1. International union of pure and applied chemistry. Standard methods for the analysis
of oils, fats and soaps. 1964. Ii. A. 1.
2. Caracteres organolpticos
2.1. Principio.
2.2. Aspecto.
Sern los normales segn el tipo de aceite, y con los aromas propios y caractersticos,
sin que se advierta en ningn caso sntomas organolpticos de rancidez.
2.4. Color.
Variara del amarillo al verde. Para los aceites de oliva y orujo se medir por el mtodo
"ndice de color a. B. T.". En los dems aceites refinados se medir en el sistema
lovibond, utilizando cubetas de 5,25 pulgadas.
3. ndice de color a. B. T.
3.1. Principio.
Este metido tiene por objeto establecer una escala de ndices para la denominacin del
color de los aceites de oliva y de semillas, que no contengan, examinados por la visin
humana, tonalidades rojizas, es decir, que solo representen tonalidades variables del
amarillo al verde.
3.2.1. Tubos de vidrio neutro de 25 mm. De dimetro interior y 140 mm. De longitud.
3.3. Reactivos.
3.3.2. Disolucin 1/15 m de fosfato disdico. Disolver 11,88 gramos de na2hpo4, 2h2o
en agua destilada y hervida, hasta completar 1 litro.
3.3.3. Disolucin de azul bromotimol al 0,04 por 100. Triturar en un mortero de gata
0,1 g de azul de bromotimol, agregar, poco a poco, y removiendo, 3,5 ml de NaOH
0,05n. Cuando se ha disuelto, observndose solo la turbidez ligera, llevar ntegramente
la disolucin a un matraz aforado de 250 ml, utilizando para lavar el mortero agua
destilada y hervida. Agregar al matraz agua destilada y hervida hasta completar la cuarta
parte de su volumen, y calentar en bao de agua a 80a grad.-90 grad. C, hasta disolucin
completa. Enfriar hasta la temperatura ambiente, completando con agua destilada y
hervida, hasta el enrase.
3.4. Procedimiento.
3.4.1. Preparacin de los patrones de color. Poner en cada uno de los nueve tubos de
vidrio, los volmenes de las disoluciones de fosfato monopotasico y disdico que se
indican en el cuadro que figura a continuacin. Agregar 2 ml de la disolucin de azul de
bromotimol y agitar los tubos.
(tabla omitida)
Si es necesario preparar otras series con las mismas mezclas de fosfatos, pero poniendo
volmenes mayores o menores de azul de bromo timo, para obtener intensidades ms
fuertes o ms dbiles del tono normal que se fija en este mtodo. Designar estos nuevos
ndices colocando entre parntesis, a continuacin de los que se establecen en este
mtodo, el nmero de ml de azul de bromotimol utilizados.
3.4.2. Determinacin del ndice de color. El aceite cuyo color se quiere describir debe
tener una temperatura aproximada de 20 grad. C y estar completamente transparente,
filtrndose si presenta turbidez.
Llenar de aceite hasta las tres cuartas partes uno de los tubos; observar por
transparencia, mirando en direccin normal al eje del tubo, con cual de los colores de la
escala de patrones se idntica, colocando detrs de los tubos una hoja de papel blanco.
4. Densidad
4.1. Principio.
4.3. Procedimiento.
4.3.2. Grasas slidas. Llenar el picnmetro hasta las tres cuartas partes,
aproximadamente, de su altura, con la grasa. Dejar 1 hora en estufa, a la temperatura de
fusin de la grasa, enfriar, pesar. Aadir agua, a la temperatura de referencia, hasta el
borde superior del picnmetro, dejar 1 hora en un bao a la temperatura de referencia,
secar el picnmetro y pesar.
4.4. Calculo.
(formula omitida)
(formula omitida)
4.4.3. Correcciones.
El valor de la densidad calculado anteriormente puede corregirse del efecto del empuje
del aire por la formula
4.5. Observaciones.
4.6. Referencias.
1. International union of pure and applied chemistry. Standard methods for the analysis
of oils, fats soaps. 1954.
Tabla 4.i
5.3. Procedimiento.
Filtrar una cantidad suficiente de muestra (200 a 300 ml) a traves de papel de filtro.
Calentar el filtrado, agitandolo continuamente hasta que adquiera exactamente una
temperatura de 130 grad. C.
Llenar completamente un frasco con el aceite muestra filtrado y tapar suavemente con
un tapon de corcho. Llevar a 25 grad. C en un bao de agua y recubrir el nte tapon con
parafina.
Al cabo de cinco horas y media retirar el frasco del bao y examinarlo detenidamente
para ver si se han formado cristales o enturbamiento. No confundir las burbujas de aire
finamente dispersadas con los cristales de grasa. La muestra habra resistido la prueba si
se conserva clara, limpia y brillante.
Negtiva o positiva.
5.5. Observaciones.
El fin del calentamiento inicial es eliminar las trazas de humedad y destruir los nucleos
cristalinos que pueden existir. Ambos interferirian la prueba ocasionando enturbamiento
por cristalizacion prematura.
5.6. Referencias.
6. Indice de refraccion
6.1. Principio.
Es igualmente la relacion del seno del angulo de incidencia al seno del angulo de
refraccion.
El indice de refraccion de una sustancia dada varia con la longitud de onda del rayo de
luz refractado y con la temperatura. Salvo indicacion contraria el indice de refraccion
viene referido a la longitud de onda correspondiente a la linea d 589,3 nm de la luz del
sodio. El indice de refraccion se indica con la notacion nt para t grad. C y longitud de
onda de la linea d del sodio. Para otra radiacion de distinta longitud de onda a t grad. C,
la notacion sera (simbolo omitido).
6.3. Procedimiento.
El aceite debe estar limpio y exento de agua. Filtrar sobre papel de filtro seco, con la
ayuda, si es necesario, de sulfato sodico anhidro. Llenar con la materia grasa el espacio
comprendido entre los dos prismas. Hacer la lectura despues de 5 minutos, al menos, de
contacto. La temperatura de lectura no debe sobrepasar en +- 2 grad. La temperatura de
referencia.
6.4. Calculo.
6.5. Referencias.
1. International union ot pure and applied chemistry. Standard methods for the analysis
of oils, fats and soaps. 1964. Ii-b.2.
7. Punto de fusion
7.1. Principio.
Las grasas y aceites naturales, como mezclas de gliceridos y otras sustancias no tienen
punto de fusion neto y definido. No presentan punto critico de solido a liquido; este
paso lo realizan gradualmente a traves de estados pastosos hasta el completamente
liquido.
Por tal razon, el punto de fusion de una gras viene definido en este metodo por dos
temperaturas: una, la inicial de ablandamiento deslizante, y otra, final de liquido
perfectamente limpio.
7.2.1. Tubo de vidrio en u de 1,4-1,5 mm. De diametro, con espesor de pared de 0,15-
0,20 mm. Una de las ramas de 80 milimetros de largo, y la otra de 60 mm. (esta
ligeramente abocada en el extremo). Distancia entre las dos ramas, 5 mm.
Aproximadamente.
7.3. Procedimiento.
Introducir la rama mas larga del tubo en la grasa fundida a una temperatura de 10 gd. C
superior al punto de fusion presumible. Deslizar la columna de grasa tomada hasta 1 cm
del codo del tubo; la columna de grasa sera aproximadamente de 1 cm de largo.
La grasa puede tambien introducirse al estado solido en el tubo, con ayuda de un hilo de
platino.
Dejar enfriar el tubo con la grasa durante 24 horas a la temperatura ambiente (por lo
menos 10 grad. Mas baja que el punto inicial de ablandamiento). Acoplar el tubo a lo
largo del termometro mediante un anillo de goma, de forma que su curvatura coincida
con el bulbo del termometro. Introducir termometro y tubo en el bao de agua; cuidar
que el nivel de esta sea inferior al de la rama mas corta.
Calentar lentamente, a razon de 0,1-0,2 gd. C por minuto, observando con una lupa lar
lentamente, a razon de 0,1-0,2 gd. C por minuto, observando con una columna de grasa,
bien iluminada sobre fondo oscuro. La temperatura inicial es aquella en que la columna
comienza a descender (se descuelga). La temperatura final corresponde a la
desaparicion de todo enturbiamiento y aspecto limpio.
En caso de duda del punto final se compara el tubo de ensayo con otro con grasa
netamente fundida.
Pero si se utiliza solo la expresion: "punto de fusion", se indicaran las dos temperaturas,
inicial y final.
7.5. Referencia.
8. Humedad
8.1. Principio.
8.2.1. Matraz de vidrio de cuello corto, de 300 a 500 ml de capacidad, sobre el cual se
adapta el aparato especial representado en la figura 8.1. Consta de un tubo cilindrico
graduado en ml, provisto de llave de descarga en el extremo inferior; en el superior se
adapta un refrigerante de reflujo. Entre este y la terminacion de la graduacion, lleva el
tubo cilindrico otro tubo comunicante y paralelo a el, a cuyo extremo se adapta el
matraz.
8.3. Reactivos.
8.3.1. Xileno.
8.4. Procedimiento.
Eliminar todo vestigio de grasa del tubo graduado y del tubo inferior del refrigerante,
lavando sucesivamente con mezcla cromica, agua destilada y acetona. Secar.
8.5. Calculo.
(formula omitida)
8.6. Observaciones.
Si las gotas de agua quedan adheridas a la pared del tubo, desprenderlas calentando con
precaucion con una llama pequea.
8.7. Referencias.
2. American oil chemists' society. Official and tentative methods. Da. 2a-45.
(figura omitida)
9(a).1. Principio.
Es aplicable a las grasas animales y vegetales, con la excepcion de los aceites secantes o
semisecantes y los aceites del grupo del coco.
9(a).2.3. Desecador, conteniendo como agente desecante sulfato calcico o gel de silice
de 6-20 mallas, o, en su defecto, acido sulfurico monohidrato (d = 1,84), aunque para
asegurar una desecacion efectiva debera ser renovado con frecuencia.
9(a).3. Procedimiento.
La muestra debe ser previamente homogeneizada antes de pesar la cantidad con que se
vaya a operar. Esto se logra, con las gras fluidas, agitando fuertemente el frasco que
contiene la muestra y virtiendo rapidamente la cantidad aproximada que se vaya a pesar
en la capsula en la que se efectue la desecacion. Si se tratase de grasas solidas o
semisolidas a la temperatura ambiente, calentar suavemente en bao de agua hasta
conseguir el grado de fluidez conveniente, cuidando de no llegar a fundir
completamente y homogeneizar con un mezclador adecuado o simplemente con una
espatula si no se dispusiese de este instrumento.
9(a).4. Calculos.
(formula omitida)
9(a).5. Referencias.
2. International union of pure and applied chemistry standard methods for the analysis
of oils, fats and soaps. 1964. Ii. C.1.1.
9(b).1. Principio.
Se establecen las condiciones adecuadas para la determinacin del agua y las materias
volatiles, en las condiciones del ensayo, en materias grasas comerciales.
Es aplicables a todos los aceites y grasas del comercio, incluyendo los aceites secantes y
semisecantes. No es aplicable a los aceites del grupo del coco, conteniendo un 1 por 100
o mas de acidos grasos libres, ni a grasas que hayan sido adicionadas de
monogliceridos.
9(b).2.1. Estufa de vacio. Estufa en cuyo interior pueda hacerse el vacio, bien sea con
trompa de agua o con bomba de caracteristicas adecuadas, pudiendose mantener el
vacio con la estufa desocupadas, al limite maximo alcanzable con la trompa de agua o
1mm de hg como minimo, si se opera con bomba de aceite. En las operaciones de
desecacion es preferible operar con trompa de agua.
9(b).2.3. Desecador, conteniendo como agente desecante sulfato calcico o gel de silice
de 6-20 mallas. Tambien puede ser utilizado el acido sulfurico monohidrato (d = 1,84),
aunque para asegurar una desecacion efectiva debera ser renovado con frecuencia.
9(b).3. Procedimiento.
La muestra debe ser previamente homogeneizada antes de pesar la cantidad con que se
vaya a operar. Esto se logra, con las grasas fluidas, agitando fuertemente el frasco que
las contiene y vertiendo rapidamente la cantidad aproximada que se vaya apesar en la
capsula en la que se efectue la desecacion. Si se tratase de grasas solidas o semisolidas a
la temperatura ambiente, calentar suavemente en bao de agua hasta conseguir el grado
de fluidez conveniente, cuidando de no llegar a fundir completamente y homogeneizar
con un mezclador adecuado o simplemente con una espatula si no se dispusiese de este
instrumento.
Mantener la capsula en la estufa durante una hora. Secar y pasar a un desecador donde
se deja enfriar, pesando a continuacion. Repetir este tratamiento en operaciones
sucesivas, hasta que la diferencia entre dos pesadas consecutivas no exceda del 0,05 por
100.
9(b).4. Calculos.
(formula omitida)
9(b).5. Referencia.
10.1 principio.
10.2. Reactivos.
10.2.3. Mezcla etanol-eter etilico, 1:1, neutralizada exactamente con koh 0,1 n etanolica,
con fenolftaleina como indicador.
10.3. Procedimiento.
0,5 n (o con 0,1 h para acideces inferiores a 2), hastao 10.4. Calculo.
Calcular la acidez como grado de acidez expresado en porcentaje de acido oleico o
como indice de acidez expresado en miligramos de koh.
(formulas omitidas)
Normalmente se expresa referida a tanto por ciento de acido oleico. Solo en casos
particulares, segun la naturaleza de la sustancia grasa, se expresara referida a acido
palmitico, laurico u otros.
10.5. Referencias.
1. International union of pure and applied chemistry. Standard methods for the analysis
of oils, fats and soaps. 1964.ii.d.1.
11.1. Principio.
11.3. Reactivos.
11.4. Procedimiento.
(Formula Omitida)
11.6. Observaciones.
11.7. Referencias.
2. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods Por The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps 1964. Ii.D.2.
12.1 Principio.
12.2.3. Placas De Carton, Circulares, Del Diametro De Los Matraces Con Un Orificio
Circular En El Centro De Diametro Adaptable Al Cuello De Los Matraces.
12.2.4. Bao De Glicerina, Que Permita Colocar Los Matraces En Posicion Inclinada,
Introducidos 1 Cm En El Bao, Protegidos Los Cuellos Por El Carton Que Apoya En El
Borde Exterior Del Bao.
12.3. Reactivos.
12.4. Procedimiento.
(Cuadro Omitido)
Agregar, Lavando Las Paredes Del Embudo Y El Cuello Del Matraz, 5 Ml De Etanol
De 95 Por 100 V/V, Conteniendo 2 O 3 Gotas De Solucion De Fenoltaleina
Previamente Neutralizada. Valorar Con Solucion Etanolica De Hidroxido Potasico 0,5
N.
Cuando La Fuerte Coloracion Del Medio Haga Dificil La Observacion Del Viraje De
La Fenolftaleina, Utilizar Como Indicador Una Solucion De Azul Alcalino 6b.
12.5. Calculo.
(Formula Omitida)
12.6. Referencias.
13.1. Principio.
Se Entiende Por Acidos Grasos Insolubles De Una Grasa, Los Obtenidos Por
Saponificacion De Aquella, Descomposicion Del Pabon Formado Y Aislamiento Segun
El Procedimiento Descrito Posteriormente. Este Debe Ser Aplicado Rigurosamente Por
La Posible Presencia De Acidos Grasos Mas O Menos Solubles En Agua.
13.4. Procedimiento.
Llevar A Ebullicion Y Mantenerla Hasta Que Los Acidos Grasos Liberados Floten En
Forma De Capa Limpia (En El Caso Particular En Que La Materia Grasa Contenga
Gliceridos Del Acido Laurico, Esta Operacion Se Hara Sobre Bao De Agua Hirviente
Y No Con Ebullicion De La Capa Acuosa).
Lavar Los Acidos Dos Veces Con 500 Ml De Solucion De Clna Hirviente. Despues De
Cada Lavado Eliminar Tan Completamente Como Sea Posible La Capa Acuosa. Pasar
Los Acidos Grasos A Una Capsula, Adicionar Sulfato Sodico Anhidro Y Filtrar Sobre
Filtro Seco.
13.5. Observaciones.
Si La Preparacion De Los Acidos Grasos Tiene Por Objeto La Determinacion Del Peso
Molecular Medio, Asegurarse Que La Ultima Capa Acuosa Eliminada Es Neutral Al
Naranja De Metilo.
13.6. Referencia.
1. Instituto De Racionalizacion Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.006.
14.1. Principio.
14.3. Procedimiento.
Este Maximo Se Toma Como Punto De Solidifacion De Los Acidos Grasos O Titulos.
14.5. Referencias.
1. American Oil Chemists' Society. Official And Tentative Methodos. Cc, 12-41.
15.1. Principio.
15.2.1.4. Matraz De Fondo Plano, Con Tapon Esmerilado, Marcados En Su Cuello Los
Enrases De 100 Y 110 Ml, Tarado (D).
15.2.1.5. Placa De Amianto O Similar, Para Proteger La Periferia Del Matraz Del
Contacto Directo De La Llama (E). Dimensiones: Diametro 120 Mm (+- 5 Mm).
Espesor, 6 Mm. Orificio Central Circular De 45 Mm De Diametro, Que Soporta El
Matraz Durante El Calentamiento.
15.3. Reactivos.
15.3.2. Solucion Acuosa De Hidroxido Sodico, 44 Por 100 P/P. Eventualmente Dejar
Calentar O Filtrar Al Abrigo Del Co2. La Solucion Empleada Debe Estar Perfectamente
Limpia Y Clara.
15.4. Procedimiento.
Procedimiento.
15.5. Calculo.
(Formula Omitida)
15.6. Observaciones.
15.7. Referencias.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. 1964.Ii.D.9.
(Metodo De Wijs)
16(a).1. Principio.
16(a).3. Reactivos.
16(a).3.1. Solucion Acuosa De Ioduro Potasico Al 10 Por 100 P/V. Esta Solucion Debe
Estar Exenta De Iodo Y De Iodato Potasico.
16(a).4. Procedimiento.
(Tabla Omitida)
Dejar Estar 1 Hora Para Grasas Cuyo Indice Sea Inferior A 150 Y 2 Horas Para Las De
Indice Superior A 150 Y Los Aceites Polimerizados U Oxidados.
Valorar Con Solucion De Tiosulfato Sodico 0,1 N, Con Engrudo De Almidon Como
Indicador, Hasta Desaparicion Justa Del Color Azul Despues De Agitacion Intensa.
16(a).5. Calculo.
(Formula Omitida)
16(a)6. Referencias.
16(B).1. Principio.
Como 16(a).1.
16(B).3. Reactivos.
16(B).4. Procedimiento.
16(B).5. Calculo.
(Formula Omitida)
16(B).6.Referencias.
17.1. Principio.
Cianogeno
El Tiocianogeno (Scn)2 Se Fija Sobre Los Dobles Enlaces Como Los Halogenos. Es
Menos Reactivo Que Los Halogenos Y Su Fijacion Solo Es Cuantitativa Con El Acido
Oleico.
17.3.1. Acido Acetico Glacial Puro. Antes De Su Empleo Calentarle A Ebullicion Con
Refrigerante De Reflujo, Durante 3 Horas, Con 10 Por 100 V/V De Anhidrido Acetico.
Destilar Sobre Anhidrido Fosforico.
17.4. Procedimiento.
Pesar Con Una Precision De 1 Mg, En Una Navecilla De Vidrio, La Cantidad Necesaria
De Materia Grasa, Segun Las Indicaciones De La Tabla Siguiente (La Cantidad De
Solucion De Tiocianogeno Sera De Un 150 Por 100 En Exceso):
(Tabla Omitida)
Los Ensayos Sobre Materia Grasa Y En Blanco Se Realizaran Al Menos Por Duplicado.
Si Entre Ambos Ensayos, Sobre Materia Grasa Y En Blanco, Se Obtienen Diferencias
Superiores A 2 Unidades Del Indice De Tiocianogeno, Repetir La Determinacion.
17.5. Calculo.
(Formula Omitida)
17.6. Referencias.
2. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps 1964. Ii.D.8.
18.1. Principio.
El Metodo Tiene Caracter Convencional, Por Lo Que Sus Prescripciones Han De Ser
Observadas Rigurosamente.
18.2.4. Ampollas De Decantacion De 500 Ml. 18.2.5. Crisol Con Placa Filtrante G3,
Con Dispositivo Para Refrigerar Y Kitasato Para Recoger El Filtrado.
18.3. Reactivos.
18.4. Procedimiento.
(Formula Omitida)
18.6. Referencia.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. 1964. Ii. D.11.
19 INDICE DE DIENOS
19.1. Principio.
19.3. Reactivos.
19.3.1. Solucion Al 6 Por 100 De Anhidrido Maleico (P.F. 52-54 Grad. C), En Toluol
Puro; Dejar En Reposo 24 Horas. Filtrar Con Papel De Filtrado Rapido Antes De Su
Uso.
19.4. Procedimiento.
Valorar Todos Los Extractos Acuosos Reunidos Con Disolucion De Hidroxido Sodico
N, Usando Fenolfttaleina Como Indicador.
19.5. Calculo.
(Formula Omitida)
19.7. Referencias.
21 Indice De Peroxidos
20.1. Principio.
Este Metodo Determina Los Acidos Oxidados Contenidos En Las Grasa, Expresados En
Materia Grasa Insoluble En Eter De Petroleo.
20.3. Reactivos.
Ter De Petroleo (P.E. 40 Grad. -60 Grad. C) Bidestilado, Exento De 20.3.3. Solucion
De Acido Clorhidrico N.
20.4. Procedimiento.
Los Acidos Oxidados Se Adhieren Generalmente A Las Paredes Del Tubo Y Aparecen
En Forma De Una Masa Roja Oscura.
Si Los Acidos Oxidados Son Abundantes, Hacer Salir El Eter De Petroleo Por La Parte
Superior De La Ampolla, Para Evitar Que Los Acidos Obturen Con 25 Ml De Eter De
Petroleo Y Filtrar. Lavar Tambien Con Eter De Petroleo El Tubo De Vaciado De La
Ampolla Y El Embudo, El Filtrado Y El Pico Del Embudo Con Porciones De 10, 10 Y
5 Ml Respectivamente. Seguidamente Desecar El Exterior Del Pico Del Embudo Y El
Del Tubo De Vaciado Del Embudo De Decantacion.
Disolver En Etanol De 95 Grad. Por 100 V/V Caliente, Los Acidos Oxidados
Contenidos En La Ampolla: Una Vez Con 25 Ml Caliente, Y Otra Con 50 Ml De Etanol
De Etanol Caliente. Pasar Sucesivamente Cada Porcion Caliente Por El Filtro. Nol
Lavar El Tubo De Vaciado De La Ampolla, El Filtro Y El Cono Del Embudo Con
Porciones Respectivas De 5 Ml De Etanol Caliente, Recoger Las Soluciones
Alcoholicas En Un Vaso De 400 Ml.
Colocar El Crisol En Estufa A 103 Grad. C (+- 2 Grad. C), Durante Media Hora. Pasar
A Desecador Con Acido Sulfurico Durante 15 Minutos Y Pesar. Repetir A.
Sucesivamente Estas Operaciones Hasta Pesada Constante Con Una Precision De 1 Mg.
La Ultima Pesada Representa El Peso De Los Acidos Oxidados Mas El De Las Sales
Minerales Arrastradas Con Los Acidos Oxidados.
20.5. Calculo.
(Formula Omitida)
20.6. Referencias.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry Standard Methods For The
Analysis Of Oils. Fats And Soaps. 1964.Ii.D.12.
21 INDICE DE PEROXIDOS
21.1. Principio.
21.3.1. Cloroformo, Para Analisis, Exento De Oxigeno Por Barboteo De Una Corriente
De Gas Inerte Puro Y Seco.
21.4. Procedimiento.
Tomar Un Matraz Con Cierre Esmerilado, De Unos 25o Ml, Previamente Seco, Y
Llenar Con Un Gas Inerte, Puro Y Seco (Anhidrido Carbonico O Nitrogeno). Introducir
Tan Rapidamente Como Se Pueda La Muestra Del Aceite Que Se Desa Ensayar,
Definida En Funcion De Los Indices Presumidos (Ver 21.6.1.).
Paralelamente, Se Efectua Un Ensayo Testigo, Sin Aceite, Que Debe Dar Un Indice
Nulo.
21.5. Calculos.
(Formula Omitida)
21.6. Obsrvaciones.
(Tabla Omitida)
21.6.2. Para La Expresion Del Indice De Peroxidos Se Han Propuesto Otras Unidades
Distintas A La Adoptada En Esta Norma Y Que Suelen Ser Utilizadas, En Algunos
Casos, Presentandose A Confusiones En La Interpretacion De Resultados. Para Evitar
Estos Errores Y Los Inconvenientes Que Pudieran Derivarse De Los Mismo, En Los
Informes Analiticos Debera Indicarse Siempre La Unidad En La Que Se Expresa El
Indice.
Para Facilitar El Paso De Una Unidad A Otra, Se Indican A Continuacion, Los Factores
De Conversion Por Los Que Debera Multiplicarse, En Cada Caso, La Cifra Del Indice,
Expresado En Una Determinada Unidad, Para Obtener La Cifra Equivalente En La
Unidad Que Se Define En 21.1.
(Tabla Omitida)
21.7. Referencias.
2. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps 1964.Ii.D.13.
22 (a). INSAPONIFICABLE
22(a).1. Principio.
22(a).3. Reactivos.
Ss.(a).4. Procedimiento.
22(a).5. Calculo.
Presado En Porcentaje.
22(a).6. Observaciones.
22(a).7. Referencias.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Anlysis Of Oils. Fats And Soaps. 1964.Ii.D.5.
22(B). Insaponificable
22(B).1. Principio.
Como 22 (a).1.
Como 22(a).2.
22(B).2. Reactivos.
22(B).4. Procedimiento.
Girar, Sobre Si Mismo, Sin Sacudidas Violentas, La Ampolla Que Contiene El Eter Y
Los 40 Ml De Agua. Una Vez Separadas Las Dos Capasa, Eliminar La Capa Acuosa.
Lavar La Capa Eterea Dos Veces, Con 40 Ml De Agua Cada Vez, Agitando
Energicamente. Despues, Lavar Sucesivamente Con 40 Ml De Solucion De Potasa
Acuosa 0,5 N, Con 40 Ml De Agua, Y De Nuevo Con 40 Ml De Solucion Acuosa De
Potasa 0,5 N, Y, Por Lo Menos, Dos Veces Con 40 Ml De Agua. Continuar Los
Lavados Con Agua Hasta Que Las Aguas De Lavado No Den Coloracion Rosa A La
Fenolfaleina.
22.(B).5. Calculo.
(Formula Omitida)
Nificable Expresado En Porcentaje.
22(B).6. Observaciones.
22(B).7. Referencias.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. 1964.Ii.D.5.
23.1. Principio.
23.2.3. Aparato De Destilacion, Con Ajustes Esmerillados Y Con Matraz De 100 A 150
Ml De Capacidad.
23.3. Reactivos.
23.4. Procedimiento.
Absorbido El Benceno Por La Alumina, Y Restando Sobre Esta Una Pequea Capa De
Disolvente, Agregar El Insaponificable Disuelto En 10 Ml De Benceno. Lavar El
Matraz Con 5 Ml De Benceno, E Incorporarlo A La Columna. Antes De Que Hayan
Desaparecido Las Ultimas Porciones De Benceno, Se Agregan 55 Ml De Este, Y
Continua El Desarrollo, Manteniendo La Presion Necesaria Para El Eluyente Fluya De
La Columna En La Proporcion De 2 Ml Por Minuto Aproximadamente.
23.5. Calculo
(Formula Omitida)
23.6. Referencia.
1. J. Fitelson. J. Ass. Off. Agr. Chem. 1943. 26. 499. 2. Instituto De Racionalizacion
Del Trabajo. Una Norma Espaola 55.038.
24(a).1. Principio.
24(a).3. Reactivos.
24(a).3.5. Rodamina 6 G Al 0,001 Por 100 En Etanol Del 90 Por 100. Se Puede
Emplear Cualquier Otro Colorante Que No Reacciones Con Los Esteroles, Como, Por
Ejemplo, Diclorofluoresceina.
24(a).3.6. Cloroformo.
24(a).4. Procedimiento.
Analisis Cromatografico:
Las Condiciones De Trabajo Dependeran Del Aparato Utilizado, Columna, Etc. Sin
Embargo, Puede Considerarse Que La Operacion Marcha Satisfacatoriamente Si Se
Registra Para El Colesterol Un Pico Simetrico, Sin La Aparicion De "Colas" Y La
Resolucion Del Estigmasterol-Camposterol No Es Inferior A 0,8 (Ver 24(a).5.4.).
24(a).5. Observaciones.
(Formula Omitida)
24(a).6. Referencias.
24 (B).1. Principio.
24(B).3. Reactivos.
24(B).3.2. Disolucion Digitomina Al 1 Por 100, P/V, En Etanol De 95 Por 100 V/V.
24(B).4. Procedimiento.
24(B). 5. Calculo.
(Formula Omitida)
24(B).6. Referencias.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. 1964.Ii.D.6.
25. IMPUREZAS
25.1. Principio.
Se Entiende Por Impurezas De Una Grasa El Conjunto De Sustancias Insolubles En Un
Disolvente Volatil En Las Condiciones Descritas, Y Que No Hayan Sido Ya
Determinadas Como "Agua Y Materias Volatiles".
Del Peso Total Obtenido De Impurezas Habra Que Deducir, Eventualmente, El Peso De
Algunas De Ellas, Que, Segun El Convenio Entre Las Partes O Segun La Costumbre,
No Deban Ser Consideradas Como Tales.
Los Jabones De Cal Se Consideraran Como Impurezas, A Menos Que Por Acuerdo
Entre Las Partes Se Decida Otra Cosa. En Este Ultimo Caso No Sera Considerado
Como Impureza Mas Que La Cal Que Contenga, Expresada En Oxido De Calcio.
25.2. Reactivos.
Las Impurezas De Las Materias Grasas Comestibles Y De Las Materias Grasas Brutas
Con Destino Comestible Despues De Tratamiento Adecuado Se Determinaran Con Eter
De Petroleo.
25.2.1. Eter De Petroleo Puro Para Analisis. En Las Condiciones Del Procedimiento
Descrito, El Eter De Petroleo Deja Insolubles: Impurezas Mecanicas (Tierra, Arena Y
Residuos Diversos); Parte De Acidos Oxidados Libres Y Sus Productos De
Polimerizacion, Lactonas-Jabones De Cal, Hidratos De Carbono, Materias
Nitrogenadas, Determinadas Resinas, Materias Minerales, Y No Disuelve Mas Que
Parcialmente Los Jabones Alcalinos.
25.2.2. Eter Tecnio (C2h5)20, Puro Para Analisis. En Las Condiciones Del
Procedimiento Descrito, El Eter Etilico Deja Insolubles: Las Impurezas Mecanicas
(Tierra, Arena Y Residuos Diversos), Materias Minerales, Hidratos De Carbono,
Materias Nitrogenadas, Ciertas Resinas, Jabones De Cal Y Jabones Alcalinos.
25.2.3. Sulfuro De Carbono, s2c, Puro Para Analisis Recien Destilado. En Las
Condiciones Del Procedimiento Descrito, El Sulfuro De Carbono Deja Insolubles:
Impurezas Mecanicas (Tierra, Arena Y Residuos Diversos), Materias Minerales,
Hidratos De Carbono, Materias Nitrogenadas, Ciertas Resinas Y Jabones De Cal. No
Disuelve Mas Que Parcialmente Los Jabones Alcalinos.
25.3. Procedimiento.
Ar La Evaporacion En Estufa Al 103 Grad. C (+- 2 Grad. C). Pesar El 25.4. Calculo.
Vaporacion En Estufa Al 103 Grad. C (+- 2 Grad. C). Pesar El (Formula Omitida)
25.5. Observaciones.
25.5.2. Para Una Determinacion De Gran Exactitud Debera Emplearse Una Cantidad De
Disolvente Cincuenta Veces Superior Al Peso De Grasa Tomada.
25.6. Referencias.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. 1964.Ii.C.2.
26. CENIZAS
26.1. Principio.
26.3. Procedimiento.
26.4. Calculo.
E Acido Carbonico.
(Formula Omitida)
26.5. Referencia.
1. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps, 1964, Ii.C.3.
27.1. Principio.
27.3. Procedimiento.
Calentar El Alambre De Cobre En La Llama Del Bunsen Hasta Que No Sea Visible
Color Verde.
27.5. Referencia. American Oil Chemists' Society. Official And Tentative Methods. Ca.
7.35.
28(a).3. Reactivos.
28(a).4. Procedimiento.
28(a).5. Referencia.
28(B).1. Principio.
28(B).3. Procedimiento.
28(B).4. Referencia.
1. American Oil Chemists' Society Official And Tentative Methods. Ca. 8a.35.
29.3. Reactivos.
29.4. Procedimiento.
29.5. Referencia.
30.1. Principio.
Este Metodo Tiene Por Objeto Identificar La Presencia De Jabon En Aceites Refinados.
30.3. Reactivos.
30.4. Procedimiento.
Los Tubos De Ensayo Deben Limpiarse Escrupulosamente Antes Del Uso. La Acetona
Al 2 Por 100 De Agua Con La Adicion De Algunas Gotas De La Disolucion De Acul
De Bormofenos Debe Dar Coloracion Del Amarillo Al Amarillo-Verdoso; Si Adquiere
Un Matiz Verdoso, Repetir La Operacion.
30.5.2. Observando Por Reflexion, Color Azul Ultramar Claro, Y Por Transparencia,
Color Azul Violeta Intenso; Contenido De Jabon Superior Al 0,001 Por 100, Expresado
En Hidroxido Sodico.
30.6. Observaciones.
Para Que El Ensayo Tenga La Sensibilidad Indicada, El Aceite Debe Tener Una Acidez
Libre Inferior Al 1 Por 100 (Expresada En Acido Oleico).
30.7. Referencia.
31.2.3. Matraces Aforados Con Tapon De Vidrio Esmerillado De 10, 500 Y 1.000 Ml.
31.3. Reactivos.
31.4. Procedimiento.
La Lectura Debe Estar Comprendida Entre 0,2 Y 0,8 De Aborbancia; En Caso Contrario
Se Repetira La Medida, Bien Diluyendo Convenientemente O Procediendo A Una
Nueva Pesada.
31.5. Calculo.
(Formula Omitida)
31.6. Observacion.
Los Aceites De Oliva Virgenes Que Sea Necesario Purificar Para Realizar Esta
Determinacion Se Someteran Al Siguiente Tratramiento En Columan De Alumina:
31.7. Referencias.
32(a).1. Principio.
32(a).3. Reactivos.
32(a).4. Procedimiento.
Eliminar El Agua Del Aceite Por Decantacion Y Filtracion Sobre Papel, Efectuada A
Una Temperatura Ligeramente Superior Al Punto De Fusion De Determinados
Componentes Solidos Que Hubieran Podido Separase De La Materia Grasa Fluida.
32(a).5. Calculo.
32(a).6. Observaciones.
32(a).7. Referencias.
32(B).1. Principio.
Como 32(a).2.
32(B).3. Reactivos.
32(B).4. Procedimiento.
Como En 32(a).4, Excepto Que Se Saponificara Con Solucion Alcalina 32(B).3.1. Y Se
Emplearan 0,8 Ml De Disolucion Acida 32(B).3.3, En Lugar De Los 1,5 Ml De
Disolucion De Acido Acetico.
32(B).5. Calculo.
32(B).6. Referencias.
33.1. Principio.
33.3. Reactivos.
33.4. Procedimiento.
Positivo O Negativo.
33.6. Observacion.
33.7. Referencias.
34.1. Principio.
34.2.1. Tubo Para Cromatografia, El Cual Consta De Dos Partes. La Parte Superior
Tiene Un Diametro Interior De 35 Mm, Y La Parte Inferior, Un Diametro Interior De 10
Mm. Cada Una De Estas Partes Tiene Una Longitud De 23 Cm, Lo Que Da Al Tubo
Cromatografico Una Longitud Total De 46 Cm. La Mitad Inferior Tiene, En Su
Extremidad, Una Estrangulacion O El Dispositivo Conveniente Para Retener El Tapon
O Lana De Vidrio Que Ha De Servir De Soporte Al Abosrbente; O Bien, Una Placa
Filtrante De Vidrio De Porosidad 2.
34.2.5. Vasito De Vidrio, Cilindrico De Fondo Plano Y Boca Esmerillada, Con Las
Siguientes Dimensiones Aproximadas: 18 Milimetros Diametro; 60 Mm De Altura
Total,Ntes Dimensiones Aproximadas: 18 Milimetros Diametro; 60 Mm De Altura
Incluida La Boca, Constituida Por Un Cono Esmerilado, Normalizado, Con Una Altura
De 10 Milimetros; Ira Provisto De Tapon De Teflon, Aunque Puede Sustituirse Por
Tapon De Vidrio.
34.2.17. Cronometro.
34.3. Reactivos.
34.3.4. Lipasa Pancreatica De Cerdo, Cuya Actividad Este Comprendida Entre 0,8 Y 2
Unidades Lipasicas Por Mg.
34.4. Procedimiento.
(Formula Omitida)
La Disolucion Oleosa Que Pasa Por La Columna Se Filtra A Traves Del Filtro De
Vidrio (34.2.2.) Previamente Desecado En Estufa A 105 Grad. C.
34.5. Observaciones.
34.5.4. Teniendo En Cuenta Que Se Han Tomado 20 G De Muestra Por Cada 1 Por 100
De Acidez Libre De Oleico, Se Debera Adicionar 0,36 Ml De La Disolucion De
Hidroxido Sodico 2n. Si La Fenolftaleina No Acusase Reaccion Alcalina, Debera
Adicionarse Mas Disolucion Gota A Gota, Y Agitando Despues De Cada Adicion,
Hasta Conseguir El Viraje Del Indicador.
34.5.5. Con Aceites Comestibles De Buena Calidad Aparente, Y Acidez Reducida (<= 3
Por 100) En Operaciones De Rutina, Se Puede Omitir El Tratamiento Previo De
Purificacion Con Alumina, Ya Que, En La Inmensa Mayoria De Los Casos, Esta
Purificacion No Es Necesaria. Sin Embargo, Como Norma General, Este Tratamiento
Debe Considerarse Como Necesario, Y Cualquier Valor Anormal Obtenido Efectuando
Una Lipolisis Directa No Debera Ser Aceptado Sin Confirmarlo Previamente, Con La
Grasa Sometida Al Proceso De Purificacion.
34.6. Referencia.
35.1. Principio.
Este Metodo Tiene Por Objeto La Identificacion Del Aceite Extraido Por Disolventes
De Los Orujos Grasos De Aceituna.
35.2.5. Matraz Erlenmeyer De 100 Ml, Con Boca Esmerilada, Provisto De Refrigerante
De Reflujo De Aire, Constituido Por Un Tubo De 80 A 100 Cm De Longitud
Aproximadamente.
35.3. Reactivos.
35.3.7. Alcohol Etilico De 85 Por 100 En Volumen. Diluir 885 Mililitros De Etanol De
96 Grad. Hasta 1.000 Ml Con Agua Destilada. La Densidad Sera 0,8520. Comprobar
Con Un Alcohometro.
35.4. Procedimiento.
Positivo O Negativo.
35.6. Referencia.
36 TETRABROMUROS
(Prueba De Vizern-Guillot)
36.1. Principio.
La Sensibilidad Es Del 5 Por 100 Para El Aceite De Soja Y Del 10 Por 100 Para Los
Demas Aceites.
36.3. Reactivos.
36.3.1. Eter De Petroleo (P. E. 40-70 Grad. C) Exento De Productos Reaccionables Con
Los Halogenos.
36.4. Procedimiento.
Positivo O Negativo.
36.6. Referencia.
37.1. Principio.
Se Hace Actuar El Acido Nitrico Concentrado Sobre El Aceite, El Cual Reacciona Con
Productos De Oxidacion Originados En Las Materias Grasas Parcialmente Alteradas,
Hayan Sido Sometidas O No A Un Proceso De Transformacion Industrial.
37.3. Reactivos.
37.4. Procedimiento.
Los Aceites De Semillas Refinados Dan Coloraciones Muy Diversas Que No Pueden
Considerarse Como Especificas Para Cada Uno, Pero Que, Sin Embargo, Un Operador
Experto En La Aplicacion De La Prueba Los Diferencia Perfectamente De Las
Coloraciones Atribuibles A Los Aceites De Oliva.
37.6. Observaciones.
37.7. Referencia.
38.1. Principio.
Este Metodo Detecta Cualitativamente El Aceite De Algodon En Mezcla Con Otros
Aceites O Grasa Vegetales O Animales.
38.2.3. Bao De Aceite O Bloque De Calefaccion Adecuado Para Los Tubos De Ensayo
Que Han De Ser Utilizados, Regulables A Una Temperatura De 110-115 Grad. C. En
Lugar De Aceite Puede Emplearse Una Disolucion Acuosa Saturada De Cloruro
Sodico.
Aceite Puede Emplearse Una Disolucion Acuosa Saturada De Cloruro 38.3. Reactivos.
38.4. Procedimiento.
Positiva O Negativa.
38.6. Observaciones.
38.7. Referencias.
3. American Oil Chemists' Society. Official And Tentative Methods. Cb. 1-25.
39.1. Principio.
39.3. Reactivos.
= 1,84.
39.4. Procedimiento.
Positiva O Negativa.
39.6. Observaciones.
39.6.1. Muchas Muestras Genuinas De Aceite De Oliva Dan Coloraciones Rosa De Una
Intensidad Comparable A Un Contenido De Aceite De Semilla De Te Del 10 Por 100 O
Mas. Por Consiguiente, Coloraciones Rosadas Debiles En Muestras Presentadas Como
Aceite De Oliva Puro No Pueden Ser Atribuidas A La Presencia De Aceite De Semilla
De Te.
39.7. Referencias.
2. American Oil Chemists' Society. Official And Tentative Methods. Cb. 3-39.
Este Metodo Tiene Por Objeto El Reconocimiento Del Aceite De Sesamo En Mezcla
Con Otros Aceites Y Grasas Comestibles.
40.3. Reactivos.
40.4 Procedimiento.
40.6. Referencias.
1. Pavolini L. Olii Minerali, Grassi Saponi, Colori Vernici; 12, 41, 1934.
41.1. Principio.
41.2.5. Cromatografo Apto Para Separar Los Esteres Metilicos, Provisto De Horno Con
Regulacion De Temperatura Hasta 250 Grad. - 300 Grad. C, E Inyector Susceptible De
Ser Calentado Hasta 50 Grad. C Por Encima De La Temperatura Del Horno. Detector
Suficientemente Sensible Y Aparato Registrador Continuo.
41.2.6. Botella Con Nitrogeno A Presion; Riqueza Minima 99,8 Por 100.
41.3. Reactivos.
41.3.9. Disolucion De Rojo De Metilo Al 0,1 Por 100 En Etanol Al 60 Por 100.
41.4. Procedimiento.
41.4.1.2. Aceites Y Grasas De Acidez No Superior Al 0,3 Por 100 En Acido Oleico.
Omitir La Metanolisis En Medio Acido. Realizar La Metanolisis Alcalina Segun
41.4.1.1. A) Y, Estando Aun Caliente El Matraz, Agregar Por La Parte Superior Del
Refrigerante Una Gota De Disolucion De Fenolftaleina Y Disolucion De Acido
Clorhidrico En Metanol En Cantidad Algo Superior A La Necesaria Para Neutralizar El
Metilado. Dejar Enfriar. Pasar La Disolucion A La Ampolla De Extraccion. Proceder A
La Extraccion De Los Esteres Metilicos Segun 41.4.1.1. C).
(Formula Omitida)
Si La Resolucion Es Igual O Mayor De 1,0 El Instrumento Y Columna Estan En
Condiciones De Trabajo Satisfactorias.
41.5.1. Identificacion De Los Picos. Los Esteres Aparecen En Orden Creciente Del
Numero De Atomos De Carbono Y De Aumento De Insaturacion Para Un Mismo
Numero De Atomos De Carbono. El Palmitico (C16) Aparece Delante De Los C18, Y
Estos En El Orden Oleato (C18:1), Linoleato (C18:2) Y Linoleato (C18:3); El Araquico
(C20:0) Aparece Normalmente Despues Del (C18:3), Pero Pueden Estar Invertidos En
Algunos Casos. Se Establecera La Identidad Para Una Columna Dada Inyectando
Muestra Patrones.
Sumar Las Areas De Todos Los Picos Y Calcular El Tanto Por Ciento Correspondiente
A Cada Pico:
(Formula Omitida)
(Formulas Omitidas)
41.6. Referencias.
3. International Union Of Pure And Applied Chemistry. Standard Methods For The
Analysis Of Oils, Fats And Soaps. A1964. Ii. D. 19. Suplemento 5. Ed.
42.1. Principio.
Se Considera Materia Grasa Del Alpechin El Producto Obtenido Por Extraccion Con
Eter De Petroleo En Condiciones Determinadas.
42.3. Reactivos.
42.4. Procedimiento.
Repetir La Extraccion Del Alpechin Dos Veces Mas, Como Minimo (Ver 42.6.4.). Las
Tres Fracciones De Eter De Petroleo Reunidas En La Segunda Ampolla Se Lavan Con
Agua Destilada Por Agitacion.
Una Vez Separada El Agua Del Ultimo Lavado, Se Aade Una Pequea Cantidad De
Sulfato Sodico Anhidro A La Solucion De Eter De Petroleo, Agitando Y Dejando
Reposar Media Hora, Como Minimo. Se Filtra Sobre El Matraz De 250 Ml,
Previamente Mantenido Dos Horas En Estufa A 105 Grad. C, Enfriado En Desecador Y
Tarado, Hasta Ocupar La Mitad Del Matraz; Se Destila El Eter Volviendo A Filtrar Otra
Porcion De Eter De Petroleo, Que Se Destila Seguidamente, Repitiendo Sucisivamente
Estas Operaciones Hasta Agotar La Totalidad Existente En La Ampolla, Que Se
Enjuaga Con 20 O 25 Ml De Eter De Petroleo, Que Se Adicionan Tambien Al Matraz.
42.5. Calculos.
(Formula Omitida)
47. FSFORO.
47.1. Principio.-Incineracin de la muestra en presencia de xido de cinc, seguida de la
medida colorimtrica del fsforo como azul de molibdeno.
Aplicable a aceites vegetales brutos, desgomados y refinados.
47.2. Material y aparatos.
47.2.1. Crisoles de porcelana de 50 ml. De capacidad.
47.2.2. Vidrios de reloj.
47.2.3. Placa de calefaccin elctrica, con regulador de temperatura.
47.2.4. Horno de mufla.
47.2.5. Embudo de vidrio de vstago corto de 50 mm. De dimetro.
47.2.6. Papel de filtro de 90 mm. De dimetro, Albet 242 o similar.
47.2.7. Frasco lavador de un litro de capacidad con cuello protegido del calor.
47.2.8. Matraces aforados de 50, 100, 250 y 500 ml. De capacidad provistos de tapones
de vidrio.
47.2.9. Pipetas de 2,5, 10 y 25 ml. De capacidad.
47.2.10. Pipetas de 10 ml. De capacidad, divididas en dcimas de mililitro.
47.2.11. Espectrofotmetro para medicin en el visible.
47.2.12. Cubetas espectrofotomtricas de 10 mm. De paso.
47.3. Reactivos.
47.3.1. Acido clorhdrico (d = 1,19).
47.3.2. Oxido de cinc.
47.3.3. Hidrxido potsico.
47.3.4. Acido sulfrico (d = 1,84).
47.3.5. Molibdato sdico.
47.3.6. Sulfato de hidracina.
47.3.7. Fosfato cido monopotsico, desecado a 103 2 C durante dos horas antes de
usarlo.
47.3.8. Disolucin de molibdato sdico.-Aadir con precaucin 140 ml. De cido
sulfrico a 300 ml. De agua destilada. Dejar enfriar la temperatura ambiente, aadir
12,5 gr. De molibdato sdico y disolver totalmente. Llevar a un matraz aforado de 500
ml., diluir con agua destilada hasta el enrase, homogeneizar y dejar reposar durante 24
horas, por lo menos, antes de usarla.
47.3.9. Disolucin de sulfato de hidracina al 0,015%.-Disolver en un matraz aforado
0,15 gr. De sulfato de hidracina en un litro de agua destilada.
47.3.10. Disolucin de hidrxido potsico al 50% (m/m). Disolver 50 gr. De hidrxido
potsico en 50 ml. De agua destilada.
47.3.11. Disolucin de fosfato cido monopotsico.-Disolver 1,0967 gr. De fosfato
monopotsico seco en agua destilada. Diluir a 250 ml. En un matraz aforado y agitar.
Esta disolucin contiene 1 mg. De fsforo por mililitro. A continuacin verter, con una
pipeta, 5 ml. De la disolucin anterior en un matraz aforado de 500 ml. Y enrasar con
agua destilada. Esta disolucin contiene 0,01 mg. De fsforo por mililitro.
47.4. Procedimiento.
47.4.1. Construccin de la curva patrn.-Tomar, mediante pipeta, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 ml.
De la disolucin 47.3.11, e introducir en matraces aforados de 50 ml. Completar el
volumen a 10 ml. Con agua destinada, utilizando la pipeta 47.2.10, continuando como
se describe en 47.4.3. A partir de la adicin de sulfato de hidracina. Las alcuotas
tomadas de la disolucin contienen 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 y 0,10 mg. De fsforo. A
continuacin representar grficamente los valores de absorbancia frente a los contenidos
en fsforo, expresado en mg.
47.4.2. Preparacin de la muestra.-Pesar, con precisin de 1 mg., de 3 a 3,2 gr. De
muestra en un crisol de porcelana y aadir 0,5 gr. De xido de cinc. Calentar lentamente
en la placa elctrica hasta que la muestra se espese y entonces aumentar gradualmente la
calefaccin hasta que la masa est completamente carbonizada. Colocar el crisol en el
horno de mufla a una temperatura de 550-600 C, mantenindolo durante dos horas.
Una vez transcurrido ese tiempo, dejar enfriar a la temperatura ambiente.
Aadir a las cenizas 5 ml. De agua destilada y 5 ml. De cido clorhdrico. Cubrir el
crisol con un vidrio de reloj y calentar suavemente a ebullicin durante cinco minutos.
Filtrar la disolucin recogiendo el filtrado en un matraz aforado de 100 ml. Lavar la
parte interior del vidrio de reloj y las paredes del crisol con 5 ml. De agua destilada
caliente, usando un frasco lavador con chorro de agua finsimo. Lavar el crisol y el
papel de filtro con cuatro porciones de 5 ml. De agua destilada caliente. Enfriar la
disolucin a temperatura ambiente y neutralizar hasta dbil turbidez, adicionando unas
gotas de potasa al 50%. Aadir cido clorhdrico gota a gota hasta que el precipitado de
xido de cinc se disuelva y entonces aadir dos gotas ms. Diluir hasta 100 ml. Con
agua destilada y agitar.
47.4.3. Determinacin.-Pasar, mediante pipeta, 10 ml. De esta disolucin a un matraz
aforado de 50 ml. Aadir 8 ml. De la disolucin de sulfato de hidracina y a continuacin
2 ml. De la disolucin de molibdato sdico. Tapar e invertir el matraz aforado dos o tres
veces, quitar el tapn y calentar durante 10 0,5 minutos en bao de agua hirviendo.
Transcurrido este tiempo retirar del bao, enfriar a 25 5 C en bao de agua, diluir
hasta el enrase con agua destilada y mezclar perfectamente. Llenar una cubeta del
espectrofotmetro y medir la absorbancia a 650 nm. Utilizando como referencia agua
destilada.
Realizar un ensayo en blanco como se ha descrito, pero sin aadir aceite.
47.5. Clculos.-Calcular el contenido en fsforo, expresado en tanto por ciento,
mediante la siguiente frmula:
Porcentaje fsforo = [10 (M - B) / PV]
Siendo:
M = contenido en fsforo, en mg, de la alcuota.
B = contenido en fsforo, en mg, del ensayo en blanco.
P = peso, en g, de la muestra.
V = volumen, en ml, tomados en 47.4.3.
% en fosftidos = % fsforo * F, donde F = factor de conversin de fsforo en
fosftidos (ver 47.6.2.).
47.6. Observaciones.
47.6.1. No debe demorarse la lectura espectrofotomtrica una vez conseguido el
desarrollo del color.
47.6.2. En el caso del aceite de soja el valor de V es prcticamente igual a 30.
47.7. Referencias.
1. Instituto Nacional de Racionalizacin y Normalizacin del Trabajo. Una Norma
Espaola 55.108-73.
49.-ACIDOS DOCOSENOICOS.
49.1.-Principio.
El mtodo se funda en obtener los steres metlicos de los cidos grasos contenidos en
la muestra problema por metanlisis con metxido sdico, completada con una
metanlisis cida si fuera necesario, adicionando previamente a la muestra una cantidad
determinada de tetracosato de metilo (lignocerato de metilo) o el cido libre, que se
utiliza como patrn interno.
49.2.-Material y aparatos.
49.3.-Reactivos.
49.3.1.-Como en el mtodo oficial nm. 41, apartados 2.2.1; 2.2.2; 2.2.3. Y 2.2.5.
49.4.-Procedimiento.
49.4.1.-Preparacin de la muestra.
La muestra utilizada deber estar seca y libre de sedimentos constituidos por materias
extraas. Si no fuese as, se filtrar previamente por un papel filtro, agregando, si fuese
necesario, una pequea cantidad de sulfato sdico anhidro, para retener la humedad. Si
los sedimentos estuviesen constituidos por materia grasa slida, se fundir, calentando
suavemente la muestra, agitando lo necesario para conseguir su homogeneizacin.
Siendo:
Ra = Factor de respuesta.
Ae = Respuesta del cido ercico, expresada en las mismas unidades del cido
lignocrico.
Al cabo de este tiempo, dejar enfriar el matraz y una vez fro quitar el refrigerante,
adicionando 5 ml de heptano; taponar el matraz, agitando fuertemente durante un
minuto. Adicionar solucin acuosa saturada de cloruro sdico hasta situar la capa de
heptano en el cuello del matraz.
49.4.4.-Cromatografa gaseosa de los steres.
Determinar la respuesta del detector para el pico de los steres de los cidos
docosenoicos y lignocrico y el lignocerato por cualquiera de los procedimientos que se
utilizan con este fin.
49.5.-Clculos.
Siendo:
Ap = Respuestas del patrn (lignocerato) expresado en las mismas unidades que los
cidos docosenoicos.
49.6.-Notas.
49.6.1.-En lugar del erucato y lignocerato de metilo se pueden utilizar como patrones
los cidos libres, siempre que tengan un mnimo de pureza del 99%.
49.6.2.-Si la muestra analizada est constituida por una grasa neutra como es el caso
normal al tratarse de aceites de semillas refinados, y el patrn utilizado es el lignocerato
de metilo, bastar efectuar solamente la metilacin alcalina, sin que sea necesario la
utilizacin de la solucin clorhdrica en metanol.
Segn esto, transcurrido el perodo de ebullicin de una hora, despus de agregar la
solucin de metilato, se deja enfriar, se agregan 10 ml de solucin acuosa de clorhdrico
IN y 5 ml de heptano, continuando como se indica en el ltimo prrafo del apartado
49.4.3.
En cualquier caso, para obtener una respuesta cuantitativa correcta, este lquido no debe
sobrepasarse, sirviendo los resultados obtenidos en la determinacin del factor de
respuesta, tal como se describe en el apartado 49.4.2., para apreciar los lmites de
linealidad en la respuesta del detector.
56. TOCOFEROLES
56.1 Principio.
1. Extraccin de la materia insaponificable de la grasa.
2. Aislamiento de la fraccin de tocoferoles por cromatografa en capa fina.
3. Separacin y cuantificacin de los componentes de la fraccin de tocoferoles por
colorimetra o cromatografa gaseosa.
56.2 Material y aparatos.
56.2.1 Matraces de fondo redondo de 50 ml y 100 ml.
56.2.2 Matraces en forma de corazn de 15 ml.
56.2.3 Tubos de reflujo de 1 ml para adaptar a los matraces (56.2.1) o refrigerante de
reflujo.
56.2.4 Ampollas de decantacin de 125 ml.
56.2.5 Microjeringuillas de 100 l.
56.2.6 Placas de vidrio para cromatografa en capa fina de 20 cm * 20 cm, con capa de
gel de slice de 0,25 mm de espesor.
56.2.7 Contraplacas de 20 cm * 16 cm.
56.2.8 Cubeta de desarrollo en vidrio para cromatografa en capa fina, con tapa de
vidrio.
56.2.9 Pulverizador para lquidos de revelado.
56.2.10 Columna de eluccin, de vidrio, dimetro interior 6 mm, con un tubo superior
de 16 mm de dimetro y 95 mm de longitud, con un tubo capilar inferior de 40 mm de
longitud (figura 1).
56.2.11 Evaporador rotatorio o bao de agua hirviendo.
56.2.12 Estufa regulada a 110 2 C.
56.2.13 Pinzas para fijar las contra placas.
56.2.14 Espectrofotmetro para lectura en el espectro visible.
56.2.15 Cubetas de 1,00 cm 0,01 cm de espesor.
56.2.16 Matraces de fondo redondo de 10 ml con tapn esmerilado.
56.2.17 Microjeringuillas de 1 l.
56.2.18 Apartado de cromatografa gaseosa con detector de ionizacin de llama y
registrador.
56.2.19 Columna de vidrio de unos 2 m de longitud, dimetro interno 2, 2-2,5 mm, con
relleno de 3 al 5 por 100 de metilsilicona (SE-30), o fenilmetilsilicona (OV-17), sobre
tierra de diatomas, con granulometra de 80-100 mallas.
56.2.20 Columna capilar de vidrio, longitud 20 m, dimetro interno 0,4 mm de
metilsilicona (SE-30), o fenilmetilsilicona (OV-17).
56.3 Reactivos.
56.3.1 N-Hexano para cromatografa.
56.3.2 N-Heptano para cromatografa.
56.3.3 Benceno anhidro (contenido en agua mximo 0,01 por 100).
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1985, TOMO III, pg. 5603)
56.3.4 Etanol absoluto exento de aldehdos, de calidad analtica.
56.3.5 Eter etlico, exento de perxidos y de residuo.
56.3.6 Lquido de desarrollo: Hexano-ter 7:3 (V/V).
56.3.7 Lquido de eluccin: Heptano-etanol 2:1 (V/V).
56.3.8 Pirogalol (1, 2, 3, Bencenotriol), solucin etanlica de 5 g/100 ml, preparada
inmediatamente antes del empleo.
56.3.9 Hidrxido de potasio, solucin acuosa de 1.000 g/l.
56.3.10 Solucin de cloruro de hierro (III): Disolver 200 g de (fecl, 6H2O), de calidad
analtica en 100 ml de etanol absoluto.
La solucin se debe preparar inmediatamente antes del empleo.
56.3.11 Solucin de referencia de tocoferoles: Disolver 200 mg de una mezcla en partes
iguales de los tres tocoferoles , y en 10 ml de heptano. Puede sustituirse esta
solucin por otra obtenida a partir de mezcla de aceite de soja y girasol, siguiendo el
procedimiento (56.4.1) y (56.4.2).
56.3.12 Solucin de fenoltalena en etanol absoluto: 10 g/l.
56.3.13 Nitrgeno conteniendo menos de 5 mg de oxgeno por kg.
56.3.14 Disolucin etlica de 2,2' dipiridilo. Disolver 200 mg de 2,2' dipiridilo en 100
ml de etanol absoluto.
56.3.15 Piridina anhidra, de calidad analtica, recientemente destilada sobre hidrxido
de sodio u xido de bario.
56.3.16 Hexametildisilazano puro.
56.3.17 Dimetilclorosilano puro.
56.3.18 Escualano puro.
56.3.19 Solucin de escualano en n-heptano, 100 mg/100 ml.
56.3.20 d-1 tocoferol, pureza mnima 99 por 100.
56.4 Procedimiento.
56.4.1 Extraccin del insaponificable total.-Pesar, con presin de 0, 005 g, 1 g de
muestra en un matraz de 50 ml. Aadir 4 ml de la solucin etanlica de pirogalol.
Adaptar el refrigerante de reflujo y llevar a ebullicin. Al empezar la ebullicin aadir 1
ml de la solucin de hidrxido de potasio. Dejar en ebullicin durante tres minutos.
Retirar el matraz y refrigerarlo bajo una corriente de agua, aadir 25 ml de agua
destilada.
Trasvasar cuantitativamente a una ampolla de decantacin. Enjuagar el matraz con 40
ml de ter etlico, aadirlo a la ampolla y efectuar una primera decantacin. Efectuar
otras dos extracciones de la fase acuosa utilizando cada vez 25 ml de ter etlico. A cada
extraccin agitar suavemente la ampolla de decantacin, girando sobre s misma, para
evitar la formacin de emulsiones, dejar reposar para separar la fase acuosa.
Reunir los tres extractos en la ampolla de decantacin y lavar con porciones de 20 ml de
agua, agitando enrgicamente hasta que el lquido de lavado no vire a rosa por adicin
de una gota de la solucin de fenolfetalina. Trasvasar la fase etrea a un matraz de 100
ml y evaporar el ter etlico por destilacin en un evaporador rotatorio o calentando
sobre un bao de agua hirviendo. Para secar el residuo, aadir 1 ml de etanol y 4 ml de
benceno y evaporar en corriente de nitrgeno por destilacin en un evaporador rotatorio
o calentando sobre bao de agua hirviendo. Repetir la adicin de etanol y benceno y
evaporar estos disolventes.
Disolver el residuo en 1 ml de hexano y transferir a un matraz en forma de corazn,
utilizando la menor cantidad posible de hexano para los lavados. Evaporar totalmente el
hexano al vaco o con corriente de nitrgeno. Eliminar el aire del matraz con ayuda de
una corriente de nitrgeno y aadir exactamente 1 ml de heptano. Efectuar
inmediatamente la cromatografa en capa fina de la solucin obtenida.
56.4.2 Cromatografa en una capa fina.-Todo el procedimiento descrito a continuacin
deber efectuarse en ausencia de luz natural, en una habitacin alumbrada por una
lmpara elctrica recubierta con papel rojo claro. Saturar la cubeta cromatogrfica con
el lquido de desarrollo (56.3.6) y cubrir las caras internas de la cubeta con papel de
filtro. Sobre una placa de cromatografa en capa previamente activada, calentando
treinta minutos en una estufa a 110 C y con la ayuda de una microjeringa graduada,
depositar 1 l de la solucin de tocoferoles de referencia (56.3.11), a 2 cm de cada
borde lateral y a 1 cm del borde inferior. A partir de 6 cm del borde derecho y sobre una
banda de 2 cm de longitud, depositar con microjeringa en finas gotas lo ms
uniformemente posible la solucin del insaponificable obtenida en 56.4.1.
La cantidad de insaponificable depositada estar comprendida entre 25 y 72 l segn la
riqueza del aceite en tocoferoles; normalmente la cantidad depositada es de 50 l. Esta
cantidad deber ser medida exactamente en el caso de una determinacin cuantitativa.
Si se ponen varias muestras para analizar en la misma placa, debern depositarse las
bandas con un espacio de separacin de 2 cm entre cada muestra.
Introducir inmediatamente la placa en la cubeta en ausencia de luz, hasta que el frente
del lquido de desarrollo diste 1 cm del borde superior de la placa. Sacar la placa y
cubrirla inmediatamente con la contraplaca sujetndola con ayuda de dos pinzas,
dejando sin cubrir dos bandas a la derecha y a la izquierda de la placa sin cubrir.
Pulverizar inmediatamente las dos bandas laterales descubiertas, poniendo en el
pulverizador una mezcla en volmenes iguales de las soluciones de cloruro de hierro
(III) y de 2,2, dipirilo (56.3.14). Conservar la placa en la oscuridad durante cinco o diez
minutos. La aparicin de manchas de color rosa oscuro indica la posicin de los
tocoferoles de la solucin de referencia.
Quitar la contraplaca y sealar los rectngulos de las bandas de 2 cm de los tocoferoles,
a las alturas indicadas, por las manchas reveladas de los tocoferoles de referencia.
Rascar la slice contenida en cada rectngulo marcado, siguiendo las precauciones
habituales para que las repercusiones sean cuantitativas.
Con la ayuda de un embudo pequeo introducir la slice de cada rectngulo en su
columna (56.2.10). Aadir pequeas porciones y facilitar el empaquetamiento con
ligeros golpes sobre las paredes de la columna.
Llevar la columna sobre un matraz en forma de corazn. Pasar 5-6 ml del disolvente de
elucin (56.3.7). Evaporar los disolventes al vaco y proceder inmediatamente a la
evacuacin de los tocoferoles en el residuo, por uno de los mtodos de cuantificacin.
56.4.3 Colorimetra.-Todas las operaciones siguientes debern efectuarse en cmara y
con luz roja.
En cada matraz conteniendo la fraccin tocoferlica obtenida en 56.4.2, aadir
exactamente 3,6 ml de etanol, 0,2 ml de la solucin de cloruro de hierro III (56.3.10).
Mezclar por ligera rotacin del matraz y dejar reposar durante diez minutos.
Efectuar un ensayo en blanco en las mismas condiciones.
Trasvasar las soluciones a las cubetas (56.2.15) y medir las absorbancias a 520 nm de
las muestras y del ensayo blanco, con relacin al etanol. El ensayo en blanco debe tener
una absorbancia inferior a 0, 05.
Este mtodo es aplicable a todos los aceites, incluidos los de oliva virgen y no se
permite la separacin del y tocoferol, ni de los tocotrienios correspondientes.
56.4.4 Cromatografa gaseosa.
56.4.4.1 Preparacin de los sililteres.
En un matraz (56.2.16) aadir 0,5 ml de piridina (56.3.15), 0,45 ml de
hexamerildisilazano (56.5.16) y 0,3 ml de dimetilclorosilano.
Tapar y dejar reposar quince minutos hasta la completa decantacin del precipitado
blanco.
Del lquido superior claro, tomar 100 l con microjeringa e introducirlo en un matraz
que contiene la fraccin de tocoferoles en 56.4.2. La mezcla de la solucin se facilita
inclinando el matraz y haciendo girar sobre s mismo. Esperar cinco minutos antes de
proceder a la cromatografa gaseosa.
56.4.4.2 Condiciones de trabajo.
Para las columnas dadas en 56.2.19 sern:
Temperatura de la columna: 240 C.
Temperatura del inyector: 250 C.
Temperatura del detector: 250 C.
Flujo del gas portador: 0,8 atmsferas.
Inyectar 0,5-1 l de la solucin silanizada que, segn la respuesta cromatogrfica puede
ser concentrada por evaporacin en corriente de nitrgeno.
En estas condiciones y utilizando la columna (SE 30), los tiempos de retencin relativos
al -tocoferol son:
-tocoferol 1,00
+ tocoferol 0,71
-tocoferol 0,55
56.4.4.3 Para columnas capilares (56.2.20), las condiciones cromatogrficas sern:
Temperatura de la columna: 240 C.
Temperatura del inyector: 250 C.
Temperatura del detector: 250 C.
Gas portador caudal de entrada: 2 ml/min; caudal de columna: 60 ml/min.
Evaporar los relativos en corriente de nitrgeno de los sililteres obtenidos segn
56.4.1. Disolver el residuo en 1 ml de ter etlico e inyectar en el cromatgrafo 1 litro.
En estas condiciones, los tiempos de retencin reducidos para el -tocoferol sern los
siguientes:
- ..... OV-17 ..... SE-30
-tocoferol ..... 1,00 ..... 1,00
-tocoferol ..... 0,64 ..... 0,68
-tocoferol ..... 0,66 ..... 0,70
-tocoferol ..... 0,50 ..... 0,54
-tocotrienol ..... 1,71 ..... 1,31
-tocotrienol ..... 1,09 ..... 0,89
-tocotrienol ..... 1,13 ..... 0,92
-tocotrienol ..... 0,86 ..... 0,70
56.4.4.4 Determinacin cuantitativa.-Determinacin de la curva patrn. En cuatro
matraces (56.2.16), pesar exactamente - tocoferol y escualano en las proporciones:
escualano/-tocoferol. 3/1, 2/1, 1/1, 0,5/1.
Preparar los sililteres como se indica en 56.4.4.1 y proceder al anlisis cromatogrfico.
Trazar la curva poniendo en abscisas la relacin: pesos de escualano/pesos de -
tocoferol y en ordenadas la relacin, rea del pico de escualano/rea del pico de -
tocoferol. Esta curva debe ser una recta que pase por el origen. A partir de esta curva,
calcular la relacin:
R = (Peso del escualano/peso de -tocoferol) / (Area del pico de escualano/rea del pico
de -tocoferol)
56.4.4.5 Introduccin del patrn interno.-En el matraz conteniendo la fraccin de
tocoferoles obtenida en 56.4.2, aadir 1 ml, exactamente medido, de la solucin de
escualano. Evaporar el disolvente al vaco y proceder inmediatamente a la silanizacin
segn 56.4.4.1.
Operar exactamente como en 56.4.4.2.
En estas condiciones y utilizando la columna SE-30, los tiempos de retencin relativos
al escualano son los siguientes:
-tocoferol: 3,36
+ -tocoferol: 2,40
-tocoferol: 1,85
Escualano: 1,00
56.4.4.6 En el caso de efectuar la cromatografa con columna capilar, introducir el
patrn interno como en 56.4.4.5, y efectuar la cromatografa como se indica en 56.4.4.3.
56.5 Operaciones.
56.5.1 Colorimetra.-En el contenido en tocoferol expresado en mg/100 g viene dado
por la siguiente frmula:
[(A - A0) * F * V * 1.000] / (v * m)
Siendo:
A = absorbancia de la disolucin de muestra.
A0 = absorbancia del ensayo en blanco.
V = volumen, en ml, del heptano utilizado para disolver el insaponificable.
V = volumen en l de la solucin de insaponificable depositada sobre la placa.
M = masa en gramos de la muestra.
F = factor espectrofotomtrico diferente para cada tocoferol.
F -tocoferol: 98
F + -tocoferol: 90
F -tocoferol: 75
56.5.2 Cromatografa gaseosa.
56.5.2.1 Utilizando el mtodo de normalizacin interna los porcentajes de cada
tocoferol vienen dados por la frmula:
Porcentaje de tocoferol = (Ax * 100) / A
Siendo:
Ax = rea del pico correspondiente a cada tocoferol.
A = Suma de reas de todos los picos de tocoferoles.
56.5.2.2 Utilizando patrn interno, el contenido en cada tocoferol expresado en mg/100
g vendr dado por la frmula:
(R * Ai * 105) / (As * m * v)
Siendo:
V = Volumen en l de la solucin de insaponificable depositada sobre la placa.
M = masa en g de la muestra.
Ai = rea de los picos de los tocoferoles.
As = rea del pico correspondiente al escualano.
R = relacin calculada en 56.4.4.4.
56.6 Observaciones.
56.6.1 En caso de necesitar preparar etanol absoluto exento de aldehdos, proceder
como se indica. Todas las operaciones deben efectuarse con material de vidrio. Aadir 2
g de hidrxido de potasio y 1 g de permanganato de potasio a 1 l de etanol absoluto
comercial pobre en aldehdos (99,5 por 100 mnimo de alcohol de melaza). Hervir a
reflujo durante treinta minutos despus de destilar. Deshidratar sobre sulfato de calcio
anhidro. Destilar de nuevo y proteger de la humedad.
56.6.2 En caso de necesitar preparar ter etlico exento de perxidos y de residuos,
proceder como se indica.
En un frasco de vidrio oscuro agregar 130 g de tamiz molecular a 4 A en parlas, de 2
mm de dimetro por cada litro de ter etlico de calidad analtica. Agitar vigorosamente
y dejar reposar durante doce horas en el mismo matraz cerrado. Conservar el ter etlico
en estas condiciones.
Para eliminar los perxidos, destacar el ter etlico, deshidratado y pasarlo sobre una
columna de almina bsica, de 22 mm de dimetro y 600 mm de longitud, actividad 1,
granulometra 0,063-0,200 mm, con 100 g de almina y un flujo de ter etlico
alrededor de 2-3 ml/min. Recoger el elusto en un frasco de vidrio oscuro.
Ver Imagen
(Ver Repertorio Cronolgico Legislacin 1985, TOMO III, pg. 5606)
56.6.3 La solucin etanlica de pirogalol puede ser sustituida por una solucin etanlica
de cido ascrbico, obtenida por disolucin de 0,3 g de cido ascrbico en 4 ml de
etanol preparada inmediatamente antes de utilizarse.
56.6.4 Durante los lavados con agua destilada, principalmente el primero, no se debe
agitar enrgicamente para evitar la formacin de emulsiones. En caso de formacin de
stas, aadir algunos mililitros de una solucin acuosa saturada de cloruro de sodio para
romper la emulsin. La separacin de las dos capas debe tener lugar inmediatamente.
56.7 Referencias bibliogrficas.
1. Internacional Union of Pure and applied Chemistry Standard, Methods for the
Analysis of Oils, Fats and Derivatines, 6. edicin, primer suplemento.
Editorial Aranzadi
Art. 2. Cuando no existan mtodos oficiales para determinados anlisis y hasta tanto
los mismos sean aprobados por el rgano competente y previamente informados
favorablemente por la Comisin Interministerial para la Ordenacin Alimentaria podrn
ser utilizados los aprobados por los Organismos nacionales o internacionales de
reconocida solvencia.
DISPOSICION ADICIONAL
ANEJO
A) Los aceites y grasas que contengan cido cetoleico (ismero cis del cido
docosenoico, que se encuentra en los aceites de pescado).
B) Los aceites y grasas hidrogenadas que contengan ismeros cis y trans del cido
docosenoico.
59.2.2.3 Aplicador para depositar las soluciones en forma de banda estrecha o de lnea
sobre placas TLC.
59.3 Reactivos:
59.3.6 Solucin de nitrato de plata de 200 g/l. Disolver 24 gramos de nitrato de plata en
agua y llevar el volumen a 120 mililitros con agua.
59.4 Procedimiento:
59.4.2 Preparacin de los stores metlicos de los cidos grasos. Tomar una muestra de
unos 400 miligramos de la grasa o aceite y preparar una solucin que contenga entre 20
y 50 miligramos/mililitro de steres metlicos en n-Hexano, siguiendo el mtodo
expuesto en el apartado B.
Las placas debern utilizarse en cuanto sea posible tras la fase de activacin, o bien
guardarse cuidadosamente al abrigo de la luz y reactivndolas antes de volverlas a
utilizar. Antes de hacer uso de ellas, trazar surcos a travs del subtrato a 10 milmetros
de los lados y de la parte superior de cada placa, a fin de disminuir los efectos
marginales durante el desarrollo (ver nota 2).
59.4.3.2 Aplicacin de los steres metlicos. Con ayuda del aplicador (59.2.2.3)
depositar 50 l de la solucin de steres metlicos preparada a partir de la muestra,
sobre una fina lnea de unos 50 milmetros de largo, a 40 milmetros como mnimo de
los lados y a 10 milmetros de la parte inferior de la placa. Aplicar de la misma manera
100 l de una solucin que contenga volmenes iguales de la solucin de steres
metlicos y de la solucin de erucato de metilo (59.3.7). Tras la aplicacin de los steres
metlicos (ver nota 3), colocar la placa en una cubeta con ter dietlico hasta que suba el
frente de desarrollo a unos 5 milmetros por encima de la zona de aplicacin. Dicha
operacin concentrar los steres metlicos en una banda estrecha.
3) Areas totales de los picos de los steres metlicos, exceptuando el patrn interno
(EF).
Ver Imagen
En donde E, EF, RF, L1 y L2 son las reas de los picos definidos en (59.4.4.2),
corregidas, si fuera necesario, por factores de calibracin. El contenido de erucato de
metilo obtenido mediante esta frmula es equivalente al contenido de cido ercico
expresado en porcentaje del contenido total en cidos grasos.
59.5.1.2 Si el rea de los picos est expresada en tanto por ciento, calcular como sigue
los valores EF y RF:
EF = 100 - L1.
RF = 100 - L2.
Ver Imagen
T2: Area del pico del ster metlico del cido tetracosanoico proveniente de la muestra,
que constituye una parte de la superficie del pico atribuido al patrn interno del
cromatograma de la fraccin restante de steres metlicos.
P2: Area del pico del ster metlico del cido palmtico obtenido del cromatograma de la
fraccin restante.
T0: Area del pico del ster metlico del cido tetracosanoico obtenido del cromatograma
de los steres metlicos de los cidos grasos totales, determinados segn el mtodo
descrito en el apartado A.
P0: Area del pico del ster metlico del cido palmtico obtenido del cromatograma de
los steres metlicos de los cidos grasos totales, determinada segn el mtodo descrito
en el apartado A.
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E / EF
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Notas:
Ver imagenfigura: Tpico ejemplo de cromatograma sobre capa delgada que muestra la
separacin de los steres metlicos del cido ercido, del cido cetoleico y de los
ismeros trans del cido docosenoico
APARTADO A
1. Prembulo.-El presente apartado tiene por objeto dar las lneas directrices bsicas
para la determinacin por cromatografa en fase gaseosa de la composicin cualitativa y
cuantitativa de una mezcla de steres metlicos de cidos grasos obtenida segn el
apartado B. Los cidos grasos polimerizados no son analizables por este mtodo.
2. Material:
2.1 Aparato de cromatografa en fase gaseosa: Cualquier equipo que permita alcanzar el
grado de eficacia y la resolucin tal como se definen en el punto 4.2.1 es vlido.
2.1.2 Horno: El horno deber ser capaz de llevar las columnas a una temperatura de al
menos 220 C y de mantener la temperatura escogida con precisin de 1 C.
En caso de utilizacin de temperaturas programadas, se aconseja escoger un aparato de
doble columna.
2.1.3 Columna:
2.1.3.1 Tubo:
Tubo de material inerte respecto a las materias que deban analizarse: Cristal o, en su
defecto, acero inoxidable (nota 2).
2.1.3.2 Relleno:
Soporte: Tierra de diatomeas lavada con cido y silanizada, o cualquier otro soporte
inerte que sea conveniente, con un estrecho intervalo de granulometra (25 m entre 125
y 200 m), estando ligado el valor medio al dimetro interior y a la longitud de la
columna.
2.1.4 Detector: El detector deber, preferentemente, ser adecuado para llegar a una
temperatura superior a la de la columna.
3. Reactivos:
Gas portador: Gas inerte (nitrgeno, helio, argn, etc.) Muy bien desecado y
conteniendo menos de 10 ppm de oxgeno.
Gases auxiliares: Hidrgeno al 99,9 por 100 como mnimo que no contenga productos
orgnicos, aire y oxgeno que no contenga productos orgnicos.
4. Mtodo operatorio:
4.1.1 Determinacin de las condiciones ptimas de trabajo: Para escoger las condiciones
de trabajo, debern tenerse en cuenta las siguientes variables:
Temperatura de la columna.
Resolucin deseada.
Concentracin de la muestra.
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Cuando el aparato lo permita, estar el inyector a una temperatura cercana a los 200 C
y el detector a una temperatura igual o superior a la de la columna.
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Donde:
W1 y w2 son las anchuras en milmetros de los picos del estearato y del oleato de metilo
medidas entre los puntos de inflexin de la curva.
/FONTD es la distancia entre los mximos relativos de los picos del estearato y del
oleato de metilo.
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Las condiciones de operacin que se tomarn en consideracin sern las que den un
nmero de platos tericos para el estearato de metilo al menos igual a 2.000 y una
resolucin de al menos 1,25. Debern, adems, ser tales que el cido linolnico (C18:3)
sea separado de los cidos arquico (C20:0) y gacoleico (C20:1)
Si fuera necesario, se recomienda hacer un anlisis sobre dos fases fijas de polaridades
diferentes para comprobar la ausencia de picos ocultos, por ejemplo para los aceites de
pescado o en el caso de la presencia simultnea de C18:3 y C20 y de C18:3 y de C18:2
conjugados.
5.1 Anlisis cualitativo: En condiciones de operacin idnticas a las del ensayo, analizar
la mezcla testigo, de composicin conocida, y determinar las distancias de retencin (o
los tiempos de retencin) para los cidos grasos constitutivos. Trazar las curvas que den
el logaritmo de la distancia de retencin (o del tiempo de retencin) en funcin del
nmero de tomos de carbono; en condiciones isotermas y para los steres de cadena
recta y un ndice de insaturacin fijado, dichas curvas trazadas sobre papel
semilogartmico debern ser rectas notablemente paralelas.
Para la prueba, identificar los picos remitindose a dichas rectas, si fuera necesario
interpolando.
Debern evitarse las condiciones operativas en las que existan picos ocultos, o sea,
que dos constituyentes no puedan distinguirse como consecuencia de una resolucin
insuficiente.
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De donde:
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Para la muestra, el contenido en cada constituyente est dado por porcentaje (m/m) del
compuesto i expresado en steres metlicos
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6. Notas:
Gas portador: Helio o, en su defecto, hidrgeno con un contenido en oxgeno tan dbil
como sea posible.
APARTADO B
1.2 Material:
Pipeta graduada de una capacidad al menos igual a 10 mililitros, y perilla para pipeta o
pipeta automtica.
1.3 Reactivos:
Eter de petrleo bidestilado (Eb 40-60 C), ndice de bromo inferior a 1 exento de
residuo o hexano (nota 2).
Rojo de metilo, en solucin al 0,1 por 100 (m/m) en etanol al 60 por 100 (v/v).
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En caso de que los steres metlicos estn destinados al anlisis por cromatografa en
fase gaseosa, la muestra ser preferentemente de alrededor de 350 miligramos. Si fuere
ms pequea, convendr tomar precauciones para que la muestra tomada sea
representativa (nota 5).
Continuar aadiendo solucin saturada de cloruro de sodio para llevar el nivel del
lquido al cuello del matraz. Trasladar alrededor de 1 mililitro de la capa superior
(solucin heptnica) a un tubo de ensayo esmerilado y aadir la cantidad de sulfato de
sodio anhidro necesaria para eliminar los restos de agua. En el caso de una muestra de
350 miligramos, la solucin obtenida contendr alrededor del 5 al 10 por 100 de steres
metlicos y podr inyectarse directamente en la columna de cromatografa en fase
gaseosa. En los otros casos diluir la solucin heptnica para obtener una concentracin
del 5 al 10 por 100 en steres metlicos (nota 6).
Para obtener la totalidad de los steres secos, trasladar la solucin y la fase heptnica a
una ampolla de decantacin de 250 mililitros. Decantar. Extraer la solucin salina con
50 mililitros de ter de petrleo (Eb 40-50 C) o de hexano.
Repetir una segunda vez esta extraccin. Reunir la fase heptnica y los dos extractos y
lavarlos con porciones de 20 mililitros de agua hasta la desaparicin de la acidez
(indicador: Rojo de metilo). Secar con sulfato de sodio anhidro y evaporar el disolvente
al bao mara bajo corriente de nitrgeno (nota 6 y nota 7). Para muestras inferiores a
500 miligramos, es preferible reducir proporcionalmente los volmenes de disolvente y
de agua.
2.1.2 Material:
2.1.3 Reactivos:
2.2 Para los cuerpos grasos cidos (IA > 2) y cidos grasos:
2.2.1 Principio:
Para los cuerpos grasos cidos, neutralizacin de los cidos grasos libres, metanlisis
alcalina de los glicridos y esterificacin posterior de los cidos grasos en medio cido.
2.2.2 Material:
2.2.3 Reactivos:
2.2.4 Mtodo operatorio para los cuerpos grasos cidos (IA > 2):
Aadir 40 mililitros de la solucin de metilato de sodio (ver observacin 2.2.6, c). Poner
bajo refrigerante a reflujo, agitar y llevar a ebullicin. La solucin debe hacerse lmpida,
lo que se produce generalmente al cabo de una decena de minutos. La reaccin estar
prcticamente finalizada despus de quince minutos.
Introducir a continuacin en el erlenmeyer o en el matraz al menos 50 mililitros de la
solucin clorhdrica, luego llevarla de nuevo a ebullicin durante diez minutos (ver
observacin 2.2.6, d).
Para los cidos grasos ser conveniente utilizar el mtodo operatorio simplificado
siguiente:
2.2.6 Observaciones:
Al ser el metanol muy vido de gas clorhdrico ser recomendable tomar todas las
precauciones de utilizacin para la disolucin, por ejemplo: Efectuar la introduccin del
gas con la ayuda de un pequeo embudo invertido que llegue hasta la superficie del
nivel del metanol. Es posible, adems preparar de antemano cantidades importantes de
soluciones metanlicas clorhdricas que se conservan perfectamente en frascos
esmerilados mantenidos en la oscuridad.
Notas:
Acidificar la solucin jabonosa acuosa, y separar los cidos grasos. Preparar sus steres
metlicos segn los procedimientos 1.4.2 2.3.5.
Los distintos reactivos no deben dar el pico que interfiera con los de los steres
metlicos de cidos grasos en el curso de la cromatografa en fase gaseosa.
Tarar un matraz de dos litros que contenga un litro de metanol. Enfriar en un bao de
agua helada. Estando todava el matraz en el bao, burbujear con BF3 procedente de
una botella de gas por medio de un tubo de vidrio en el metanol hasta la absorcin de
125 gramos, operando bajo una campana de gases. Hacer pasar la corriente de BF3 al
tubo de vidrio antes de sumergirlo en el metanol y hasta que sea retirado para evitar
cualquier vuelta de lquido al sistema descompresor de gas. El gas, al escaparse
demasiado rpidamente, no debera dar como resultado pequeas nubes de humo
blanco. El reactivo permanece estable durante dos aos.
4. El heptano (mezcla de ismeros C7 puros sometida a prueba por cromatografa en
fase gaseosa) puede sustituirse por hexano en ausencia de cidos grasos de 20 tomos de
carbono y ms.
5. Si no se dispusiera del peso de muestra prevista, sta podr ser reducida hasta 10
miligramos e incluso hasta menos, siempre que disminuyan proporcionalmente los
volmenes de reactivos y la capacidad del equipo.
Editorial Aranzadi