PRCTICA N3

DEGRADACIN DE PETRLEO POR BACTERIAS

HIDROCARBUROCLSTICAS

I. INTRODUCCIN:

El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha generado a escala mundial, un

problema de contaminacin de suelos, aire y agua. Entre las ms severas contaminaciones se
destacan las que se produjeron y todava se producen a causa de la extraccin y el manejo del
petrleo en todos los pases productores de hidrocarburos.

A nivel mundial, el volumen de derrame de petrleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas

mtricas por ao y en nuestra regin (Pacfico Sudeste) es de 6000 toneladas mtricas al ao.
En el Per se registran derrames de petrleo desde 1978, uno de ellos fue el producido en el
oleoducto marino de Talara y el producido el 30 de enero del 2008 en el que, debido a una
explosin producida en un barco carguero, se derramaron frente al mar de Tumbes 1300 barriles
de crudo de petrleo. Pero no slo derrames mayores causan contaminacin sino tambin los
constantes derrames accidentales en suelos de nuestra selva, los que se producen por el
rompimiento del Oleoducto Nor-Peruano, debido a accidentes naturales y por la actividad
extractiva.

En el medio ambiente existen microorganismos que presentan funciones catablicas que

permiten el consumo del petrleo y su conversin en energa, masa celular y en productos
biolgicos inofensivos, esto se debe a que los hidrocarburos provenientes de los productos
petroleros pueden funcionar como fuente de carbono y de energa para el crecimiento de
diferentes microorganismos que pueden de este modo, colonizar los sitios contaminados y
degradar el agente contaminante.

El uso de microorganismos representa una mejor alternativa en la degradacin de hidrocarburos

frente a los procesos fsicos o qumicos, ya que estos organismos vivos se encuentran fcilmente
en la naturaleza (en consorcios) disminuyendo la concentracin de hidrocarburos presentes en
el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente.

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II. OBJETIVOS:

Comprobar la efectividad de bacterias hidrocarburoclsticas en la degradacin del crudo de

petrleo.
Evaluar el consumo de petrleo por bacterias hidrocarburoclsticas mediante la
determinacin del crecimiento microbiano al inicio y al final del proceso.

III. MARCO TERICO:

a) Petrleo o crudo de petrleo:

El petrleo es un combustible natural compuesto de varios tipos de hidrocarburos, es decir, de

molculas que contienen bsicamente, carbono e hidrgeno. Estas molculas pueden estar
formadas de cadenas de tomos de carbono largas o cortas y que pueden adoptar diferentes
estructuras. Los hidrocarburos del petrleo pueden dividirse en cuatro categoras de
compuestos:

I. Los saturados: los alcanos como el hexano, el octano, el decano, el hexadecano, los
isoalcanos y los cicloalcanos como el ciclohexano.
II. Los aromticos: benceno, tolueno, xileno y naftaleno agrupados tambin bajo la
apelacin BTEX y los poliaromticos o PAHs.
III. Las resinas: slidos polares amorfos disueltos que contienen nitrgeno, azufre y
oxgeno.
IV. Los asfltenos: grandes molculas polares coloidales sin disolver que son ms
resistentes a la biodegradacin.

En trminos generales, de un 70 a un 97% de los hidrocarburos del petrleo es degradable (la

fraccin de hidrocarburos saturados y aromticos) y el resto representa los asfaltenos y las
resinas esencialmente inertes (Prince et al., 1999).

Cada una de las categoras agrupa compuestos con caractersticas de solubilidad, volatilidad y
toxicidad propias. Desde un punto de vista de biodegradabilidad, los hidrocarburos pueden
ordenarse de mayor a menor biodegradabilidad en: alcanos lineales > alcanos ramificados >
aromticos ligeros > alcanos cclicos > aromticos pesados > compuestos polares (Olson, et al.,
1999 ; Harris, 1997).

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La elevada complejidad de la composicin del crudo de petrleo y derivados, implica la
existencia de una amplia capacidad enzimtica si se quiere conseguir una degradacin
significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas
bacterianas individuales o con la combinacin de diferentes cepas aisladas.

b) Microorganismos que degradan los hidrocarburos:

Los microorganismos se adaptan o desarrollan su metabolismo en funcin de los parmetros

fsico-qumicos (pH, temperatura, humedad) as como de los compuestos qumicos que se
encuentran en su ambiente inmediato. El petrleo y los hidrocarburos se encuentran
naturalmente presentes en el suelo, lo que ha permitido a muchos microorganismos
acostumbrarse a su presencia y utilizarlos para sobrevivir.

En el caso de los hidrocarburos, las bacterias gram negativas parecen encontrarse ms

adaptadas a estas fuentes de carbono.

Se ha establecido una lista de 160 gneros de microorganismos que degradan los hidrocarburos
(Prince et al., 1999), los consorcios ms empleados contienen las especies Flavobacterium,
Achromobacter, Rhodococcus, Micrococcus, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas,
Aeromonas, Acinetobacter y en menos ocasiones Mycobacterium, Aspergillus, Fusarium,
Penicillium, Rhodotorula y Candida.

Los microorganismos aislados en suelos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que

permiten la oxidacin de algunas fracciones del petrleo. Esta oxidacin cambia las propiedades
de los compuestos hacindolos susceptibles a ataques secundarios y facilitando su conversin a
bixido de carbono y agua.

En la mayora de los casos, son degradadores de alcanos, debido a que los alcanos son los
componentes ms abundantes del crudo de petrleo. No obstante en algunos casos, algunos
microorganismos tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alqulicas de ciertos
HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo.

Es importante estudiar qu poblaciones existen en el suelo contaminado ya que estas

probablemente ya se habrn adaptado al ambiente contaminado. Las poblaciones nativas
pueden ser sensibles a la presencia y la actividad de poblaciones extranjeras especializadas.

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IV. MATERIALES:

a. Materiales y Equipos de Laboratorio:

Placas petri Tubos de ensayo Pipetas Frascos de vidrio

Perlas de vidrio Incubadora Autoclave Biorreactor

b. Medios de cultivo y reactivos:

Solucin salina fisiolgica

Plate count Agar
Agar nutritivo
Agar petrleo 1%
Crudo de petrleo
Medio base:

COMPONENTE g/L
K2HPO4 1.5
KH2PO4 0.5
(NH4)2SO4 0.5
NaCl 0.5
MgSO4 3.0
CaCl2 0.002
Agua destilada 0.002

c. Material biolgico:

Cepas de bacterias hidrocarburoclsticas

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V. PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACIN DEL INCULO:

Se reactiv las cepas hidrocarburoclsticas en agar petrleo al 1% y se incubo a temperatura

ambiente por 7 das.
Se realiz la proliferacin celular en dos placas, una con agar nutritivo y otra con plate count,
se incub a 37C por 24 horas.

Pasadas las 24 horas se procedi a cosechar las clulas colocando en las placas con
crecimiento celular 1 ml de medio base y 5 perlas de vidrio estril, se movi suavemente las
placas hasta obtener una suspensin celular la cual se coloc en un frasco de vidrio y se
enraz con medio base hasta 50 ml.

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 Para determinar la concentracin del inculo se realiz diluciones hasta 10-10 y el recuento
celular por incorporacin en placa (37C/ 24 horas).

LA
CONCENTRACIN
DEL INCULO FU:

5 X 108 UFC/ml

2. PREPARACIN DEL BIOREACTOR:

Se arm y se esteriliz un biorreactor de burbujeo.

3. DEGRADACIN DEL PETRLEO:

Se coloc en el biorreactor 950ml de medio base + petrleo al 1% y posteriormente se aadi

9,5 ml del inculo. Se insufl aire estril a 1.1 VVM y se puso en funcionamiento por 4 das.

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 Mediante clculos se determin la concentracin inicial de la biomasa en el biorreactor.

VALORES:

V1: volumen de inculo agregado = 9,5 ml

C1: concentracin celular del inculo = 5 X 108 UFC/ml

V2: volumen de medio en el biorreactor = 950 ml

C2: concentracin celular en el biorreactor al inicio del proceso = ?

V1 x C2 = V2 x C2

9,5 x 5 x 108 = 950 x C2

C2= 5 x 106 UFC/ml

Pasados 4 das se determin la concentracin final de la biomasa en el biorreactor mediante

recuento celular realizando diluciones hasta 10-12 e incorporacin en placa de las cuatro
ltimas diluciones (37C/ 24 horas).

LA CONCENTRACIN
FINAL DE BIOMASA EN
EL BIORREACTOR FU:

4 x 1010 UFC/ml

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VI. RESULTADOS:

La degradacin de petrleo en el biorreactor se mantuvo por 4 das, finalizado este tiempo se

obtuvo los siguientes resultados:

Tabla 1. Recuento celular de bacterias hidrocarburoclsticas

DAS CONCENTRACIN CELULAR

1 5 x 106 UFC/ml
4 4 x 1010 UFC/ml

VIII. CONCLUSIONES:

Existen bacterias hidrocarburoclsticas capaces de degradar el petrleo en condiciones de

laboratorio.
Las bacterias hidrocarburoclsticas emplean el carbono del petrleo para su crecimiento
El biorreactor de burbujeo fue efectivo para el proceso de biodegradacin con
microorganismos aerobios.

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 ANEXOS

1. FLUJOGRAMA DEL PROCESO:

REACTIVACIN DE LA CEPA PROLIFERACIN CELULAR COSECHA

SSF

PERLAS DE
VIDRIO
CEPA DE BACTERIAS SIEMBRA EN PLATE COUNT O
HIDROCARBURO- AGAR PETRLEO AGAR NUTRITIVO
CLSTICAS (T AMB./7 DAS) (37C/ 24 HORAS)
SUSPENSIN
CELULAR
EVALUACIN POR DETERMINACIN
DE CRECIMIENTO DE BIOMASA

DEGRADACIN DEL PETRLEO