UNIVERSIDAD DE AMRICA

Vicerrectora Acadmica y de Posgrados

Syllabus de Asignatura

PROGRAMA: Ingeniera Qumica

FACULTAD: INGENIERIAS

NOMBRE ASIGNATURA: Bioprocesos CODIGO: 3677L

NOMBRE DE LA PRCTICA:

PRCTICA No. Cuantificacin Sustrato y Productos (COEFICIENTES DE RENDIMIENTO DE

1 PRODUCTOS Y REACTIVOS EN UN CULTIVO BATCH DE Saccharomyces cerevisiae).

1 INTRODUCCIN Y MARCO TERICO:

La fermentacin involucra el crecimiento de los microorganismos en un sustrato orgnico. Los productos de
fermentacin incluyen, los microorganismos, tambin como los productos orgnicos reducidos y oxidados. Los azcares
son un buen sustrato para que los microorganismos puedan crecer, ya que a partir de estos, se producen dichos
compuestos orgnicos oxidados y reducidos. Los productos de fermentacin varan de acuerdo al tipo de
microorganismo, tipo de sustrato, y factores ambientales, tales como el pH y la temperatura. La fermentacin acido
lctica y alcohlica son dos rutas metablicas comnmente usadas por las clulas, para metabolizar azcares. Las
levaduras en mayor proporcin la ruta de la fermentacin alcohlica (en condiciones anaerbicas). Una hexosa produce
dos moles de CO2 y dos moles de etanol por gramo de azcar (glucosa) utilizada. El rendimiento terico de etanol es
51,1% en peso. El proceso genera dos molculas de ATP por molcula de azcar utilizada, el cual puede ser
considerado como energa para los microorganismos. Algunos microorganismos, usan el oxgeno molecular, en su
metabolismo y crecen aerbicamente. Este proceso es conocido como respiracin. La respiracin es mucho ms
eficiente que el proceso de fermentacin anaerbico, ya que produce 38 moles de ATP por mol de azcar utilizado.
Saccharomyces cereviciae es capaz de crecer ya sea con presencia de oxgeno o sin presencia de este compuesto
(Facultativo). Si hay suficiente O2 disponible, la levadura, preferir el uso de la ruta metablica de la respiracin (cidos
tricarboxlicos), reduciendo el consumo de azcares y la produccin de etanol. Sin embargo hay una mayor generacin
de biomasa por unidad de azcar consumido.

2 OBJETIVO(S):
Determinar los coeficientes de rendimiento de los compuestos que intervienen en la fermentacin batch (por lotes)
mediante el uso de tcnicas experimentales y tericas.

3 EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y/O MATERIALES:

Equipos

pH-metro (1)
Espectrofotmetro (con sus respectivas celdas)
Balanza analtica (1)
Balanza 300 gr a 3 kg (1)
Plancha de calentamiento y agitacin (2) con 2 agitadores magnticos
Bao Termostatado (1)
Centrifuga (1)
Shaker o agitador mecnico (1)
Microscopio (1)
Horno o Mufla a 100C

Reactivos

Agua destilada
NH3

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MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
K2HPO4
Glucosa
Levadura liofilizada o Fresca (estudiantes)
Solucin de DNS (Preparacin segn la IUPAC semestre anterior) 1 L
Solucin del glucosa (2 g/l) 50 mL
Reactivos tincin de gram (lugol, cristal violeta, acetona, safranina)
Aceite de inmersin
1 litros solucin medio de cultivo: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O
0,08 g/l, K2HPO4 2g/l y Glucosa 10 g/l. Ajustar pH de la solucin a 5.
1 litros solucin medio de cultivo: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O
0,08 g/l, K2HPO4 2g/l y Glucosa 15 g/l. Ajustar pH de la solucin a 5.

Materiales

Gasa (estudiantes)
Algodn
Erlenmeyer de 250 ml (3)
Probeta de 100 ml (3)
Tijeras (estudiante)
Agitadores Magnticos (1)

Vidrios de Reloj (2)
Papel o toallas para secar
Tubos falcon (8)
Micropipetas y puntas 2
Alcoholmetro
Pipetas 10 ml (2)
Vaso de precipitado de 500 ml (2)
Tubos de ensayo de 10 ml (7) Por cada estudiante
Porta objetos (estudiantes)
Mecheros (1)
Pipeteador (pera) (1) Por estudiante
Pipetas pasteur
Microespatulas (1)
Gradilla (1) Por estudiantes

Las cantidades sealadas frente a cada uno materiales se entienden para un grupo.
Tres estudiantes por prctica

4 MTODOS Y PROCEDIMIENTOS:
Preparacin del medio de cultivo.

Prepare con la ayuda de una probeta de 100 ml, dos soluciones de 100 ml de medio de cultivo que contenga cada una
los siguientes compuestos: NH3 3 gr/l; MgSO4*7H2O 0,11 g/l, CaCl2*2H2O 0,08 g/l, K2HPO4 2g/l. La glucosa se
evaluar a dos concentraciones 10 y 15 g/l (de acuerdo al diseo del experimento consultar con el profesor el ensayo
que le corresponde). Para tapar cada uno de los frascos haga tapones con la ayuda de gasa y algodn. Mida el pH de la
solucin y ajuste para dejarlo en un valor de 5. Una vez obtenido los medios (con su respectiva fuente de carbono),
esterilizar cada uno en auto clave a 121 C, 15 psi por 15 minutos. Si no se cuenta con autoclave, disminuya la carga
bacteriana calentando el medio hasta ebullicin dejando los medios a esa temperatura por 5 minutos. Dejar enfriar los
medios a temperatura ambiente.

Inoculacin

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Inocule de acuerdo al diseo del experimento, cada uno de los frascos (consulte con el profesor el ensayo que le
corresponde) en una proporcin de 0,5 g/l y 1 g/l de levadura. Activar en bao de mara a 38 C por 20 minutos.
Despus de esto, secar los frascos.

Fermentacin
Bajo las condiciones anteriormente descritas (segn corresponda a su grupo) previamente se han llevado tres unidades
experimentales a fermentacin, tendrn 24, 48 y 72 horas respectivamente.
Tome cada una de estas unidades experimentales y djelas reposar, con el fin que la biomasa precipite.

Medicin de producto
Cuidadosamente vierta el contenido de cada unidad experimental en una probeta de 100 ml y con ayuda de un
alcoholmetro, determine los grados Gay-Lussac contenidos en el volumen depositado en la probeta.
Posterior a ello, devuelva el contenido al Erlenmeyer agite vigorosamente y determine la concentracin final de biomasa
y glucosa, para cada unidad experimental, conforme el siguiente apartado.

Muestreo y Ensayos

Determinacin de Biomasa

Con una solucin stock de biomasa, realizar las siguientes diluciones:

Tubo Sln stock Biomasa Medio de cultivo Absorbancia Concentracin

(mL) (mL) (540 nm) Biomasa
(g/L)
0 0 5
1 0.5 4.5
2 1 4
3 1.5 3.5
4 2 3
5 2.5 2.5
6 3 0

Posterior a realizar las diluciones, para hallar la concentracin de Biomasa de la muestra stock, pesar tres
tubos de vidrio secos, distribuir el volumen de la muestra stock de biomasa y llevar al horno o mufla durante 48
h, posterior pesar nuevamente los tubos y determinar el peso seco de la biomasa. El peso de la biomasa (base
seca) es la diferencia entre el tubo con el sedimento menos el tubo vaco.

Para determinar la concentracin inicial de biomasa y glucosa, sacar una muestra de cada uno de los cultivos en los
tiempos determinados. Para la biomasa tomar 10 ml de muestra y medir la absorbancia (en caso que supere el valor
0.99, realizar diluciones), posterior a ello, colocarla en un tubo falcon (previamente pesado) y centrifugar a 9000 rpm por
6 minutos. Depositar el sobrenadante en otro tubo (prueba DNS) y pesar nuevamente. El peso de la biomasa (base
hmeda) es la diferencia entre el tubo con el sedimento menos el tubo vaco.

Determinacin de Azcares

Curva Patrn
Para realizar la curva patrn, tomar 2 mL de muestra y agregar 2 mL del reactivo DNS, mezclar y llevar a reaccin:

Sumergir los tubos con la muestra (tubos de ensayo con muestra y DNS) en agua hirviendo por 5 minutos. Despus,
realizar un choque trmico y llevar los tubos durante 5 min a un bao de hielo.
Tomar las muestras y medir la absorbancia con el espectrofotmetro a 540 nm. El tubo cero corresponde al blanco.
Si la absorbancia de la muestra, registra un valor mayor a 1,0; diluir la muestra 5 o 10 veces, de acuerdo a la intensidad
del color. Tener en cuenta el factor de dilucin en el clculo de la concentracin de la glucosa (factor de dilucin =
Volumen final/volumen de tomado de la muestra). Se debe multiplicar el factor de dilucin a la concentracin de glucosa
determinada, para hallar el valor real. Hallar la ecuacin de la recta (correlacin concentracin de glucosa vs
absorbancia)

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Curva de Calibracin de Glucosa

A partir de una solucin stock de Glucosa (2g/L) prepare las siguientes diluciones:

Tubo Sln stock Glucosa Agua destilada Absorbancia Concentracin

(mL) (mL) (540 nm) Glucosa
(g/L)
0 0 5
1 0.5 4.5
2 1 4
3 1.5 3.5
4 2 3
5 2.5 2.5
6 3 0

Cuantificacin de sustrato en las muestras

Para determinar el contenido de glucosa en los cultivos, tomar 2 ml de muestra del sobrenadante del proceso anterior y
2 ml del reactivo DNS, mezclar.

Sumergir los tubos con la muestra (tubos de ensayo con muestra y DNS) en agua hirviendo por 5 minutos. Despus,
realizar un choque trmico y llevar los tubos durante 5 min a un bao de hielo.
Tomar las muestras y medir la absorbancia con el espectrofotmetro a 540 nm. El tubo cero corresponde al blanco.
Si la absorbancia de la muestra, registra un valor mayor a 1,0; diluir la muestra 5 o 10 veces, de acuerdo a la intensidad
del color. Tener en cuenta el factor de dilucin en el clculo de la concentracin de la glucosa (factor de dilucin =
Volumen final/volumen de tomado de la muestra). Se debe multiplicar el factor de dilucin a la concentracin de glucosa
determinada, para hallar el valor real. Utilizar la ecuacin lneal de la curva de calibracin (correlacin concentracin de
glucosa vs absorbancia) para determinar la concentracin del azcar.

Tincin de Gram.

Realice tincin de Gram, sus respectivos microorganismos, tomado un porta objetos y aplicndole una gota de agua
destilada. A esta gota agregarle una pequea cantidad de biomasa (levadura) (no exceda la cuarta parte de la gota) y
extenderla por todo el porta-objetos, dejar secar y aplicar el procedimiento de tincin de Gram.

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5 CLCULOS Y RESULTADOS:

6 ANEXOS: