Guia de Practicas de Laboratorio Microbiologia 2017

A
GUAS DE LABORATORIO
CURSO DE MICROBIOLOGA GENERAL
NEYLA BENTEZ CAMPO Ph.D.
ANA CRISTINA BOLAOS Ph.D.
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
UNIVERSIDAD DEL VALLE
Santiago de Cali, febrero de 2017

Bentez-Campo, N. y Bolaos, A.C. Gua de laboratorio de Microbiologa. Dpto. de Biologa.
Universidad del Valle. Cali, Colombia.2017
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA...................................................................................................................... i
PRCTICA No. 1. UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS: PRESENCIA DE
MICROORGANISMOS EN DIFERENTES AMBIENTES ...................................................... 1
PRACTICA No. 2. PREPARACIN DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES
DIFERENCIALES....................................................................................................................... 4
PRACTICA No. 3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO........................................... 9
PRCTICA No. 4. MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS ............................................................................................................ 12
PRCTICA No. 5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA .................... 15
PRCTICA No. 7. CARACTERIZACION BIOQUMICA DE Bacillus cereus ..................... 20
PRACTICA No. 8. HONGOS: IDENTIFICACIN DE DIVERSOS GRUPOS ..................... 22
PRCTICA No. 9. APLICACIONES BIOTECNOLGICAS: PREPARACIN DE
YOGURT ................................................................................................................................... 27
PRACTICA No. 10. ANALISIS MICROBIOLGICO DE SUELOS ..................................... 29
PRCTICA No. 11. ANALISIS BACTERILOGICO DE AGUAS ....................................... 32
PRCTICA No. 12. ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS ............................. 34
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................................... 39
i
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Morfologa de las colonias bacterianas ........................................................................ 3

Figura 2. Preparacin de extendidos y coloracin ...................................................................... 5
Figura 3. Mtodos de siembra. Siembra por agotamiento (a). Siembra por estras (b) ........... 14
Figura 4. Siembra en profundidad (Vertido en placa). ............................................................. 14
Figura 5. Esquema representativo de una caja de Petri con los discos de antibitico y el halo
de inhibicin ............................................................................................................................... 16
Figura 6. Siembra de colonia bacteriana para pruebas: agar almidn, agar leche y agar
gelatina. ...................................................................................................................................... 21
Figura 7. Textura algodosa ........................................................................................................ 25
Figura 8. Textura granular (a) y textura polvosa (b). ............................................................... 25
Figura 9. Textura afelpada (a) y Textura glabra o cerosa (b) .................................................. 26
Figura 10. Esquema de siembra en caja de Petri para la prueba antagonismo ....................... 31
Figura 11. Mtodo del NMP de coliformes totales, fecales y determinacin de E. coli ............ 36
ii
LISTA DE CUADROS
Pg.
Cuadro 1. Procedimiento de la coloracin de Gram ................................................................... 7

Cuadro 2 Interpretacin de resultados en agar TSI. ................................................................ 18
Cuadro 3. Nmero Ms Probable (NMP) por g/mL de muestra, usando tres tubos de 0.1, 0.01
y 0.001 g/mL ............................................................................................................................... 38
iii
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA
Todos los laboratorios deben seguir normas de seguridad que garanticen el buen uso y conservacin
de los mismos para lograr los objetivos de los estudios que all se desarrollen. En general la labor
del microbilogo en el laboratorio, consiste en aislar e identificar microorganismos que, en algunos
casos, pueden resultar patgenos. Para aislar el microorganismo de inters, se debe trabajar con
elementos estriles (asas, medios de cultivo, material de vidrio, recipientes, etc.) y manipular las
muestras con sumo cuidado, como potenciales vehculos de microorganismos patgenos. Algunas
de estas normas son:
1. Antes de entrar a trabajar al laboratorio, lea el texto de la prctica que va a realizar y haga el
plan de trabajo.
2. No comer, beber o fumar dentro del laboratorio.
3. Usar siempre bata de laboratorio, que debe lavar peridicamente.
4. No pipetear con la boca el material contaminado, utilice pipeteadores.
5. Reducir al mnimo la produccin de aerosoles. (Preferiblemente utilizar mascarilla).
6. Antes y despus de cada sesin lave las manos y aplique alguna solucin desinfectante.
7. Antes y despus de cada sesin de trabajo limpie los mesones con solucin desinfectante
(Alcohol o hipoclorito de sodio).
8. Las asas bacteriolgicas deben ser esterilizadas en la llama del mechero, poniendo al rojo
vivo todo el alambre, antes y despus de su uso.
9. Cada vez que se derrame material contaminado, cubra la mesa con toallas de papel, y
humedzcalas con sustancias bactericidas. (Alcohol o hipoclorito de sodio).
10. Las incubaciones deben realizarse durante el perodo de tiempo recomendado, no dejar
material contaminado dentro de las incubadoras innecesariamente.
11. Informe inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como cortaduras,
quemaduras o derrames de cultivos. Tome las precauciones posibles para evitar accidentes
12. Todos los reactivos y equipos deben dejarse organizados y en sus sitios respectivos al final
de cada prctica.
13. Despus de realizar las respectivas lecturas de los cultivos, coloque el material contaminado
en la mesa dispuesta para tal fin, o devulvalo al personal de laboratorio, para su posterior
esterilizacin y/o desecho.
14. Cada grupo de estudiantes tendr a su cargo un microscopio que debe aprender a manejar y
cuidar adecuadamente ya que ste ser usado durante todo el curso.
15. No olvide traer a las prcticas los siguientes implementos de uso personal:
i
Bata de laboratorio Encendedor

Bitcora de Laboratorio Porta - objetos
Marcador de vidrio o lpiz vidriograf Cubre objetos
Guantes desechables Tapabocas
ii
Bentez-Campo, N. y Bolaos, A.C. 2017. Gua de laboratorio de Microbiologa. Dpto. de Biologa.
Universidad del Valle. Cali, Colombia.
PRCTICA No. 1. UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS: PRESENCIA DE

MICROORGANISMOS EN DIFERENTES AMBIENTES
1. INTRODUCCION
La ubicuidad de los microorganismos se basa en tres caractersticas principales: su tamao pequeo,

el cual les permite una gran capacidad de dispersin, su variabilidad metablica, que les permite
tolerar y adaptarse rpidamente a condiciones ambientales desfavorables, y su plasticidad gentica
(o gran capacidad de transferencia horizontal de genes), que les permite re-combinar y recolectar
los caracteres positivos y persistir durante largo tiempo adaptndose a condiciones ambientales
cambiantes. Este grupo de organismos "invisibles" representan un vasto terreno inexplorado de
conocimiento y de diversidad biolgica. Sin el conocimiento de los microorganismos la biologa
sera mucho ms limitada, no sabramos que hay vida en condiciones de temperatura, salinidad o
pH extremas, la fotosntesis solamente sera aerobia y oxignica y los seres vivos ms longevos
(como las Secuoyas) no superaran los miles de aos de edad.
2. OBJETIVOS
Comprobar la presencia de los microorganismos en diversos ambientes
Validar el concepto de ubicuidad microbiana
3. MATERIALES
5 Cajas de Petri con agar nutritivo Exuvias de insectos

5 Cajas de Petri con agar papa dextrosa Semillas varias (ajonjol, linaza, lentejas,
(PDA) etc)
Mecheros Hojas de plantas
Asas Pinzas estriles
Bistur
2 Aplicadores (copitos) estriles Bistur
Encendedor Cinta vinilpel
2 Cajas de Petri vacas estriles
4. METODOS
a. Microorganismos presentes en el are

Tome dos cajas de Petri; una de agar nutritivo y otra con PDA. bralas en un espacio
escogido por usted y exponga al aire por un perodo mnimo de 30 minutos. Tape, selle
con cinta vinilpel y marque. Incube y observe el crecimiento de los microorganismos que
aparecern al cabo de 24 y 48 horas.
b. Microorganismos presentes en semillas

Tome dos cajas de Petri; una de agar nutritivo y otra con PDA. bralas y al lado del
mechero, con una pinza estril coloque cinco semillas de una especie seleccionada, en
cada caja. Tape, selle con cinta vinilpel y marque. Incube y observe el crecimiento de los
microorganismos que aparecern al cabo de 24 y 48 horas.
c. Microorganismos presentes en tejido vegetal
1
Con una piza estril, tome una hoja de una planta, y con ayuda de un bistur, fragmntela
en pequeos pedazos y llvelos a cada caja de petri (una de agar nutritivo y otra con
PDA). Tape, selle con cinta vinilpel y marque. Incube y observe el crecimiento de los
d. Microorganismos presentes en insectos

Tome una exuvia o un cadver de un insecto, fragmntelo en pequeos pedazos y llvelos
a cada caja de petri (una de agar nutritivo y otra con PDA). Tape, selle con cinta winilpel
y marque. Incube y observe el crecimiento de los microorganismos que aparecern al cabo
de 24 y 48 horas.
e. Microorganismos presentes en humanos

Con un copito estril frote las encas, lengua, dientes, axilas u otra parte de su cuerpo.
Luego pase suavemente el copito sobre una caja de agar nutritivo y sobre otra caja con
PDA. Tape, marque y selle con cinta vinilpel. Incube y observe el crecimiento de los
NOTA: Las cajas con agar nutritivo se incubarn a 35C y las cajas con PDA a 28C.
5. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Despus del perodo de incubacin observe cada una de las cajas con microorganismos y
describa la coloracin, tamao, elevacin, forma y borde de las colonias (Figura 1).
Compare los tipos de colonias obtenidas a partir de los diferentes sustratos. Cuente el
nmero de colonias presentes en las cajas expuestas al aire y divida el nmero obtenido
sobre el rea de la caja de Petri. Exprese el resultado del anlisis del aire como UFC/cm 2
(Unidades Formadoras de Colonias/cm2). Las colonias obtenidas en los otros ambientes
solo se describen, no se expresan en UFC/cm2, debido a que no se muestreo un rea
conocida.
6. PEGUNTAS
1. Explique cmo inciden los microorganismos del aire en el trabajo de laboratorio en

microbiologa.
2. Indique las posibles razones por las cuales se utilizaron dos medios de cultivo y dos
temperaturas de incubacin
3. Exprese las razones por las cuales los microorganismos pueden encontrarse en
diversos ambientes
2
Figura 1. Morfologa de las colonias bacterianas
3
PRACTICA No. 2. PREPARACIN DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES

DIFERENCIALES
I. PREPARACIN DE EXTENDIDOS
1. INTRODUCCIN
La determinacin de la morfologa en la identificacin de los microorganismos juega un papel

fundamental, para una diferenciacin inicial. A travs de las determinaciones morfolgicas, se
puede efectuar el reconocimiento de los microorganismos soportada con una adecuada consulta
bibliogrfica. Para observar las caractersticas de las bacterias es necesario hacer preparaciones
(extendidos o frotis) sobre una lmina porta objetos y lograr luego de un proceso de coloracin, ver
las clulas al microscopio.
2. OBJETIVO
Aprender la tcnica del montaje de placas con bacterias y empezar a familiarizarse con el manejo de
los cultivos.
3. MATERIALES
Lminas porta objetos.

Asa de inoculacin.
Mechero.
Goteros.
Agua destilada.
Cultivos de bacterias.
4. MTODO
Preparacin del extendido
En una lmina porta objetos limpia, coloque con el asa una gota de agua.
Esterilice el asa ponindola verticalmente a la llama del mechero hasta que se ponga de
color rojo en toda su longitud.
Enfre el asa introducindola en el borde del medio de cultivo.
Con el asa saque suavemente una pequea porcin de colonia bacteriana sin tomar el medio
de agar.
Coloque la muestra sobre la gota de agua en el porta objetos, haga una extensin delgada
con el fin de que las bacterias queden bien esparcidas. Si usted observa que la suspensin
no se extiende en la superficie del porta objetos, sino que se recoge en gotas, significa que
el porta objetos est engrasado y deber repetir el proceso en un porta objetos
completamente limpio.
Realice extendidos con todos los cultivos de bacterias que se le entregaron (puede poner
dos bacterias diferentes por lmina, siempre y cuando aplique despus el mismo colorante).
Deje que la preparacin se seque al aire.
Fije la preparacin pasndola dos veces sobre la llama del mechero, as las bacterias quedan
firmemente adheridas al porta objetos (Figura 2).
4
Nota: Cuando se hacen extendidos a partir de cultivos en medio lquido, no es necesario colocar la
gota de agua.
Preparacin de extendidos
Coloracin
Colorante
Figura 2. Preparacin de extendidos y coloracin
II. COLORACIONES DIFERENCIALES
A. COLORACION DE GRAM
1. INTRODUCCIN
La morfologa de las bacterias se puede confirmar de dos maneras: Observndolas sin teir donde
se pueda demostrar la movilidad u observndolas muertas teidas con colorantes. Algunos
colorantes sirven para observar la estructura interna de las clulas, que de otra manera sern
invisibles. Es importante que todos los colorantes se preparen en el laboratorio siguiendo las
instrucciones especficas del fabricante. Es preciso seguir paso a paso los detalles cuando se
preparan mezclas o compuestos colorantes mltiples, el perodo y las condiciones de
almacenamiento pueden ser factores crticos para determinar la composicin y la calidad de la
solucin final.
La coloracin de Gram fue elaborada por el Dans Hans Gram en 1884, y permite distinguir entre
diferentes bacterias que puedan mostrar una morfologa similar. Al examen microscpico de un
extendido coloreado por el mtodo de Gram que contenga una flora bacteriana mixta, aparecen las
caractersticas diferenciales del mtodo. Muchas bacterias conservan la combinacin violeta-yodo y
se teirn de prpura (Gram positivas), otras se colorean de rojo por la safranina o el colorante que
se emplee en la contra-coloracin (Gram-negativas). Con este procedimiento no slo se hace visible
la forma, tamao y otros detalles estructurales, sino que pueden agruparse los microorganismos
presentes en tipos Gram-positivos y Gram-negativos, por sus reacciones frente a los colorantes.
La diferencia en la reaccin de coloracin entre las positivas y las negativas se atribuye a la

diferencia en su composicin qumica. Las paredes de las clulas Gram-negativas tienen un
5
contenido lipdico ms elevado que las positivas, y aunque en ambas se forma un complejo cristal
violeta-yodo, el alcohol extrae el lpido de las clulas Gram-negativas y aumenta por lo tanto la
permeabilidad celular. Esto da como resultado la prdida del complejo de colorantes y se colorean
de rojo con la safranina o la fucsina. El mismo es retenido por las clulas Gram-positivas, en las
cuales la deshidratacin por el alcohol ocasiona una disminucin de la permeabilidad, reteniendo el
cristal violeta tras la decoloracin y se observan de color violeta.
Un microorganismo Gram-positivo puede presentar una pared sana, al sufrir dao en esta, se vuelve
Gram-negativo; lo cual indica la importancia de la pared para la retencin o escape del colorante.
Las caractersticas de coloracin de Gram pueden ser atpicas en cultivos muy jvenes o muy
viejos.
2. OBJETIVO
Aplicar la tcnica de coloracin de Gram identificar formas y diferenciar grupos bacterianos.

Observar al microscopio la motilidad de algunas especias bacterianas
3. MATERIALES
Cristal violeta
Lugol de Gram
Alcohol-Acetona (decolorante)
Safranina o Fucsina (contracolor)
Cultivos bacterianos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus)
Bandejas de coloracin
4. MTODO
Prepare un extendido fino de una colonia bacteriana y dejarlo secar al aire. Utilice los
cultivos de Echerichia coli, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus.
Fije el material al porta objetos de modo que no sea arrastrado durante el proceso de
tincin, pasando el porta objetos 3 o 4 veces sobre la llama del mechero.
Coloque el preparado sobre un soporte de tincin y cubra la superficie con solucin de
cristal-violeta durante 1 minuto.
Luego lave bien con agua destilada.
Cubra el preparado con solucin de yodo (Lugol de Gram), durante 1 minuto.
Lave nuevamente con agua.
Sostenga el porta objetos con una pinza y bae la superficie con unas gotas del decolorante
(Alcohol-acetona), hasta no arrastrar ms colorante violeta (esto requiere habitualmente
unos 10 segundos o menos).
Lave nuevamente con agua corriente y coloque el porta-objetos nuevamente sobre el
soporte, cubra la superficie con safranina o fucshina, durante 30 seg.; lave con agua
corriente (Cuadro 1).
Examine el preparado al microscopio, las bacterias Gram positivas se observan de color
violeta y las Gram negativas rojo o rosadas.
6
Cuadro 1. Procedimiento de la coloracin de Gram
PASO TIEMPO RESULTADOS
GRAM + GRAM -
Colorante Bsico Cristal Violeta 1 minuto Se tien de Se tien de
violeta violeta
Mordiente Lugol 1 minuto Siguen Violeta Siguen Violeta
Decoloracin Alcohol-Acetona 10 seg. Permanecen Se decoloran
violeta
Contraste Safranina 30 seg. Permanecen Se tien rosado
violeta
B. COLORACIN DE CPSULA (mtodo de Anthony)
Prepare un extendido fino y uniforme de Klebisella pneumoniae; extindalo con un porta-

objetos en ngulo recto.
Seque al aire. No exponga al calor.
Adicione solucin acuosa de cristal violeta al 1%, durante 2 minutos.
Lave con solucin de sulfato de cobre al 20%.
Deje secar al aire en posicin vertical y observe al microscopio.
Las clulas se tien de color prpura intenso y la cpsula aparece sin colorear en el borde externo
de la clula
C. COLORACIN DE ESPORAS
Realice un extendido de una colonia bacteriana tomada de un cultivo con Bacillus cereus.
Cubra el portaobjetos con una tira de papel filtro.
Bae todo el portaobjetos con solucin acuosa de Verde Malaquita al 5%.
Caliente al vapor durante 3 a 6 minutos sin dejar secar.
Lave con agua
Contra colorear con solucin de Safranina al 0.5 % durante 30 segundos.
Observe las esporas, estas se ven en forma de esfrulas verdes al interior de las clulas
bacterianas coloreadas de rojo, o junto con desechos de color rojo.
D. PRUEBA DE MOVILIDAD
Coloque una gota de agua sobre una lmina portaobjetos.

Suavemente tome con un asa previamente esterilizada un poco de muestra de cultivo
bacteriano.
Coloque suavemente el asa sobre la gota de agua teniendo cuidado de NO esparcir la gota
sobre toda la lmina.
Coloque la lmina cubre objetos sobre la gota y observe al microscopio.
4. PREGUNTAS
1. Explique qu es un colorante fluorescente y para qu sirve.
2. Explique qu es una tincin filogentica y su utilidad
7
3. Porque las esporas son ms difciles de teir que una clula vegetativa?
4. Cmo se correlaciona la presencia de la capsula con la virulencia de una bacteria patognica?
5. Explique un mtodo por el cual se puedan obtener muestras de pared celular para analizar su
composicin qumica.
RESULTADOS
Preparacin de extendidos y coloraciones diferenciales.
Nombre:____________________________________________Cdigo:____________
Microorganismo Tcnica Colorantes Esquemas y Observaciones
8
PRACTICA No. 3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
1. INRODUCCIN
Los microorganismos tienen alta capacidad para crecer y adaptarse a sustratos de variada
composicin. Su estudio ha sido posible gracias a la implementacin de los medios de cultivo, los
cuales le suministran al organismo los elementos necesarios para su crecimiento. Los medios de
cultivo son preparaciones utilizadas para muchos propsitos como: aislamiento e identificacin de
microorganismos, anlisis ambientales, anlisis de alimentos y prueba de sensibilidad a los
antibiticos.
Cuidado y recomendaciones. Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus

componentes o segn las recomendaciones del fabricante, cuando este se consigue comercialmente
hay varias reglas que se deben guardar para asegurar la buena calidad del medio preparado.
El agua utilizada debe ser destilada, bidestilada o desmineralizada, proveniente de un sistema
adecuado de destilacin; su medida debe ser exacta y en ningn momento con aproximaciones que
generalmente se traducen en una alteracin de la consistencia del medio, especialmente cuando se
trata de agares.
Si los ingredientes necesarios para preparar el medio de cultivo son deshidratados deben
permanecer en remojo durante 15 minutos, con la finalidad de permitir una hidratacin total de las
molculas, lo cual evita el calentamiento excesivo que conduce generalmente a evaporacin y
descomposicin del medio.
Antes de someterse a la accin del autoclave, el medio debe estar completamente disuelto. No
disolverlo con la temperatura del autoclave, pues generalmente el exceso de calor produce un medio
con grumos debido a una deficiente disolucin.
Los medios de cultivo que contienen yema de huevo, carbohidratos, urea o cualquier nutriente, no
pueden ser esterilizados en autoclave, estos medios se preparan esterilizando por separado lo que
conocemos como base (se esteriliza en autoclave) y los suplementos por filtracin o vapor fluente;
la mezcla de los componentes se realiza cuando la base se ha enfriado entre 45 y 50 C.
Todos los medios de cultivo despus de preparados y vertidos en la caja de petri estriles, deben
secarse, con la finalidad de eliminar el exceso de agua que queda en la superficie para evitar la
coalescencia y mezcla de las colonias cuando se hace la siembra. El secado de la superficie tambin
previene la contaminacin; se lleva a cabo en la estufa incubadora a 37C durante 20 minutos
aproximadamente, quitando la tapa de la caja y colocando el medio con la superficie hacia abajo.
Despus del secado las cajas se pueden guardar en refrigeracin envueltas en bolsas plsticas hasta
por tres meses, dependiendo del medio de cultivo. Los medios que contienen antibiticos deben
utilizarse en corto tiempo.
2. OBJETIVO
Aplicar tcnicas para la preparacin de los medios de cultivo y reconocer la importancia de sus
componentes para el crecimiento bacteriano.
3. MATERIALES
Frasco con agar nutritivo

Frasco con caldo nutritivo
Probeta de 100 mL
9
Balanza
Plancha de agitacin y magneto
Autoclave
Esptula
Papel aluminio
1 Erlenmeyer de 200 mL
Guantes de proteccin para calor
Pipeta de 10 mL
Pipeteador
3 cajas de petri vacas
8 tubos de ensayo con tapa
4. MTODOS
Preparacin de medios slidos.
Tome el frasco de agar nutritivo y efecte los clculos correspondientes para preparar 80
mL, segn las instrucciones de la etiqueta del frasco.
Lleve la preparacin a una plancha de agitacin, regule la temperatura y agitacin para
diluir la mezcla y deje calentar hasta que la solucin se torne traslucida.
Inmediatamente, baje el Erlenmeyer de la plancha y deje reposar unos cinco minutos. Use
guantes de proteccin para calor.
Distribuya la preparacin de la siguiente manera:
7 mL en un tubo de ensayo
3 mL en un segundo tubo de ensayo
70 mL en un Erlenmeyer de 200 mL
Lleve las preparaciones al autoclave y esterilice a 15 lps y 121C, durante 15 minutos.
Despus de la esterilizacin, deje enfriar hasta aproximadamente 50C y vierta el contenido
del Erlenmeyer en tres cajas de petri (15 mL en cada una).
Coloque el Erlenmeyer con la cantidad sobrante en un bao mara a 45C, para garantizar
que no se solidifique. Este ser usado en la prctica siguiente.
El tubo de 7 mL, djelo solidificar en forma inclinada y el tubo de 3 ml djelo solidificar en
forma vertical en la gradilla, rotule y guarde en la nevera.
Preparacin de medios lquidos.
Tome el frasco de caldo nutritivo y efecte los clculos correspondientes para preparar 30 mL,
segn las instrucciones de la etiqueta del frasco.
Disuelva en la plancha de agitacin o con la ayuda de una varilla de agitacin. Este medio no es
necesario calentarlo
Vierta porciones de aproximadamente 5 mL en 6 tubos de ensayo, rotule, esterilice en autoclave y
deje enfriar, luego guarde en la nevera.
Estos medios se guardarn para ser empleados en la siguiente prctica.
10
5. PREGUNTAS
Investigue como se clasifican los medios de cultivo

Cules son los nutrientes esenciales para el aislamiento de un microorganismo heterotrfo y de uno
quimiohetertrofo.
11
PRCTICA No. 4. MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS
1. INTRODUCCIN
Existen tcnicas de siembra universales bsicas para el aislamiento de los microorganismos en el

laboratorio, entre las ms usadas se encuentran la siembra por agotameinto y por estras, la siembra
en profundidad, siembra por puncin y siembra por dilucin, importantes cuando se trata de estimar
el crecimiento de un microorganismo o simplemente de aislarlo y conservarlo.
La observacin e interpretacin de los cultivos despus de la incubacin es el paso definitivo en la

decisin de continuar o no con la identificacin de los microorganismos aislados. La decisin se
basa en la observacin de las caractersticas del crecimiento y nmero de cada tipo de colonia,
grado de pureza, coloracin de Gram y los cambios en el medio de cultivo que rodea la colonia, los
cuales reflejan la actividad metablica del microorganismo aislado, elemento importante en la
identificacin.
2. OBJETIVO
Aplicar los mtodos bacteriolgicos ms usuales para el crecimiento y aislamiento de

microorganismos.
3. MATERIALES
1 Tubo con agar nutritivo inclinado.

1 tubo de ensayo con agar nutritivo en columna
1 tubo con caldo nutritivo.
3 cajas de Petri con agar nutritivo.
1 caja de petri vaca y estril.
1 Erlenmeyer con 20 mL agar nutritivo fundido y enfriado a 45 C.
.
1 tubo con 9.9 mL de Agua peptonada.
4. MTODOS
SIEMBRA Y CARACTERIZACION DE CULTIVOS BACTERIANOS
Escoja uno de los cultivos bacterianos suministrados: Proteus sp, E. coli, B. cereus,
Salmonella, S. aureus, Pseudomonas sp, o Klebsiella sp
Esterilice el asa en la llama del mechero calentndola completamente hasta el rojo.
Destape el tubo con agar inclinado y flamee la boca del tubo
Con el asa previamente esterilizada tome una muestra del cultivo bacteriano y esprzalo en
lnea recta sobre la superficie del medio.
Flamee nuevamente la boca del tubo y tapelo, esterilice nuevamente el asa.
Repita el anterior procedimiento, utilizando el tubo con agar nutritivo en columna.
Inocule de manera similar el microorganismo escogido en el tubo con caldo nutritivo,
agitando bien el asa dentro del caldo.
Luego siembre mediante el mtodo de agotamiento (Fig. 1), que consiste en tomar una
12
muestra del cultivo bacteriano y con el asa rayar suavemente de manera horizontal la
superficie del agar, contenido en una caja de Petri haciendo rayados suaves, de un extremo
a otro de la caja. Tape y esterilice el asa nuevamente.
Rotule adecuadamente cada uno de los tubos de ensayo y la caja de Petri, proceda a incubar
a 35C, por 18 - 24 horas.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
a. Siembra por estras
Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada tome una muestra de un tubo que
contiene un cultivo bacteriano mixto, siembre por estras sobre un extremo de una caja de
Petri con agar nutritivo, y flamee el asa nuevamente.
Gire la caja 90 y con el asa esparza el cultivo hacia el siguiente extremo de la caja,
realizando rayados suaves en forma horizontal (formando estras); contine el aislamiento
realizando el mismo procedimiento en los dos extremos restantes de la caja. En el ltimo
extremo, cuando est realizando la estriacin tenga cuidado de no tocar con el asa el primer
rayado que realiz (Fig. 3). Debe esterilizar el asa cada vez que cambia de extremo en la
caja, para garantizar el aislamiento.
b. Siembra en superficie por perlas de vidrio

Coloque 100 l del cultivo bacteriano mixto en la superficie de una caja de Petri con agar
nutritivo
Adicione 6-8 perlas de vidrio estriles y realice movimientos suaves en varias direcciones.
Descarte las perlas en el recipiente indicado. Incube a 35C durante 24 horas.
c. Siembra en profundidad (vertido en placa)

Tome 0.01 mL del cultivo mixto y transfiralos a un tubo con 9.99 mL de agua peptonada.
Tome 100 L de la dilucin anterior y depostelos en el centro de una caja de Petri estril
vaca.
Tome el Erlemeyer con el medio de cultivo fundido (45C) y virtalo en la caja de Petri,
homogenice rpidamente por movimientos giratorios horizontales en varias direcciones,
teniendo cuidado de no formar burbujas (Fig. 4). Deje solidificar e incube en posicin
invertida.
Rotule adecuadamente cada una de las cajas de Petri, proceda a incubar a 35C, por 18 - 24
horas.
Haga observaciones y esquemas, describa como crece el microorganismo estudiado, aydese

con las figuras anexas.
13
a b
Figura 3. Mtodos de siembra. Siembra por agotamiento (a). Siembra por estras (b)
Figura 3. Siembra en profundidad
Figura 3. Siembra en profundidad
Figura 4. Siembra en profundidad (Vertido en placa).
14
PRCTICA No. 5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
1. INTRODUCCIN
En mltiples enfermedades infecciosas se requiere aislar el agente causal, probar su sensibilidad

frente a varios antibiticos, interpretar correctamente los resultados para posteriormente, emplear el
ms adecuado.
Las tcnicas para la determinacin de la susceptibilidad son: Dilucin y Difusin
Tcnica de dilucin. Se basa en la realizacin de una serie de diluciones del antibitico frente a una
concentracin determinada del microorganismo. Esta tcnica determina la concentracin del
antimicrobiano requerida para inhibir el crecimiento bacteriano (concentracin mnima inhibitoria,
CMI) y se expresa usualmente en microgramos por mililitro (g/mL). Esta tcnica puede realizarse
en agar o en caldo (en tubo o en microplacas).
Tcnica de difusin en agar (Mtodo de Kirby Bauer). Se basa en la utilizacin de discos
impregnados con una concentracin de antimicrobiano determinada que se coloca sobre la
superficie del agar que presenta una siembra del microorganismo en estudio pero con una
concentracin bacteriana conocida (1 x 10 8 UFC/mL). Como medio de cultivo se utiliza el Agar
Mueller-Hinton y ocasionalmente agar sangre.
La preparacin se incuba por un periodo determinado durante el cual el antibitico se difunde
dentro del agar. El dimetro de cada zona debe ser medido e interpretado de acuerdo a estndares
internacionales previamente establecidos. En una sola caja de petri se puede estudiar varios
antibiticos simultneamente. La preparacin del inoculo debe tener la turbidez similar al tubo 0.5
de la escala de Mac Farland. Los halos de inhibicin se miden con una regla y se reportan en mm.
Prueba de Epsilon o E-test. Se basa en la utilizacin de una tirilla de plstico que conlleva un
gradiente de concentraciones del antimicrobiano. Una vez colocada la tira sobre el agar el
antimicrobiano comienza a difundir y produce resultados tanto cualitativos como cuantitativos de la
susceptibilidad del microorganismo frente al agente probado. Es decir permite cuantificar la CMI.
2. OBJETIVOS
Conocer las tcnicas implementadas para la realizacin del antibiograma.

Aprender a interpretar los resultados obtenidos en un antibiograma.
3. MATERIALES
Diluciones seriadas de una suspensin bacteriana

2 Cajas de Medio Mueller Hinton
Asas bacteriolgicas
Cultivo de microorganismos Gram positivos en cajas de agar sangre
Cultivo de microorganismos Gram negativos en cajas de agar sangre
Reglas para medicin de los halos
Hisopos o escobillones estriles
Tubos de vidrio estriles (pueden ser de la medida de los tapa roja) con solucin salina
estril.
Dos discos de antibiticos por cada microorganismo
Escala de Mc Farland 0,5
Antibiograma demostrativo en Mueller Hinton con discos de sensibilidad
Pinza estril tipo depilador para tomar los discos
15
4. MTODOS
Tomar dos a tres colonias de cada uno de los cultivos bacterianos Gram positivos y
Gram negativos.
Inocularlos en los tubos estriles que contienen solucin salina estril
Introducir e impregnar el hisopo estril en la solucin salina con colonias de bacterias.
Escurrir el hisopo en las paredes del tubo al momento de sacarlo de all
Sembrar por el mtodo de siembra en cuadricula masivamente por todo el medio de
cultivo Mueller Hinton.
Colocar con una pinza, uno a uno los discos de sensibilidad, a una distancia de 40 mm,
entre cada uno de ellos.
Incubar a 37 C por 24 horas
Despus del perodo de incubacin mida el tamao de los halos de inhibicin, que corresponden a la
zona traslucida que se observa alrededor de los discos de antibiticos, segn se observa en la Fig. 5.
Figura 5. Esquema representativo de una caja de Petri con los discos de antibitico y
el halo de inhibicin
Se describe a los antimicrobianos como SENSIBLE, INTERMEDIO O RESISTENTE,

dependiendo de los estndares internacionales descritos para cada antimicrobiano sobre cada
bacteria.
ACTIVIDAD DE LA PRCTICA
DESARROLLAR LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES DURANTE A LA PRCTICA

1. Grafique la tcnica que se llev a cabo en el laboratorio
2. Interprete los resultados de la actividad demostrativa:

Tipo de microorganismo:
Discos utilizados:
Interpretacin:
Mtodo:
16
PRCTICA No. 6. METABOLISMO MICROBIANO: PRUEBAS BIOQUMICAS
1. INTRODUCCIN
El metabolismo microbiano se define como el conjunto de reacciones qumicas que desarrolla una
clula para su funcionamiento. Las reacciones metablicas pueden ser de dos tipos: catablicas
cuando descomponen un sustrato y anablicas cuando forman algunos compuestos a partir de
elementos ms simples. Estas reacciones se realizan gracias a la presencia de enzimas que pueden
ser intracelulares o extracelulares.
El nmero y la clase de enzimas bacterianas son diferentes, debido a que cada enzima est bajo un
control gentico, por lo cual se dan variaciones en la utilizacin de los sustratos. Estas variaciones
se utilizan a su vez para ayudar a caracterizar diferentes gneros y especies bacterianas.
En esta prctica se trabajar con bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Esta familia est
compuesta por bacilos Gram negativos y Gram positivos, de tamao mediano, anaerobios
facultativos, mviles o inmviles y no esporulados. Este grupo de bacterias crece bien en medios
artificiales, tienen necesidades nutritivas simples, fermentan la glucosa con produccin de cido
y/o gas, reducen los nitratos a nitritos y son oxidasa-variables.
Las Enterobacterias son organismos ubicuos de distribucin mundial, se encuentran en el suelo, el

agua, la vegetacin y forman parte de la flora bacteriana normal de casi todos los animales incluido
el ser humano. Algunos miembros de esta familia se encuentran asociados a cuadros disentricos,
mientras que otros pueden producir infecciones oportunistas, las cuales pueden afectar a casi todas
las partes del cuerpo.
2. OBJETIVOS
Diferenciar la actividad bioqumica de las bacterias mediante la utilizacin de diferentes

medios de cultivo
Analizar las pruebas bioqumicas utilizadas y con base en los resultados, realizar la
caracterizacin de las bacterias
3. MATERIALES
Cepas de Enterobacterias en agar MacConkey

Medios de cultivo para pruebas bioqumicas.
Asa de punta y de argolla
Mechero
4. MTODOS
El laboratorio suministrar a cada grupo de estudiantes, cultivos con las cepas de

Enterobacterias, sembradas en agar MacConkey. Observe la morfologa, tamao, aspecto y
color de las colonias. El color rojo o rosado indica fermentacin de la lactosa.
Tome una de las colonias aisladas, en el agar Mc Conkey y con el asa recta siembre por
puncin hasta el fondo del tubo y contine por estra en la superficie en los tubos con: TSI
(Agar hierro tres azcares) y Lisina decarboxilasa. Incube a 37C por 18 - 24 h.
17
Tome una sola colonia con el asa recta y siembre por puncin un tubo con medio SIM
(Sulfuro Indol Motilidad), tenga cuidado de sacar el asa por el mismo sitio de entrada.
Incube a 37C por 18 - 24 h.
Contine la siembra, tomando una sola colonia del cultivo puro y siembre solo en la
superficie inclinada de los tubos con Agar Cirato de Simmons y Agar urea de
Christensen. Incube a 37C por 18 - 24 h.
Luego tome una sola colonia con el asa de argolla y siembre dos tubos con caldo MRVP
(Rojo de metilo Voges Proscauer). Incube a 37C por 24 - 48 h.
El agar TSI, contiene glucosa, sacarosa y lactosa. Adems rojo de fenol, como indicador de pH y
sulfato ferroso, para demostrar la produccin de H2S, para intrpretar los resultados en este medio
emplee el cuadro 2.
Cuadro 2 Interpretacin de resultados en agar TSI.
Reaccin Interpretacin
Fondo cido* superficie inclinada alcalina Fermentacin a glucosa (K/A)
Todo el medio cido* Fermentador de glucosa, lactosa (A/A)
Burbujas Aergenos
Ennegrecimiento del fondo H2S
Medio alcalino** No fermentador de azcar (K/K)
** alcalino rojo *Acido-Amarillo
Lisina decarboxilasa: La decarboxilacin es el proceso por el cual las bacterias que poseen la
enzima decarboxilasa especfica son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo carboxilo (-
COOH), dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico.
La prueba es positiva cuando hay cambio de color del prpura a amarillo apagado (producido por la
cadaverina); la prueba es negativa cuando no hay cambio de color.
Prueba de Indol y movilidad: La movilidad se observa en el medio SIM por turbidez formada
alrededor de la de la lnea de inoculacin.
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa, son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano
con la produccin de indol, cido pirvico y amonio. Reaccionar que se observa despus de la
incubacin por 18-24 horas, para su interpretacin adicione 2 a 3 gotas del reactivo de Kovacs a los
tubos con medio SIM, la presencia de indol se destaca por la formacin de un anillo rojizo en la
superficie del tubo.
Adicionalmente, algunos microorganismos producen ennegrecimiento del medio por formacin de
sulfuro de hidrogeno, a partir del tiosulfato presente en este medio de cultivo.
Citrato de Simmons: Contiene citrato como nica fuente de carbono y sales de amonio como
fuente de nitrgeno, no contiene aminocidos. Las bacterias que pueden utilizar el citrato tambin
extraen nitrgeno con la produccin de amonio que alcaliniza el medio de cultivo. El indicador de
pH es azul de bromotimol.
La prueba es positiva cuando se observa crecimiento con un color azul intenso. La prueba es
negativa cuando no se observa crecimiento ni cambio de color.
18
Urea de Christensen: Si la bacteria posee la enzima ureasa, hidroliza urea del medio liberando
amonio y CO2, el indicador utilizado es rojo de fenol.
La prueba es positiva cuando se observa cambio de color amarillo a rosado. La prueba es negativa
cuando no hay cambio de color.
Reaccin del rojo de Metilo: Algunas bacterias utilizan la glucosa con gran formacin de cido, de
forma que el valor del pH del medio desciende a menos de 4.4. Otras bacterias producen menos
cido, reduciendo en menor cantidad el pH del medio. Esta distincin puede hacerse a travs del
rojo de metilo, que presenta color amarillo por encima del pH 5.1 y color rojo cuando el pH
desciende a 4.4.
Despus del tiempo de incubacin, adicione 5 gotas de la solucin rojo de metilo, si se torna rojo, la
prueba ser positiva y si no cambia de color, ser negativa.
Ensayo de Voges Proscaver: A partir de la glucosa, numerosos microorganismos forman acetona

(acetilmetilcarbinol), 2,3 butanodiol diacetilo. La demostracin de estos productos metablicos se
lleva a cabo con los reactivos de OMEARA, mejorado por Levine y Col (1932) con sulfato de
cobre con el reactivo de BARRIT (1936).
Despus del tiempo de incubacin, adicione 1 mL de la solucin de sulfato de cobre. En caso
positivo se presenta un viraje a rojo despus de algunos minutos.
6. PREGUNTAS
Investigue la reaccin bioqumica que ocurre durante la degradacin de la urea, de produccin de

indol y de formacin de butanodiol.
Identifique las principales vas metablicas de las Enterobacterias que se lograron comprobar con
cada una de las pruebas bioqumicas realizadas en la prctica
19
PRCTICA No. 7. CARACTERIZACION BIOQUMICA DE Bacillus cereus
1. INTRODUCCION
Bacillus cereus es una bacteria aerbica facultativa, Gram positiva, formadora de endosporas
altamente resistentes. Puede ser encontrada comnmente en el suelo como bacteria antagnica de
hongos y bacterias patgenas a plantas, pero tambin puede ser causante de intoxicacin por el
consumo de alimentos contaminados. Los alimentos en los cuales se puede encontrar este bacilo,
son los cereales, pur de papas, verduras, carne picada, embutido de hgado, etc. Sin embargo, es un
microorganismo que por su plasticidad y alta resistencia a condiciones adversas, ha desarrollado
caractersticas que le han permitido destacarse en procesos de biorremediacin de contaminantes
como metales pesados y plaguicidas.
2. OBJETIVO
Realizar el diagnstico bacteriolgico de Bacillus cereus.
3. MATERIALES
Caja de petri con medio MYP (Manitol-Levadura-Peptona) selectivo para Bacillus cereus
Caja de petri con: Agar leche, Agar Almidn, Agar Gelatina.
Tubos de ensayo con Caldo Nitrato, Caldo Glucosa, Caldo Arabinosa y Caldo Xilosa
Solucin de Lugol
Reactivo de Griess.
Cloruro de Mercurio a 15 %.
4. MTODOS
Realice la caracterizacin morfolgica de Bacillus cereus
Con el asa previamente esterilizada al mechero, inocule una colonia de B. cereus formando
una lnea horizontal sobre Agar almidn sin tocar los bordes de la caja.
Repita el procedimiento anterior, sembrando una colonia sobre Agar leche y Agar Gelatina.
Incube a 35 C durante 48 horas. Ver Fig. 6.
Prueba de catalasa. Tome una asada de la bacteria y colquela en un portaobjetos limpio y
estril. Agregue 2 o 3 gotas de perxido de hidrgeno (H2O2) al 30% sobre la muestra.
Homogenice la muestra con un asa o palillo de madera. Si la prueba es positiva se formarn
burbujas inmediatamente.
Prueba de oxidasa. Tome una porcin de la bacteria y estrela sobre el borde de la tira con
BACTIDENT OXIDASA (para-amino-N- dimetil-anilina). Si se torna de color violeta la
reaccin ser positiva.
AGAR ALMIDN: Despus del tiempo de incubacin cubra la superficie del medio con solucin
de lugol, si no se ha producido la hidrlisis del almidn, se teir de azul. Las reas hidrolizadas
20
aparecern como zonas claras.
Figura 6. Siembra de colonia bacteriana para pruebas: agar almidn, agar leche y
agar gelatina.
AGAR GELATINA: Aada a la superficie con agar gelatina, 5 gotas de cloruro de mercurio al
15%, elimnelo despus de 5 minutos, lave con agua corriente. La reaccin es positiva cuando una
zona clara rodea la estra.
AGAR LECHE: Observe una zona clara que aparece alrededor del crecimiento, que indica
degradacin de la casena.
CALDO GLUCOSA, ARABINOSA Y XILOSA: Observe si hubo o no fermentacin, indicada por

un color rosado en el medio de cultivo, y si hubo o no produccin de gas, indicada por la aparicin
de burbujas en el caldo.
Glucosa + (sin gas)
Arabinosa ( - )
Xilosa ( - )
CALDO NITRATO: Aada al tubo tres gotas del reactivo de Griess. El color rojo indica prueba
positiva de reduccin de nitratos. Si no hay cambio de color la prueba es negativa.
6. PREGUNTAS
En que difiere la gelatina de la mayora de las dems protenas?

Diga cul es la ventaja de las enzimas hidrolticas como la AMILASA a nivel ecolgico en
ecosistemas terrestres?
21
PRACTICA No. 8. HONGOS: IDENTIFICACIN DE DIVERSOS GRUPOS
1. INTRODUCCIN
Los hongos son organismos con caractersticas particulares, las cuales permiten ubicarlos en un
reino separado, EL REINO FUNGI. Actualmente este reino est constituido por cinco phyla:
Phylum Chytridiomycota, Phylum Glomeromycota, Phylum Zygomycota, Phylum Ascomycota y
Phylum Basidiomycota. Las clulas fngicas son eucariotas, estn compuestas por una pared celular
que vara en composicin qumica de acuerdo al grupo taxonmico; algunos de estos constituyentes
son: - glucano y quitina.
Morfolgicamente las formas ms sencillas poseen un solo ncleo (levaduras) y las ms complejas
forman filamentos multinucleados y se denominan hongos filamentosos. Estos filamentos son
llamados hifas y son la unidad constituyente de su cuerpo o soma, la cual crece nicamente por su
pice y se ramifica peridicamente dando como resultado un conjunto de hifas denominada micelio.
Los hongos presentan diversas caractersticas nutritivas: parsitos, simbiticos o saprofitos cuando
requieren materiales orgnicos preformados que utilizan como fuente de energa y como esqueletos
carbonados para la sntesis celular.
Algunas caractersticas morfolgicas como el color y hbito de crecimiento se ven influenciadas por
el medio de cultivo utilizado. La mayora de las descripciones existentes se basan en las
observaciones obtenidas sobre Agar papa dextrosa o Agar Sabouraud.
Microscpicamente los hongos se pueden caracterizar de acuerdo a su organizacin celular y
estructuras presentes. Macroscpicamente se puede caracterizar la colonia de un hongo de acuerdo
a la textura, color presente en el verso y anverso de la colonia en un medio de cultivo. En el verso se
define como la altura del micelio y puede ser: algodonosa o area, granular o polvosa, afelpada y
glabra. En el anverso las colonias pueden ser lisas, rugosas o verrugosas.
Formas macroscpicas se encuentran en Ascomycota y Basidiomycota y hay estructuras
caractersticas para la identificacin de las especies.
2. OBJETIVOS
Reconocer las diferentes estructuras o cuerpos reproductivos de algunos hongos.

Conocer el protocolo general para la observacin e identificacin de hongos.
Aislar, sembrar y observar hongos presentes en diversos tejidos.
3. MATERIALES
Asas curvas y rectas

Cajas de petri con medios de cultivo especficos para el crecimiento de hongos
Cultivos de hongos diversos
Muestras de materiales afectados por hongos
Portaobjetos
Cubreobjetos
Azul de lactofenol o azul de algodn
22
Reactivo de Melzer
Frasco para descartar porta y cubreobjetos
Mechero
4. MTODOS
4.1 Descripcin e identificacin de caracteres macroscpicos de hongos.
Tome las diferentes cajas de cultivo y describa las caractersticas de la colonia en la superficie o en
el verso de cada colonia. Registre estas caractersticas en el cuadro que se suministra.
Realice una caracterizacin morfolgica de los hongos suministrados enfatizando en las

caractersticas de la superficie superior e inferior (Verso y anverso) de acuerdo a los siguientes
parmetros:
SUPERFICE SUPERIOR (VERSO)
- Algodonosa: Se caracteriza por un micelio areo, denso y muy alto, con aspecto de algodn
(Figura 7).
- Granular y/o polvosa: Se caracteriza por la facilidad con que se desmenuza y la excesiva
produccin de conidias. Con frecuencia estos dos trminos se intercambian, sin embargo la
textura granular es ms rugosa semejante al azcar granulado, mientras que la polvosa
parece harina o polvo (Figura 8).
- Afelpada: Se caracteriza por presentar un micelio areo bajo, con aspecto de felpa o
terciopelo (Figura 9a).
- Glabra o cerosa: No producen micelio areo, por lo tanto tiene una superficie pareja.
Generalmente se presentan en las colonias de levaduras (Figura 9b).
SUPERFICIE INFERIOR
- Rugosa: tiene pliegues irregulares que irradian el centro de cultivo.

- Verrugosa o cerebriforme: Posee una superficie delgada que semeja un cerebro.
- Topografa lisa: No posee irregularidades en su superficie.
4.2 Descripcin e identificacin de caracteres microscpicos de hongos.
Haga un montaje directo de micelio, para esto coloque una gota de azul de algodn con
lactofenol en un porta-objetos. Seguidamente, tome con el asa de punta recta estril una
porcin de micelio de la parte ms externa. Lleve la muestra sobre la gota azul de lactofenol.
Coloque el cubre-objetos y observe cada uno de los especmenes representativos para cada
Phylum al microscopio.
a. CHITRIDIOMYCOTA
Tome cajas de petri con colonias aisladas previamente, monte en una lmina y observe al
microscopio
.
23
b. ZIGOMYCOTA
Tome microcultivos preparados previamente de Rhizopus sp.; Mucor sp. Lleve la placa al
microscopio y observe estructuras sexuales y asexuales e hifas.
c. GLOMEROMYCOTA
Tome suelo de races previamente colectado, tamcelo y observe en vidrio reloj la forma, color y
ornamentacin de las esporas presentes.
d. ASCOMYCOTA
Tome microcultivos preparados previamente de diferentes cepas de hongos pertenecientes a este
grupo. Lleve cada placa al microscopio y observe estructuras asexuales (conidiforo,
conidiosporas, filides e hifas). Para observar estructuras sexuales (ascas, ascosporas), tome un
apotecio de un liquen indicado en la prctica, haga un corte transversal delgado. Observe algunas
levaduras.
e. BASIDIOMICOTA
Tome un cuerpo fructfero de un macrohongo indicado en la prctica, diferencie cada una de sus
partes, haga un corte transversal y observe basidios y basidiosporas.
Examine al microscpico y haga una identificacin del hongo. Tenga en cuenta que de acuerdo al
Phylum se deben buscar determinadas caractersticas o estructuras.
En la observacin se debe tener en cuenta:

El tipo de hifa (septada, aseptada, hialina, pigmentada)
Forma de la estructura reproductiva en estado anamrfico o telemrfico
En estado anamrfico se observa conidiforo, tipo de conidias, color, tamao, forma.
En la fase telemrfica se observan esporas, las cuales presentan forma, tamao, color
ornamentacin, que definen el gnero y/o la especie del hongo
4.3 Siembra de hongos en medio de cultivo

Con el asa para hongos, tome inculo de un cultivo puro de un hongo suministrado en la
prctica, fragmente y coloque en una caja con PDA (papa dextrosa agar). Incube a 28C
observe el crecimiento.
6. PREGUNTAS
En que difieren los hongos filamentosos de las levaduras?

Defina los siguientes trminos:
o Hifa, micelio, esporangios, gametangios, conidios, ascosporas, basidios,
endomicorrizas, ectomicorrizas.
En qu se diferencian los conidios de las ascosporas?
Describa las caractersticas distintivas de los Phylum Chytridiomycota, Zygomycota,
Ascomycota y Basidiomycota.
24
La mayora de los hongos pueden reproducirse tanto asexual como sexualmente. Cules
son las ventajas y desventajas de cada tipo de reproduccin?
Tabla sugerida para la descripcin de los hongos observados

ASPECTO MACROSCPICO ASPECTO MICROSCPICO ESQUEMA
Textura: Tipo de hifa:
Topografa: Tipo de conidia:
Color:
Figura 7. Textura algodosa
a b
. .
Figura 8. Textura granular (a) y textura polvosa (b).
25
a b
. .
Figura 9. Textura afelpada (a) y Textura glabra o cerosa (b)
26
PRCTICA No. 9. APLICACIONES BIOTECNOLGICAS: PREPARACIN DE

YOGURT
1. INTRODUCCIN
Las bacterias lcticas son un grupo de bacterias unidas por una amplia serie de caractersticas
morfolgicas, metablicas y fisiolgicas. Estn generalmente asociadas a la industria
agroalimentaria ya que son consideradas agentes de alteracin de las materias primas para la
obtencin de la calidad organolptica de los alimentos.
La produccin de yogurt es el resultado del desarrollo de determinados microorganismos que

modifican los componentes normales de la leche, donde la lactosa se transforma parcialmente en
cido lctico. Entre estos microorganismos se encuentran Lactobacillus bulgarus y Streptococcus
thermophilus. Estas bacterias soportan muy bien los medios cidos y cuando se cultivan
conjuntamente producen ms cido lctico que cuando crecen aislados.
2. OBJETIVO
Aprender la tcnica bsica de siembra de microorganismos en leche para la produccin de yogurt.

Caracterizar las bacterias que participan en la fabricacin de productos lcteos como el yogurth.
3. MATERIALES
Frascos con 250 mL de leche pasteurizada entera

2 Cajas de Petri con medio MRS
Balanza
Papel para pesar
Esptula
Azcar
Cepa madre (yogurt comercial)
Pipeta de 10 mL estril
pH-metro
Incubadora a 45 C
Becker de 100 mL
4. MTODOS
Tome el frasco con 250 mL de leche pasteurizada entera y calintelo a 45 C en incubadora, mida el
pH inicial.
Adicione 10 mL de la cepa madre (yogurt comercial) en una concentracin del 4%, Adicione 20g
de azcar.
Incube a 45 C durante 3 horas, midiendo el pH de la leche cada hora.
Deje en incubacin por 24 horas, mida nuevamente el pH.
Con un asa estril tome una muestra del yogurt y simbrela por estras en una caja de Petri con
medio MRS. Incube a 37C por 2-3 das.
Despus de observar el crecimiento, tome una colonia representativa y realice un extendido para
hacer coloracin de Gram.
Realice esquemas y describa las caractersticas macro y microscpicas de los microorganismos
observados.
27
5. PREGUNTAS
Cul es el pH ptimo de un yogurt de buena calidad?

Cules son los microorganismos que producen el yogurt, haga una breve caracterizacin de estos?
28
PRACTICA No. 10. ANALISIS MICROBIOLGICO DE SUELOS
1. INTRODUCCION
El suelo ha sido definido como la capa del planeta que provee el sustrato que hace posible la vida
vegetal y animal. Las caractersticas biolgicas del suelo varan segn su localizacin, clima
profundidad, propiedades fsicas, etc. La poblacin de bacterias del suelo sobrepasa los dems
grupos de microorganismos: hay varios millones por gramo; hay bacterias auttrofas, mesfilas,
termfilas, aerobias y anaerobias. Degradadoras de celulosa y oxidantes del azufre, fijadores de
nitrgeno, degradadoras de protenas, y otros tipos. Abundan los Actinomicetos de los gneros
Nocardia, Estreptomyces, Micromonosporas. Abundan los hongos que puedan degradar celulosa,
lignina y pectina.
2. OBJETIVOS
Determinar la abundancia de bacterias, hongos y actinomicetos presentes en una muestra de

suelo, mediante el mtodo de recuento estndar en placa.
Determinar el antagonismo que se presenta entre algunos microorganismos del suelo.
3. MATERIALES
Barreno estril
Balanza analtica y balanza gramera
Horno a 105 C
Vrtex
1 tamiz de 2 mm esterilizado
10 g de suelo tomado a 10, 20 y 30 cm. de profundidad
90 mL de solucin salina estril
1 tubo con 9.9 mL de solucin salina estril
2 tubos con 9.0 mL de solucin salina estril
6 cajas con agar para Actinomicetos
6 cajas con agar nutritivo
6 cajas con Agar PDA
1 caja de Agar nutritivo para la prueba de antagonismo
4 pipetas se 1.0 mL estriles
3 asas de vidrio estril
Esptula estril
Mechero y alcohol para manos
Solucin desinfectante para desecho de pipetas
Cucharas estriles
Bolsas plsticas estriles
Marcadores sharpie
Cinta de enmascarar
Papel aluminio estril
4. MTODOS
29
Toma de muestras del suelo

Demarquer el transecto o rea de toma de muestra, se hace una caracterizacin del terreno:
vegetacin dominante, pendiente, presencia de erosin, cultivos, estado de cultivo, o actividad sobre
el terreno, altura sobre el nivel del mar y si es posible, temperatura, as como la localizacin
geogrfica.
Proceda a tomar una muestra de suelo a una profundidad de 20 a 30 cm, con la ayuda de un barreno.
Deposite la muestra en una bolsa plstica nueva, cuidando de no crear anaerobiosis. La bolsa debe
rotularse con la fecha, el sitio, la hora y el nombre de quien tomo la muestra.
Transporte la muestra al laboratorio, y gurdela en la parte de abajo de la nevera para procesarla lo

ms pronto posible.
Preparacin de la muestra
Tamizar en condiciones de asepsia la muestra de suelo por tamiz de malla de 2 mm. Se determina la
humedad total del suelo para hacer la respectiva correccin a peso seco, de la siguiente manera: Se
seca un poco ms de 10 g de suelo a 105 C por 24 horas, posteriormente se deja reposar dentro de
un desecador y se vuelve a pesar hasta que el peso de la muestra se estabilice. Para el clculo de la
humedad utilice la siguiente frmula:
A. MTODO DE RECUENTO ESTNDAR EN PLACA
Preparacin de las diluciones

Pese 10 g de suelo, con correccin al peso seco (Se le suma el valor en g, correspondiente al
porcentaje de humedad)
Virtalos en un frasco con 90 mL de solucin salina estril. Agite vigorosamente por 30
min., esta es la dilucin 10-1
Realice la segunda dilucin tomando 0.1 mL de la primera dilucin y virtalos en otro tubo
con 9.9 mL de solucin salina estril, esta es la dilucin 10-3.
Tome ahora 1 mL de esta dilucin y virtalos en un tubo con 9.0 mL de solucin salina,
esta ser la dilucin 10-4.
Repita el procedimiento a partir de la ltima dilucin y prepare la dilucin 10 -5.
Recuento Total de bacterias aerobias, Actinomicetos y Mohos y Levaduras
Para el recuento de bacterias aerobias, siembre por duplicado, 0.1 mL de las diluciones 10-
3
a 10-5 en las cajas de Petri con Agar Nutritivo. Esparza rpidamente el inculo con asa de
vidrio. Incube a 28oC por 24-48 horas.
30
Para el recuento de Actinomicetos siembre 0.1 mL de las diluciones 10-2 a 10-4 en las cajas
de Petri con Agar para Actinomicetos. Esparza rpidamente el inculo con asa de vidrio.
Incube a 28oC por 5 a 7 das.
Para el recuento de Mohos y Levaduras siembre por duplicado, 0.1 mL de las diluciones
10-2 a 10-4 en las cajas de Petri Agar PDA (Papa Dextrosa Agar). Esparza rpidamente el
inculo con asa de vidrio. Incube a 28oC por 5 a 7 das.
B. PRUEBA DE ANTAGONISMO
Despus de las 24 horas de incubacin, escoja 3 colonias de bacterias distintas aisladas de su

muestra de suelo en agar nutritivo, rotule las colonias como A, B y C.
Con el asa tome muestra de cada una de las colonias seleccionadas y transfiralas a una caja de agar
nutritivo siguiendo el esquema de la Fig. 10.
Despus de 48 horas de incubacin, siembre el hongo Penicillium sp., el cual actuar como
microorganismo antagnico. Deje en incubacin a 28
C, por 5 das.
Figura 10. Esquema de siembra en caja de Petri para la prueba antagonismo
Para la interpretacin de resultados del recuento realizado por el mtodo de recuento estndar en
placa, siga las siguientes indicaciones:
Despus del perodo de incubacin respectivo para cada tipo de microorganismo, proceda a contar
el nmero total de colonias en cada dilucin y reporte los resultados como unidades formadoras de
colonia (UFC/g) de suelo seco. Para el reporte de sus resultados tenga en cuenta las
recomendaciones del documento que encontrar en:
https://campusvirtual.univalle.edu.co/moodle/pluginfile.php/1090342/mod_resource/content/1/Recu
ento%20en%20placa.pdf
Para la prueba de antagonismo, determine si se presenta o no inhibicin del crecimiento de alguno

de los microorganismos, lo cual indicar el antagonismo.
31
PRCTICA No. 11. ANALISIS BACTERILOGICO DE AGUAS
DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL MTODO DE

FILTRACIN POR MEMBRANA
1. INTRODUCCIN
La orientacin de estos anlisis se ha basado principalmente en el inters en los aspectos sanitarios.

No se conocen bien las bacterias cuyo medio propio es el agua, en parte porque es difcil que
muchas de ellas crezcan en medios de cultivo en laboratorio, pero hay muchas que se han
identificado como poblacin natural, entre las cuales encontramos Serratia, Pseudomonas, Sarcina,
Micrococcus y Caulobacterias.
Es necesario el anlisis bacteriolgico del agua para determinar su calidad para el consumo
humano, as como para controlar la eficacia de los sistemas de potabilizacin del agua y de las
piscinas de uso pblico. Como indicadores bacteriolgicos de la calidad del agua se han establecido
los coliformes totales y fecales, bacterias que en aguas se analizan por medio de la tcnica de
filtracin por membrana. En este mtodo una medida del volumen de agua es filtrado a travs de
una membrana que retiene las bacterias en su superficie por su tamao de poro (0.45 micras). La
membrana es luego incubada sobre un medio selectivo, que permite que las bacterias crezcan y
formen colonias. Este mtodo es recomendable para aguas claras y es adaptable a aguas con altas
turbiedades cuando se hacen diluciones apropiadas de la muestra.
2. OBJETIVO
Determinar el nmero de coliformes totales y fecales en una muestra de agua, por el mtodo de
filtracin por membrana
3. MATERIALES
1 Frascos estriles para toma de muestras

3 Frascos para agua de dilucin
3 cajas de Petri pequeas con medio chromocult
1 Pinza estril
1 Probeta estril de 100 mL
Agua destilada estril en Erlenmeyers de 500 mL
3 Filtros de membrana de 0.45 micras
3 Pipetas estriles Mechero
4. MTODOS
Preparacin de las diluciones
Es necesario realizar diluciones para las aguas no potables y para aquellas que tienen una alta
turbiedad y contaminacin ya que al sembrarlas directamente no permiten un recuento apropiado,
puesto que se recomienda que el crecimiento por caja est entre 20 y 200 colonias, para hacer el
recuento.
a. Para agua cruda
32
Tome aspticamente 20 mL de la muestra y llvelos a un frasco que contiene 180 mL de

agua de dilucin (agua peptonada estril). Mrquelo como dilucin 10 -1.
Luego, tome aspticamente 20 mL de la dilucin 10 -1 y llvelos a un frasco que contiene
180 mL de agua de dilucin (agua peptonada estril). Mrquelo como dilucin 10 -2.
Finalmente, tome aspticamente 20 mL de la dilucin 10-2 y llvelos a un frasco que
contiene 180 mL de agua de dilucin (agua peptonada estril). Mrquelo como dilucin 10 -
3
.
b. Para agua potable y agua de piscina

Las muestras de agua potable y agua de piscina no requieren la preparacin de diluciones.
100 mL, por duplicado.
Filtracin y siembra
Proceda a ensamblar el embudo de filtracin sobre el Erlenmeyer con desprendimiento

lateral. Coloque la membrana de filtracin estril con la ayuda de una pinza estril.
Para agua potable y agua de piscina. Con una probeta estril mida 100 mL de la muestra
de agua y filtre. Lave el embudo con aproximadamente 50-70 mL de agua estril despus
de la filtracin y filtre nuevamente, con el objeto de dejarlo limpio el embudo para las
posteriores filtraciones.
Remueva el filtro con una pinza estril y colquelo sobre el medio contenido en la caja de
Petri. Rotule cada una de las cajas y coloque en la incubadora a 44.5oC por 24 horas.
Para agua cruda. Con una probeta estril mida 100 mL de la dilucin 10-3 y filtre. Lave el
embudo con aproximadamente 50-70 mL de agua estril despus de cada filtracin y filtre
nuevamente, con el objeto de dejarlo limpio para las posteriores filtraciones.
Remueva el filtro con una pinza estril y colquelo sobre el medio contenido en la caja de
petri. Rotule cada una de las cajas y coloque en la incubadora a 44.5 oC por 24 horas.
Haga lo mismo con la dilucin 10-2 y finalmente con la dilucin 10 -1. Incube a 44.5oC por
18-24 horas.
3. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Despus de la incubacin cuente las colonias para determinar la concentracin de

organismos en la muestra de agua original.
El nmero total de bacterias para una muestra de agua se expresa en Unidades Formadores
de Colonias UFC/100 mL, segn la siguiente frmula:
33
PRCTICA No. 12. ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS
1. INTRODUCCIN
La investigacin sobre los productos alimenticios o sus constituyentes requiere especial atencin
para detectar aquellos microorganismos que los deterioran o que son patgenos para el consumidor.
El examen microbiolgico permite obtener pautas para el establecimiento de normas de higiene
aplicables durante la produccin, y de mtodos eficaces de conservacin.
Microorganismos indicadores: Este trmino se aplica a cualquier grupo taxonmico, fisiolgico o

ecolgico de microorganismos cuya presencia proporcione evidencia indirecta de que los alimentos
estuvieron expuestos a condiciones que pudieron determinar la llegada de microorganismos
peligrosos o permitir la proliferacin de especies patgenas o toxignicas. Los organismos
patgenos son de gran utilidad tanto para determinar la calidad bacteriolgica de los alimentos
como la garanta que ofrecen al consumidor.
Escherichia coli y coliformes: Son organismos que habitan en el tracto digestivo de los hombres y
otros animales. Su presencia en un alimento indica contaminacin directa o indirecta de origen
fecal. La presencia de E. coli advierte el riesgo de que pudieran estar presentes bacterias patgenas
entricas, entre ellas algunas de los gneros Salmonella, Shigella y Vibrio; as como virus entricos
y parsitos diversos. Los otros coliformes (especies de varios gneros de la familia
Enterobacteriaceae), son buenos indicadores de limpieza y desinfeccin inadecuadas, o de una
manipulacin o tratamiento incorrecto de los alimentos. La presencia de niveles altos de coliformes
en un alimento tratado, no indica necesariamente un contacto inmediato con heces o con superficies
contaminadas con heces. Indica que pudieron existir circunstancias favorecedoras de la
multiplicacin de estos microorganismos introducidos probablemente por deficiente limpieza o
desinfeccin.
2. OBJETIVOS
Determinar la calidad de un producto alimenticio en trminos de contaminacin microbiana.

Establecer el nmero y tipo de microorganismos que se encuentran en distintos alimentos.
3. MATERIALES
6 Cajas de petri vacas esterilizadas. 6 Pipetas estriles de 5 mL

1 Frasco con 90 mL de agua peptonada. 1 Pipeta estril de 10 mL
6 Tubos de ensayo con 9 mL de agua peptonada. 1 Esptula
9 Tubos de ensayo con 10 mL de caldo Lauryl sulfato 1 Mechero.
60 ml de Agar base Ogye o Saboreaud fundido Papel para pesar estril
60 ml de Agar cuentagrmenes fundido 1 Stomacher
1Gradilla para tubos. Balanza
A las 24 48 h
2 Tubos con Caldo Brilla 1 Tubo con caldo triptona
1 Caja de agar EMB Reactivo de Kovac's.
1 asa 1 Mechero
34
4. MTODOS
DILUCION DE LA MUESTRA

Analice la muestra rpidamente despus de recogida o mantngala en refrigeracin hasta 24
horas despus de tomada.

Pese 10g del alimento a analizar, para alimentos lquidos o slidos blandos como las
verduras y las frutas, homogenice durante 30 seg. a 1 min, en un Stomacher. Para alimentos
como carnes, embutidos o harinas, homogenice por cinco minutos.
Para preparar la dilucin 10 -1, mida 10 mL o gramos de muestra en un frasco que contenga
90 ml de diluyente (agua peptonada).
Para obtener la dilucin 10-2, Transfiera 1 ml de la dilucin 10-1 a un tubo que contenga 9
mL de diluyente y as sucesivamente prepare diluciones hasta 10-6. Cada dilucin sucesiva
disminuir 10 veces la concentracin.
Recuerde marcar convenientemente los tubos.
INOCULACION DEL ALIMENTO
A. Nmero ms probable de coliformes totales y fecales:
Prueba presuntiva para coliformes totales.

Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones (10 -1 a 10-6) en tubos con Caldo lauryl sulfato o
Caldo brilla, utilizando 3 tubos por dilucin. El instructor le indicar el nmero de
diluciones a sembrar, porque estas dependern de que tan contaminado se sospecha que est
el alimento a analizar.
Incubar los tubos a 37C por 24-48 horas.
Pasadas las 24-48 horas anotar los tubos que muestren turbiedad y produccin de gas, esta
ltima puede observar por el desplazamiento del tubo de Durham.
Prueba confirmativa para coliformes totales.

Confirmar que los tubos con produccin de gas en la prueba presuntiva son positivos,
inoculando 3 a 5 gotas en otros tubos con caldo brilla y en otro tubo con Caldo triptona.
Incube los tubos a 44.5 C por 24 horas en bao mara (Ver Figura 11).
Pasadas las 24 horas anotar los tubos que muestren turbiedad y produccin de gas.
Revelar el Caldo triptona adicionando 3 a 5 gotas del reactivo de Kovac's, agitar
suavemente y observar la presencia de un anillo rojo en la superficie, cuando la reaccin es
positiva para la formacin de indol, cuando es negativa no se observa cambio.
Interpretacin de los resultados.

Leer la tabla del NMP (Nmero Ms Probable), del cuadro 3, para calcular el resultado de
acuerdo con el nmero de tubos positivos, para los coliformes totales, segn el resultado de
la prueba confirmativa y para los fecales, segn el caldo brilla y el caldo triptona incubados
a 44.5 C.
35
Figura 11. Mtodo del NMP de coliformes totales, fecales y determinacin de E. coli
Determinacin de E. Coli.
A partir del tubo positivo de la prueba confirmativa en el caldo brilla incubado a 44.5 oC,
sembrar por estra, tomando una asada del tubo en la superficie de una placa de agar EMB
(Eosina azul de metileno).
Incubar las cajas invertidas a 37C por 24-48 horas.
36
Pasado este tiempo hacer la lectura de las colonias tpicas de E. coli, aquellas que presentan
un brillo verde metlico.
En caso positivo, es necesario realizar las pruebas bioqumicas para identificacin de E. coli
B. Recuento de mesfilos por el mtodo de recuento estndar en placa
Su presencia puede reflejar deficiencias en el proceso de elaboracin y contaminacin en la

manipulacin durante el empaque.
Transferir 1 mL de cada una de las diluciones de la muestra del alimento (10 -1 a 10-6, o las
indicadas por el instructor) a cajas de Petri vacas estriles y previamente marcadas.
Inmediatamente adicione el agar cuenta grmenes fundido (aproximadamente 20 mL)
Mezclar el inculo con el medio fundido, moviendo suavemente la caja en forma circular.
Dejar solidificar el agar.
Invertir e incubar las cajas de petri a 37C durante 24 horas.
Pasado este tiempo, contar las colonias que hayan crecido en cajas que contengan entre 30 a
300 colonias. Siga las instrucciones dadas en:
https://campusvirtual.univalle.edu.co/moodle/pluginfile.php/1090342/mod_resource/con
tent/1/Recuento%20en%20placa.pdf.
Los resultados se deben expresar con 2 dgitos y el resto en potencia de 10.
Ej.: Si el recuento se realiza en una dilucin 10-2 y fue de 148 colonias, el tercer dgito por
ser mayor a 5 se aproxima al siguiente nmero, o sea que el recuento sera 150x102, se
expresa mejor como 15x103.
Si el recuento fue 234, por ser el tercer dgito menor que 5 se anula y se expresa: 230x102, o
mejor 23x103.
Cuando el recuento se utiliza para determinar la aceptacin de un alimento, se compara con
los valores lmites establecidos segn la normatividad del Ministerio de Salud, del INVIMA
o las Normas Icontec.
C. Recuento de hongos y levaduras
La presencia de hongos y levaduras en los alimentos, se da generalmente por contaminacin del aire
en el momento de empaque, por manipulacin de personas con lesiones en la piel ocasionadas por
hongos o por mal almacenamiento del producto. El procedimiento es el siguiente:
Transferir por duplicado alcuotas de 1 mL de cada una de las diluciones (10 -1 a 10-3) en
cajas de petri estriles previamente marcadas.
Inmediatamente adicionar el agar Ogye o Saboreaud fundido y mantenido a 45C, mezclar
suavemente.
Dejar solidificar.
Invertir e incubar las cajas a temperatura ambiente durante 5 a 8 das.
Se procede de aqu en adelante igual que el recuento de mesfilos.
37
Cuadro 3. Nmero Ms Probable (NMP) por g/mL de muestra, usando tres

tubos de 0.1, 0.01 y 0.001 g/mL
Numero de Tubos Numero de Tubos Numero de Tubos Numero de Tubos

positivos positivos positivos positivos
0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 NMP
NMP NMP NMP
0 0 0 3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23
0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95
0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 43
0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75
0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160
0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93
0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290
0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100
5. PREGUNTAS
Cul es el fundamento de las diferentes pruebas que se han realizado?.
Cules son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y porqu se utilizan?
38
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Alexopolus, C.J & C.W.Mims.1979 Introductory Micology. Third edition. Jhon Willey & Sons.
New York, p.632.
Alvarez,V. M.I.. Gua de Laboratorio de Micologa. 1996. Universidad del Valle. Facultad de
Salud. Departamento de Microbiologa. Seccin de Micologa.. Cali Colombia.
APHA, AWWA, WPCF. 1992. Mtodos Normalizados, para el anlisis de aguas potables y
residuales. Ediciones Daz de Santos, S.A. Madrid (Espaa).
Astudillo, M. Barona, G. Carmona, F. Daza, L.H. 1998. Manual de Bacteriologa Postgrado.
Universidad del Valle. Departamento de Microbiologa. Cali Colombia.
Bentez, N. 2002. Manual de laboratorio de Microbiologa. Universidad del Valle. Facultad de
Ciencias. Departamento de Biologa.
Deacon, J.W.1993. Introduccin a la micologa moderna. Ed Limusa. Mxico. D.F. 350 p.
Holgun, M.S. Higuera, I.M. Rubio, L.B. Vargas, M. Muoz, A.I. Daz, G. 1998. Manual de
Tcnicas de Anlisis para Control de Calidad Microbiolgico de alimentos para Consumo
Humano. Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. Divisin
Laboratorio de Alimentos y Bebidas Alcohlicas. Seccin de Microbiologa de Alimentos.
Santaf de Bogot, Colombia.
Margulis, L & Schwartz, K.V. 1998. Fivew Kingdoms.W.H.Freeman and Co EUA.
MERCK. 1994. Manual de Medios de Cultivos. Darmstadt, Alemania..
Pascual, Anderson. M. R, 1992. Microbiologa Alimentaria Metodologa Analtica para Alimentos y
Bebidas. Ediciones Daz de Santos S.A. Madrid. Espaa.
www. Micolog.com/chap 3b.htm
www.biology.iastate.edu/fungi/fungi/FungINDX.htm
https://campusvirtual.univalle.edu.co/moodle/pluginfile.php/1090342/mod_resource/content/1/Recu
ento%20en%20placa.pdf.
39

Guia de Practicas de Laboratorio Microbiologia 2017

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Guia de Practicas de Laboratorio Microbiologia 2017

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

A

CURSO DE MICROBIOLOGA GENERAL

NEYLA BENTEZ CAMPO Ph.D.

ANA CRISTINA BOLAOS Ph.D.

Santiago de Cali, febrero de 2017

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

Figura 1. Morfologa de las colonias bacterianas ........................................................................ 3

Cuadro 1. Procedimiento de la coloracin de Gram ................................................................... 7

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

Bata de laboratorio Encendedor

PRCTICA No. 1. UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS: PRESENCIA DE

La ubicuidad de los microorganismos se basa en tres caractersticas principales: su tamao pequeo,

5 Cajas de Petri con agar nutritivo Exuvias de insectos

a. Microorganismos presentes en el are

b. Microorganismos presentes en semillas

c. Microorganismos presentes en tejido vegetal

d. Microorganismos presentes en insectos

e. Microorganismos presentes en humanos

1. Explique cmo inciden los microorganismos del aire en el trabajo de laboratorio en

Figura 1. Morfologa de las colonias bacterianas

PRACTICA No. 2. PREPARACIN DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES

La determinacin de la morfologa en la identificacin de los microorganismos juega un papel

Lminas porta objetos.

Preparacin del extendido

Figura 2. Preparacin de extendidos y coloracin

II. COLORACIONES DIFERENCIALES

La diferencia en la reaccin de coloracin entre las positivas y las negativas se atribuye a la

Aplicar la tcnica de coloracin de Gram identificar formas y diferenciar grupos bacterianos.

Cuadro 1. Procedimiento de la coloracin de Gram

PASO TIEMPO RESULTADOS

B. COLORACIN DE CPSULA (mtodo de Anthony)

Prepare un extendido fino y uniforme de Klebisella pneumoniae; extindalo con un porta-

Coloque una gota de agua sobre una lmina portaobjetos.

Preparacin de extendidos y coloraciones diferenciales.

Microorganismo Tcnica Colorantes Esquemas y Observaciones

PRACTICA No. 3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Cuidado y recomendaciones. Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus

Frasco con agar nutritivo

Preparacin de medios slidos.

Preparacin de medios lquidos.

Estos medios se guardarn para ser empleados en la siguiente prctica.

Investigue como se clasifican los medios de cultivo

PRCTICA No. 4. MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE

Existen tcnicas de siembra universales bsicas para el aislamiento de los microorganismos en el

La observacin e interpretacin de los cultivos despus de la incubacin es el paso definitivo en la

Aplicar los mtodos bacteriolgicos ms usuales para el crecimiento y aislamiento de

1 Tubo con agar nutritivo inclinado.

SIEMBRA Y CARACTERIZACION DE CULTIVOS BACTERIANOS

a. Siembra por estras

b. Siembra en superficie por perlas de vidrio

c. Siembra en profundidad (vertido en placa)

Haga observaciones y esquemas, describa como crece el microorganismo estudiado, aydese

Figura 3. Siembra en profundidad

Figura 3. Siembra en profundidad

Figura 4. Siembra en profundidad (Vertido en placa).

PRCTICA No. 5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

En mltiples enfermedades infecciosas se requiere aislar el agente causal, probar su sensibilidad

Conocer las tcnicas implementadas para la realizacin del antibiograma.

Diluciones seriadas de una suspensin bacteriana

Se describe a los antimicrobianos como SENSIBLE, INTERMEDIO O RESISTENTE,

DESARROLLAR LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES DURANTE A LA PRCTICA

2. Interprete los resultados de la actividad demostrativa:

PRCTICA No. 6. METABOLISMO MICROBIANO: PRUEBAS BIOQUMICAS

Las Enterobacterias son organismos ubicuos de distribucin mundial, se encuentran en el suelo, el