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Disciplina de Profa Daiane Bopp Roteiro de

Microbiologia Clínica Fuentefria aulas práticas


VIII Nível / 2010

Normas do Laboratório de Microbiologia


1. Os alunos somente poderão assistir ou participar dos experimentos práticos
protegidos com avental apropriado (uso obrigatório);
2. Os alunos que apresentem soluções de continuidade (ferimentos ou cortes) na
pele devem informar ao professor antes do início da prática para que o mesmo
avalie se o aluno pode participar diretamente da prática;
3. Os objetos pessoais, exceto aqueles utilizados em experimento da prática
(caderno, caneta, lápis, etc...), devem ser colocados nos armários;
4. Os alunos devem, de preferência, ocupar um lugar específico na bancada e
mantê-lo fixo por todo o semestre;
5. Os estudantes devem evitar conversas paralelas e circulação entre as
bancadas para diminuir os riscos de contaminação;
6. Antes de iniciar os trabalhos, os alunos devem sempre realizar a desinfecção
da bancada utilizando algodão embebido em soluções de álcool a 70% ou de
hipoclorito de sódio a 1000 ppm, ou outro agente, por um período adequado;
Apesar de não trabalharmos com amostras clínicas ou microrganismos virulentos,
convém considerar que todo material biológico é infeccioso;
7. Todo experimento deve ser efetuado com o máximo de cuidado e atenção;
8. Não é permitido fumar, beber ou comer no laboratório;
9. Manter a bancada arrumada e colocar papéis no lixo;
10.É recomendado não assistir aulas de chinelos, sandálias ou bermudas;
11.Ao receber o material para a prática verificar se está devidamente íntegro, tubos
tampados adequadamente, se não há vazamentos;
12. Ao utilizar alças e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por
flambagem antes e após cada operação efetuada com culturas microbianas;
13.Colocar os instrumentos e materiais utilizados inclusive vidraria, em
recipientes apropriados, ao final do experimento;
14.Caso ocorra algum acidente comunicar imediatamente ao Professor
Responsável que tomará as providências cabíveis;
Ao final dos experimentos envolvendo microscopia, as objetivas devem ser limpas, o
condensador deve ser deixado na posição original e o equipamento devidamente
protegido e desligado;
15.Os alunos devem trazer canetas tipo Pilot para identificar devidamente os
materiais utilizados na prática, facilitando o reconhecimento posterior;
16.Não é permitido pipetar com a boca, em vez disso usar pêras ou pipetadores
apropriados;
17.Não recapear agulhas;
18.Ao final da aula prática envolvendo culturas microbianas, lavar as mãos com
sabão líquido e enxugar com papel toalha ou álcool-gel;
19.Após o término do experimento o aluno deverá deixar a bancada limpa e
organizada;
20.Após o término da aula, o aluno deverá retirar o jaleco e acondicioná-lo
apropriadamente, pois não será permitido que o aluno circule pelas
dependências do Instituto com o avental utilizado na aula prática;

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Após os trabalhos de laboratório, o recolhimento do material e o descarte das


culturas são feitos por técnicos do laboratório. Cabe ao aluno, entretanto, deixar
a bancada organizada e limpa.

Uso do Bico de Bunsen


A chama tem três zonas: duas internas, mais frias, formadas
por um gás que não entrou em plena combustão; a última é a
zona oxidante da chama, sendo a que mais se emprega em
microbiologia. Esta região azul da chama, na parte superior, é
que deve ser utilizada para esterilizar alças e agulhas de
platina.
As alças devem ser colocadas num ângulo de 45o na chama até
ficarem incandescentes. Esperar esfriar e utilizar. Todo o
material de microbiologia deve ser manipulado atrás do fogo,
na área estéril, de forma a proteger o operador de possíveis
aerossóis gerados e proteger a amostra biológica de
contaminação.
Procedimento:
1. Abrir a válvula de controle do gás;
2. Acender o fósforo;
3. Abrir lentamente a válvula do distribuidor;
4. Ajustar a chama;
5. Desligar na ordem inversa: feche a válvula do distribuidor e em seguida a
válvula de controle de gás.

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Aula 01 – Coloração de Gram


1. Princípio
Baseado na impregnação pelo cristal violeta (corante primário) na parede celular
de algumas espécies bacterianas após este corante formar um complexo
insolúvel com uma solução de iodo (lugol – mordente). Estas bactérias, devido à
natureza de sua parede celular, retém o cristal violeta, mesmo após tratamento
com descorante orgânico (álcool-acetona) e são chamadas de Gram-positivas. As
bactérias que perdem a coloração primária são ditas Gram-negativas, sendo
posteriormente coradas pelo corante secundário (fucsina), tomando a coloração
rósea.
2. Amostra
2.1. Tipo de amostra
Qualquer amostra clínica onde se deseja pesquisar a presença de
bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, anteriormente ao cultivo ou
não ou, ainda, de colônias isoladas em meios de cultivo primários.
3. Metodologia
- Posicionar a lâmina sobre o suporte.
- Cobrir a lâmina com violeta de Genciana por 1 minuto.
- Lavar com água corrente e adicionar o lugol, deixando-o agir por 1 minuto.
- Com a torneira ligeiramente aberta, retirar todo o lugol e proceder a
descoloração com álcool-acetona (tempo crítico – aproximadamente 5
segundos), até que a coloração violeta não se desprenda mais da lâmina.
Enxaguar imediatamente.
- Adicionar a Fucsina de Gram por 30 segundos. Enxaguar e secar a lâmina.
Observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão).
4. Interpretação
Bactérias Gram-positivas = se coram em azul
Bactérias Gram-negativas = se coram em vermelho
5. Interferentes
O cristal violeta pode precipitar, formando estruturas semelhantes a cocos
Gram-positivos. Entretanto os precipitados são geralmente maiores que as
bactérias. Nesse caso, o corante deve ser filtrado antes do uso. O descoramento
em excesso ou a falta do mesmo podem fornecer resultados errôneos, assim
como o ajuste inadequado do conjunto ótico do microscópio.

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Aula 02 - Observação de características morfológicas e tintoriais na


Coloração de Gram

Observar ao microscópio, em imersão, e avaliar as seguintes bactérias


quanto a morfologia (cocos, bacilos, cocobacilos, vibrio), arranjo (isolados, aos
pares, agrupados, em cachos de uva, em cadeias, em tétrades) e coloração de
Gram (Gram-positivos ou Gram-negativos).

Bactéria Morfologia Arranjo Gram


1. Staphylococcus sp.
2. Streptococcus sp.
3. Enterococcus sp.
4. Streptococcus
pneumoniae
5. Escherichia coli
6. Bacillus sp.
7. Neisseria sp.
8. Acinetobacter sp.

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Aulas 03 – Semeadura em Meios de cultura seletivos e diferenciais

Cada dupla receberá um microrganismos (Escherichia coli, Salmonella sp.,


Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella sp) e deverá inocular em
diferentes meios de cultura, pela técnica de isolamento. Incubar as placas a 35 ± 1 oC
por 24 horas. Após o período de incubação observar e anotar as características das
colônias nos diferentes meios de cultura. Anotar também as características observadas
nos microrganismos dos outros colegas

Meio de Bactéria Pigmentaç Característica Observações


cultura testada ão diferencial do
(Cor da meio
colônia)
Sangue

Mac
Conkey

XLD

Hektoen

Observações:

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Aula 04 – Coleta de secreção de orofaringe

1. Princípio
Isolar bactérias patogênicas de secreção de orofaringe, especialmente
estreptococos beta-hemolíticos do grupo A, uma vez que se faz necessária a
terapia imediata. A urgência não é justificada apenas pela doença básica
(faringite, amigdalite), mas também para evitar complicações posteriores,
potencialmente graves, como febre reumática, glomerulonefrite e
endocardite reumática.
2. Amostra
2.1. Tipo de amostra
Secreção de orofaringe, faringe, amígdalas e/ou pontos purulentos
dessas regiões.

2.2. Material para coleta


- 01 abaixador de língua
- 02 lâminas para microscopia
- 01 swab estéril
- 01 placa de Agar sangue ou
- 01 tubo de Stuart (meio de transporte)

Procedimento:
• Sentar o paciente e inclinar levemente a cabeça de modo a
obter boa iluminação na cavidade oral;
• Expor o máximo as amígdalas, com o abaixador de língua;
• Esfregar o swab, de maneira rotatória, nas amígdalas e na
faringe posterior. Coletar também qualquer outro ponto de pus;
• Cuidar para não tocar com o swab na parede da cavidade bucal
e não carregar saliva, caso contrário haverá contaminação da
amostra.
• Rolar o swab no início de um quadrante da placa de ágar sangue
(AS) e, posteriormente, fazer um esfregaço em lâmina;
• Caso não esteja disponível a placa de AS, introduzir o swab em
um meio de transporte de Stuart, imediatamente após a coleta.
2.3. Estabilidade da amostra
Amostra em placa: encaminhada em até 2 horas em temperatura
ambiente
Amostra em meio de transporte: 24 horas em temperatura ambiente

3. Metodologia
3.1 Bacterioscopia
Após fixar o esfregaço, corar pelo método de Gram e observar ao microscópio
com objetiva de 100x, verificando a presença de leucócitos, células e
bactérias.

3.2. Semeadura e isolamento


Com auxílio de uma alça de platina, fazer a semeadura do material no meio
pela técnica de isolamento.
Incubar em jarra com 5% de tensão de CO2 por 24-48 horas.

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Proceder a identificação baseada na morfologia das colônias e hemólise em


Agar sangue.

4. Interferentes
Qualquer antibiótico administrado previamente a coleta poderá fornecer
resultados falso negativos. A falta de uma técnica adequada de coleta poderá
levar a uma contaminação da amostra por bactérias da microbiota normal,
presentes na saliva e na cavidade oral (ex.: Estreptococos do grupo Viridans e
estafilococo coagulase-negativo). Isto pode gerar dificuldades na
interpretação clínica do resultado. Entretanto, este tipo de contaminante não
deve ser valorizado em culturas de orofaringe.

Atividade de quinta-feira:

Após o período de incubação, selecionar uma colônia da placa, fazer um


esfregaço e corar pelo Gram. Observar ao microscópio.

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Aula 05 – Preparo de meios de cultura

1. Calcular a quantidade de meio necessária


2. Pesar o meio de cultura e colocar no
recipiente de autoclavacao
3. Medir o volume de água destilada
desejado
4. Adicionar a água ao recipiente
5. Dissolver com ou bastão de vidro e/ou no
microondas
6. Autoclavar por 15 minutos a 120 0C a 1
atm.
7. Esperar esfriar (ficar morno) e verter nas
placas.

Uso da Autoclave
1. Verificar se o nível da água cobre a resistência (a água deve tocar o
fundo do cesto).
8. Colocar o material a ser autoclavado no
cesto, respeitando a carga máxima;
9. Fechar a autoclave;
10. Abrir a válvula de vapor;
11. Ligar a autoclave na temperatura
máxima;
12. Aguardar a saída contínua de vapor da
mangueira;
13. Fechar a válvula de vapor;
14. Aguardar a autoclave atingir a pressão de
1 atm (120oC). Quando a pressão chegar a 1 atm, baixar o termostato para a
temperatura média e marcar o tempo de esterilização;
15. Desligar a autoclave e esperar o indicador
de pressão chegar a zero;
16. Abrir a válvula de vapor;
17. Abrir a autoclave, sem colocar o rosto em
cima;
18. Retirar o material cuidadosamente.

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Aula 06 – Identificação de Enterobactérias e Bacilos Gram-negativos não


fermentadores

Quarta-feira
1. Cada dupla receberá uma bactéria em Agar inclinado e deverá proceder a
identificação do microrganismo.
2. Inocular a bactéria nos meios de identificação bioquímica e fazer a prova da
citocromo-oxidase.
3. Incubar as provas de identificação a 35 ± 1 oC por 24 horas.

Quinta-feira
1. Interpretar e anotar os resultados das provas bioquímicas.
2. Colocar os resultados em tabelas de identificação bioquímica.
3. Identificar o microrganismo.

Semeadura em provas bioquímicas


Meio Interpretação Como inocular Resu
lt
Citocromo- Pigmento roxo: positivo Colocar uma colônia sobre a tira
oxidase Pigmento incolor: negativo de oxidase
TSI KK - - : inerte Usar a agulha.
AA + - : ácido, ácido, gás +, H2S – Inocular em picada e fazer estrias
AA + + : ácido, ácido, gás +, H2S + na superfície inclinada.
KA + - : ácido, ácido, gás +, H2S –
Motilidade Visualizada no meio SIM Meio SIM
Turvação ou crescimento difuso na Usar agulha
picada: positivo Inocular em picada
Ausência de turvação ou crescimento
difuso: negativo
Indol Adicionar 3 gotas do reativo de indol no Meio SIM
tubo de SIM e aguarda 2 min. Usar agulha
Coloração rosa Pink: positivo Inocular em picada
H2S Produção de pigmento negro no meio Meio SIM
SIM Usar agulha
Inocular em picada
Uréia Rosa: positivo Usar a agulha . Inocular em
Cor inalterada: negativo picada e na superfície do agar
inclinado.

Lisina Fica amarelo e retorna a púrpura: Usar a alça.


positiva Inocular 1 a 2 colônias e cobrir o
Amarelo: negativa tubo com 3 gotas óleo mineral.
Fenilalanin Adicionar 5 gotas de cloreto férrico 10% Usar a alça.
a na superfície. Inocular a superfície do meio
Cor verde escuro: positivo inclinado, fazendo estrias.
Cor do meio inalterada: negativo
Citrato Azul: positivo Usar a alça.
Verde ou ausência de crescimento: Inocular a superfície do meio
negativo inclinado, fazendo estrias.
Cresciment Turvação do caldo: positivo Usar a alça e soltar 1 a 2 colônias
o a 42oC Ausência de crescimento: negativo no caldo.
Incubar no banho-maria a 42oC.

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DNAse Halo claro: positivo Usar a alça, fazendo uma estria.


Sem halo: negativo Adicionar HCL 1 N para proceder
a leitura.

Esquema Geral de Identificação

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Tabela 1 - Consulta para identificação das principais Enterobactérias de


importância clínica (%). Nível de complexidade 1. (ANVISA, Módulo V)

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Tabela 2 - Consulta para identificação das principais Enterobactérias de


importância clínica (%). Nível de complexidade 2. (ANVISA, Módulo V)

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Esquemas de identificação de bacilos gram-negativos não fermentadores da


glicose

Tabela 1 - Bacilos Gram-negativos, Oxidase-negativa, Motilidade positiva, TSI inerte

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Tabela 2 – Bacilos Gram-negativos, Oxidase positiva, Motilidade positiva, TSI inerte

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Aula 07 – Identificação de cocos Gram-positivos

1. Princípio
Identificar os cocos Gram-positivos até o gênero: Staphylococcus, Streptococcus e
Enterococcus.

2. Prova da catalase
Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e depois
a prova da catalase.
a) Em uma lâmina limpa, pingar uma gota de peróxido de hidrogênio 20 volumes
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para a lâmina e emulsioná-la no
peróxido
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO

3. Catalase-positivos
Inocular a colônia suspeita no plasma e incubar a 35 oC por 4 horas. Após o período de
incubação, a formação de um coágulo indica um resultado positivo e identifica S.
aureus.

4. Observar as hemólises e características das colônias em agar sangue de


carneiro 5%.

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Esquema de identificação de cocos Gram-positivos de importância médica

Identificação de Staphylococcus soagulase negativos (SCN)

CAT
Stap
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Identificação de Enterococcus

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Aula 08 – Urocultura

1. Princípio
Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais que
propiciam o desenvolvimento de patógenos de interesse em infecções urinárias
e sua quantificação pela semeadura com alça calibrada. O objetivo é isolar e
quantificar bactérias patogênicas do trato urinário, diferenciando infecção de
colonização.

2. Amostra
2.1. Tipo de amostra
Urina colhida por micção (jato intermediário), punção suprapúbica,
cateterização ou sonda uretral.
2.2. Preparo da amostra
Não é exigido

3. Estabilização e armazenamento
A urina que não for transportada ao laboratório em até uma hora ou semeada
dentro de duas horas após a coleta deve ser refrigerada até o momento da
semeadura, podendo permanecer nestas condições por, no máximo, 24 horas.

4. Materiais inadequados
- Jato primário de urina (a não ser por solicitação médica)
- Amostra em frasco não estéril
- Urina colhida com coletor e contaminada com fezes (bebês)
- Amostra colhida de bolsa coletora de pacientes sondados

5. Metodologia
5.1. Semeadura e isolamento
• Para a cultura quantitativa de urina utilizar a alça calibrada de 1 µl
(1:1000) ou 10 µl (1:100).
• Após a homogeneização da amostra, proceder a semeadura com
alça apropriada em ágar CLED e ágar Mac Conkey, pela técnica de
esteira. Esta semeadura constará inicialmente de uma estria central
na superfície do Agar, seguida de um estriamento perpendicular a
esta estria inicial, possibilitando assim, a obtenção de colônias
isoladas para contagem.

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• Incubar as placas a 35o C por 18-24 horas.


• Analisar as características das colônias e proceder a identificação
(Bacilos Gram-negativos ou Cocos Gram-positivos).
5.2. Contagem de colônias
• Caso seja utilizada a alça de 1 µl, o número de UFC será dado pela
contagem das colônias do mesmo aspecto na placa, multiplicado
por 1000.
• Caso seja utilizada a alça de 10 µl, o número de UFC será dado pela
contagem das colônias do mesmo aspecto na placa, multiplicado
por 100.

6. Interpretação
De acordo com o número de microrganismos isolados e sua quantidade,
proceder a interpretação de acordo com a necessidade.
O crescimento de uma ou duas espécies em contagem superior a 100.000
UFC/ml dever ser sempre valorizado (identificação + antibiograma).
Desenvolvimento de três ou mais espécies em contagens inferiores a 100.000
UFC/ml devem ser analisadas criteriosamente em cada caso.

6.1. Modelo de resultado


Desenvolvimento de Escherichia coli
Contagem de colônias: Superior a 100.000 UFC/ml

Cultura negativa
Contagem de colônias: zero UFC/ml

7. Interferentes
O uso de antibióticos e diuréticos pode diminuir sensivelmente a contagem de
colônias. Amostras colhidas inadequadamente poderão apresentar contaminação
bacteriana por microbiota normal da uretra e/ou vaginal. Amostras não
refrigeradas poderão apresentar um subcrescimento de bactérias
contaminantes, “positivando” a cultura.

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Aula 09 – Coprocultura

1. Princípio
O crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais propicia o
enriquecimento e o desenvolvimento de patógenos de interesse nas
gastroenterites. A partir disto é possível a sorotipagem de bactérias
enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli invasora EIEC e E. coli
enteropatogênica - EPEC) presentes na amostra.

2. Amostra
Fezes recentes em frasco de boca larga estéril ou em meio de transporte ou
swab retal em meio de transporte.
Estabilidade e armazenamento da amostra: A amostra, em meio de transporte,
pode permanecer até 24 horas em temperatura ambiente. O armazenamento
após a semeadura direta e enriquecimento da amostra, deve ser feito sob
refrigeração por mais 24 horas. Entretanto, a refrigeração pode inviabilizar
algumas cepas de Shigella.

3. Metodologia
3.1Exame macroscópico
Anotar sempre o aspecto das fezes (p. ex.: diarréicas, moldadas,
mucosanguinolentas, etc)

3.2Exame microscópico direto


A partir de um frasco sem meio de transporte realizar uma suspensão em salina
sobre uma lâmina e observar a presença de leucócitos em objetiva de 40x.

3.3Bacterioscopia de Gram
Realizar apenas quando solicitado pelo médico ou para a pesquisa de
Campylobacter (presença de leucócitos e bacilos Gram-negativos curvos).
Preparar uma suspensão em salina conforme dito acima, deixar secar e corar
pelo método de Gram.

3.4Semeadura e isolamento
Proceder a semeadura direta por esgotamento no meio MacConkey, Hektoen e
no caldo GN. Incubar as placas por 18-24 horas e o caldo GN por 4 horas
(máximo 6 horas). Repicar do caldo GN para uma placa com XLD e incubá-la por
18 – 24 horas a 35oC.
Identificar as colônias de interesse por meio de provas bioquímicas.

Sorologia:
Após a leitura das provas de triagem, realizar a sorologia indicada, caso
necessário, conforme descrito a seguir.

Procedimento:
Adicionar 2 – 3 colônias suspeitas a 1 mL de salina e homogeneizar bem.
Colocar em uma placa escavada, 1 gota do anti-soro e misturar com uma
gota da suspensão bacteriana. Homogeneizar por 2 minutos. Observar ao
microscópio (10x) a presença de aglutinação.

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Anti-soros utilizados:

2) Salmonella polivalente somático e flagelar.


3) Shigella: S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, S. dysenteriae.
4) EPEC (crianças até 02 anos): polivalentes A, B e C
5) EIEC: polivalentes A e B

4. Modelo de resultado
Será relatada a presença ou ausência dos enteropatógenos aqui pesquisados,
conforme faixa etária (a EPEC só deve ser pesquisada em crianças até 2 anos de
idade).
Exemplos: “Não houve desenvolvimento de Salmonella, Shigella e E. coli
enteropatogênica clássica”.
“Desenvolvimento de Salmonella”.

5. Interferentes
A bacterioscopia não pode ser realizada com amostra em meio de transporte,
pois este prejudica a coloração e causa interferência no método. A semeadura
em grandes quantidades de amostra pode causar a viragem do pH dos meios e
não permitir a obtenção de colônias isoladas. Algumas cepas de EPEC podem
apresentar aglutinação inespecífica com todos os antisoros (cepas
autoaglutináveis). Nestes casos, re-isolar as cepas e repetir a sorologia. Caso a
aglutinação se repita, o resultado é inconclusivo.

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Aula 10 – Hemocultura

1. Princípio
O Objetivo da hemocultura é a realização do isolamento, identificação e
antibiograma de bactérias que possam estar envolvidas em um processo
infeccioso da corrente sanguínea. Isto é possível através da incubação das
amostras em caldos de enriquecimento na proporção de 1:10, para que haja
diluição das prováveis substâncias inibitórias presentes no sangue. O frasco de
hemocultura contém ainda um anticoagulante (SPS), vácuo e CO2, permitindo
assim o desenvolvimento da grande maioria dos microrganismos envolvidos em
bacteremias. O número de amostras varia conforme solicitação médica. Quanto
maior o número de amostras coletadas, maior será a probabilidade do
isolamento do agente etiológico causador da infecção.

2. Amostra
Tipo de amostra: Sangue venoso ou arterial.

Procedimentos:
• Fazer rigorosa assepsia da pele do paciente, utilizando algodão embebido em
álcool 70%. Deixar o álcool agir por 1 minuto.
• Enquanto isso, friccionar um algodão embebido em álcool 70% na tampa de
borracha do frasco de hemocultura. Identificar o frasco.
• Puncionar a veia do paciente e coletar o volume de sangue recomendado (5 a
10 mL para adultos e 2 a 4 mL para crianças). Tranferi-lo imediatamente para
o frasco de hemocultura. Enviar o frasco para o setor.
• No setor, incubar as amostras e observar uma a uma a cada 24 horas para
pesquisa de hemoculturas positivas.
• No caso da detecção de hemocultura positiva (por turvação, grumos ou
hemólise), proceder da seguinte maneira.

Hemoculturas positivas:
• Homogeneizar bem a amostra e, com auxílio de uma seringa de insulina, coletar
0,1 mL da amostra e transferir uma gota para Agar sangue, Mac Conkey. Incubar
as placas a 37oC por 24 horas. Transferir uma gota para preparar lâminas para
corar pelo Gram.
• Caso haja crescimento, identificar a bactéria com provas bioquímicas e realizar o
antibiograma específico para o patógeno isolado.

Hemocultura negativas:
Devem ser incubadas por 7 dias a 37oC, observando-as a cada 24 horas. Após o
término da incubação, liberar o resultado da hemocultura como Negativo.

Aula 10 - Cultura de ponta de cateter

1. Princípio
Desenvolvimento e quantificação de bactérias, utilizando o Agar sangue.

2. Tipo de amostra

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Ponta de cateter.

3. Procedimento
• Deixar a placa com Agar sangue a temperatura ambiente.
• Com auxílio de uma pinça estéril (flambada e resfriada), retirar a ponta de
cateter do frasco e rolar o mesmo por toda a extensão da placa (4 a 5
vezes)
• Incubar a 35oC por 24 horas.
• Observar se houve crescimento e, caso positivo, contar o número de
unidades formadoras de colônias (UFC) de cada espécie (geralmente
cresce um único tipo).
• Confeccionar uma lâmina para Gram e proceder a identificação conforme
o tipo de bactéria isolada.
4. Interpretação
Por estar em contato direto com a corrente sanguínea a colonização da ponta do
cateter oferece risco eminente de disseminação destas bactérias para o sangue.
Cateteres colonizados por 15 UFC ou mais constituem uma importante fonte de
infecção.

5. Modelo de resultado
Deve-se relatar a bactéria isolada e o número de UFC encontrado.
Exemplo:

Microrganismo isolado: Staphylococcus aureus


Contagem de colônias: 89 UFC/segmento

Ou

Não houve desenvolvimento de microrganismos.

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Aula 11 – Cultura de escarro

1. Princípio
Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos, diferenciais e
enriquecidos, que propiciem o desenvolvimento da maioria dos patógenos de
interesse clínico nesse tipo de material.

2. Amostra
Escarro

Coleta:
Expectorar a amostra de maneira que esta seja representativa do trato
respiratório inferior
Enviar o frasco para o laboratório dentro de 1 hora

3. Material inadequado
Amostra contendo muita saliva

4. Metodologia
BACTERIOSCOPIA
• Observar a presença de leucócitos, células epiteliais e bactérias (fazer o
Gram mesmo que o médico não tenha solicitado)
• Observar em aumento de 10x. Se for observada uma quantidade superior
a 10 células epiteliais e/ou quantidade inferior a 25 leucócitos por campo
(observar 10 campos), incluir no laudo a seguinte observação:
“Amostra não representativa do trato respiratório inferior. Sugerimos
repetir exame, observando rigorosamente as instruções de coleta”.

SEMEADURA E ISOLAMENTO
Semear em ágar chocolate, Agar sangue e Mac Conkey pela técnica de
isolamento. Incubar a 35oC por 24 horas. O Agar chocolate deve ser incubado em
tensão de CO2. Observar o crescimento e fazer uma bacterioscopia (Gram) das colônias
de prováveis patógenos e proceder a identificação.

5. Resultados
5.1 Interpretação
A cultura de escarro é de valor questionável. Isto é devido ao fato deste material
ser invariavelmente contaminado por bactérias da microbiota normal do trato
respiratório superior. Por outro lado, o escarro não é o material mais
representativo do quadro infeccioso do trato respiratório inferior. A análise
microbiológica de outros materiais como lavado brônquico, aspirado traqueal,
leva a resultados mais conclusivos. Para contornar o problema de contaminação
com bactérias não patogênicas, pesquisar principalmente microrganismos cuja
patogenicidade é bem estabelecida neste tipo de material. Dentre estes, os mais
freqüentes são:
Staphylococcus aureus: ++++
Pseudomonas aeruginosa: +++
Streptococcus pneumoniae: ++
Klebsiella pneumoniae: ++
Haemophilus influenzae: ++

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Moraxella catarrhalis: ++

As bactérias acima descritas devem ser pesquisadas primeiramente na cultura


do escarro de rotina, exceto quando houver solicitação médica em pacientes
gravemente debilitados (ex. em UTIs).

Atividade prática:
Observe as lâminas de escarro coradas pelo Gram e, de acordo com os critérios
acima descritos, classifique essas amostras em adequadas ou inadequadas.
Observe cerca de 10 campos em aumento de 10x e faça uma média.

Contagem de Contagem de Avaliação Bactérias


células leucócitos
epiteliais
Lâmina 1
Lâmina 2
Lâmina 3
Lâmina 4
Lâmina 5

Aula 11 – Cultura quantitativa de aspirado traqueal

1. Princípio
Desenvolvimento e quantificação de bactérias Gram negativas e Gram
positivas, utilizando meios de cultura apropriados (Agar sangue, Agar
chocolate e Mac Conkey) e um fluidificante.

2. Amostra
2.1 Tipo de amostra
Aspirado traqueal

2.2 Coleta
Coleta: procedimento médico

2.3 Preparo da amostra


BACTERIOSCOPIA
Preparar duas lâminas diretamente do material e corar pelo Gram para
avaliar a qualidade da amostra (controle de qualidade interno, resultado
não divulgado).

SEMEADURA
• Homogeneizar bem a amostra
• Misturar 1 mL da amostra com 1 ml de N-acetilcisteína 1%
(fluidificante) (Diluição ½)
• Da mistura anterior (Diluição ½), adicionar 100 µl mais 900 µl de
solução fisiológica estéril e homogeneizar bem (Diluiçã 1/10)
Diluição final 1/20
• Inocular 1 µl e semear pela técnica de esteira. (Diluição final:
1/20.000)

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• Incubar a 35oC por 24 horas


• Observar o crescimento e caso positivo anotar a quantidade de
colônias de cada tipo e confeccionar uma lâmina das colônias de
interesse para iniciar a identificação.
• Proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada.

3. Resultados
3.1 Interpretação
A quantificação de bactérias neste tipo de amostra é importante para
estabelecer uma melhor correlação com uma infecção e descartar a
probabilidade de uma contaminação pela microbiota normal. Para calcular
o número total de colônias por mililitro de amostra, contar todas as
colônias e multiplicar por 20.000. (Exemplo: contagem de 50 colônias x
20.000 = 1.000.000 UFC/ml)
Valor significativo para aspirado traqueal: 106 UFC/ml (1.000.000
UFC/ml)
O resultado será expresso conforme abaixo.

3.2 Modelo de resultado


No laudo deve constar a bactéria identificada e o número de colônias
contadas.
Exemplo:
“Desenvolvimento de Klebsiella pneumoniae
Contagem de colônias: 1.000.000 UFC/ml”.

“Não houve desenvolvimento de bactérias


Contagem de colônias: zero UFC/ml”.

4. Interferentes
A presença de contaminantes do trato respiratório superior pode fornecer
resultados falso-positivos. Entretanto, nestes casos a contagem de colônias é
geralmente baixa.

5. Fluxograma de processamento do aspirado traqueal

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Aula 12 - Cultura de Líquor

1. Princípio
A meningite aguda é a principal manifestação de infecção do SNC e
representa uma emergência médica. Geralmente a concentração de
microrganismos no líquor é baixa, daí a importância da concentração da
amostra antes do processamento. Por se tratar de um material estéril em
condições habituais, qualquer achado no exame bacterioscópico ou cultura
deve ser considerado e criteriosamente reportado.

2. Amostra
A amostra deve ser coletada em um tubo estéril e encaminhada ao
laboratório a temperatura ambiente o mais rápido possível. Dependendo do
microrganismo presente, prazos superiores a 1 hora podem ser prejudiciais
ao exame. O volume mínimo recomendável para o isolamento de bactérias é
1 mL, porém volumes menores podem ser aceitos. Quando houver pedido de
citologia e bioquímica, o material deve ser primeiramente encaminhado a
bacteriologia e depois aos demais setores.

Coleta da amostra: equipe médica especializada

3. Procedimento
Avaliar em conjunto com a cultura os parâmetros físico-químicos,
citológicos e bioquímicos do líquor.
• Transferir a amostra para um tubo estéril.
• Centrifugar a 4.000 rpm por 15 minutos.
• A partir do sedimento, inocular em Agar chocolate e Agar sangue
(pela técnica de isolamento) e prepara lâminas para corar pelo
Gram.
• Incubar as placas a 35 oC com 5% de CO2 por 24-48 horas.
• Após período de incubação, observar se há crescimento bacteriano.
• Identificar por provas bioquímicas.

4. Resultado
O isolamento de qualquer bactéria é forte indício de meningite, entretanto
observar a correlação dos achados na cultura com características físico-
químicas, bioquímicas e citológicas do líquor é essencial. Liberar no laudo
o gênero e espécie do microrganismo isolado.

Exemplo de resultado:
Cultura de líquor:
“Desenvolvimento de Neisseria meningitidis”.

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Aula 13 – Antibiograma
1. Princípio
Observar a resistência ou sensibilidade que uma determinada cepa
bacteriana apresenta frente a antimicrobianos, através de zonas de inibição de
crescimento in vitro. Na superfície de um meio de cultura, onde é semeada uma
quantidade padrão de microrganismos em teste, são colocados discos de papel,
impregnados com concentrações conhecidas de antibióticos. É então formada
uma concentração em gradiente pela difusão do antibiótico no Agar, e o
crescimento do organismo em teste fica inibido a uma certa distância do disco. A
medida do halo de inibição e a comparação deste com uma tabela normatizada é
que vai fornecer a susceptibilidade do microrganismo.

2. Amostra
Colônias previamente isoladas do microrganismo a ser testado. Importante:
Cultura pura

3. Procedimento
• Com uma alça bacteriológica, tocar umas cinco colônias bem isoladas
da bactéria em teste e inoculá-las em solução fisiológica.
• Ajustar a turvação da suspensão bacteriana para o equivalente do tubo
0,5 da escala de Mac Farland. O ajuste é feito em espectrofotômetro,
utilizando um tubo de solução fisiológica não inoculada para “zerar” o
aparelho. Para a quantidade de colônias de 3 x 10 8 UFC/ml, a 625 nm,
a absorbância deve estar entre 0,08 e 0,10. (Se der > 0,10 = diluir
adicionando mais salina; se der < 0,08 = acrescentar mais colônias).
Ou, pode-se utilizar o ajuste visual, comparando-se com uma escala de
0,5 de Mc Farland com boa luminosidade contra um fundo branco com
listras negras.
• Embeber um swab no caldo inoculado, retirar o excesso nas paredes
do tubo e semear na placa de Mueller-Hinton pela técnica de “8
direções”.
• Aplicar os discos na placa, com auxílo de uma pinça, de maneira que
os discos fiquem a uma distância de, pelo menos, 15 mm de distância
(centro a centro). A seleção dos discos a serem utilizadas depende da
bactéria testada (consultar manual do CLSI).
• Incubar a placa invertida, por 18-24 horas e proceder a leitura dos
halos com auxílio de uma régua e tabela de interpretação.

4. Interpretação
A determinação do perfil de susceptibilidade de uma bactéria pode
fornecer um auxílio muito importante para o clínico. Entretanto, é comum
ocorrer discrepâncias entre as sensibilidades in vitro e in vivo. Cabe ao clínico
perceber as situações e tomar as devidas providências.

5. Modelo de resultado
Urocultura:
Escherichia coli
Contagem de colônias: superior a 100.000 UFC/ml
Antibiograma:

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Sensibilidade a: Amicacina, Nitrofurantína, Imipenem, Cefrtiaxona,


Gentamicina
Sensibilidade reduzida a: Ciprofloxacina, Norfloxacina
Resistência a: Não houve resistência aos sais testados.

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Bactéria testada: _____________________________________________________

Antibiótico Classificaçã Medida do Classificação


o CLSI halo (mm) (S, I ou R)

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Aula 14 – Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR)


1. Princípio
A parede celular das micobactérias, devido ao seu alto conteúdo lipídico,
apresenta resistência a coloração. Entretanto, uma vez coradas, as
micobactérias resistem ao descoramento por solventes orgânicos fortes (como o
álcool-ácido) e, por isso, são chamadas de álcool-ácido resistentes. Esta
coloração é realizada para detectar a presença e evidenciar as características
morfológicas e tintoriais dos Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR).
2. Amostra
2.1 Tipo de amostra:
Escarro, lavado brônquico, lavado bronco-alveolar, secreção traqueal, aspirado
traqueal, LCR, urina, líquidos estéreis em geral, fezes, linfa, secreção muco-
nasal.
3. Metodologia
- Preparar o esfregaço do material e fixar com calor. As amostras de vias
aéreas superiores deve ser manipuladas com máscaras, óculos e luvas.
- Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 5 minutos, aquecendo-a por duas
vezes durante este período, até a emissão de vapores. Não deixar ferver.
- Descorar com álcool-ácido, até que toda a fucsina seja eliminada.
- Cobrir com azul de metileno (coloração de fundo) por 2 minutos.
- Secar e observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão).
4. Interpretação
A observação de bacilos álcool-ácidos resistentes (coradas em rosa) é altamente
sugestiva de micobactérias, sendo o Mycobacterium tuberculosis e o M. leprae os
mais frequentes. Outras micobactérias também são álcool-ácido-resistentes.
5. Interferentes
- Riscos na lâmina podem ser confundidos com BAAR se o observador não tiver
muita experiência.
- Além das micobactérias, outras bactérias podem apresentar álcool-ácido
resistência parcial ou total (Ex. Nocardia, Rhodococcus)

Referências:
KONEMAN, Elmer W.. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color. Buenos Aires:
Panamericana, 1999. 1432 p.
OPLUSTIL, Carmen Paz. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. São Paulo:
Sarvier, 2000. 254 p.

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Aula 15 – Coleta de linfa do lóbulo da orelha e/ou dobra do cotovelo.

1. Técnica de Coleta de Material para Baciloscopia:

• receber o paciente e explicar sobre o exame;


• selecionar os sítios de coleta , fazer assepsia;
• usar lâminas de vidro novas e limpas , identificá-las com o nome do paciente e o
local da coleta.
• demarcar as lâminas do lado que serão feitos os esfregaços;
• usar uma lanceta para cada paciente;
• fazer boa isquemia com a pinça de Kelly e a incisão, sem sangrar;
• colocar o material coletado na lâmina previamente demarcada. Espalhar
circularmente e cuidadosamente até obter os esfregaços homogêneos com 1 cm
de diâmetro;
• Corar as lâminas com Zhiel-Neelsen (BAAR) e observar ao microscópio para
pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes.

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