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Universidade Federal do Piau

Departamento de Qumica
Qumica Orgnica III

MTODOS CROMATOGRFICOS

Prof. Gerardo Magela


CROMATOGRAFIA
um mtodo fsico-qumico de separao dos
componentes de uma mistura, realizada atravs da
distribuio destes componentes entre duas fases que esto
em contato ntimo. Uma das fases permanece estacionria e
a outra move-se atravs desta.
Ocupa um lugar de destaque entre os mtodos modernos,
devido a sua facilidade em efetuar separao, identificao e
quantificao das espcies qumicas, sozinha ou em conjunto
com outras tcnicas, tais como: espectrometria de massas
(EM) e a ressonncia magntica nuclear (RMN).

O nome cromatografia deriva das palavras gregas "chrom"


(cor) e "graphe" (escrever), embora o processo no dependa
da cor, exceto para visualizao e identificao dos
componentes separados.

2
Em 1889, Beyerinck usou slidos em camada delgada
sobre vidro para separar sais inorgnicos.

Em 1906 Mikhael Semenovich Tswett (botnico russo)


utilizou os termos cromatografia, cromatograma e
mtodos cromatogrficos para descrever suas
experincias de separao de componentes de extratos de
folhas e gema de ovo, usando colunas de vidro recheadas
com vrios slidos e ter de petrleo para arrastar os
componentes.

Em 1941, Martin e Synge publicaram um trabalho no qual


descreveram a cromatografia por partio (cromatografia
lquido-lquido) e anteciparam o surgimento da CG e a
3 CLAE (Nobel de 1952).
4
5
CLASSIFICAO DA CROMATOGRAFIA PELAS FORMAS FSICAS

CROMATOGRAFIA
Critrio de
classificao

Tcnica Em coluna
Planar

Fase mvel Lquido Gs Fluido Lquido


supercrtico

Fase Lquido Slido Fase Lquido Slido Fase Slido Fase Lquido Slido Fase ligada
ligada ligada ligada
estacionria

Tipo de CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CLS CE
CLFL CTI CB
cromatografia

CP: cromatografia em papel CLS: cromatografia lquido-slido


CCD: cromatografia em camada delgada CE: cromatografia por excluso
CGL: cromatografia gs-lquido CLFL: cromatografia lquida de fase ligada
CGS: cromatografia gs-slido CTI: cromatografia de troca inica
CGFL: cromatografia gasosa de fase ligada CB: cromatografia por bioafinidade
CSS: cromatografia slida supercrtica
CSFL: cromatografia supercrtica de fase ligada
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CLL: cromatografia lquido-lquido
Classificao da cromatografia com base
na polaridade relativa das fases

Gasosa (fase mvel inerte, a amostra


interage apenas com a fase estacionria)
Lquida (a polaridade de ambas as fases
importante)
- fase normal (fase estacionria mais polar que
a mvel)
- fase reversa (fase estacionria menos polar
que a mvel)

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Classificao da cromatografia com base
no mecanismo de separao

Processos fsicos, qumicos e mecnicos

Processos fsicos
Soro - adsoro: CCD, CGS, CLS e
cromatografia supercrtica com fase estacionria
slida (CSS)

Absoro ou partio: CP, CGL CLL


Ambos baseiam-se em atraes eletrostticas

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Processos qumico
Cromatografia de troca inica (CTI)
Fase estacionria: matriz polimrica com grupos funcionais
ionizveis
Trocadores catinicos (stios ativos carregados
negativamente)
Trocares aninicos (stios ativos carregados
positivamente)
SO3H CH2N+(CH3)3Cl-

SO3H CH2N+(CH3)3Cl-

1 2

1 cido sulfnico ligado a copolmero de estireno-divinilbenzeno


2 Sal de amnio quaternrio ligado a copolmero de estireno-divinilbenzeno

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W X
Z
B+ C++ + +
+

X
X
+ X
X Z C++ +
B+ C++ Z W+ + -
+ X +
+
X
X - + -- B+ - - - W +

+ - X C++ - C++ +

+
C++ Z+
W
+ W+
X X X X Z W
+ + + + + +
B+ B+ B+ C++ C++ C++
X W
+ B+ C++ +

a b c e f

Esquema do mecanismo de troca inica


B+ e C+ so materiais a serem separados. X+, Z+ e W+ so ons contidos
nos eluentes 1, 2, e 3 respectivamente.
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Processo mecnico
Cromatografia por excluso (CE)
Separa molculas de acordo com o tamanho
Molculas maiores eluem primeiro e as pequenas por ltimo

Representao grfica do princpio da cromatografia por excluso


11
Cromatografia por excluso (CE)
"Fase estacionria": matriz de composio inerte com
partculas de tamanho e porosidade uniformes.

Gel - material elstico contendo gua, ou seja, uma estrutura


tridimensional, contendo ligaes cruzadas, onde os espaos
no ocupados pelo material contm lquido.

Tipos de materiais que podem formar gis:


Polissacardeos de frutas e razes, protenas, silicatos
inorgnicos e fosfatos

Exemplo: gis de dextrano (Sephadex) - um polissacardeo


com unidades de glicose, obtido pela fermentao da sacarose

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Tipos de Sephadex
G-10, G-15, G-25, G-50, G-75, G-100, G-150, G-200 (o
nmero representa a quantidade de mL de gua absorvido
por 1 g de gel x 10)

Sephadex LH-20
Preparado por hidroxipropilao do Sephadex G-25
Limite de excluso: MM = 5000
Aplicaes: separao de substncias polares e apolares
Dependendo do eluente, alm da excluso, outros
mecanismos tais como partio e adsoro podem atuar
reciclvel e o gasto de solvente mnimo,
compensando o alto custo
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CB: antgeno (anticorpo)
enzima (protena)
lectina (acar)

Esquemas dos mecanismos cromatogrficos


14 a: adsoro; b: partio; c: troca inica d: bioafinidade
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Consiste na separao dos componentes de uma


mistura atravs da migrao diferencial sobre uma
camada delgada de fase estacionria retida sobre uma
superfcie plana.
Vantagens
Fcil compreenso e execuo
Rapidez
Versatilidade
Grande reprodutibilidade
Baixo custo

Aplicaes da CCD
Comparativa ou analtica (camadas de 0,25 mm)
Preparativa (camadas de 0,5 a 1 mm)
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Mecanismo de separao
Principalmente adsoro
Partio e troca inica

Tipos de substncias analisadas por CCD


Separao de substncias hidrofbicas: aldedos,
cetonas, fenis, cidos graxos, alcalides
terpenides e esterides

Hidroflicas: aminocidos (placas desativada


com vapor d' gua ou eluente contendo gua,
mecanismo de separao semelhante ao da
cromatografia em papel)

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Fases estacionrias
Slica, alumina, celulose e poliamida (mais usados)
Outros: Uria e polietileno (separar cidos graxos)
silicato de clcio ou magnsio (separar acares)
gel de dextrana (separar aminocidos e protenas)
carvo ativado (separar fenis)

Slica (SiO2) - cido silcio amorfo


Mais usado (cromatografia por adsoro)
Altamente poroso
Crater fracamente cido (pode conduzir
reaes cido-catalisadas das
amostras, formando artefatos)
Polar (fase normal)
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Quim. Nova 2005, 28, 544-547
Simbologia utilizada na slica produzida pela Merck

G: contm aglutinantes (10-15% de gesso, ou 1-3% de


amido ou talco)
H: no contm aglutinates
P: para uso em camada preparativa
F: indica a presena de substncias fluorescentes
(indicao do comprimento de onda da excitao da
substncia incorporada). Exemplo: PF254; PF366; PF254+366;
GF254

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PREPARAO DA FASE REVERSA
Pode ser preparada a partir de gel de slica (Woelm, 32-63 m)
com n-octadeciltriclorosilano, pelo mtodo de Evans et al., 1980

Fase reversa versus fase normal


Fase reversa Fase normal
Polaridade da fase estacionria Baixa Alta
Polaridade da amostra Apolar Polar
Fora de eluio MeOH diminui MeOH aumenta
Ordem de eluio Mais polar 1o Menos polar 1o
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Preparao das placas analticas
25 g de slica + 50-60 mL de gua
5 placas de 20x20 cm com espessura da camada de 0,25 mm
Observao: existem disponveis placas pr-fabricadas

Aplicao da suspenso de slica nas placas


Manualmente
Com espalhadores (manuais e automticos)
Placas: lavadas com detergente, soluo sulfocrmica, gua corrente e
secas em estufa. Para eliminar toda gordura, recomenda-se passar na placa
depois de seca, um chumao de algodo embebido em acetona ou hexano

Aps a aplicao da camada de adsorvente sobre a placa, ela seca ao


ar livre. Quando a superfcie ficar opaca, dependendo da finalidade,
coloca-se para ativar

Ativao das placas


Slica e alumina: 105-110 oC por 30 a 60 minutos
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Seleo da fase mvel

Depende da natureza qumica das substncias a serem


separadas (origem da amostra)

Solvente ou mistura de solventes

Toma-se como base a srie eluotrpica dos solventes

Srie eluotrpica - ordenao dos solventes com base em


suas polaridades, as quais esto diretamente relacionadas
com o poder de eluio

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Srie eluotrpica, em ordem crescente de polaridade*
Solvente
Hexano
ter de petrleo
Ciclo-hexano
Tetracloreto de cabono
Benzeno
Tolueno
Diclorometano
Clorofrmio
ter etlico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
Etanol
Metanol
cido actico
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Algumas fases mveis ordenadas em funo de suas polaridades

Solubilidade em Constante
Solvente gua g/100 mL dieltrica (20 oC)
ter de petrleo (30-60 oC) imiscvel 1,84
Hexano imiscvel 1,88
Benzeno 0,08 2,29
ter etlico 7,5 4,34
Clorofrmio 0,82 4,80
Acetato de etila 8,6 6,02
Diclorometano 0,6 10,40
Butan-2-ol 12,5 17,80
Acetona miscvel 21,50
Etanol miscvel 24,60
Metanol miscvel 33,60
gua miscvel 80,40

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Aplicao de amostras em cromatoplacas
Cromatoplacas analticas
Em foma de solues em solventes volteis (0,1 a 1%),
usando micropipetas (determina a quantidade aplicada) e
capilares
Ponto de aplicao: 1,5 a 2 cm acima da borda inferior
Distncia aproximada entre as gotas das amostras: a 1 cm

Cromatoplacas preparativas
Solues mais concentradas aplicadas na forma de faixa
(linha)
Cerca de 2 cm da borda inferior
A aplicao feita a mo, utilizando micropipetas ou
aplicadores (manuais ou automticos)

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Formas de desenvolvimento
Unidimensional ascendente (mais usado)
As cubas (de vidro, fundo plano) devem ter junto s paredes
um pedao de papel de filtro que permita que a fase mvel suba
por ele e sature bem rapidamente seu interior
Volume da fase mvel: suficiente para cobrir o fundo da
cuba (0,5 a 1 cm) e no ultrapassar o ponto de aplicao da
amostra na placa (1,5 a 2,0 cm)
As placas so colocadas na cuba verticalmente, apoiadas no
fundo e inclinada nas laterais.

Bidimensional
A amostra colocada em um ngulo da placa e o cromatograma
desenvolvido em um sentido. A placa retirada da cuba, seca e,
aps um giro de 90 oC, desenvolvida em um segundo sentido,
utilizando uma fase mvel diferente.
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Revelao dos cromatogramas
A visualizao das substncias incolores feita atravs de
mtodos: fsicos, qumicos ou biolgicos

1) Mtodos fsicos (no destrutivos, indicados para CCDP)


Luz ultravioleta - muitos compostos (conjugados)
tornam-se fluorescentes quando excitados por esta
radiao (254 e 366 nm).
Quando as substncias no so fluorescentes, utiliza-se
adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes e neste
caso, observa-se machas escuras contra fundo claro

Substncias radioativas podem ser localizadas atravs de


contador de radiaes (tipo Geiger) ou de auto-
radiografia
Iodo (compostos insaturados)
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2) Mtodos qumicos (destrutivos)
Soluo de sulfato crico, H2SO4 concentrado, Vanilina
sulfrica
Reagente Dragendorff (alcalides)
Soluo de Ninidrina (aminocidos)

3) Mtodos biolgicos
Reaes enzimticas ou bacterianas

Documentao dos cromatogramas


As placas aps revelao podem ser desenhadas,
fotografadas, fotocopiadas ou "escaneadas"
A camada de adsorvente pode ser retirada pela formao
de uma pelcula plstica flexvel sobre a superfcie resultante
da borrifao com reativos especiais como o "Neatan"
(propionato de vinila) da Merck.
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Alise quantitativa em CCD
Diretamente sobre a camada de adsorvente, exemplo:
densitometria (determina a rea e a intensidade da
mancha).
Retirado da placa a rea que contm a substncia, que
ento extrada e quantificada.

Aplicaes da CCD
Anlise de substncias orgnicas e inorgnicas
Acompanhamento de reaes em sntese
Acompanhamento de processos de purificao
Critrio de pureza
Identificao de subtncias

Critrio de pureza - a mostra pura dever originar uma


nica mancha quando a placa desenvolvida em vrios
eluentes
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Aplicaes da CCD

Identificao de substncias
As amostras analisadas so consideradas iguais
quando apresentam o mesmo Rf (fator de reteno) e
colorao aps serem reveladas

Fator de reteno - Rf

Distncia(cm, mm) percorrida pela substncia (b ou d )


Rf
Distncia(cm, mm) percorrida pela frenteda fase mvel ( y)
29
Fase estacionria
1) Preparao da cuba

2) Aplicao da amostra na placa

Fase mvel

Frente do solvente

Solvente 4) Revelao

3) Desenvolvimento 5) Documentao do cromatograma

Etapas principais da cromatografia em camada delgada


30
Exemplos de cromatogramas obtidos CCD

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Hexano-AcOEt (8:2) CHCl3-MeOH (9:1) CHCl3-MeOH-H2O (65:30:5)

Cromatograma dos extratos de cascas do bacuri obtidos em CCD


1: Ext.acetona; 2: Ext. AcOEt; 3: Ext. EtOH-1; 4: Ext. H2O Revelador: soluo de Ce(SO4)2
31
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Eluente: hexano-AcOEt (8:2) Eluente: CHCl3-MeOH-H2O (65:30:5)


Revelador: soluo de Ce(SO4)2 Revelador: soluo de Ce(SO4)2

1: Ext. EtOH; 2: F. Hex; 3: Ppt-Hex/F. hidroalc; 4: F. Etrea; 5: F. AcOEt; 6: F.


Aquosa 2 L de solues de amostra a 15 mg/mL

Partio de 200 g de Ext. EtOH (1) 60 g F. hex (2) + 24 g F. etrea (4) + 21 g F.


AcOEt (5) + 75 g F. aquosa (6)
CCD de leo vegetal e biodiesel

O
O R
R O NaOH O OH
O 3R + HO
MeOH
O OCH3 OH
O biodiesel glicerol
triacilglicerol
R (ster metlico)

1 2 3 4 5

Cromatograma em camada delgada do leo e biodiseis de pinho manso


leo de pinho-manso (1), biodieseis metlico (2) e etlico (3) dos leos degomado
com gua, biodieseis metlico (4) e etlico (5) do leo degomado com H3PO4.
Eluente: hexano/AcOEt (95:5); revelador: vapores de iodo

Arajo et al. Renewable Energy 2014, 71, 495


34
A B

Resina H
12 H
13
Amirinas

3 H H
Diis HO HO
-Amirina -Amirina

H H
Figura 2: Cromatograma em camada delgada de gel
de slica. Eluente: hexano-acetato de etila (8:2)
revelador: soluo de sulfato crico OH OH
H
A: imediatamente aps a revelao H
B: 15 min. aps a revelao HO HO
Amirinas: e -amirina; Diis: brena e maniladiol Brena Maniladiol

Figura 1: Estruturas dos principais constituintes da


resina de almcega
36
Problemas:
Uma alquota de 2 mg de mistura composta por um
alceno, uma cetona e um lcool contendo 15 tomos de
carbono cada foi analisada por CCD de gel de slica,
usando como eluente hexano-AcOEt (9:1).
1. Indique a ordem de eluio destas substncias na placa
apresentada no sistema a seguir.
2. Este tipo de cromatografia de fase normal ou reversa?
Analtica ou preparativa?

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Quantas manchas seriam observadas no cromatograma
obtido em CCD em gel de slica da mistura das substncias 1-
4? O eluente usado foi hexano-AcOEt (8:2).
Este tipo de cromatografia de fase normal ou reversa.
Justifique.
Desenhe o cromatograma desta separao.
Qual o componente a apresentar o menor Rf?

H H H
H H H H H H
HO HO HO
2
1 3

H H
38 O
4
Cromatografia em Camada Delgada de Alta
Eficincia (CCDAE)

Semelhante CLAE, diferem apenas no aspecto


prtico

Na CLAE as separaes so realizadas utilizando-


se colunas metlicas, sendo a fase mvel eluda a
altas presses

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Comparao entre CCD e CCDAE
Parmetro CCD CCDAE
Tamanho usual da placa 20x20 cm 10x10 cm
Volume aplicado de cada amostra 1 - 5 L 0,1-0,2 L
Nmero de amostras por placa 7 - 10 10-20
Dimetro da mancha 3 - 6 mm 1 mm
Distncia de migrao do solvente 10 - 15 cm 3 - 6 cm
Tempo de corrida 30 - 200 min 3 - 20 min
Dimetro mdio da partcula de slica 20 m 5 m
Limite de deteco
por absoro de luz ~5 ng ~0,5 ng
por fluorescncia ~0,1 ng ~0,01 ng
Pratos tericos at 600 at 5000
40
CHROMATOTRON

Equipamento que consiste de uma CCD com


desenvolvimento circular, em um disco de 24 cm de
dimetro com uma camada de adsorvente de 1 a 4 mm de
espessura.
O processo cromatogrfico se desenvolve do centro para
as bordas.
O disco submetido a um movimento circular de
velocidade controlada.
Vantagem: rpidas separaes preparativas, de amostras
com quantidades de 0,1 a 1,0 g

41
Cromatografia lquida em coluna
Classificao:
I) Cromatografia lquida clssica
II) Cromatografia lquida sob presso

I) A Cromatografia lquida clssica ou cromatografia


lquida por fora da gravidade (colunas de vidro
abertas ou seja presso atmosfrica)
Utilizase 30 mg de amostra/g de fase estacionria
(~1:30) para valores de Rf bem distintos
comum usar 10 de amostra/g (~1:100) de fase
estacionria
Permite se obter uma coluna de comprimento
maior, resultando em uma melhor resoluo
O aumento do dimetro s permite a utilizao
42 de maior quantidade de amostra
Cromatografia lquida clssica
(cromatografia lquida por fora da gravidade)

Mecanismos de separao da CLC


lquido-slido (adsoro)
lquido-lquido (partio)
troca inica
Excluso

43
Cromatografia em coluna (adsoro)
Dimenses da coluna dependem da quantidade de material
a ser cromatografado (podendo ser at uma bureta)

A atividade do adsorvente (atividade cromatogrfica) traduz


a fora de adsoro

A atividade cromatogrfica aumenta sobre substncias


polares na seguinte ordem:
-CO2H -OH -NH2 -SH -CHO -COR2 -CO2R
-OCH3 -CH = CH-

44
Fases estacionrias para CC

*Atividade na escala Brockmann


Atividade I aquecimento a 400 oC por 4 horas
Atividade II 2-3% de gua
Atividade III 5-7% de gua

Tamanho da partcula
Adsorvente Atividade* malha m
xido de alumnio bsico I 70-230 63-200
xido de alumnio neutro I 70-230 63-200
xido de alumnio cido I 70-230 63-200
xido de alumnio neutro II e III 70-230 63-200
Celulose microcristalina - 70-230 63-200
Slica gel (c. Silcico) II e III 70-230 63-200
45
Cromatografia em coluna

A escolha do eluente feita por CCD

Enchimento (empacotamento) da coluna


1. Coloca-se um pequeno chumao de algodo
na extremidade inferior da coluna
2. Coloca-se a suspenso do adsorvente na coluna
contendo 1/3 de volume da fase mvel
3. Deixa-se escoar a fase mvel at ficar uma
camada de 2-3 cm de espessura acima da fase
estacionria
Evitar deixar a coluna secar (rachaduras)

46
Cromatografia em coluna
Aplicao da amostra na coluna

Proporo amostra:adsorvente = 1:30


(mnimo)
Coloca-se a amostra no topo da coluna
1. Dissolvida num volume mnimo do
solvente com o qual foi empacotada a
coluna
2. Dissolvida em outro solvente, misturada
com o adsorvente e posteriormente feita a
evaporao deste solvente (farofa)
Relao amostra-adsorvente: 1:1 ou no
mximo 1:3
47
Cromatografia em coluna
Volume Morto VM

o volume de solvente que se encontra nos


interstcios da fase estacionria
A = volume real do solvente (por ex. 20 mL)
B B = volume aparente do solvente
C = volume real do adsorvente (slica-gel)
D C=BA
D = volume aparente do adsorvente
D C = volume morto para o adsorvente = VM
P = massa do adsorvente (por ex. 10 g)

25 mL
48 Fator VM =1,6 determinado para o solvente hexano
Cromatografia em coluna - CC
Eluio
Descendente, portanto ocorre por ao da
gravidade

Isocrtica ou com gradiente

O volume das fraes que a metade do volume


morto

A verificao da pureza das fraes feita por CCD

49
rea de pesquisa nas quais a CC utilizada

Separar e purificar reagentes e materiais obtidos por


sntese;

Separar e purificar produtos naturais;

Separar esterides de urina ou de sangue, etc, em


laboratrios de anlises clnicas.

50
Problemas:
Uma mistura (2 mg) composta por um
alceno, uma cetona e um lcool, contendo 15
tomos de carbono cada, foi analisada por CCD
de gel de slica, usando como eluente hexano-
AcOEt (9:1).
Na separao em coluna clssica de gel de
slica foram aplicadas 200 mg da mistura e
como eluente hexano-AcOEt (95:5).
1. Indique a ordem de eluio destas
substncias da coluna.
2. A cromatografia clssica em coluna de gel de
slica de fase normal ou reversa? Analtica
ou preparativa?
3. Qual dos eluentes usados tem maior fora de
eluio? Por que na cromatografia em coluna
51 foi reduzida a proporo de AcOEt?
II. Cromatografia lquida sob presso
Cromatografia flash (aproximadamente 2 bar/30 psi)
CL a baixa presso (Lobar) (< 5 bar/75 psi)
CL a mdia presso (CLMP ou MPLC) (5 - 20 bar/75 -
300 psi)
CL a alta presso (CLAE ou HPLC) (> 20 bar/300 psi)
Denominada tambm cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE) usa colunas metlicas fechadas. A fase
mvel eluda sob alta presso, obtida com auxlio de
bombas

52
Relao amostra e tipo de cromatografia

CLAE analtica
CLAE preparativa

CL baixa presso

CL flash

CL mdia presso

1 mg 10 mg 100 mg 1g

Adaptado de AQUINO NETO, F.R.; NUNES, D.S.S. Cromatografia:


53
princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro, Intercincia, 2003.
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE)

Outras denominaes para a CLAE


Cromatografia lquida: de alta velocidade, alta presso,
alto desempenho, alta resoluo e alta eficincia.
Utiliza instrumentos sofisticados (automatizados)
Emprega pequenas colunas fechadas, recheadas com
materiais especialmente preparados e reaproveitveis
Fase mvel eluda a altas presses

Em 1968 j era possvel


Rechear colunas com partculas de pequeno tamanho
fundamental para se obter alta resoluo
Adquirir equipamentos que funcionasse a altas presses,
necessrias ao aumento da velocidade de eluio
Avanos nos ltimos anos

Desenvolvimento
de detectores espectrofotomtricos
que operam com comprimentos de onda varivel at
190 nm

Acoplamento com os espectrmetros de massas e de


RMN

Estes avanos possibilitaram a deteco da maioria dos


compostos orgnicos e a anlise de traos em amostras
complexas tais como: sangue urina, solo, extrato de planta,
alimento petrleo etc
Tcnicas hifenadas
Cromatografia lquida de alta eficincia e
cromatografia lquida clssica

57
Collins et al., 2006
CLAE: quantidade de amostra x dimetro da
coluna x fluxo

(1) Amostra altamente solvel na fase mvel


(2) Separada dos componentes contaminantes
(3) Comprimento da coluna: 250 mm
58 (4) Eluio isocrtica
Tcnicas usadas na CLAE
Cinco tipos de diferentes de fases estacionrias (5
mecanismos )

Cromatografia lquido-slido ou por adsoro

Cromatografia lquido-lquido ou por partio

Cromatografia lquida com fase ligada

Cromatografia por excluso

Cromatografia por troca inica


Cromatografia lquida com fase ligada
A fase estacionria est ligada quimicamente
superfcie de um suporte
Mecanismo principal de separao: partio
(lquido-lquido)
Apresenta tambm influncia dos grupos polares da
superfcie (mecanismo de adsoro)
Natureza dos grupos funcionais da superfcie

Polares: amino (-NH2), nitrilo (-CN) - fase normal

Apolares: octil (-C8H17), octadecil (C18H37),


fenil (-C6H5), etc - fase reversa
Vantagens da CLAE
Menor tempo de anlise (poucos minutos at horas)

Alta resoluo (misturas complexas)

Resultado quantitativos (fcil execuo e grande


preciso)
Boa sensibilidade (detecta na faixa de nanogramas, 10-9
e com detectores especficos, at picogramas, 10-12)
Versatilidade

Aplicada para compostos orgnicos, inorgnicos

Amostras podem ser lquidas ou slidas, inicas ou


covalentes
Os gases no so analisados por CLAE
Limitaes da CLAE
Alto custo da instrumentao
Sistemas mais simples: US$ 7.000 a 20.000
Mais sofisticados: acima de US$ 50.000
Difcil anlise qualitativa
A comparao do tempo de reteno (Tr) no um
mtodo seguro de identificao
Falta de detector universal sensvel
ndice de refrao universal pois responde a todos os
componentes, mais sua sensibilidade limitada
Ultravioleta sensvel, mas seletivo pois s responde
a substncias que absorvem no determinado
Amostras tpicas analisadas pela CLAE

Aminocidos Metablitos de animais e plantas

Explosivos Pigmentos de plantas

Lipdios polares Produtos farmacuticos

Protenas Polmeros sintticos e polissacardeos

Tintas
Separaes difceis so frequentemente
realizadas pela CLAE

Possui duas fases cromatogrficas de interao seletiva


com as molculas da amostra versus uma na CG
Possui uma maior variedade em possveis mecanismos de
separao
Permite a separao de compostos termicamente instveis
a baixas temperaturas
A CLAE no to sensveis nem rpida, como a CG, mas
seu campo de aplicao mais vasto
O equipamento bastante caro

No existe competio entre a CLAE e CG, porque


estas duas tcnicas se complementam e geralmente
analisam tipos de amostras diferentes
Esquema de um CLAE
Substncias separadas por CLAE

Acetogeninas Porcelia macrocarpa (Annonaceae), separadas por CLAE

HO R 1: R = ( )8 ( )5

H3C O O 2: R = ( )8 ( )5

Condies: CLAE preparativa RP-18


Coluna: PerkinElmer series 3B (ODS 2.2 cm d.i. x 25 cm)
Eluente: MeOH-H2O (75:25)
Detector: UV, =230 nm

CHAVES, M.H.; ROQUE, N.F. Phytochemistry, 1997, 44 (3), 523


CROMATOGRAFIA GASOSA - CG
Baseia-se na distribuio diferente das substncias da
amostra entre duas fase:
Fase mvel: gs (N2, He, H2 e Ar)
Fase estacionria: slida (CGS) ou lquida (CGL)

histrico

67
Tipos de substncias separadas por CG

68
Cromatgrafo a gs

Fonte de gs de arraste
Injetor*
Coluna*
Detector*
Registrador
*Injetor, coluna e detector so aquecidos para
vaporizar as substncias, que de acordo com suas
propriedades e da fase estacionria, so retidas
chegando sada da coluna em tempos diferentes.
**Um detector adequado na sada da coluna
possibilita a deteco e quantificao das
substncias.
69
Cromatgrafo a gs

1. Reservatrio de gs e controles de vazo/presso


2. Injetor (vaporizador) da amostra*
3. Coluna cromatogrfica e forno da coluna* Temperatura controlada
4. Detector*
5. Eletrnica de tratamento (Amplificao) do sinal
6. Registro do sinal (Registrador ou Computador)
70
Temperatura da coluna
Constante (CG isotrmica)
Variao linear ou no (CG com temperatura programada)

Programao de temperatura
Melhora a separao e diminui o tempo de anlise
Comea a anlise com a coluna em uma temperatura mais baixa para
eluir as substncias de baixo ponto de ebulio
Durante a anlise a temperatura aumentada para diminuir o tempo
de reteno de substncias de P.E. mais alto
Maior simetria dos picos
Melhora a detectabilidade dos picos com tempo de reteno
excessivamente longos sob condies isotermicas
til quando a amostra composta de substncias com grande
diferena em seus pontos de ebulio.
71
Vantagens da CG

Excelente poder de resoluo


Analisa dezenas de substncias de uma mesma
amostra
Alta sensibilidade (10-12 g dependendo do tipo de
substncia e detector empregados)
Baixa quantidade de amostra
Excelente tcnica quantitativa (concentraes variam
de picogramas a miligramas)
Rapidez
72
Inconvenientes da CG
Empregada na anlise de substncias volteis e estveis
termicamente
Requer pr-tratamento da amostra para que no contamine
a coluna (aumento do tempo e custo da anlise)
leos essenciais: so analisados diretamente, sem pr-
tratamento.
leos fixos: devem ser saponificados e os cidos graxos
extrados e metilados ou so diretamente transesterificados.
No uma tcnica qualitativa eficiente, precisa muitas vezes
de tcnica auxiliares para identificao (CG-EM)
Baixa capacidade preparativa (na faixa de microgramas e
miligramas, com mltiplas injees).
73
Programao de temperatura para leo essencial

60 oC (1 min), 3 oC/min (1 h), 240 oC

CG-DIC: Tinj: 220 oC 240 oC


Tdet: 240 oC

3 oC/min (1 h)
CG-EM: Tinj: 220 oC 60 oC

Tinterface: 240 oC 1'

Coluna DB-5, 30 m (95% metil e 5% fenil polisiloxana - pouco polar)

74 Adams, 2007
Eficincia da coluna
Medida pelo nmero de pratos tericos (n)

Um prato terico = uma etapa de equilbrio da substncia


entre a fase estacionria e a fase mvel.
Quanto maior n maior ser a eficincia (picos mais estreitos)

n = 16(dr/Wb)2

n = no de pratos tericos
dr= distncia de reteno
Wb= largura do pico na linha base

75
Fase mvel em CG
No interage com a amostra, apenas arrasta os
componentes da mistura atravs da coluna,
assim comumente referida como gs de arraste
Requisitos
INERTE No deve reagir com a amostra, fase estacionria
ou superfcie do instrumento
PURA Deve ser isenta de impurezas que possam degradar
a fase estacionria

76
Requisitos
CUSTO gases de altssima pureza podem ser muito caros

A = 99,995%
B = 99,999%
C = 99,9999%

77
DETECTORES

78
FASES ESTACIONRIAS

SLIDOS
colunas recheadas com
material finamente granulado
(empacotadas) ou depositado
sobre a superfcie interna do
tubo (capilar)

79
80
FASES ESTACIONRIAS

81
FASES ESTACIONRIAS
FE Slidas: adsoro

82
FASES ESTACIONRIAS SLIDAS

83
FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS

A absoro ou partio ocorre no interior do filme de FE lquida (fenmeno


INTRAfacial)

84
FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS
Maior parte das aplicaes em CG moderna quatro grandes grupos
POLIGLICIS Muito polares, sensveis a umidade e oxidao, ainda muito
importantes
Principal: polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax,
HP-Wax, etc)

Aminas alifticas
Coluna: 4% Carbowax 20 m
Tcol.: 200 oC (isotmica)
Gs de arraste: N2 @ 20 mL min-1
Detector: DIC
Amostra: 0,01 mL da mistura de aminas

85
FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS

86
FASES ESTACIONRIAS LQUIDAS

Ligao Si-O extremamente estvel = elevada estabilidade trmica e qumica

FE derivada de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituio de CH3 por


radicais em crescente de polaridade:
Fenil 5% - pouco polar
Cianopropil 7% - moderadamente polar
Fenil 50% - moderadamente polar, retm compostos aromticos
Trifluoropropil 50% - moderadamente polar, retm compostos carbonlicos
Cianopropil 50% - polar, retm doadores de eltrons
Cianopropil 100% - altamente polar
87
Moderadamente polar

Pouco polar

88
89
90
Controle teraputico: separao de 14 antiepilpticos ou seus produtos de
91 biotransformao
Comparao entre as caractersticas da CG e da CLAE
Fator CG* CLAE

Amostra ou derivado voltil, termicamente Amostra solvel na fase


Requisitos para amostra estvel (~400o C) mvel

Lquidos, slidos inicos,


Tipo de amostra Gases, lquidos e slidos: MM 2 a 1200 covalentes MM: 32 at
4.000.000
Quant. mnima detectvel 10-12 ga 10--9 gb

Tempo de anlise Minutos at poucas horas Minutos at muitas horas

Pratos tericos por coluna 2.000 -300.000 500 - 25.000

Capacidade preparativa Pobre at razovel, usando mltiplas Boa com facilidade de


injees coleta
Excelente. Separao de amostras com Excelente. Separao de
Capacidade analtica at 200 componentes at 50 componentes

Capacidade de treinamento Cerca de 3 meses Pelo menos 6 meses

*Mais difundida e usada. aDetetor por ionizao em chama; bDetetor por absoro do UV
94
Bibliografia
COLLINS, H.C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P. S. Fundamentos de
cromatografia. Ed da UNICAMP, 2006.
AQUINO NETO, F. R.; NUNES, D.S.S. Cromatografia: princpios
bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro, Intercincia, 2003.
Poole, C. F. The Essence of Chromatography. Elsevier, 2003. ISBN:
0444 50199 1.
McMaster, M. GC/MS: A Practical User's Guide, 2008. ISBN 978-
0-470-10163-6.
Meyer, V. R.; - Practical High-Performance Liquid
Chromatography. 2004. ISBN: 0-470-09378-1.
Artigos cientficos