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Aula 6 Testes treponmicos

Nesta aula voc conhecer os testes treponmicos mais utilizados, suas indicaes de uso e as
limitaes dessas metodologias.

Os testes treponmicos FTA-abs, MHA-TP/TPHA/TPPA e ELISA foram desenvolvidos


inicialmente para confirmar resultados positivos obtidos previamente com testes no
treponmicos.

Atualmente os ELISA e suas variaes, por permitirem automao, tambm so utilizados como
testes de triagem em laboratrios ou em hemocentros com grande rotina.

Caractersticas gerais dos


testes treponmicos
Como dificilmente esses testes treponmicos tornam-se no reagentes mesmo aps o tratamento
eficaz da infeco, necessrio que o mdico investigue a histria clnica do indivduo e a
associe o resultado do teste treponmico com o do teste no treponmico.

Trata-se de testes qualitativos. Sua reatividade indica que o usurio teve contato com Treponema
pallidum em alguma poca de sua vida e desenvolveu anticorpos especficos.

So testes indicados para confirmao do diagnstico, quando a triagem feita com um teste no
treponmico. Veja a seguir apresenta os testes treponmicos mais utilizados no Brasil.

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Teste treponmico Por que utilizado Notas:

FTA-abs (Fluorescent considerado o teste de referncia ou 1 - espectrofotometria


treponemal antibody padro ouro dentre os testes treponmicos. um mtodo ptico
de leitura de reaes
absorption) Pode ser feito com amostras de soro ou que utiliza diferentes
plasma. filtros para determinar
a presena e (ou) a
o primeiro teste a se tornar reagente aps quantidade de um analito.
a infeco, tendo bom desempenho no O equipamento utilizado
diagnstico da sfilis primria em usurios o espectrofotmetro.
que apresentam o cancro duro com mais de
10 dias de evoluo.
importante tambm para o esclarecimento
do diagnstico de usurios com evidncia
clnica de sfilis que apresentaram resultados
no reagentes nos testes no treponmicos,
situao que pode ocorrer em amostras
de pacientes com sfilis primria, latente
recente ou tardia.
Testes de So de execuo simples.
hemaglutinao ou Podem ser feitos em amostras de soro ou
aglutinao indireta plasma.
ou passiva No necessitam equipamentos para sua
realizao ou para a leitura dos resultados.
Imunoenzimticos So ensaios que podem ser automatizados
ELISA, incluindo os e empregados em laboratrios que tm
quimioluminescentes grande rotina.
Podem ser feitos em amostras de soro ou
plasma. Existem, ainda, kits padronizados
para testar amostras de sangue seco em
papel-filtro.
A leitura dos resultados feita por
espectrofotometria1 ou outros mtodos
automatizados.
Testes Rpidos TR No necessitam de estrutura laboratorial
para serem executados.
Podem ser feitos em amostras de sangue
total, soro ou plasma.
Entre a coleta da amostra e a emisso do
resultado decorrem cerca de 30 minutos.

Quadro 1 - testes treponmicos mais utilizados no Brasil.

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Teste FTA-abs (Fluorescent 2 - adsorvente fixao
de molculas a uma
treponemal antibody absorption) superfcie slida.

3 - liofilizado que
passou por um processo
Reagentes e insumos para o FTA-abs de desidratao usado
para preservar alimentos
perecveis, princpios
ativos, bactrias etc.
Atualmente os testes so apresentados na forma de conjuntos O elemento (partcula,
molcula etc.) congelado
diagnsticos (kits), que geralmente incluem: e a gua retirada por
sublimao, sem que
passe pelo estado lquido.
lminas com os antgenos j fixados, embaladas individualmente;
conjugado fluorescente com o ttulo pr-determinado;
soluo adsorvente2 ou sorbent;
os soros controles positivos e negativos;
soluo concentrada de salina tamponada com fosfato (PBS)
para a lavagem das lminas.

Esses reagentes e insumos podem ser adquiridos separadamente. Neste


caso, se o antgeno for liofilizado3, dever ser reconstitudo e fixado nas
lminas.

O conjugado adquirido deve ser titulado para determinar a diluio ideal,


e a soluo salina tamponada deve ser preparada no laboratrio.

Utilize ponteiras estreis na preparao do conjugado,


a fim de evitar a contaminao deste.

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Princpio metodolgico da reao de FTA-abs

A reao de FTA-abs uma tcnica de imunofluorescncia indireta (IFI). Essa tcnica utiliza
Treponema pallidum (da cepa Nichols) fixado em reas demarcadas de lminas de vidro em que
so feitas as reaes. Veja na Figura 1 a representao do seu princpio metodolgico.

Anticorpo Conjugado
treponmico fluorescente
da amostra

Figura 1 Representao esquemtica de uma reao de imunofluorescncia indireta.

Reao de FTA-abs

A amostra de soro utilizada deve ser inativada, por 30 minutos, a 56C.

As diluies so feitas em tubo. A amostra diluda a 1/5, misturando-se 1 parte de soro e 4


partes de soluo absorvente ou sorbent extrato de cultura de treponema Reiter no patognico.
Essa diluio feita para remover anticorpos treponmicos comuns maioria dos treponemas
no patognicos que podem estar presentes no soro.

A amostra diluda colocada sobre a demarcao da lmina. Se a amostra contiver anticorpos


antitreponema pallidum, estes vo se ligar aos treponemas fixados na lmina.

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Aps a incubao da reao e a lavagem da lmina para remover 4 - conjugado um
anticorpos e outros componentes da amostra que no se ligaram reagente formado por duas
reao, adicionado o conjugado fluorescente soro anti- molculas ligadas, como o
fluorocromo isotiocianato
imunoglobulina humana conjugado4 ao isotiocianato de fluorescena). de fluorescena
ligado molcula de
imunoglobulina utilizada na
Se na amostra houver anticorpos ligados aos treponemas fixados na reao de FTA-abs.
lmina, o conjugado vai se ligar aos anticorpos, tornando os treponemas
fluorescentes.

Assim, estes podero ser vistos, em microscopia de fluorescncia,


emitindo luz verde-ma.

Numa leitura e interpretao da reao de FTA-abs, os resultados


possveis so estes:

reagente quando os treponemas ficam fluorescentes (emitem


cor de ma-verde) sob microscopia de imunofluorescncia;
no reagente quando os treponemas apresentam uma
colorao avermelhada ou cor verde plida, sem sinal de
fluorescncia;
inconclusiva quando h presena de treponemas com baixa
intensidade de fluorescncia, quando se observa fluorescncia
descontnua na bactria, normalmente em pontos esparsos, ou
quando se observam, no mesmo campo, treponemas fracamente
fluorescentes e treponemas com colorao avermelhada.

!
Utilize sempre um controle positivo e um controle
negativo em toda a lmina de FTA-abs.

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Veja a seguir os itens que devem ser verificados para tentar solucionar os problemas relativos
a ocorrncia de resultados inconclusivos quando os padres de reatividade obtidos no esto
dentro do esperado.

Confira o tempo e a temperatura utilizados para inativar a amostra. Nestes casos, teste
novamente a amostra aps a correo do problema.
Verifique se a amostra foi congelada e descongelada vrias vezes, o que pode causar
diminuio ou perda de reatividade. Neste caso, solicite uma nova amostra.
Observe se o antgeno contm muitos restos celulares e (ou) outros contaminantes
biolgicos.
Os conjugados fluorescentes podem ter perdido a marcao com a fluorescena ou podem
apresentar contaminao bacteriana ou fngica. Nestes dois casos, observa-se intensa
fluorescncia inespecfica.
Certifique-se de que o tempo e a temperatura de incubao da reao foram os
recomendados pelo fabricante.
Verifique as condies do microscpio e da lmpada de fluorescncia.
Confira se o pH da salina tamponada com fosfato utilizada para a lavagem das amostras
est em 7,20,2.

!
Se houver constatao de que h problemas com o antgeno
de T. pallidum ou com o conjugado fluorescente, verifique
primeiramente se houve problema de m conservao ou se
os reagentes esto fora do prazo de validade estabelecido pelo
fabricante.

Caso tudo esteja correto, entre em contato com o fornecedor e


solicite a troca do reagente com problema.

Se aps a adoo dessas medidas o resultado permanecer inconclusivo, utilize outra metodologia
para tentar esclarecer o resultado e se possvel colete nova amostra.

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Testes MHA-TP (Micro-hemaglutinao
para Treponema pallidum) e da
aglutinao indireta
Princpio metodolgico da reao de MHA-TP

O teste de hemaglutinao indireta ou passiva baseia-se na ligao dos anticorpos treponmicos


presentes no soro com hemcias que contm, na sua superfcie, antgenos de Treponema
pallidum (cepa Nichols).

Os anticorpos presentes no soro ligam-se aos antgenos que esto na superfcie das hemcias,
resultando na hemaglutinao.

Na reao de aglutinao indireta, os antgenos de Treponema pallidum so adsorvidos


superfcie de partculas de gelatina.

Os anticorpos presentes no soro ligam-se aos antgenos de vrias partculas de gelatina,


resultando na aglutinao.

importante que, antes de iniciar a reao, voc leia atentamente as recomendaes do


fabricante do kit quanto necessidade de inativar o soro, diluir a amostra com soluo adsorvente
ou sorbent, utilizar 2mercaptoetanol para adsorver fator reumatoide ou outros interferentes
da reao e utilizar controles com hemcias ou partculas de gelatina sem antgenos na sua
superfcie.

Para evitar resultados falso-positivos, retire a eletricidade esttica da placa de reao, passando
uma gaze mida embaixo da placa antes de iniciar a incubao.

Alm disso, incube a reao em local onde no haja vibrao, para evitar que a ligao dos
anticorpos s hemcias ou s partculas de gelatina seja desfeita, o que causa resultados falso-
negativos.

!
No reutilize as placas de microtitulao para fazer esta reao.
Placas usadas devem ser descartadas.

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Numa leitura e interpretao da reao de hemaglutinao ou de aglutinao, os resultados
possveis so estes:

Reagente
Quando h hemaglutinao (ou aglutinao), forma-se uma
rede ou tapete de hemcias (ou de partculas de gelatina) Reagente
unidas aos anticorpos, a qual se espalha por toda a superfcie
do poo da placa em que foi realizada a reao;

No reagente
Quando no h hemaglutinao, as hemcias (ou as partculas
de gelatina) se depositam e formam um boto compacto no No reagente
fundo do poo da placa em que a reao foi realizada;

Inconclusiva
Neste caso, no h formao completa da hemaglutinao Inconclusiva
nem do boto, por isso se observa um misto dos dois,
no sendo possvel definir se a amostra reagente ou no
reagente. Quando isso ocorre, o teste deve ser repetido.

Teste treponmico imunoenzimtico


ELISA ou de quimioluminescncia
Os testes imunoenzimticos e suas variaes, como o mtodo de quimioluminescncia, so
testes treponmicos que utilizam antgenos recombinantes de Treponema pallidum fixados em
uma fase slida. A esses antgenos vo se ligar aos anticorpos presentes na amostra do usurio.

As reaes devem ser feitas sempre de acordo com as instrues dos fabricantes, pois existem
variaes na forma de revelar os anticorpos das amostras que se ligaram aos antgenos fixados.
Essas reaes so semi ou totalmente automatizadas, e necessitam de equipamentos
especficos.

Para conhecer o princpio metodolgico dos testes ELISA e


de quimioluminescncia, faa o curso HIV Estratgias para
diagnstico no Brasil, da Srie TELELAB.

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Referncias

LARSEN, S.A., POPE, V., JOHNSON, R.E., KENNEDY, JR., E.J. A Manual of Tests for Syphilis.
Washington: APHA, 1998, 361p. 9 edio

LARSEN S.A., STEINER, B.M., RUDOLPH, A.H. Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests
for Syphilis. Clin. Microbiol. Rev., Washington, v.8, n.1, p.1-21, 1995.

BAZZO, M. L. Avaliao do uso de teste treponmico imunoenzimtico competitivo na triagem


sorolgica da sfilis em 23.531 soros de uma populao de baixa prevalncia. Dissertao de
Mestrado. 1999. 99p. Dissertao (Mestrado). Universidade de So Paulo, So Paulo, 1999.

BENZAKEN, A. S.; BAZZO, M. L.; GALBAN, E.; PINTO, I. C. P.; NOGUEIRA, C. L.; GOLFETTO, L.;
BENZAKEN, N. S.; SOLLIS, K. A.; MABEY, D.; PEELING, R. W. External quality assurance with
dried tube specimens (DTS) for point-of-care syphilis and HIV tests: experience in an indigenous
populations screening programme in the Brazilian Amazon. Sexually Transmitted Infections (Print),
v. 00, p. 1-5, 2013.

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