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cidos

Orgnicos

Los cidos orgnicos han sido un producto importante de la biotecnologa. Mucha
informacin sobre la historia de las fermentaciones de cidos orgnicos se puede
encontrar en las revisiones de Miall [103], Mattey [104], Roehr [105], y Magnuson y
Lasure [106]. Los cidos orgnicos comerciales ms importantes son los cidos ctrico,
actico y lctico. Los procesos de fermentacin estn tambin disponibles para la
produccin de cidos succnico, glucnico, oxoglucnico, pirvico, itacnico, shikmico,
mlico, propinico, butrico, oxlico, kjico, fumrico, eritrobrico, trans-epoxisuccnico,
tartrico, itatrtrico y de cadena larga cidos , -dicarboxlicos.

La produccin de cido ctrico tiene una importancia histrica ya que fue la primera
fermentacin industrial que se desarroll. Haba sido producido exclusivamente por
aislamiento de los limones. En 1916, la produccin de cido ctrico por aspergilli negro fue
descrita por Charles Thom y J.N. Currie [107]. Currie se uni a Chas. Pfizer and Co. en
Brooklyn, NY y desarroll un proceso de produccin comercial en 1923. Las patentes de
1927 de Fernbach et al. El proceso fue mejorado en la dcada de 1930 por el grupo de
Raistrick [110] y por Doelger y Prescott [111]. Los requisitos de metal cruciales de la
cultura de Aspergillus niger fueron estudiados por un nmero de grupos incluyendo
Tomlinson y compaeros de trabajo [112] y Adiga et al. [113].

Durante los primeros aos, el cido se produjo nicamente mediante cultivo superficial en
frascos para estudios de laboratorio y en bandejas para produccin comercial. Sin
embargo, Amelung [114] y Kluyver y Perquin [115] encontraron que la cultura sumergida
era mejor. El desarrollo posterior de la fermentacin del cido ctrico dependi en gran
medida del trabajo del profesor Marvin Johnson con sus colegas David Perlman y Ping Shu
en la Universidad de Wisconsin durante los mismos aos en que Johnson contribua tanto
al desarrollo de la penicilina fermentacin. El uso El uso de melazas invertidas (melaza de
alto test), tratado para reducir su contenido de hierro, fue iniciado por Miles Laboratories.
Los mutantes que producen mayores concentraciones fueron obtenidos por Miles
Laboratories [118], James et al. [119] y Hannan et al. [120].

Alrededor de 1,5 millones de toneladas de cido ctrico son producidas por A. niger por
ao. El proceso comercial emplea a A. niger en medios deficientes en hierro y manganeso.
Un alto nivel de produccin de cido ctrico tambin se asoci con un aumento de la
concentracin intracelular de fructosa 2,6-bifosfato, un activador de la gluclisis. Otros
factores que contribuyeron a la alta produccin de cido ctrico fueron la inhibicin de la
isocitrato deshidrogenasa por el cido ctrico, y el bajo pH ptimo (1,7-2,0). En
aproximadamente 4-5 das, la porcin principal (80%) del azcar proporcionada se
convirti en cido ctrico, los ttulos alcanzaron aproximadamente 100 g / l. Se
desarrollaron procesos alternativos para la produccin de cido ctrico por levaduras
Candida, especialmente a partir de hidrocarburos. Tales levaduras eran capaces de
convertir n-parafinas en cidos ctrico e isoctrico en rendimientos extremadamente altos
(150-170% sobre una base en peso). Se alcanzaron ttulos de hasta 230 g / l.
Las bacterias del cido actico son bacterias Gram-negativas, obligatoriamente aerobias
compuestas de especies de Acetobacter, Gluconoacetobacter y Frateuria. Su actividad
como agentes de deterioro del vino ha sido un problema desde al menos 10000BC.
Acetobacter suboxydans se utiliz para producir vinagre ya en 4000 aC. De hecho, la
palabra latina "acetum" significa vino agrio o vino afilado. La produccin de vinagre, una
solucin acuosa de cido actico, se lleva a cabo mejor con especies de Gluconacetobacter
y Acetobacter [121]. Se convirti una solucin de etanol en cido actico en la que se
atac 90 - 98% del etanol, dando una solucin de vinagre que contena cido actico al 12-
17%. La produccin industrial de cido actico se llev a cabo nicamente mediante la
conversin de azcar hasta finales de la dcada de 1800, cuando la destilacin de la
madera se hizo competitiva con el proceso de fermentacin. El petrleo se convirti
entonces en una fuente importante de cido actico sinttico. La primera planta qumica
para la produccin de cido actico se estableci en 1916. El cido actico producido por
fermentacin a partir del maz fue utilizado principalmente por la industria alimentaria. La
produccin de cido actico asciende a 7,5 millones de toneladas al ao por sntesis y
fermentacin.

Hoy en da, la fermentacin con cido actico es un proceso en dos etapas en el que la
levadura Saccharomyces cerevisiae convierte la glucosa en etanol y Acetobacter aceti
produce cido actico a partir del etanol. Clonacin de aldehido deshidrogenasa de
Acetobacter polyoxogenes en un vector plasmdico en A. aceti subsp. Xylinum aument la
tasa de produccin de cido actico en ms del 100% (1,8 g / l por h a 4 g / l por h) y el
ttulo en un 40% (68-97 g / l) [122].

Otro grupo de organismos considerados para la produccin de cido actico ha sido los
anaerobios anaerbicos y termoflicos del gnero Clostridium. En 1940, Wieringa aisl
Clostridium aceticum [123], que posteriormente se perdi. Sin embargo, en 1942,
Fontaine et al. [124] aislado Clostridium thermoaceticum que convirti el azcar
cuantitativamente a cido actico a travs de la va de Embden-Meyerhof a piruvato que
luego se convirti en acetato. Como resultado, se convirti 1 mol de glucosa en 3 moles de
acetato. La experiencia con esta fermentacin mostr que 0,85 g de cido actico podra
producirse a partir de 1 g de glucosa [125] y se alcanzaron ttulos de 83-102 g / l con
mutantes mejorados [126]. La produccin de C. thermoaceticum fue revisada por Cheryan
et al. [127].

La produccin de cido lctico se ha utilizado para retardar el deterioro de los alimentos
durante siglos, pero la forma en que lo hace no se saba hasta el descubrimiento de
Pasteur de 1857 que esta actividad favorable fue causada por microorganismos. En 1878,
Joseph Lister [128] aisl el primer cultivo puro de cualquier bacteria que l llam
Bacterium lactis, que ms tarde sera renombrado Lactobacillus lactis ssp. Lactis. Las
bacterias del cido lctico son anaerobios Gram-positivos que producen y excretan cido
lctico en el medio. Se encontraban entre los primeros microbios que se utilizarn en la
fabricacin de alimentos. Hoy en da, el cido lctico se utiliza en la industria alimentaria
como conservante y como potenciador del sabor y en la industria qumica y farmacutica.
Aplicaciones importantes del cido L-lctico se encuentran en la fabricacin de polilactida
(vase la seccin 1.7.6) y la del solvente benceno para el medio ambiente etil-lactato.
Alrededor de 250 000 toneladas de cido lctico se producen anualmente.

Adems de las bacterias del cido lctico, el hongo Rhizopus es tambin un productor del
cido. A veces se prefiere porque no requiere suplementos tales como extracto de
levadura, licor de maceracin de maz o suero que hacen que la recuperacin del producto
sea costosa. Adems, Rhizopus oryzae sintetiza nicamente el ismero L - (+) del cido
lctico, mientras que la mayora de los lactobacilos producen ismeros mixtos del cido.

Algunos lactobacilos recombinantes pueden producir ismeros individuales, pero los
rendimientos son bajos. Un programa de mejora de la deformacin de seis pasos dio
como resultado una cepa de R. oryzae produciendo ms de 130 g / l de cido L - (+) -
lctico y un rendimiento de la glucosa de cerca del 90% [129].

Aunque la mayora de los lactobacilos producen ismeros mixtos, se ha aislado una cepa
de L. lactis que produce 195 g / l de cido L-lctico a partir de 200 g / l de glucosa [130].
Una cepa recombinante de E. coli produjo cido D-lctico pticamente puro a partir de
glucosa con un rendimiento casi al rendimiento terico mximo (es decir, dos molculas
de una molcula de glucosa) [131]. El organismo fue modificado genticamente
eliminando genes de vas competidoras que codifican la fumarato reductasa, alcohol /
aldehdo deshidrogenasa y piruvato formato liasa, y por una mutacin en el gen de la
acetato cinasa.

Alcoholes

La produccin de etanol es probablemente el proceso de fermentacin ms antiguo
conocido. Durante 6000 aos, desde los das sumerio y egipcio, la conversin del azcar
en frutas y granos a etanol ha sido un proceso importante. Hasta los aos ochenta, se
utilizaba principalmente para hacer bebidas alcohlicas, pero en los ltimos aos se ha
convertido en un importante material de alimentacin limpio y limpio, especialmente para
automviles. El etanol tambin tiene aplicaciones como: (i) un disolvente en el
laboratorio, en productos farmacuticos y en cosmtica, (ii) un co-tensioactivo en
emulsiones aceite-agua, y (iii) un agente esterilizante y antisptico.

Fue J.L. Gay-Lussac quien, en 1810, report por primera vez el etanol y el CO2 como los
principales productos de la descomposicin del azcar por levadura (vase la fascinante
revisin de F. Schlenk [132]). En 1837, el fsico Charles Cagniard-Latour describi las
caractersticas de las clulas de levadura encontradas en las bebidas fermentadas,
incluyendo su forma, reproduccin, necesidad de carbohidratos fermentables y una
fuente de nitrgeno para la multiplicacin y diferencias entre las levaduras de la
produccin de vino y Esos de El proceso de elaboracin de la cerveza. Aproximadamente
al mismo tiempo, Theodor Schwann, entrenado en medicina, encontr que las levaduras
eran necesarias para la fermentacin alcohlica. El trabajo de Cagniard-Latour y Schwann
fue confirmado por Friedrich Traugott Kuetzing, un farmacutico y profesor universitario.
Sin embargo, el trabajo de estos pioneros fue rechazado por los qumicos J.J. Berzelius, J.
Liebig y F. Woehler, que crean que el proceso era de naturaleza estrictamente qumica.
Curiosamente, uno de los crticos ms severos de los qumicos fue Moritz Traube, que
haba sido un estudiante de Liebig. Propuso que la fermentacin se llevara a cabo
oxidando y reduciendo los componentes celulares que llam "fermentos". Fue Pasteur en
1860 quien demostr que las clulas de levadura eran absolutamente necesarias para
llevar a cabo la serie de reacciones (bio) qumicas. Finalmente, Eduard Buchner en 1897,
con la ayuda de su hermano Hans, pudo realizar la sntesis de etanol sin clulas con
extractos de levadura. Para ello, gan el Premio Nobel de Qumica en 1907.

El alcohol etlico se produce a travs de la fermentacin de azcares (o un polisacrido
que puede despolimerizarse en un azcar fermentable) por S. cerevisiae en el caso de
hexosas y Kluyveromyces fragilis o especies de Candida con lactosa o pentosa,
respectivamente. S. cerevisiae y otras levaduras fueron elegidas y adaptadas para
fermentaciones especficas de etanol. Se incluyeron levaduras de panadera (diferentes
cepas para levadura seca comprimida y activa), levaduras de vino (incluidas las cepas
floculentas especiales para la produccin de champn y las cepas formadoras de pelcula
para la produccin de flor de jerez), levadura de sake y cepas fermentadoras superiores e
inferiores Variando el grado de floculacin que se produce durante la fermentacin) y las
cepas del destilador utilizadas para la produccin de alcohol a partir de almidn de cereal.

Alrededor de 2 millones de toneladas de levadura se producen anualmente para las
industrias de destilacin, elaboracin de la cerveza y panificacin cada ao. La produccin
de alcohol para bebidas estaba restringida al uso de microorganismos (por ejemplo,
levadura), pero la de alcohol industrial y de combustible se llevaba a cabo por sntesis
qumica desde el petroleo; Esto eventualmente cambi a favor de las levaduras. Bajo
condiciones ptimas, aproximadamente 10-12% de etanol en volumen se obtuvo en
fermenaciones de levadura en 5 das. Una concentracin tan alta ralentiz el crecimiento
y la fermentacin ces. Con levaduras especiales (saki), la fermentacin podra continuar
hasta concentraciones de alcohol del 20% en volumen, pero estas concentraciones se
alcanzaron slo despus de meses de fermentacin.

En 1977, la produccin de levadura de bebidas, combustible y alcohol combustible fue
20% menor que por sntesis qumica. Sin embargo, en 1984, las levaduras proporcionaron
87% ms etanol que la sntesis qumica. El porcentaje de alcohol total producido por
levaduras continu aumentando a lo largo de los aos. En 2006, 13.2 millones de
toneladas de etanol se producan a partir de maz anualmente en los Estados Unidos por
fermentacin en comparacin con 0.65 millones de toneladas por sntesis. Debido a la
eliminacin del plomo de la gasolina, el etanol fue substituido como una mezcla para
levantar el ndice del octano de la gasolina. Ms tarde, se agreg a la gasolina como un
oxigenado para reducir las emisiones de CO2 mediante la mejora de la oxidacin general y
el rendimiento de la gasolina. Esto se debi a la eliminacin gradual del uso de metil-terc-
butil ter (MTBE) como oxigenato, como dictaminado por muchas legislaturas estatales en
los Estados Unidos. El alcohol etlico se produjo en Brasil a partir de azcar de caa a una
tasa de ms de 4 mil millones de galones al ao y se utiliz ya sea como una mezcla del
25% o como un combustible puro.

El etanol de combustible producido a partir de biomasa est siendo considerado como un
medio para aliviar la contaminacin atmosfrica causada por el uso de gasolina sin
contribuir al efecto invernadero [133] y de eliminar la dependencia de Estados Unidos de
las fuentes extranjeras de petrleo. La materia prima disponible en los Estados Unidos
podra suministrar 20 mil millones de galones de etanol de combustible. Se han
desarrollado nuevos procesos para convertir la biomasa en etanol y se ha utilizado
tecnologa de ADNr para convertir E. coli y sus parientes cercanos en eficientes
productores de etanol (43% de rendimiento, v / v) [134]. Los genes de alcohol
deshidrogenasa II y piruvato descarboxilasa de Zymomonas mobilis se insertaron en E. coli
y se convirtieron en el sistema dominante para la regeneracin de NAD. El etanol
represent ms del 95% de los productos de fermentacin en la cepa genticamente
modificada. Algunas cepas de E. coli modificadas genticamente produjeron hasta 60 g / l
de etanol. Clonando y expresando los mismos dos genes en Klebsiella oxytoca, la cepa
recombinante fue capaz de convertir celulosa cristalina en etanol con alto rendimiento
cuando se aadi celulasa fngica [135]. El rendimiento terico mximo fue de 81-86% y
se produjeron ttulos de hasta 47 g / l de etanol a partir de 100 g / l de celulosa.

Bacterias como clostridia y Zymomonas tambin han sido reexaminadas por su utilidad en
la produccin de etanol despus de aos de abandono. Clostridium thermocellum, un
termfilo anaerbico, convierte celulosa residual (es decir, biomasa) y celulosa cristalina
directamente en etanol, sin necesidad de celulasa fngica [136-139].

El butanol es otro alcohol que podra ayudar a resolver el problema de la excesiva
dependencia del petrleo como combustible de motor [140, 141]. La clonacin de sus
genes opern ace (adC codificador de acetoacetato descarboxilasa), ctfA y ctfB (dos genes
que codifican la coenzima A transferasa) en un plsmido que contiene el promotor adc en
Clostridium acetobutylicum dio como resultado un aumento del 95% en la produccin de
acetona, un 37% Un aumento del 90% en el etanol, un aumento del 50% en el
rendimiento del disolvente de la glucosa, y una produccin 22 veces menor de cidos
[142].

Se ha desarrollado un cultivo de E. coli que crece en glucosa y produce 1,3-propanodiol
(PDO, trimetilenglicol, 3G) a 135 g / l, con un rendimiento del 51% y una tasa de 3,5 g / l
por h [ 143]. Este esfuerzo fue llevado a cabo conjuntamente por cientficos de Genencor
International y DuPont y se logr mediante la introduccin de ocho nuevos genes para
convertir dihidroxiacetona fosfato (DHAP) en PDO. Estos incluyen genes de levadura que
convierten dihidroxiacetona en glicerol y genes de Klebsiella pneumoniae que convierten
glicerol en DOP. Los investigadores mejoraron la produccin en el recombinante mediante
la modificacin de 18 genes de E. coli, incluidos los genes reguladores. PDO era el
monmero utilizado para sintetizar qumicamente poliuretanos y la fibra de polister
SoronoTM de DuPont (vase la seccin 1.7.6). El DOP tambin se utiliza como lubricante
de tipo poliglicol y como disolvente.

Otros alcoholes que se pueden preparar por fermentacin son glicerol, eritritol, manitol,
sorbitol y xilitol.

Enzimas

El trmino "enzima" fue acuado por primera vez por Kuhne en 1877, que significa "en
levadura". Cuando el campo de la bioqumica naci en 1897 a travs del descubrimiento
de Buchner de que los extractos libres de clulas de levadura podran llevar a cabo la
produccin de etanol a partir de azcar, Las enzimas se volvieron valiosas en la fabricacin
debido a su accin rpida y eficaz a bajas concentraciones bajo valores y temperaturas
suaves de pH, su alto grado de especificidad de sustrato (que redujo el lado Formacin de
productos), su baja toxicidad y la facilidad de terminar su accin mediante tratamientos
suaves. Algunas cepas microbianas produjeron concentraciones muy altas de enzimas
extracelulares. Las cepas silvestres de Bacillus licheniformis produjeron 5 g / l de proteasa
y cepas comerciales de 20 g / l. Las cepas de alto rendimiento de Aspergillus produjeron
20 g / l de glucoamilasa.

Otras razones para usar las clulas microbianas como fuentes de enzimas fueron las
siguientes: (i) las fermentaciones enzimticas fueron bastante econmicas a gran escala
debido a ciclos de fermentacin cortos y medios econmicos; (Ii) los procedimientos de
seleccin fueron simples y miles de culturas pudieron ser examinadas en un tiempo
razonablemente corto; Y (iii) diferentes especies produjeron enzimas algo diferentes que
catalizaban la misma reaccin, permitiendo una flexibilidad con respecto a las condiciones
de operacin en en el reactor. Esta versatilidad se ilustra por el hecho de que la -amilasa
de Bacillus amyloliquefaciens, un enyzme comercial usado durante aos para la hidrlisis
de almidn a una temperatura tan alta como 90 C, fue forzada a competir en 1972 con
una enzima similar de B. licheniformis que Podra funcionar a 110 C. Las temperaturas
ptimas para las B. amyloliquefaciens y las -amilasas de B. licheniformis fueron 70 C y
92 C, respectivamente.

En los aos ochenta y noventa, las enzimas microbianas se utilizaron cada vez ms para
aplicaciones que tradicionalmente empleaban enzimas vegetales y animales. Estos
cambios incluyeron la sustitucin parcial de (i) amilasas de cebada malteada y trigo en las
industrias de cerveza, horneado y textil por amilasas de Bacillus y Aspergillus; (Ii)
proteasas vegetales y animales por Aspergillus proteasa para refrigerar cerveza y ablandar
la carne; (Iii) proteasas pancreticas por Aspergillus y Bacillus proteasas para el
abatimiento del cuero y en preparaciones detergentes; Y (iv) cuajo de vientre de becerro
(quimosina) de Mucor rennins para la fabricacin de queso. Posteriormente, la clonacin
de la quimosina de mamfero fue de inters para los fabricantes de queso y las pruebas en
el queso elaborado con la enzima recombinante mostraron xito comercial. La quimosina
recombinante fue aprobada en los Estados Unidos y su precio fue la mitad de la quimosina
natural de ternera. Las enzimas industriales importantes incluyeron lo siguiente: (i)
glucosa isomerasa para la produccin de maz de alta fructosa; (Ii) penicilina-acilasa para
la produccin de penicilinas semi-sintticas; (Iii) peroxidasa para la fabricacin de resinas
fenlicas (que podran sustituir a los fenoles-formaldehdos sintticos); Y (iv) nitrilo
hidrolasa para hidratacin de acrilonitrilo a acrilamida. Se utiliz isomerasa de glucosa
junto con -amilasa y glucoamilasa para convertir el almidn en mezclas de glucosa y
fructosa conocidas como "jarabe de maz de alta fructosa". El desarrollo de la isomerasa
de glucosa permiti a la industria de molienda hmeda de maz capturar el 30% La
industria azucarera en los aos setenta. Solamente en los Estados Unidos, el jarabe de
maz de alta fructosa se produce en 30 billones de libras por ao.

El mercado de enzimas industriales alcanz los 2.000 millones de dlares en 2000, dividido
en las siguientes reas de aplicacin: alimentos, 45% (de los cuales el procesamiento de
almidn representa el 11%); Detergentes, 34%; Textiles, 11%; Cuero, 3%; Pulpa y papel,
1,2%. Esto no incluye las enzimas diagnsticas y teraputicas. El mercado mundial de los
productos de las reacciones enzimticas fue el siguiente: jarabe de maz de alta fructosa,
US $ 1.000 millones; Aspartame, US $ 800 millones; Acrilamida, US $ 300 millones; cido
6-aminopenicilnico (6-APA) y cido 7-aminodeacetoxicefalospornico (7ADCA), US $ 200
millones.

Ciertos microorganismos ("extremfilos") pueden crecer en ambientes extremos tales
como 100 C, 4 C, 250 atm, pH 10, pH 2 o 5% de NaCl. "Extremozymes", es decir,
enzimas de estos diversos organismos, tienen importancia industrial. Un ejemplo
comercial es Cellulase 103 a partir de un alkaliphile. La enzima rompi el fuzz
microscpico de fibras de celulosa que atrap la suciedad en la superficie de los textiles de
algodn. La enzima fue comercializada por Genencor International en 1997 para su uso en
detergentes para devolver la "novedad" de la ropa de algodn incluso despus de muchos
lavados.

Con el desarrollo de la metodologa de rDNA se hizo posible clonar genes que codifican las
enzimas microbianas y expresarlas a niveles cientos de veces superiores a los producidos
naturalmente. El negocio de la enzima industrial adopt los mtodos de rDNA con
entusiasmo para aumentar los niveles de produccin y producir enzimas de
microorganismos no industriales en organismos industriales, como especies de Aspergillus
y Trichoderma, as como Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Yarrowia lipolytica y B.
licheniformis . Ms del 50% del mercado es proporcionado por procesos recombinantes. El
sesenta por ciento de la renina de ternera (quimosina) utilizada para la fabricacin de
queso en los Estados Unidos es suministrada por E. coli recombinante y las dos lipasas
utilizadas industrialmente (es decir, la lipasa de Humi- cola producida en Aspergillus y la
lipasa de Pseudomonas) son recombinantes. La amilasa termoestable de B. licheniformis
se ha preparado en una cepa amplificada por el gen de la misma especie. La fitasa vegetal
(producida en A. niger recombinante) se utiliza como alimento para el 50% de todos los
cerdos en Holanda. Un aumento de 1000 veces en la produccin de fitasa se logr en A.
niger mediante el uso de tecnologa recombinante. Los cientficos de Novo Nordisk han
aislado una lipasa muy deseable para su uso en detergentes de una especie de Humicola.
Para fines de produccin, el gen se clon en A. oryzae donde se produce 1000 veces ms
enzima [199]. Se convirti en un producto comercial para la limpieza de ropa, para la
interesterificacin de lpidos y para la esterificacin de glucsidos productores de
glicolpidos que tienen aplicaciones como agentes tensioactivos no inicos biodegradables
para detergentes, productos de cuidado de la piel, lentes de contacto y como
emulsionantes alimentarios.

Prcticamente todos los detergentes para ropa contienen ahora enzimas genticamente
modificadas y mucho queso se hace con microbios genticamente modificados. Ms del
60% de las enzimas utilizadas en las industrias de procesado de detergentes, alimentos y
almidn son productos recomen- dantes [200].

Las propiedades de muchas enzimas han sido alteradas por medios genticos. La
mutagnesis de "fuerza bruta" y la seleccin aleatoria de microorganismos a lo largo de
los aos han conducido a cambios en el pH ptimo, termoestabilidad, inhibicin de la
retroalimentacin, inhibicin de la fuente de carbono, especificidad del sustrato, Vmax,
Km y Ki. Esta informacin ha sido explotada por las tcnicas ms racionales de ingeniera
de protenas. Los cambios individuales en las secuencias de aminocidos han producido
tipos similares de cambios en una gran variedad de enzimas. Por ejemplo, una proteasa de
Bacillus stearothermophilus aument su tolerancia al calor de 86C a 100C, es decir, se
hizo resistente a la ebullicin. La enzima se desarroll mediante mutagnesis dirigida
[201]. Slo ocho aminocidos tuvieron que ser modificados. La estabilidad a la
temperatura a 100 C se increment 340 veces y la actividad a temperatura ms baja no
disminuy. Las ocho mutaciones estaban lejos del sitio activo de la enzima.

Un excelente mtodo para mejorar las enzimas es la evolucin dirigida (tambin conocida
como evolucin molecular aplicada o evolucin molecular dirigida. [202] El shufling de
ADN, un tipo de evolucin dirigida, ha logrado una mejora significativa de la actividad
cataltica, la especificidad modificada y la mejora Este mtodo de agrupacin y
recombinacin de partes de genes similares de diferentes especies o cepas ha producido
notables mejoras en las enzimas en un perodo de tiempo muy corto.El procedimiento
imita realmente la naturaleza en que se utiliz la mutacin, la seleccin y la
recombinacin La actividad enzimtica se ha mejorado hasta 32 000 veces (TEM-1 -
lactamasa), la especificidad del sustrato por 1000 veces (-galactosidasa), plegado de la
protena por 48 (Protena fluorescente verde), actividad de anticuerpos por ms de 400
veces, expresin por 100 veces, resistencia al arsenato por 40 veces, degradacin de la
atrazina por 80 veces, etc. [203].

Las protenas del trabajo dirigido de la evolucin primero fueron en el mercado en 2000.
stas eran protena fluorescente verde de Clonetech y LipoPrime lipasa de Novo Nordisk.
La evolucin dirigida proporcion actividad -glucosidasa a una -galactosidasa, convirti
una -glucuronidasa en una -galactosidasa, dio actividad fosfolipasa a una lipasa y
convirti una indol-3-glicerol-fosfato sintasa en una fosforibosilantranilato isomerasa
[204].