Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010

Profa Daiane Bopp Fuentefria

Roteiro de aulas práticas

Normas do Laboratório de Microbiologia 1. Os alunos somente poderão assistir ou participar dos experimentos práticos protegidos com avental apropriado (uso obrigatório); 2. Os alunos que apresentem soluções de continuidade (ferimentos ou cortes) na pele devem informar ao professor antes do início da prática para que o mesmo avalie se o aluno pode participar diretamente da prática; 3. Os objetos pessoais, exceto aqueles utilizados em experimento da prática (caderno, caneta, lápis, etc...), devem ser colocados nos armários; 4. Os alunos devem, de preferência, ocupar um lugar específico na bancada e mantê-lo fixo por todo o semestre; 5. Os estudantes devem evitar conversas paralelas e circulação entre as bancadas para diminuir os riscos de contaminação; 6. Antes de iniciar os trabalhos, os alunos devem sempre realizar a desinfecção da bancada utilizando algodão embebido em soluções de álcool a 70% ou de hipoclorito de sódio a 1000 ppm, ou outro agente, por um período adequado; Apesar de não trabalharmos com amostras clínicas ou microrganismos virulentos, convém considerar que todo material biológico é infeccioso; 7. Todo experimento deve ser efetuado com o máximo de cuidado e atenção; 8. Não é permitido fumar, beber ou comer no laboratório; 9. Manter a bancada arrumada e colocar papéis no lixo; 10.É recomendado não assistir aulas de chinelos, sandálias ou bermudas; 11.Ao receber o material para a prática verificar se está devidamente íntegro, tubos tampados adequadamente, se não há vazamentos; 12. Ao utilizar alças e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por flambagem antes e após cada operação efetuada com culturas microbianas; 13.Colocar os instrumentos e materiais utilizados inclusive vidraria, em recipientes apropriados, ao final do experimento; 14.Caso ocorra algum acidente comunicar imediatamente ao Professor Responsável que tomará as providências cabíveis; Ao final dos experimentos envolvendo microscopia, as objetivas devem ser limpas, o condensador deve ser deixado na posição original e o equipamento devidamente protegido e desligado; 15.Os alunos devem trazer canetas tipo Pilot para identificar devidamente os materiais utilizados na prática, facilitando o reconhecimento posterior; 16.Não é permitido pipetar com a boca, em vez disso usar pêras ou pipetadores apropriados; 17.Não recapear agulhas; 18.Ao final da aula prática envolvendo culturas microbianas, lavar as mãos com sabão líquido e enxugar com papel toalha ou álcool-gel; 19.Após o término do experimento o aluno deverá deixar a bancada limpa e organizada; 20.Após o término da aula, o aluno deverá retirar o jaleco e acondicioná-lo apropriadamente, pois não será permitido que o aluno circule pelas dependências do Instituto com o avental utilizado na aula prática;

1

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010

Profa Daiane Bopp Fuentefria

Roteiro de aulas práticas

Após os trabalhos de laboratório, o recolhimento do material e o descarte das culturas são feitos por técnicos do laboratório. Cabe ao aluno, entretanto, deixar a bancada organizada e limpa. Uso do Bico de Bunsen A chama tem três zonas: duas internas, mais frias, formadas por um gás que não entrou em plena combustão; a última é a zona oxidante da chama, sendo a que mais se emprega em microbiologia. Esta região azul da chama, na parte superior, é que deve ser utilizada para esterilizar alças e agulhas de platina. As alças devem ser colocadas num ângulo de 45o na chama até ficarem incandescentes. Esperar esfriar e utilizar. Todo o material de microbiologia deve ser manipulado atrás do fogo, na área estéril, de forma a proteger o operador de possíveis aerossóis gerados e proteger a amostra biológica de contaminação. Procedimento: 1. Abrir a válvula de controle do gás; 2. Acender o fósforo; 3. Abrir lentamente a válvula do distribuidor; 4. Ajustar a chama; 5. Desligar na ordem inversa: feche a válvula do distribuidor e em seguida a válvula de controle de gás.

2

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010

Profa Daiane Bopp Fuentefria

Roteiro de aulas práticas

Aula 01 – Coloração de Gram 1. Princípio Baseado na impregnação pelo cristal violeta (corante primário) na parede celular de algumas espécies bacterianas após este corante formar um complexo insolúvel com uma solução de iodo (lugol – mordente). Estas bactérias, devido à natureza de sua parede celular, retém o cristal violeta, mesmo após tratamento com descorante orgânico (álcool-acetona) e são chamadas de Gram-positivas. As bactérias que perdem a coloração primária são ditas Gram-negativas, sendo posteriormente coradas pelo corante secundário (fucsina), tomando a coloração rósea. 2. Amostra 2.1. Tipo de amostra Qualquer amostra clínica onde se deseja pesquisar a presença de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, anteriormente ao cultivo ou não ou, ainda, de colônias isoladas em meios de cultivo primários. 3. Metodologia - Posicionar a lâmina sobre o suporte. - Cobrir a lâmina com violeta de Genciana por 1 minuto. - Lavar com água corrente e adicionar o lugol, deixando-o agir por 1 minuto. - Com a torneira ligeiramente aberta, retirar todo o lugol e proceder a descoloração com álcool-acetona (tempo crítico – aproximadamente 5 segundos), até que a coloração violeta não se desprenda mais da lâmina. Enxaguar imediatamente. - Adicionar a Fucsina de Gram por 30 segundos. Enxaguar e secar a lâmina. Observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). 4. Interpretação Bactérias Gram-positivas = se coram em azul Bactérias Gram-negativas = se coram em vermelho 5. Interferentes O cristal violeta pode precipitar, formando estruturas semelhantes a cocos Gram-positivos. Entretanto os precipitados são geralmente maiores que as bactérias. Nesse caso, o corante deve ser filtrado antes do uso. O descoramento em excesso ou a falta do mesmo podem fornecer resultados errôneos, assim como o ajuste inadequado do conjunto ótico do microscópio.

3

4 . em cachos de uva. Staphylococcus sp.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 02 . em tétrades) e coloração de Gram (Gram-positivos ou Gram-negativos). em imersão. Neisseria sp. 8. Streptococcus pneumoniae 5. Streptococcus sp. bacilos. e avaliar as seguintes bactérias quanto a morfologia (cocos. arranjo (isolados. Bactéria 1. Enterococcus sp. 4. cocobacilos. Bacillus sp. 7. Escherichia coli 6. Acinetobacter sp. em cadeias. agrupados. 2. aos pares. vibrio). Morfologia Arranjo Gram 3.Observação de características morfológicas e tintoriais na Coloração de Gram Observar ao microscópio.

Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella sp) e deverá inocular em diferentes meios de cultura. Proteus mirabilis. Anotar também as características observadas nos microrganismos dos outros colegas Meio de cultura Bactéria testada Pigmentaç ão (Cor da colônia) Característica diferencial do meio Observações Sangue Mac Conkey XLD Hektoen Observações: 5 . pela técnica de isolamento. Incubar as placas a 35 ± 1 oC por 24 horas. Salmonella sp. Após o período de incubação observar e anotar as características das colônias nos diferentes meios de cultura..Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aulas 03 – Semeadura em Meios de cultura seletivos e diferenciais Cada dupla receberá um microrganismos (Escherichia coli.

• Expor o máximo as amígdalas. verificando a presença de leucócitos. Material para coleta . 2. glomerulonefrite e endocardite reumática. potencialmente graves. de maneira rotatória. mas também para evitar complicações posteriores.02 lâminas para microscopia . Incubar em jarra com 5% de tensão de CO2 por 24-48 horas. corar pelo método de Gram e observar ao microscópio com objetiva de 100x. Estabilidade da amostra Amostra em placa: encaminhada em até 2 horas em temperatura ambiente Amostra em meio de transporte: 24 horas em temperatura ambiente 2. Amostra 2.01 abaixador de língua . fazer um esfregaço em lâmina. posteriormente. 2. com o abaixador de língua.3.2.01 placa de Agar sangue ou . nas amígdalas e na faringe posterior. 6 . A urgência não é justificada apenas pela doença básica (faringite. • Cuidar para não tocar com o swab na parede da cavidade bucal e não carregar saliva. faringe. Coletar também qualquer outro ponto de pus. caso contrário haverá contaminação da amostra.2. 3.01 swab estéril . introduzir o swab em um meio de transporte de Stuart. como febre reumática. Semeadura e isolamento Com auxílio de uma alça de platina. Tipo de amostra Secreção de orofaringe. 3. imediatamente após a coleta. amígdalas e/ou pontos purulentos dessas regiões.1 Bacterioscopia Após fixar o esfregaço. • Rolar o swab no início de um quadrante da placa de ágar sangue (AS) e.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 04 – Coleta de secreção de orofaringe 1. Metodologia 3.01 tubo de Stuart (meio de transporte) Procedimento: • Sentar o paciente e inclinar levemente a cabeça de modo a obter boa iluminação na cavidade oral. fazer a semeadura do material no meio pela técnica de isolamento. especialmente estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. • Caso não esteja disponível a placa de AS. • Esfregar o swab. células e bactérias. uma vez que se faz necessária a terapia imediata.1. Princípio Isolar bactérias patogênicas de secreção de orofaringe. amigdalite).

Atividade de quinta-feira: Após o período de incubação. 4. A falta de uma técnica adequada de coleta poderá levar a uma contaminação da amostra por bactérias da microbiota normal. Interferentes Qualquer antibiótico administrado previamente a coleta poderá fornecer resultados falso negativos. fazer um esfregaço e corar pelo Gram. selecionar uma colônia da placa. 7 . Entretanto. este tipo de contaminante não deve ser valorizado em culturas de orofaringe. presentes na saliva e na cavidade oral (ex. Isto pode gerar dificuldades na interpretação clínica do resultado.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Proceder a identificação baseada na morfologia das colônias e hemólise em Agar sangue.: Estreptococos do grupo Viridans e estafilococo coagulase-negativo). Observar ao microscópio.

mangueira. 17. máxima. cima. microondas 6.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 05 – Preparo de meios de cultura 1. de pressão chegar a zero. 10. 14. 2. Calcular a quantidade de meio necessária Pesar o meio de cultura e colocar no Medir o volume de água destilada Adicionar a água ao recipiente Dissolver com ou bastão de vidro e/ou no Autoclavar por 15 minutos a 120 0C a 1 Esperar esfriar (ficar morno) e verter nas placas. Ligar a autoclave na temperatura Aguardar a saída contínua de vapor da Fechar a válvula de vapor. 18. baixar o termostato para a esterilização. Desligar a autoclave e esperar o indicador Abrir a válvula de vapor. respeitando a carga máxima. Quando a pressão chegar temperatura média e marcar o tempo de 15. 7. Verificar se o nível da água cobre a resistência (a água deve tocar o fundo do cesto). Uso da Autoclave 1. Abrir a válvula de vapor. sem colocar o rosto em Retirar o material cuidadosamente. 1 atm (120oC). 16. 13. Abrir a autoclave. desejado 4. 11. cesto. 8 . recipiente de autoclavacao 3. atm. 5. 9. 8. Aguardar a autoclave atingir a pressão de a 1 atm. Colocar o material a ser autoclavado no Fechar a autoclave. 12.

gás +. Usar a alça. fazendo estrias. Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Usar a agulha . Colocar os resultados em tabelas de identificação bioquímica. Cor verde escuro: positivo Cor do meio inalterada: negativo Azul: positivo Verde ou ausência de crescimento: negativo Turvação do caldo: positivo Ausência de crescimento: negativo Colocar uma colônia sobre a tira de oxidase Usar a agulha. Usar a alça. gás +.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 06 – Identificação de Enterobactérias e Bacilos Gram-negativos não fermentadores Quarta-feira 1. ácido. fazendo estrias. Inocular a superfície do meio inclinado. Interpretar e anotar os resultados das provas bioquímicas. Resu lt Motilidade Indol H2S Uréia Lisina Fenilalanin a Citrato Cresciment o a 42oC 9 . Incubar no banho-maria a 42oC.: inerte AA + . 2. H2S – Visualizada no meio SIM Turvação ou crescimento difuso na picada: positivo Ausência de turvação ou crescimento difuso: negativo Adicionar 3 gotas do reativo de indol no tubo de SIM e aguarda 2 min. 3. Inocular em picada e fazer estrias na superfície inclinada. H2S – AA + + : ácido.. 2. Inocular a bactéria nos meios de identificação bioquímica e fazer a prova da citocromo-oxidase. Coloração rosa Pink: positivo Produção de pigmento negro no meio SIM Rosa: positivo Cor inalterada: negativo Fica amarelo e retorna a púrpura: positiva Amarelo: negativa Adicionar 5 gotas de cloreto férrico 10% na superfície. ácido. 3. ácido. Usar a alça.: ácido.: ácido. gás +. Quinta-feira 1. Inocular 1 a 2 colônias e cobrir o tubo com 3 gotas óleo mineral. Usar a alça e soltar 1 a 2 colônias no caldo. Incubar as provas de identificação a 35 ± 1 oC por 24 horas. Identificar o microrganismo. H2S + KA + . Inocular a superfície do meio inclinado. Inocular em picada e na superfície do agar inclinado. Meio Citocromooxidase TSI Semeadura em provas bioquímicas Interpretação Como inocular Pigmento roxo: positivo Pigmento incolor: negativo KK . Cada dupla receberá uma bactéria em Agar inclinado e deverá proceder a identificação do microrganismo.

fazendo uma estria.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 DNAse Halo claro: positivo Sem halo: negativo Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Usar a alça. Esquema Geral de Identificação 10 . Adicionar HCL 1 N para proceder a leitura.

Nível de complexidade 1.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 1 . Módulo V) 11 .Consulta para identificação das principais Enterobactérias de importância clínica (%). (ANVISA.

Consulta para identificação das principais Enterobactérias de importância clínica (%).Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 2 . Módulo V) 12 . Nível de complexidade 2. (ANVISA.

Bacilos Gram-negativos.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Esquemas de identificação de bacilos gram-negativos não fermentadores da glicose Tabela 1 . Oxidase-negativa. Motilidade positiva. TSI inerte 13 .

Oxidase positiva.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 2 – Bacilos Gram-negativos. TSI inerte 14 . Motilidade positiva.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 07 – Identificação de cocos Gram-positivos 1. Observar as hemólises e características das colônias em agar sangue de carneiro 5%. a formação de um coágulo indica um resultado positivo e identifica S. Streptococcus e Enterococcus. 4. Prova da catalase Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos. 2. Princípio Identificar os cocos Gram-positivos até o gênero: Staphylococcus. transferir uma colônia para a lâmina e emulsioná-la no peróxido c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO 3. Após o período de incubação. realizar uma bacterioscopia e depois a prova da catalase. pingar uma gota de peróxido de hidrogênio 20 volumes b) Com auxílio de uma alça. aureus. a) Em uma lâmina limpa. 15 . Catalase-positivos Inocular a colônia suspeita no plasma e incubar a 35 oC por 4 horas.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Esquema de identificação de cocos Gram-positivos de importância médica Identificação de Staphylococcus soagulase negativos (SCN) CAT Stap 16 .

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Identificação de Enterococcus 17 .

1. proceder a semeadura com alça apropriada em ágar CLED e ágar Mac Conkey. Estabilização e armazenamento A urina que não for transportada ao laboratório em até uma hora ou semeada dentro de duas horas após a coleta deve ser refrigerada até o momento da semeadura. diferenciando infecção de colonização. Tipo de amostra Urina colhida por micção (jato intermediário). possibilitando assim. 24 horas. O objetivo é isolar e quantificar bactérias patogênicas do trato urinário. Preparo da amostra Não é exigido 3. Semeadura e isolamento • Para a cultura quantitativa de urina utilizar a alça calibrada de 1 µl (1:1000) ou 10 µl (1:100). Amostra 2.2.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Aula 08 – Urocultura Roteiro de aulas práticas 1. Esta semeadura constará inicialmente de uma estria central na superfície do Agar.Amostra em frasco não estéril . punção suprapúbica. no máximo. 2.Amostra colhida de bolsa coletora de pacientes sondados 5. seguida de um estriamento perpendicular a esta estria inicial. Metodologia 5. 4.Urina colhida com coletor e contaminada com fezes (bebês) . Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais que propiciam o desenvolvimento de patógenos de interesse em infecções urinárias e sua quantificação pela semeadura com alça calibrada. Materiais inadequados . 2. podendo permanecer nestas condições por. pela técnica de esteira. • Após a homogeneização da amostra. cateterização ou sonda uretral. 18 .Jato primário de urina (a não ser por solicitação médica) . a obtenção de colônias isoladas para contagem.1.

multiplicado por 1000.1. o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa. multiplicado por 100. Modelo de resultado Desenvolvimento de Escherichia coli Contagem de colônias: Superior a 100.000 UFC/ml Cultura negativa Contagem de colônias: zero UFC/ml 7.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 • Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 5. O crescimento de uma ou duas espécies em contagem superior a 100. Amostras colhidas inadequadamente poderão apresentar contaminação bacteriana por microbiota normal da uretra e/ou vaginal. Interpretação De acordo com o número de microrganismos isolados e sua quantidade. proceder a interpretação de acordo com a necessidade. “positivando” a cultura. Desenvolvimento de três ou mais espécies em contagens inferiores a 100. Contagem de colônias • Caso seja utilizada a alça de 1 µl.2.000 UFC/ml dever ser sempre valorizado (identificação + antibiograma). • Caso seja utilizada a alça de 10 µl. 19 . 6. Incubar as placas a 35o C por 18-24 horas. • Analisar as características das colônias e proceder a identificação (Bacilos Gram-negativos ou Cocos Gram-positivos). o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa. 6. Amostras não refrigeradas poderão apresentar um subcrescimento de bactérias contaminantes. Interferentes O uso de antibióticos e diuréticos pode diminuir sensivelmente a contagem de colônias.000 UFC/ml devem ser analisadas criteriosamente em cada caso.

O armazenamento após a semeadura direta e enriquecimento da amostra. coli enteropatogênica . Preparar uma suspensão em salina conforme dito acima. deixar secar e corar pelo método de Gram. caso necessário.3Bacterioscopia de Gram Realizar apenas quando solicitado pelo médico ou para a pesquisa de Campylobacter (presença de leucócitos e bacilos Gram-negativos curvos).: diarréicas. Estabilidade e armazenamento da amostra: A amostra. Procedimento: Adicionar 2 – 3 colônias suspeitas a 1 mL de salina e homogeneizar bem. ex. deve ser feito sob refrigeração por mais 24 horas. E. A partir disto é possível a sorotipagem de bactérias enteropatogênicas (Salmonella.EPEC) presentes na amostra. 3. 20 . Metodologia 3. 3. em meio de transporte. Homogeneizar por 2 minutos. pode permanecer até 24 horas em temperatura ambiente. realizar a sorologia indicada. Repicar do caldo GN para uma placa com XLD e incubá-la por 18 – 24 horas a 35oC. coli invasora EIEC e E. conforme descrito a seguir.2Exame microscópico direto A partir de um frasco sem meio de transporte realizar uma suspensão em salina sobre uma lâmina e observar a presença de leucócitos em objetiva de 40x. Entretanto. Identificar as colônias de interesse por meio de provas bioquímicas. Incubar as placas por 18-24 horas e o caldo GN por 4 horas (máximo 6 horas).4Semeadura e isolamento Proceder a semeadura direta por esgotamento no meio MacConkey. etc) das fezes (p. Hektoen e no caldo GN. Shigella. Colocar em uma placa escavada. 3. 2.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 09 – Coprocultura 1. Sorologia: Após a leitura das provas de triagem. 1 gota do anti-soro e misturar com uma gota da suspensão bacteriana. moldadas. 3. Observar ao microscópio (10x) a presença de aglutinação.1Exame macroscópico Anotar sempre o aspecto mucosanguinolentas. Amostra Fezes recentes em frasco de boca larga estéril ou em meio de transporte ou swab retal em meio de transporte. a refrigeração pode inviabilizar algumas cepas de Shigella. Princípio O crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais propicia o enriquecimento e o desenvolvimento de patógenos de interesse nas gastroenterites.

Caso a aglutinação se repita.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Anti-soros utilizados: Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 2) Salmonella polivalente somático e flagelar. dysenteriae. “Desenvolvimento de Salmonella”. B e C 5) EIEC: polivalentes A e B 4. conforme faixa etária (a EPEC só deve ser pesquisada em crianças até 2 anos de idade). pois este prejudica a coloração e causa interferência no método. S. Exemplos: “Não houve desenvolvimento de Salmonella. sonnei. Modelo de resultado Será relatada a presença ou ausência dos enteropatógenos aqui pesquisados. Shigella e E. re-isolar as cepas e repetir a sorologia. boydii. o resultado é inconclusivo. Algumas cepas de EPEC podem apresentar aglutinação inespecífica com todos os antisoros (cepas autoaglutináveis). 21 . coli enteropatogênica clássica”. A semeadura em grandes quantidades de amostra pode causar a viragem do pH dos meios e não permitir a obtenção de colônias isoladas. 3) Shigella: S. Nestes casos. 4) EPEC (crianças até 02 anos): polivalentes A. flexneri. 5. Interferentes A bacterioscopia não pode ser realizada com amostra em meio de transporte. S. S.

identificar a bactéria com provas bioquímicas e realizar o antibiograma específico para o patógeno isolado. Enviar o frasco para o setor. Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias. Mac Conkey. incubar as amostras e observar uma a uma a cada 24 horas para pesquisa de hemoculturas positivas. maior será a probabilidade do isolamento do agente etiológico causador da infecção. • No setor. 2. vácuo e CO2. observando-as a cada 24 horas. • No caso da detecção de hemocultura positiva (por turvação. proceder da seguinte maneira. Incubar as placas a 37oC por 24 horas.1 mL da amostra e transferir uma gota para Agar sangue. para que haja diluição das prováveis substâncias inibitórias presentes no sangue. • Enquanto isso. grumos ou hemólise).Cultura de ponta de cateter 1. Aula 10 . utilizando o Agar sangue. Transferir uma gota para preparar lâminas para corar pelo Gram. com auxílio de uma seringa de insulina. 2. Procedimentos: • Fazer rigorosa assepsia da pele do paciente. O número de amostras varia conforme solicitação médica. • Puncionar a veia do paciente e coletar o volume de sangue recomendado (5 a 10 mL para adultos e 2 a 4 mL para crianças). Princípio O Objetivo da hemocultura é a realização do isolamento. Deixar o álcool agir por 1 minuto. O frasco de hemocultura contém ainda um anticoagulante (SPS). permitindo assim o desenvolvimento da grande maioria dos microrganismos envolvidos em bacteremias. utilizando algodão embebido em álcool 70%. Amostra Tipo de amostra: Sangue venoso ou arterial. friccionar um algodão embebido em álcool 70% na tampa de borracha do frasco de hemocultura. • Caso haja crescimento. Tranferi-lo imediatamente para o frasco de hemocultura. coletar 0. Tipo de amostra 22 . liberar o resultado da hemocultura como Negativo. Hemocultura negativas: Devem ser incubadas por 7 dias a 37oC. identificação e antibiograma de bactérias que possam estar envolvidas em um processo infeccioso da corrente sanguínea. Identificar o frasco. Quanto maior o número de amostras coletadas.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 10 – Hemocultura 1. Isto é possível através da incubação das amostras em caldos de enriquecimento na proporção de 1:10. Após o término da incubação. Hemoculturas positivas: • Homogeneizar bem a amostra e.

Cateteres colonizados por 15 UFC ou mais constituem uma importante fonte de infecção. • Observar se houve crescimento e. Procedimento • Deixar a placa com Agar sangue a temperatura ambiente. 4. contar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de cada espécie (geralmente cresce um único tipo). retirar a ponta de cateter do frasco e rolar o mesmo por toda a extensão da placa (4 a 5 vezes) • Incubar a 35oC por 24 horas.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Ponta de cateter. • Confeccionar uma lâmina para Gram e proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada. Interpretação Por estar em contato direto com a corrente sanguínea a colonização da ponta do cateter oferece risco eminente de disseminação destas bactérias para o sangue. 23 . Modelo de resultado Deve-se relatar a bactéria isolada e o número de UFC encontrado. 5. caso positivo. • Com auxílio de uma pinça estéril (flambada e resfriada). Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 3. Exemplo: Microrganismo isolado: Staphylococcus aureus Contagem de colônias: 89 UFC/segmento Ou Não houve desenvolvimento de microrganismos.

pesquisar principalmente microrganismos cuja patogenicidade é bem estabelecida neste tipo de material. que propiciem o desenvolvimento da maioria dos patógenos de interesse clínico nesse tipo de material. observando rigorosamente as instruções de coleta”. Observar o crescimento e fazer uma bacterioscopia (Gram) das colônias de prováveis patógenos e proceder a identificação. 2. os mais freqüentes são: Staphylococcus aureus: ++++ Pseudomonas aeruginosa: +++ Streptococcus pneumoniae: ++ Klebsiella pneumoniae: ++ Haemophilus influenzae: ++ 24 . Incubar a 35oC por 24 horas. SEMEADURA E ISOLAMENTO Semear em ágar chocolate. leva a resultados mais conclusivos. incluir no laudo a seguinte observação: “Amostra não representativa do trato respiratório inferior. Metodologia BACTERIOSCOPIA • Observar a presença de leucócitos. A análise microbiológica de outros materiais como lavado brônquico. Isto é devido ao fato deste material ser invariavelmente contaminado por bactérias da microbiota normal do trato respiratório superior. células epiteliais e bactérias (fazer o Gram mesmo que o médico não tenha solicitado) • Observar em aumento de 10x. Amostra Escarro Coleta: Expectorar a amostra de maneira que esta seja representativa do trato respiratório inferior Enviar o frasco para o laboratório dentro de 1 hora 3. o escarro não é o material mais representativo do quadro infeccioso do trato respiratório inferior. Agar sangue e Mac Conkey pela técnica de isolamento. Dentre estes. aspirado traqueal. Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos. Por outro lado. Se for observada uma quantidade superior a 10 células epiteliais e/ou quantidade inferior a 25 leucócitos por campo (observar 10 campos). diferenciais e enriquecidos. Material inadequado Amostra contendo muita saliva 4.1 Interpretação A cultura de escarro é de valor questionável. Sugerimos repetir exame. 5. O Agar chocolate deve ser incubado em tensão de CO2. Para contornar o problema de contaminação com bactérias não patogênicas. Resultados 5.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 11 – Cultura de escarro 1.

SEMEADURA • Homogeneizar bem a amostra • Misturar 1 mL da amostra com 1 ml de N-acetilcisteína 1% (fluidificante) (Diluição ½) • Da mistura anterior (Diluição ½).000) 25 . (Diluição final: 1/20. classifique essas amostras em adequadas ou inadequadas. Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias Gram negativas e Gram positivas. utilizando meios de cultura apropriados (Agar sangue.1 Tipo de amostra Aspirado traqueal 2.3 Preparo da amostra BACTERIOSCOPIA Preparar duas lâminas diretamente do material e corar pelo Gram para avaliar a qualidade da amostra (controle de qualidade interno. exceto quando houver solicitação médica em pacientes gravemente debilitados (ex. Agar chocolate e Mac Conkey) e um fluidificante. Atividade prática: Observe as lâminas de escarro coradas pelo Gram e. em UTIs). adicionar 100 µl mais 900 µl de solução fisiológica estéril e homogeneizar bem (Diluiçã 1/10) Diluição final 1/20 • Inocular 1 µl e semear pela técnica de esteira. Amostra 2.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Moraxella catarrhalis: ++ Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas As bactérias acima descritas devem ser pesquisadas primeiramente na cultura do escarro de rotina. de acordo com os critérios acima descritos. resultado não divulgado).2 Coleta Coleta: procedimento médico 2. 2. Contagem de Contagem de células leucócitos epiteliais Lâmina Lâmina Lâmina Lâmina Lâmina 1 2 3 4 5 Avaliação Bactérias Aula 11 – Cultura quantitativa de aspirado traqueal 1. Observe cerca de 10 campos em aumento de 10x e faça uma média.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 • • • Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Incubar a 35oC por 24 horas Observar o crescimento e caso positivo anotar a quantidade de colônias de cada tipo e confeccionar uma lâmina das colônias de interesse para iniciar a identificação.000.000. Interferentes A presença de contaminantes do trato respiratório superior pode fornecer resultados falso-positivos. (Exemplo: contagem de 50 colônias x 20.000 UFC/ml) Valor significativo para aspirado traqueal: 106 UFC/ml (1. contar todas as colônias e multiplicar por 20. 4. 3.1 Interpretação A quantificação de bactérias neste tipo de amostra é importante para estabelecer uma melhor correlação com uma infecção e descartar a probabilidade de uma contaminação pela microbiota normal.000. Fluxograma de processamento do aspirado traqueal 26 . 5. Entretanto. nestes casos a contagem de colônias é geralmente baixa.000 = 1. Exemplo: “Desenvolvimento de Klebsiella pneumoniae Contagem de colônias: 1. Resultados 3. Para calcular o número total de colônias por mililitro de amostra. 3.000 UFC/ml”.000.000 UFC/ml) O resultado será expresso conforme abaixo.2 Modelo de resultado No laudo deve constar a bactéria identificada e o número de colônias contadas. Proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada. “Não houve desenvolvimento de bactérias Contagem de colônias: zero UFC/ml”.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 27 .

• A partir do sedimento. • Centrifugar a 4. 28 . • Transferir a amostra para um tubo estéril. Quando houver pedido de citologia e bioquímica. inocular em Agar chocolate e Agar sangue (pela técnica de isolamento) e prepara lâminas para corar pelo Gram. porém volumes menores podem ser aceitos. Princípio A meningite aguda é a principal manifestação de infecção do SNC e representa uma emergência médica. Por se tratar de um material estéril em condições habituais. daí a importância da concentração da amostra antes do processamento. Liberar no laudo o gênero e espécie do microrganismo isolado.Cultura de Líquor 1. Amostra A amostra deve ser coletada em um tubo estéril e encaminhada ao laboratório a temperatura ambiente o mais rápido possível. qualquer achado no exame bacterioscópico ou cultura deve ser considerado e criteriosamente reportado. Geralmente a concentração de microrganismos no líquor é baixa.000 rpm por 15 minutos. prazos superiores a 1 hora podem ser prejudiciais ao exame. o material deve ser primeiramente encaminhado a bacteriologia e depois aos demais setores. • Após período de incubação. entretanto observar a correlação dos achados na cultura com características físicoquímicas. • Incubar as placas a 35 oC com 5% de CO2 por 24-48 horas. 4. 2. O volume mínimo recomendável para o isolamento de bactérias é 1 mL. Dependendo do microrganismo presente. Resultado O isolamento de qualquer bactéria é forte indício de meningite. Exemplo de resultado: Cultura de líquor: “Desenvolvimento de Neisseria meningitidis”. • Identificar por provas bioquímicas.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 12 . citológicos e bioquímicos do líquor. bioquímicas e citológicas do líquor é essencial. Coleta da amostra: equipe médica especializada 3. observar se há crescimento bacteriano. Procedimento Avaliar em conjunto com a cultura os parâmetros físico-químicos.

Amostra Colônias previamente isoladas do microrganismo a ser testado. • Incubar a placa invertida.5 da escala de Mac Farland. O ajuste é feito em espectrofotômetro. são colocados discos de papel. 15 mm de distância (centro a centro). Ou. 4. com auxílo de uma pinça. Importante: Cultura pura 3. impregnados com concentrações conhecidas de antibióticos.08 e 0.10 = diluir adicionando mais salina. pode-se utilizar o ajuste visual. de maneira que os discos fiquem a uma distância de. A seleção dos discos a serem utilizadas depende da bactéria testada (consultar manual do CLSI). utilizando um tubo de solução fisiológica não inoculada para “zerar” o aparelho. é comum ocorrer discrepâncias entre as sensibilidades in vitro e in vivo. por 18-24 horas e proceder a leitura dos halos com auxílio de uma régua e tabela de interpretação. Entretanto. Cabe ao clínico perceber as situações e tomar as devidas providências. Procedimento • Com uma alça bacteriológica. onde é semeada uma quantidade padrão de microrganismos em teste.10. tocar umas cinco colônias bem isoladas da bactéria em teste e inoculá-las em solução fisiológica. a 625 nm.000 UFC/ml Antibiograma: 29 . Para a quantidade de colônias de 3 x 10 8 UFC/ml.08 = acrescentar mais colônias). e o crescimento do organismo em teste fica inibido a uma certa distância do disco. Princípio Observar a resistência ou sensibilidade que uma determinada cepa bacteriana apresenta frente a antimicrobianos. retirar o excesso nas paredes do tubo e semear na placa de Mueller-Hinton pela técnica de “8 direções”.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 13 – Antibiograma 1.5 de Mc Farland com boa luminosidade contra um fundo branco com listras negras. através de zonas de inibição de crescimento in vitro. 5. comparando-se com uma escala de 0. se der < 0. pelo menos. A medida do halo de inibição e a comparação deste com uma tabela normatizada é que vai fornecer a susceptibilidade do microrganismo. Modelo de resultado Urocultura: Escherichia coli Contagem de colônias: superior a 100. a absorbância deve estar entre 0. Interpretação A determinação do perfil de susceptibilidade de uma bactéria pode fornecer um auxílio muito importante para o clínico. (Se der > 0. • Ajustar a turvação da suspensão bacteriana para o equivalente do tubo 0. É então formada uma concentração em gradiente pela difusão do antibiótico no Agar. • Embeber um swab no caldo inoculado. • Aplicar os discos na placa. 2. Na superfície de um meio de cultura.

Sensibilidade a: Amicacina. Imipenem. Gentamicina Sensibilidade reduzida a: Ciprofloxacina.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Cefrtiaxona. Nitrofurantína. Norfloxacina Resistência a: Não houve resistência aos sais testados. 30 .

I ou R) 31 .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Bactéria testada: _____________________________________________________ Antibiótico Classificaçã o CLSI Medida do halo (mm) Classificação (S.

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 32 .

Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 33 .

As amostras de vias aéreas superiores deve ser manipuladas com máscaras. secreção muconasal.Preparar o esfregaço do material e fixar com calor. . . 1432 p.Riscos na lâmina podem ser confundidos com BAAR se o observador não tiver muita experiência.Além das micobactérias. OPLUSTIL. Buenos Aires: Panamericana.Secar e observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). Amostra 2. Entretanto. Esta coloração é realizada para detectar a presença e evidenciar as características morfológicas e tintoriais dos Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). linfa. até a emissão de vapores. uma vez coradas. Elmer W. óculos e luvas.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 14 – Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR) 1. 2000. 1999. .Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 5 minutos. são chamadas de álcool-ácido resistentes. 254 p.Cobrir com azul de metileno (coloração de fundo) por 2 minutos. líquidos estéreis em geral. sendo o Mycobacterium tuberculosis e o M. Outras micobactérias também são álcool-ácido-resistentes. lavado brônquico.Descorar com álcool-ácido. São Paulo: Sarvier. devido ao seu alto conteúdo lipídico. lavado bronco-alveolar. Metodologia .1 Tipo de amostra: Escarro. .. 5. . até que toda a fucsina seja eliminada. Rhodococcus) Referências: KONEMAN. 4. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. fezes. outras bactérias podem apresentar álcool-ácido resistência parcial ou total (Ex. 34 . as micobactérias resistem ao descoramento por solventes orgânicos fortes (como o álcool-ácido) e. LCR. Nocardia. 2. 3. Interpretação A observação de bacilos álcool-ácidos resistentes (coradas em rosa) é altamente sugestiva de micobactérias. Interferentes . Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color. Carmen Paz. leprae os mais frequentes. Não deixar ferver. Princípio A parede celular das micobactérias. urina. secreção traqueal. aspirado traqueal. apresenta resistência a coloração. por isso. aquecendo-a por duas vezes durante este período.

Técnica de Coleta de Material para Baciloscopia: • • • • • • • • receber o paciente e explicar sobre o exame. 1. 35 . Espalhar circularmente e cuidadosamente até obter os esfregaços homogêneos com 1 cm de diâmetro. usar uma lanceta para cada paciente.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 15 – Coleta de linfa do lóbulo da orelha e/ou dobra do cotovelo. usar lâminas de vidro novas e limpas . identificá-las com o nome do paciente e o local da coleta. demarcar as lâminas do lado que serão feitos os esfregaços. colocar o material coletado na lâmina previamente demarcada. selecionar os sítios de coleta . sem sangrar. fazer assepsia. Corar as lâminas com Zhiel-Neelsen (BAAR) e observar ao microscópio para pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes. fazer boa isquemia com a pinça de Kelly e a incisão.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful