Laboratorio 3 I

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ADN DE HOGOS Y SEPARACIN POR
ELECTROFORESIS.
LABORATORIO 3. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN DE HONGOS Y

SEPARACIN DE ADN POR ELECTROFORESIS HORIZONTAL EN GEL DE
AGAROSA
1
Jaimes Paula, 2Pineda Bryan, 3Porras Mailyn.
1
1610811, 21610864, 31610815
Universidad Francisco de Paula Santander
RESUMEN
El presente laboratorio se realiz en dos partes. En la primera se hizo la extraccin de ADN

para lo cual se requiri hacer una serie de etapas bsicas; en primer lugar se debe que romper la
pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. Despus debe
romperse igual la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el
ADN de enzimas que puedan disminuirlo y para aislarlo hay que hacer que se precipite en
alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y
precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol
separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa. En
la segunda parte se procedi a separar el ADN con electroforesis horizontal en gel de agarosa; los
geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin
de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao van a emigrar de forma
distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Adems, si en dicha electroforesis se aplican
marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamao conocido) se puede calcular el
tamao aproximado del DNA en estudio.
Palabras clave: Extraccin, DNA, Gel de agarosa, Electroforesis
INTRODUCCIN
El ADN constituye el material gentico de los organismos. Es el componente qumico

primario de los cromosomas y el material del que los genes estn formados. (Hombreiro Noriega
Luis. (2013). EL ADN de Locard Gentica forense y criminalstica. Fernndez de los Ros-
Madrid: Reus, S.A) El ADN no existe como molcula libre en las clulas, por el contrario se
encuentra asociado con las protenas y ARN. Es por esto, que los procesos de extraccin y
ELECTROFORESIS.
aislamiento de ADN de una clula y de otras molculas es el primer paso para muchos
procedimientos de laboratorio en biotecnologa, biologa molecular y gentica entre otras
ciencias. Estos procesos involucran generalmente, rompimiento de las clulas, desnaturalizacin
de protenas y la precipitacin del ADN como material fibroso.
El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula cargada bajo la
influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes biolgicamente (aminocidos,
pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en
solucin como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies
cargadas se van a separar en funcin de su carga cuando se aplica un voltaje a travs de los
electrodos .En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se
intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas
correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular. .
(Carmen Alicia Padilla Pea, Jess Diez Dapena, Emilia Martnez Galisteo, Jos Antonio
Brcena Ruiz, Concepcin Garca Alfonso. (2008). Electroforesis de cidos nucleicos en geles de
agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. 2006, de
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071).
Los geles con bajo contenido de agarosa permiten el fraccionamiento de molculas de DNA
relativamente grandes en distinto rangos de tamao. De esta manera, puede separarse DNA de
mayor tamao. (Pablo Baldi. Laura patricia Blumeti. Silvia Fernndez Castelo. (2004).
Biochemistry. Montevideo, Urugay: MEDICA PANAMERICANA S.A.)
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS

2 microtubos de 2ml Buffer de extraccin Incubadora
2 microtubos de 1ml Fenol/Cloroformo(1:1) Centrifuga
1 caja de Petri estril Isopropanol Vortex
1 Asa microbiolgica Etanol Rotor
Pistilos TE 1X Micropipetas
Bistur de diseccin
Puntas o tips
Tabla 1. Extraccin y purificacin del ADN de hongos
IMPLEMENTOS REACTIVOS EQUIPOS

ELECTROFORESIS.
Bata Buffer de carga: xilencianol, Cmara de electroforesis

azul de bromofenol y orange
Guantes Buffer de corrida: TBE 1X Fuente de poder
Tapabocas Agarosa Transiluminador
Gafas ADN extrado Micropipetas
Tips o puntas Bromuro de etidio
Tabla 2. Separacin de ADN por electroforesis horizontal en gel de agarosa
Figura 1. Extraccin y purificacin del ADN de hongos

Permite la disgregacin de la estructura
tisular y celular, para facilitar la salida de los HOMOGENIZACION
cidos nucleicos
Mtodos fsicos: hervido, congelacin-

descongelacin, choque osmtico.
Detergentes, como SDS
Enzimas, como la lisozima, proteinasa K
Permite la eliminacin progresiva de

SEPARACIN Y
protenas y otros contaminantes celulares,
PURIFICACIN
y la obtencin de un material gentico
cada vez ms limpio.
Fenol/Cloroformo: Fenol desnaturaliza las

protenas y componentes celulares y
cloroformo permite la separacin de fases
durante la centrifugacin
Separacin cromatografa
Permite la obtencin de un cido nucleico

listo para ser almacenado o diluido en la PRECIPITACIN
concentracin deseada para su anlisis
Etanol o Isopropanol
ELECTROFORESIS.
1. Se aaden 0.5 a 2.0g 1. Se adiciona un volumen de

de micelio en un fenol/cloroformo de (1:1) y se lleva a
microtubo de 2ml. centrifugar a 10000rpm durante 10
Aydandonos con una min
caja de petri para el
corte de micelio
2. Transferimos la fase acuosa a

otro microtubo.
PURIFICACIN DEL VIZUALIZACIN DEL
EXTRACCION DEL ADN
ADNADN Y ARN
a. Fase acuosa: ADN
2. Adicionamos un b. Fase intermedia: proteinas
volumen de 500l de c. Fase orgnica: residuos Electroforesis en
buffer de extraccin; se gel de agarosa al
macera la muestra con
el buffer de extraccin
0.7 % de 0.5 a 5
3. Agregamos un volumen de voltios por
Isopropanol/etanol de (1:1) y centimetro entre
centrifugamos a 10000 rpm los electrodos por
durante 10 min 20 min
3. Agitamos en vortex
por un minuto y 4. Se llev a 0C por 10 min;
centrifugamos a 6000 centrifugamos a 10000 rpm
rpm/ 10 min durante 10 min
5. Descargamos el etanol por

4. Sacamos el inmersin, asi mismo secamos
sobrenadante a un tubo el precipitado a 37C y se
para centrifuga de 1ml e resuspend en 50l de TE 1X
incubamos a 70C por pH=8 Y RNAsa
15 min
ELECTROFORESIS.
Separacin de ADN por electroforesis horizontal en gel de agarosa
PREPARACIN DE GEL DE AGAROSA AL 0.7%
1. En un Erlenmeyer adicionamos 0.28 gr de agarosa y se

disolvi en 40ml de buffer de corrida (TBE 1X),
calentamos en placa de calentamiento hasta que se
disolvi totalmente la agarosa
2. Se dej enfriar la solucin de agarosa hasta 65C;

seguidamente adicionamos con mucha precaucin
3l de bromuro de etidio y agitamos para
homogenizar
3. Colocamos los aseguradores y se verti la solucin

de agarosa en la cubeta de la cmara e introducimos
el peine para formar los pozos
4. Dejamos el gel en reposo por 20 min hasta que

solidific completamente y retiramos el peine
suavemente para no romper el gel ni los pozos
5. Colocamos la cubeta en la cmara de electroforesis

con el gel de agarosa; se adicion a la cmara el buffer
de corrida (TBE 1X) hasta que cubri completamente el
gel de agarosa
6. Antes de preparar las muestras para cargar en el gel,

definimos el orden de las muestras, utilizando el
formato que est ms adelante; se utiliz como
marcador el DNA del fago predigerido con la enzima de
restriccin Hind III
ELECTROFORESIS.
PREPARACIN DE LAS MUESTRAS
1. En un tubo para centrifuga adicionamos entre 1 y 2 l

de buffer de carga, segn el nmero de muestras.
Tomamos 8l de ADN extrado y mezclamos en el buffer
de carga.
2. Se Coloca un papel oscuro debajo de la camara

para facilitar su visualizacin al cargar el pozo
3. Se carga el ADN en el pozo, evitando que se salga de la

muestra con micropipeta de 20l y punta fina sin
incorporar aire a la punta. Se introduce la punta en el
centro del pozo y suavemente depositamos el volumen;
retiramos suavemente para dejarle espacio a la muestra.
Se repiti el proceso para cada muestra en un pozo
diferente y con punta nueva
VISUALIZACION DEL ADN
1. Verificamos que los cables estaban conectados

correctamente a la fuente de poder, e iniciamos con un
voltaje de 0.5 a 5 voltios por centmetro entre electrodo a
electrodo y luego ajustamos el voltaje para una apropiada
separacin. El tiempo de corrida est determinado por la
migracin de los colorantes el azul de bromofenol migra
con fragmentos de 300-500 pb y el xilencianol de 3-4 kpb.
La buena separacin se logra cuando los dos colorantes
dividen el gel en tres partes iguales
2. Al finalizar quitamos el suministro de corriente y se

retir con cuidado la cubeta con el gel, escurrimos un
poco sobre una servilleta. Y llevamos al transiluminador
de UV
ELECTROFORESIS.
RESULTADOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12 13
MUESTRA CULTIVO
1 Profesora Liliana Paecilomyces 1
2 Keyla Paecilomyces 2
3 Ginna Paecilomyces 1
4 Sandra Paecilomyces 2
5 Andrea Paecilomyces 1
6 Mairene Paecilomyces 2
7 Paula J Metarhizium 2
8 Bryan Metarhizium 1
9 Mailyn Paecilomyces 1
10 Rojo Paecilomyces 1
11 Samuel Paecilomyces 1
12 Luis Paecilomyces 2
13 Paula Paecilomyces 1
FORMATO DE GUIA CONTROL DE ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS.
Electroforesis No. 1 Fecha: 8 de abril del 2015
% de agarosa: Buffer de carga: Buffer de corrida: BrEt:

0.7% Mixto TBE 3l
Voltaje/Corriente inicial: 125V Tiempo: 10 min
Voltaje/Corriente final: 110V Tiempo de corrida: 30 min
CARRI MUESTRA FOTOGRAFA

L
1 P1 +
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2 P2 + 12 13
3 P1 +
4 P2 +
5 P1 -
6 P2 +
7 M2 +
8 M1 +
9 P1 +
10 P1 +
11 P1 +
12 P2 +
13 P1 +
Electroforesis grupo B
ELECTROFORESIS.
MUESTR CULTIVO
A
1 Isabel Metarhizium
2 Mayari Penicillium
3 Jhan Pablo Penicillium
4 Francisco Penicillium
5 Yesica Metarhizium
6 Zuky Metarhizium
7 Leidy Metarhizium
8 Alejandra Beauveria b.
9 Paola Penicillium
10 Paula Metarhizium
11 Luisa Beauveria b.
12 Angie Metarhizium
13 Jose Penicillium
FORMATO DE GUIA CONTROL DE ELECTROFORESIS
Electroforesis No. 1 Fecha: 8 de abril del 2015

% de agarosa: Buffer de carga: Mixto Buffer de corrida: TBE SYBR Green:
0.7% 3l
Voltaje/Corriente inicial: 125V Tiempo: 10 min
Voltaje/Corriente final: 110V Tiempo de corrida: 30 min
ELECTROFORESIS.
CARRI MUESTRA FOTOGRAFA

L
1 M-
2 P+
3 P +/-
4 P+
5 M-
6 M-
7 M-
8 B-
9 P+
10 M-
11 B-
12 M-
13 P+
CUESTIONARIO
a. Cul es la diferencia entre ADN genmico y ADN cromosmico?
El ADN genmico se localiza dentro del ncleo de la clula eucariota, en el cromosoma y

se denomina as al ADN extrado directamente de la clula o a la secuencia de ADN
cromosmico de un gen o un fragmento de este. Mientras que el ADN mitocondrial se encuentra
en el cromosoma de la mitocondria y el ADN plasmdico es el que forma los plsmidos, usados
principalmente en investigacin para la replicacin de genes. El ADN mitocondrial es muy
utilizado en filogentica.
b. Qu son las nucleasas?
Las fosfodiesterasas (PDE) o nucleasas son enzimas hidrolasas que pueden ser tanto
ribonucleasas (RNAasas) como desoxirribonucleasas (DNAasas), las primeras hidrolizan al RNA
y las segundas al DNA. Estas enzimas se encuentran en los lisosomas de las clulas y cuando se
requieren salen para actuar en la hidrlisis de los cidos nucleicos tanto de bacterias y virus
como de clulas daadas, envejecidas o aquellas que se estn multiplicando en forma
desordenada. Por lo tanto, participan en la limpieza celular del organismo. En los procesos de
tipo inflamatorio tambin son indispensables, porque actan sobre los cidos nucleicos de los
clulas muertas o en los leucocitos que se encuentran formando parte de los abscesos.
c. Qu son lisozima y mutanolisina?

ELECTROFORESIS.
La lisozima, tambin llamada muramidasa, es una enzima de 14,4 kilodalton que daa las
clulas bacterianas catalizando la hidrlisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de cido N-
acetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano.
La lisozima es una enzima presente en las lgrimas y la saliva en donde acta como una
barrera frente a las infecciones. Tambin es muy abundante en la clara del huevo, de donde se
extrae para su uso industrial, en particular para el control de las bacterias lcticas en los vinos.
La mutanolisina es una enzima especfica Gram positiva que hidroliza componentes de la

pared celular.
La mutanolisina es una enzima que hidroliza el peptidoglicano de la pared celular.
d. Qu papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extraccin y

purificacin?
Buffer TE
Es comnmente utilizado solucin tampn en la biologa molecular, especialmente en los
procedimientos que implican el ADN, ADNc o ARN. "TE" se deriva de sus componentes: Tris,
un tampn de pH comn, y EDTA, una molcula que quela cationes como Mg 2+. El propsito
de tampn TE es para solubilizar ADN o ARN, mientras que lo protege de la degradacin.
Fenol/cloroformo
Es ampliamente utilizado en biologa molecular para el aislamiento de ADN, ARN y
protenas.
Isopropanol
Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o
etanol.
Etanol
Los cidos nucleicos se precipitan aadiendo etanol, este limpia el ADN de otras
biomolculas por un proceso llamado "precipitacin". EN este proceso, el etanol hace que el
ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las molculas de agua que lo rodean, y lo asla
de la solucin acuosa para dejarlo libre de impurezas.
e. Describa cul es el objetivo de cada una de las siguientes etapas:
Macerado del hongo

El macerado del micelio del hongo nos ayuda a romper las membranas celular y hacer ms fcil
la extraccin, y obtener una pequea muestra.
ELECTROFORESIS.
En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extraccin, es necesario

degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los mtodos fsicos son los ms empleados,
especialmente la congelacin y la maceracin.
Adicion de buffer de extraccin

Es comnmente utilizado solucin tampn en la biologa molecular, especialmente en los
procedimientos que implican el ADN, ADNc o ARN. "TE" se deriva de sus componentes: Tris,
un tampn de pH comn, y EDTA, una molcula que quela cationes como Mg 2+. El propsito
de tampn TE es para solubilizar ADN o ARN, mientras que lo protege de la degradacin.
Adicion de fenol: cloroform

Se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las protenas del ADN como fenol y
cloroformo.
Precipitacin con etanol

El ADN es precipitado con alcohol y centrifugacin.
Limpia el ADN de otras biomolculas por un proceso llamado "precipitacin". EN este proceso,
el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las molculas de agua que
lo rodean, y lo asla de la solucin acuosa para dejarlo libre de impurezas
f. Mencione y explique otros mtodos de extraccin
1. Extraccin de ADN de hongos filamentosos
Disponer de micelio congelado a 80 C

Pesar 200-400 mg de micelio congelado
Sumergirlo en nitrgeno lquido unos minutos (cuando deja de hervir indica que est
congelado)
Introducir el micelio congelado en mortero de porcelana esterilizado.
Aadir un poco de nitrgeno
Triturar con pistilo esterilizado. Reponer el N evaporado (tras cada adicin hierve un
poquito; esperar a que deje de hervir)
Aadir HSE (1ml/100 mg de micelio). Mezclar poco a poco
Pasar la suspensin a un tubo falcn (sarstedt)
Enfriar en hielo
Aadir SDS (0.1 volumen de SDS 10%).
Homogeneizar la suspensin invirtiendo suavemente y alternativamente el tubo
Incubar a 65 grados durante 15 minutos
Aadir un volumen de TE concentrado (50mM Tris pH 8, EDTA 20mM pH 8). y volver
a agitar suavemente por inversin.
aadir fenol
ELECTROFORESIS.
Aadir la mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25/24/1) hasta obtener una fase

acuosa limpia.
Equilibrar los tubos. Centrifugar en fri tras cada extraccin (5000 rpm durante 5
minutos).
El ADN Se encuentra disuelto en la fase acuosa (la superior). La fase orgnica inferior es
de color amarillo debido a hidroquinoleina
La fase acuosa (la superior). Es menos densa que la fase orgnica, (cuando contiene
menos de 0,5 M de sales o 10% de sacarosa). Utilizar pipeta automtica.
Hacer una nueva extraccin de la fase orgnica interfase, agregando un volumen de
[TE] pH 8. Centrifugar (5 min, 5000 rpm.) Recuperar la fase acuosa y unirla a la
anterior.
Repetir la extraccin con fenol hasta que no se vea aire ocluido en la interfase.
Aadir un volumen de cloroformo. Mezclar suavemente. Centrifugar a 5000 rpm por 5
minutos, recuperar la fase acuosa con micropipeta usando puntas cortadas.
Aadir 0,2 volmenes de acetato sdico 3M pH 6,0. Mezclar
Aadir 0,6 volmenes de isopropanol. Mezclar muy suavemente. Dejar precipitar 1 hora
a temperatura ambiente
Centrifugar a 10000 rpm, 10 minutos en frio.
Lavar el precipitado con 500 ul de etanol 70%.
Centrifugar a 10000 rpm, 5 min.
Secar al vaci
Resuspender finalmente en 25ul, 50ul o 100 ul de H2O ultra pura estril.
Aadir 1 ul de RNAsa libre de DNAasas de una solucin madre 10 mg/ml. Incubar a
37C durante 30 min.
2. Extraccin de ADN de Cryptococcus spp.
Se emplean dos mtodos de extraccin por medio de ruptura fsica con perlas de vidrio de
acuerdo con el protocolo descrito por Daz. Brevemente, las cepas de Cryptococcus sp. fueron
sembradas en agar glucosado de Sabouraud durante 48 h, se agrega un tampn de extraccin y
una mezcla de fenolcloroformo-alcohol isoamlico (25:24:1). Se adicionan las perlas de vidrio
(Sigma, grosor 0,4-0,6 mm) y se mezcla en vrtex por 30 minutos; se realiza una segunda
extraccin con fenol-cloroformo-alcohol isoamlico y el ADN se precipita con etanol absoluto y
acetato de amonio; se lava con etanol al 70%, se resuspende en tampn TE y la concentracin del
ADN se mide por espectrofotometra en una absorbancia de 260 a 280 nm y se determina su
pureza teniendo en cuenta este valor; la pureza del ADN es ptima cuando la relacin entre la
A260/280 nm es mayor de 1,8 (13). En el otro mtodo de extraccin se emplea nitrgeno
lquido, segn el mtodo descrito por Meyer (19). El ADN extrado se amplifica mediante PCR.
ELECTROFORESIS.
ELECTROFORESIS
a. Qu funcin cumple el buffer de carga y que otros colorantes se utilizan como

buffers de carga?
Este buffer le da peso a la muestra para que el ADN se precipite al fondo de los pozos as como
indicar el corrimiento de cada muestra debido al colorante
b. Qu otras macromolculas se pueden separar por electroforesis en gel? Y que

polmero se usa para cada una.
cidos nucleicos
ADN y ARN (una sola cadena)
La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efecta en geles de agarosa.
Protenas
Las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos nucleicos, y por tanto sus
velocidades de migracin no son similares entre las protenas.
La electroforesis de protenas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE),
isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional.
c. Consulte los tipos de electroforesis que existen y sus aplicaciones.
Electroforesis de frente mvil

Las molculas estn presentes en toda la disolucin y su posicin se determina en funcin del
tiempo por la ptica de Schlieren- tcnica analtica utilizada para determinar el movimiento y
punto isoelctrico de protenas-. Debido a que la utilidad de la determinacin cuantitativa de la
movilidad es poco utilizada, este tipo de electroforesis tambin lo es.
Por ejemplo en protenas
Electroforesis Zonal
Son los ms comunes debido a su alta aplicabilidad en diferentes campos, con el fin de separar
mezclas complejas. La solucin a tratar se aplica en pequeas cantidades sobre un soporte slido
ELECTROFORESIS.
y homogneo, como papel o ciertos tipos de geles; se impregna con una solucin tampn. Los
soportes son generalmente polmeros o un gel poroso el cual restringe el movimiento delas
molculas a travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del
solvente
Posee un gran poder resolutivo ya que al aplicar una pequea cantidad de protena en una zona
estrecha la longitud del trayecto es mayor que la zona de aplicacin
Electroforesis continua
La muestra se aplica tambin en una zona pero se aade continuamente a lo largo del proceso
d. Qu tipos de marcadores moleculares que existen y son de inters?
Tipos de marcadores genticos
1. Marcadores morfolgicos
Son caractersticas fenotpicas de fcil identificacin visual tales como forma, color, tamao o
altura. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores, a la hora de inscribir nuevas
variedades.
2. Isoenzimas
Se definen como diferentes formas moleculares de un tipo de enzima, que poseen una actividad
cataltica comn, es decir actan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de
ADN (mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la
composicin de aminocidos. Si estos cambios se producen, las protenas podran tener la misma
actividad biolgica, pero como su composicin de aminocidos vara, podran tener diferente
carga neta y por tanto diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas
diferencias determinan patrones caractersticos de migracin electrofortica de las formas iso-
enzimticas (ver Cuaderno n 67, 34). Las enzimas que se utilizan en estos estudios se clasifican
de acuerdo a su funcin y se representan con una sigla de tres letras.
3. Protenas de reserva
Se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albminas solubles en agua, globulinas
en solucin salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en cidos o lcalis. El uso de protenas de
almacenamiento en estudios de diversidad gentica sistemtica, se basa en el hecho que las
protenas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homlogas, y que al separarse en
un gel producirn bandas similares o diferentes. Debido a que las protenas de reserva carecen de
actividad enzimtica, ellas son detectadas en el gel por medio de tcnicas generales de teido
4. ADN y marcadores moleculares

Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no
corresponder a un gen.
ELECTROFORESIS.
Existen diversas tcnicas de biologa molecular disponibles para detectar variabilidad en la

secuencia de ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restriccin, la
separacin electrofortica de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones
(Ver Cuadernos 34 y 67) son algunas de las tcnicas que permiten obtener un nmero
virtualmente ilimitado de marcadores moleculares. y cubrir la totalidad del genoma de un
organismo.
e. El voltaje sugerido para la electroforesis en gel de agarosa es de 1 a 5 V/cm.

Explique a que se refiere esta relacin.
A bajo voltaje, la tasa de migracin de fragmentos lineales de ADN es proporcional al voltaje

aplicado. No obstante, a medida que la fuerza del campo elctrico se incrementa, la movilidad de
los fragmentos de ADN de alto PM incrementa diferencialmente. As, el rango efectivo de
separacin en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se incrementa. Para obtener una
resolucin mxima de fragmentos de ADN mayores a 2Kb, los geles se deben correr a no ms de
5 V/cm. La distancia se mide como la va ms corta entre los electrodos, no es simplemente la
longitud misma del gel.
f. Que funcin tiene cada uno de los reactivos utilizados en el procedimiento?
Xylene cyanol
Puede ser utilizado como un marcador de color , o el seguimiento de colorante , para supervisar
el proceso de electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis en gel de poliacrilamida .
bromofenol azul y naranja G tambin se puede utilizar para este propsito. En 1% geles de
agarosa, xilenocianol migra aproximadamente a la misma velocidad que un fragmento de ADN
par de 4 a 5 kilobases [1] (aunque esto depende del tampn usado). Xileno cianol en un gel de
poliacrilamida al 6% migra a la velocidad de un fragmento de ADN de 140 pares base. El 20%
desnaturalizante (urea 7 M) electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), cianol xileno migra
aproximadamente a la tasa de 25 bases de oligonucletidos.
Azul de Bromofenol
Se utiliza como un marcador de color para vigilar el proceso de electroforesis en gel de agarosa y
la electroforesis en gel de poliacrilamida . Desde azul de bromofenol lleva una carga ligera
negativa a pH moderado, que migrar en la misma direccin que el ADN o la protena en un gel;
la velocidad a la que migra vara segn la densidad de gel y tampn de composicin, pero en un
tpico 1% de agarosa en un gel 1X tampn TAE o tampn TBE , bromofenol azul migra a la
misma velocidad como un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pares de bases , en 2%
de agarosa como 150 pb.
Rojo de Cresol
ELECTROFORESIS.
Puede ser utilizado como un marcador de color para controlar el proceso de electroforesis en gel
de agarosa, corriendo aproximadamente en el tamao de un 150 par de bases molcula de ADN.
Naranja G
Puede ser utilizado como un marcador de color para controlar el proceso de electroforesis en gel
de agarosa, corriendo aproximadamente en el tamao de un 50 par de bases molcula de ADN
g. Qu otras tcnicas son utilizadas para la extraccin de ADN genmico? Y

explquelas.
Mtodo de calentamiento:
La pata fue homogeneizada de forma manual en nitrgeno lquido y 50 L de agua destilada. Se
incub a 93 C durante 15 min. Se realiz una centrifugacin a 8 000 g por 10 min y el
sobrenadante se conserv a - 20 C.
Mtodo fenol-cloroformo
La pata fue homogeneizada de forma manual en nitrgeno lquido y 1 mL de tampn de lisis
(tris-HCl 50mM pH 8,25; EDTA 50 mM; NaCl 50 mM; SDS 1 %). La suspensin se incub con
2 mg/mL de proteinasa K (Boehringer Mannheim) toda la noche a 37 C y seguidamente se
realizaron 3 extracciones de protenas con igual volumen de fenol, fenol-cloroformo-alcohol
isoamlico (25:24:1) y cloroformo-alcohol isoamlico (24:1), con sus respectivas
centrifugaciones a 8 000 g por 10 min a 4 C. El ADN se precipit con 2 volmenes de etanol
absoluto y 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M pH 5,3; durante 30 min a - 20 C. El precipitado
de ADN genmico que se obtuvo por centrifugacin a 10 000 g durante 20 min se lav con
etanol 70 % y se sec a temperatura ambiente; fue resuspendi finalmente en 50 mL de tampn
tris-EDTA (TE) (tris-HCl 1 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0). El ARN presente en la muestra se
digiri con la adicin de RNAsa H (Boehringer Mannheim, Germany), incubndose durante 1 h
a 37 C. Seguidamente se realiz una extraccin empleando un volumen de cloroformo-alcohol
isoamlico (24:1) y el sobrenadante se conserv a - 20 C.
Mtodo del acetato de potasio

8,9 la pata fue homogeneizada de forma manual en 100 L de tampn de lisis (NaCl 0,1 M;
sacarosa 0,2 M; EDTA 50 mM; tris-HCl 100 mM pH 8,25; SDS 0,05 %). La suspensin se
incub durante 30 min a 65 C. Los cidos nucleicos se extrajeron adicionando 14 L de acetato
de potasio 8 M incubndose en hielo durante 15 min, seguido de una centrifugacin a 8 000 g
durante 10 min a 4 C donde se colect la fase acuosa. El ADN se precipit a - 20 C durante 30
min en presencia de 2 volmenes de etanol absoluto que contena acetato de sodio 0,3 M.
Posteriormente, se centrifug la mezcla a 10 000 g durante 20 min y el precipitado se lav con
etanol (70 %). Despus de secar a temperatura ambiente, el ADN se disolvi en 50 L de tampn
TE. El ARN restante se elimin con RNAsa H (Boehringer Mannheim), la suspensin se incub
a 37 C durante 1 h. Despus de extraer con igual volumen de cloroformo-alcohol isoamlico
(24:1), la fase acuosa se conserv a - 20 C.
ELECTROFORESIS.
Mtodo del acetato de potasio modificado

La pata fue homogeneizada de forma manual en nitrgeno lquido y 150 L de tampn de lisis
(tris-HCl 20 mM pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 1 %). La suspensin se incub con
100 g/mL de proteinasa K (Boehringer Mannheim) durante 1 h a 56 C. Los cidos nucleicos se
extrajeron adicionando 100 L de acetato de potasio 3 M incubndose en hielo durante 1 h,
seguido de una centrifugacin a 8 000 g durante 10 min a 4 C donde se colect la fase acuosa.
El ADN se precipit a - 20 C durante 30 min en presencia de 2 volmenes de etanol absoluto
que contena acetato de sodio 0,3 M. Posteriormente, se centrifug la mezcla a 10 000 g durante
20 min y el precipitado se lav con etanol (70 %). Despus de secar a temperatura ambiente, el
ADN se disolvi en 50 L de tampn TE. El ARN restante se elimin con RNAsa H (Boehringer
Mannheim), la suspensin se incub a 37 C durante 1 h. Despus de extraer con igual volumen
de cloroformo-alcohol isoamlico (24: 1), la fase acuosa se conserv a - 20 C.
Mtodo de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB):

La pata fue homogeneizada de forma manual en nitrgeno lquido y 500 L de tampn de lisis
(tris-HCl 20 mM pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 1 %). La suspensin se incub con
100 g/mL de proteinasa K (Boehringer Mannheim) durante 1 h a 56 C. Los cidos nucleicos se
extrajeron adicionando 150 L de NaCl 5 M y 1/10 del volumen de 10 % de CTAB, incubndose
durante 10 min a 65 C, seguidamente se realizaron 2 extracciones de protenas con igual
volumen de fenol-cloroformo-alcohol isoamlico (25:24:1) y cloroformo-alcohol isoamlico
(24:1) con sus respectivas centrifugaciones a 8 000 g por 10 min a 4 C. El ADN se precipit con
2 volmenes de etanol absoluto y 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M pH 5,3; durante 30 min a
- 20 C. El precipitado de ADN genmico que se obtuvo por centrifugacin a 10 000 g durante
20 min se lav con etanol 70 % y se sec a temperatura ambiente, y fue resuspendido finalmente
en 50 mL de tampn TE. El ARN presente en la muestra se digiri con la adicin de RNasa H
(Boehringer Mannheim, Germany), incubndose durante 1 h a 37 C. Seguidamente se realiz
una extraccin empleando un volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1) y el
sobrenadante se conserv a - 20 C.
h. Estas tcnicas son tambin utilizadas para extraer ADN mitocondrial y de

cloroplastos?
En el proceso de extraccin y purificacin debe variar para extraer ADN mitocondrial y de

cloroplastos, pero se puede usar la electroforesis en gel de agarosa ya que se emplea en muchas
macromolculas importantes (los aminocidos, los pptidos, las protenas, los nucletidos y los
cidos nucleicos)( M. Somma.2010Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente
Modificados en Muestras de Alimentos).Sin embargo existen tcnicas especificas para extraer
ADN mitocondrial y de cloroplastos.
DISCUSIONES
ELECTROFORESIS.
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se utiliza para separar,

identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una tcnica sencilla y rpida que permite
diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros
procedimientos (M. Somma).
En nuestro caso se hizo para identificar la calidad y cantidad de ADN presente en las muestras
tomadas anteriormente a partir de Metarhizium spp y Paecilomyces spp. como se puede observar
en las 2 muestras correspondientes nuestro grupo (Metarhizium) la corrida arrastro
completamente el colorante a lo largo del gel, lo que podra indicar contaminacin al momento
de hacer la extraccin; como la separacin hecha fue de fragmentos de ADN, en la muestras 7 y
8 se puede encontrar gran concentracin de cidos de nucleicos y pero su calidad es dudable,
mientras que en las muestras 2, 3 y 5 no hay una adecuada diferenciacin de estos fragmentos al
estar en menor concentracin y los patrones se observan difusos; esto debido a que los geles de
agarosa permiten una electroforesis rpida, pero con una resolucin limitada por cuanto las
bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse (M. Somma).
El desplazamiento de los cidos nucleicos se debe a la carga elctrica tomada por estos segn el
pH presente en la solucin del gel. Los geles (poliacrilamida o la agarosa) se colocan en la
cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las
molculas de ADN sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo puesto que a pH
superiores a 5 poseen carga negativa (Carmen Alicia Padilla Pea).
La utilizacin de colorantes fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que
conforman el cido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualizacin
de ADN y es este un reactivo altamente toxico. Sin embargo en la actualidad existen colorantes
fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y
Syto60, desarrollados especficamente para reducir los riesgos (Duque, 2009).
La electroforesis es uno de los mtodos de cuantificacin ms utilizados para la separacin de

molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico (Berth M, 2007), existen diferentes
tipos de electroforesis en gel los cuales tienen una funcin determinada como la electroforesis en
gel de muestras grandes de ADN y ARN se efecta en geles de agarosa, la electroforesis de
protenas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), isoelectroenfoque, geles
nativos o electroforesis bidimensional, electroforesis capilar, electroforesis de ADN, zimografa
o zimogramas (Bandow J, 2008). Uno de los mtodos ms usados en los ltimos aos y gran
importancia en medicina; es la electroforesis capilar la cual presenta la versatilidad de poder
separar aminocidos, cidos orgnicos, iones inorgnicos, carbohidratos, esteroides, tioles,
contaminantes alimenticios, material gentico y algunos frmacos importantes en el estudio de
diferentes ramas en el rea de la salud o usualmente el anlisis de los diferentes analitos puede
realizarse en unos minutos; se requiere de pequeas cantidades de muestra (GARCA-CANAS
V, 2007).
Como podemos observar las dos electroforesis son distintas a que su florescencia es diferente,
esto se debe a que se us bromuro de etidio con el grupo A y SYBR Green con el grupo B, segn
estas fotos el mejor fue el bromuro de etidio, observndose en los resultados una mejor
visibilidad de las bandas de ADN, cuando se coloca el gel en el transiluminador.
ELECTROFORESIS.
Segn nos muestra en la imagen del grupo b de la electroforesis las muestras de ADN que se ven
son aquellas que pertenecen a Penicillium, esto puede deberse a que el SYBR Green acta mejor
en el ADN de este hongo haciendo que aparezca la fluorescencia
CONCLUSIONES
Este mtodo de extraccin de ADN es muy factible para Paecilomyces 1 Paecilomyces 2 y

Metarhizium 1 y 2 aunque al realizar la electroforesis se pudo ver para Metarhizium existe cierta
contaminacin en la corrida electrofortica, por tanto es ms viable para Paecilomyces 1 y 2.
El muestra 5 la cual corresponde a Paecilomyces 1 hubo una corrida electrofortica casi nula;
existe la posibilidad de que no se vio, debido a que se realizo de una manera incorrecta cuando se
situ la muestra en el pozo.
En la muestra 9 se ve poco corrido electrofortico, esto puedo ser debido a que al hacer el
proceso de extraccin y purificacin de ADN fue una muestra que se rescato del micelio usado
de Paecilomyces 1.
En la muestras 1,2,3,4,6,7,8,9,10,11,12,13 se vio una corrida electrofortica buenas y optimas

esto nos quiere decir que se realizo un buen protocolo de extraccin y purificacin de ADN,
adems a la hora de situar la muestra de ADN se hizo de la manera debidamente correcta.
En si la electroforesis es una tcnica sensible y altamente verstil que se encuentra involucrada

en investigacin genmica y farmacutica, pero que adems se expande constantemente en el
diagnstico molecular y clnico con resultados asombrosos sin contar con las aplicaciones
forenses que de alguna forma la hicieron saltar a la fama en sus inicios.
La alta afinidad de SYBR Green para el ADN de doble cadena hace que sea til para la deteccin
de muestras de ADN con bajo nmero de copias. Se une preferentemente ADN de doble cadena,
pero tambin puede unirse al ADN monocatenario con fluorescencia reducida. Al igual que con
cualquier molcula de unin a ADN, SYBR Green puede causar mutaciones y es un posible
carcingeno. Es, sin embargo, ms seguro para trabajar que el bromuro de etidio.1
El SYBR Green se intercala entre el ADN bicatenal, por ello son no especificas ya que pueden
unirse a dimeros de cebadores o productos inespecficos.2
BIBLIOGRAFIA
1 http://www.slickpalm.com/cual-es-sybr-green/
2 Optimizacin del diagnstico, caracterizacin molecular y anlisis de virulencia del virus
de la septicemia hemorrgica viral (VHSV)
ELECTROFORESIS.
Carmen Alicia Padilla Pea, Jess Diez Dapena, Emilia Martnez Galisteo, Jos Antonio
Brcena Ruiz, Concepcin Garca Alfonso. (2008). Electroforesis de cidos nucleicos en
geles de agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. 2006,
de Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de
Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba Sitio web:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS
%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf
Laura Alejos, Extraccin y purificacin de ADN. Recuperado de

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf
M. Somma, Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en
Muestras de Alimentos. Recuperado de
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf
Microbial, (2009) La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR. Mitos
y realidades. Recuperado de
http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
Duina Posso, (2009) Electroforesis del adn en geles de agarosa. Recuperado de

http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Electroforesis%20de%20ADN%20en%20geles
%20de%20agarosa.pdf
Instituto Nacional de Salud de Lima, (2003) Manual de procedimientos de electroforesis

para protenas y ADN. Recuperado de
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis%2038.pdf
Hombreiro Noriega Luis. (2013). EL ADN de Locard Gentica forense y

criminalstica. Fernndez de los Ros- Madrid: Reus, S.A
(Pablo Baldi. Laura patricia Blumeti. Silvia Fernndez Castelo. (2004).

Biochemistry. Montevideo, Urugay: MEDICA PANAMERICANA S.A.)
Carmen Alicia Padilla Pea Jess Diez Dapena, Emilia Martnez Galisteo, Jos
Antonio Brcena Ruiz, Concepcin Garca Alfonso Electroforesis de cidos nucleicos en geles
de agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico [Informe]. -
Crdoba : Campus Universitario de Rabanales.Duque Duina Posso Protocolos de laboratorio
UEG . - 2009.
GARCA-CANAS V CIFUENTES A. Detection of microbial food contaminants

and their products by capillaryelectromigration techniques. [Informe]. - [s.l.] : Electrophoresis,
2007.
Jonathan J Magaa1 2,a, Mara de la Luz Arenas-Sordo1,b, La electroforesis

ELECTROFORESIS.
capilar [Informe]. - chile : Rev Md , 2008.
M. Somma M. Querci Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente

Modificados en Muestras de alimentos. - [s.l.] : WORLD HEALTH ORGANIZATION
Mirian Cordero, (2015). Quantification of Penicillium nalgiovense on Dry-Cured

Sausage Salchichn Using a SYBR Green-Based Real-Time PCR. Recuperado de
http://www.researchgate.net/publication/270649973_Quantification_of_Penicillium_nalgiovense
_on_Dry-Cured_Sausage_Salchichn_Using_a_SYBR_Green-Based_Real-Time_PCR
Lpez Vzquez, Optimizacin del diagnstico, caracterizacin molecular y anlisis de

virulencia del virus de la septicemia hemorrgica viral (VHSV). Recuperado de
https://books.google.com.co/books?
id=YgGIf8QeqaoC&pg=PA16&lpg=PA16&dq=El+sybr+green+es+un+intercalante&source=bl
&ots=8hKknpRod1&sig=mHCxl44ZOdqD4jZUHIdWhq3eiUs&hl=es-
419&sa=X&ei=YBc3VbbNE6HfsASvzIHIAQ&ved=0CB8Q6AEwAg#v=onepage&q=El
%20sybr%20green%20es%20un%20intercalante&f=false

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EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ADN DE HOGOS Y SEPARACIN POR

LABORATORIO 3. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN DE HONGOS Y

Universidad Francisco de Paula Santander

El presente laboratorio se realiz en dos partes. En la primera se hizo la extraccin de ADN

Palabras clave: Extraccin, DNA, Gel de agarosa, Electroforesis

El ADN constituye el material gentico de los organismos. Es el componente qumico

MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS

IMPLEMENTOS REACTIVOS EQUIPOS

Bata Buffer de carga: xilencianol, Cmara de electroforesis

Figura 1. Extraccin y purificacin del ADN de hongos

Mtodos fsicos: hervido, congelacin-

Detergentes, como SDS

Enzimas, como la lisozima, proteinasa K

Permite la eliminacin progresiva de

Fenol/Cloroformo: Fenol desnaturaliza las

Permite la obtencin de un cido nucleico

1. Se aaden 0.5 a 2.0g 1. Se adiciona un volumen de

2. Transferimos la fase acuosa a

5. Descargamos el etanol por

Separacin de ADN por electroforesis horizontal en gel de agarosa

PREPARACIN DE GEL DE AGAROSA AL 0.7%

1. En un Erlenmeyer adicionamos 0.28 gr de agarosa y se

2. Se dej enfriar la solucin de agarosa hasta 65C;

3. Colocamos los aseguradores y se verti la solucin

4. Dejamos el gel en reposo por 20 min hasta que

5. Colocamos la cubeta en la cmara de electroforesis

6. Antes de preparar las muestras para cargar en el gel,

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

1. En un tubo para centrifuga adicionamos entre 1 y 2 l

2. Se Coloca un papel oscuro debajo de la camara

3. Se carga el ADN en el pozo, evitando que se salga de la

VISUALIZACION DEL ADN

1. Verificamos que los cables estaban conectados

2. Al finalizar quitamos el suministro de corriente y se

FORMATO DE GUIA CONTROL DE ELECTROFORESIS

Electroforesis No. 1 Fecha: 8 de abril del 2015

% de agarosa: Buffer de carga: Buffer de corrida: BrEt:

Voltaje/Corriente inicial: 125V Tiempo: 10 min

Voltaje/Corriente final: 110V Tiempo de corrida: 30 min

CARRI MUESTRA FOTOGRAFA

FORMATO DE GUIA CONTROL DE ELECTROFORESIS

Electroforesis No. 1 Fecha: 8 de abril del 2015

CARRI MUESTRA FOTOGRAFA

a. Cul es la diferencia entre ADN genmico y ADN cromosmico?

El ADN genmico se localiza dentro del ncleo de la clula eucariota, en el cromosoma y

b. Qu son las nucleasas?

c. Qu son lisozima y mutanolisina?

La mutanolisina es una enzima especfica Gram positiva que hidroliza componentes de la

d. Qu papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extraccin y

e. Describa cul es el objetivo de cada una de las siguientes etapas:

Macerado del hongo

En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extraccin, es necesario

Adicion de buffer de extraccin

Adicion de fenol: cloroform

Precipitacin con etanol

f. Mencione y explique otros mtodos de extraccin

1. Extraccin de ADN de hongos filamentosos

Disponer de micelio congelado a 80 C

Aadir la mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25/24/1) hasta obtener una fase

2. Extraccin de ADN de Cryptococcus spp.

a. Qu funcin cumple el buffer de carga y que otros colorantes se utilizan como

b. Qu otras macromolculas se pueden separar por electroforesis en gel? Y que