Fluorescencia

La fluorescencia es un fenmeno
que fue conocido en el siglo XIX por Excitacin Emisin
Stoke: observ fluorescencia en el Luz mayor
Luz UV
mineral de fluorita

El agua tnica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina.

La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del
rbol de la quina, y tiene propiedades antipirticas, analgsicas y contra la
malaria.
La quinina es una sustancia fluorescente

Bajo luz del sol Bajo luz ultravioleta

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 2
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 Espectrometra de luminiscencia

Emisin de radiacin electromagntica por molculas que excitadas

Cada especie A emite radiaciones de caractersticas Anlisis cualitativo

La intensidad de la radiacin IF es proporcional a la [A] Anlisis cuantitativo

Anlisis cualitativo
Espectro
A A* A + hv de
emisin Anlisis Cuantitativo

Absorcin de Reaccin qumica Analito + (O3 o H2O2)

fotones (hv )

Fluorescencia Fosforescencia Quimioluminiscencia

Cambio de spin del electrn

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 Recorderis

Especie absorbente Tiempo de vida 10-8 s

Descomposicin de Rx fotoqumica
Proceso de relajacin
Reemisin fluorescente
Reemisin fosforescente

Excitacin de
electrones de enlace

Transferencia de carga

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Especies absorbente

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 Especies absorbente

150 a 250 nm

200 a 700 nm
200 a 700 nm
UV Vaco < 185 nm

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Especies absorbente

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 Espectrometra de luminiscencia

A + hvexcitacin A* A + hvemisin hvexcitacin hvemisin

excitacin emisin
E1
hvexcitacin hvemisin
E0
Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia.

Estado electrnico molecular

singlete: los espines de los e- estn
apareados (diamagntico)

Estado electrnico molecular

Estado Estado Estado triplete: los espines de los e- estn
singlete singlete triplete
fundamental excitado excitado desapareados (paramagntico)

Fluorescencia Fosforescencia
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Espectrometra de luminiscencia

Estado Estado Estado

singlete singlete triplete
fundamental excitado excitado

Etriplete < Esinglete

Transicin S/T o T/S es menos probable que S/S

S/T o T/S > 10-4 segundos

S/S entre 10-5 y 10-8 segundos

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Diagrama parcial de energa para un sistema fotoluminiscente

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 Velocidad de absorcin y emisin
La velocidad a la que un fotn de radiacin es absorbido es
grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s

La emisin fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente ms

lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar
del pico de absorcin correspondiente al proceso de excitacin

La emisin fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ms.

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El camino ms probable
hacia el estado Proceso de desactivacin
fundamental es aquel que
minimiza el tiempo de
vida del estado excitado

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 Rendimiento cuntico de la fluorescencia
Rendimiento cuntico de fluorescencia:

= n molculas que emiten fluorescencia/n total de molculas excitadas

= n fotones emitidos/n fotones absorbidos

= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd

K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivacin posibles:
fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversin externa (Kce), conversin
interna (Kci), predisociacin (Kpd) y disociacin (Kd ).

Las variables que conducen a valores altos de KF y valores bajos del resto de velocidades
exaltan la fluorescencia

KF, Kpd, Kd Estructura qumica

Kces, Kce, Kci Entorno qumico
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 Fluorescencia

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 Fluorescencia

Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados

La fluorescencia ms intensa es la que presentan los compuestos que contienen

grupos funcionales aromticos con transiciones * de baja energa

Antraceno Fenantreno

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 Fluorescencia

H
Heterociclos N O S N
sencillos no
fluorescentes
Piridina Furano Tiofeno Pirrol
H
N N
Fusionados con anillos N
bencnicos s presentan
fluroescencia
Quinoleina Isoquinoleina Indol

La sustitucin en el anillo bencnico produce:

Desplazamientos de la de los mximos de excitacin y emisin

Un aumento o disminucin de la intensidad de fluorescencia segn el

sustituyente
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 Fluorescencia
Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y OR,
aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazndola a mayores l.
Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y NO2,
reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transicin n-p *.
Los grupos sulfnicos no modifican significativamente la fluorescencia
Efecto de la sustitucin en la fluorescencia del benceno

Longitud de onda de la Intensidad relativa de la

Compuesto Frmula fluorescencia, nm fluorescencia
Benceno C6H6 270-310 10
Tolueno C6H5CH3 270-320 17
Propilbenceno C6H5C3H7 270-320 17
Fluorobenceno C6H5F 270-320 10
Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7
Bromobenceno C6H5Br 290-380 5
Iodobenceno C6H5I - 0
Fenol C6H5OH 285-365 18
-
In fenolato C6H5O 310-400 10
Anisol C6H5OCH3 285-345 20
Anilina C6H5NH2 310-405 20
+
In anilinio C6H5NH3 - 0
cido benzico C6H5COOH 310-390 3
Benzonitrilo C6H5CN 280-360 20
Nitrobenceno C6H5NO2 - 0
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 Rigidez estructural

La emisin fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una

superficie slida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorcin

= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd

Aumento de velocidad de conversin interna,

produce aumento de desactivacin no radiante

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Disolvente
La fluorescencia de una molcula disminuye en presencia de disolventes que
contengan tomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo
Transformacin a estado triplete

Temperatura
Un aumento de temperatura provoca disminucin de I F
Por aumento de colisiones, desactivacin por conversin externa

pH

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Cuantificacin en Fluorescencia

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 Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia y fosforescencia

Fenantreno
Espectro de excitacin: Se
obtiene al registrar la
intensidad de fluorescencia,
manteniendo fija la emisin y
variando la excitacin
Espectro de emisin : Se
obtiene al registrar la
intensidad de fluorescencia
manteniendo fija la excitacin y
variando la emisin.
Los anlisis se efectan
seleccionando excitacin y
emisin mximas. Excitacin Emisin Emisin
Fluorescente Fosforescente

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 Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia y fosforescencia

Cada uno es una imagen especular del otro.

Las emisin son mayores que excitacin

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 Esquema de un espectrofluormetro

Fuente de Monocromador exc Cubeta de

radiacin de excitacin muestra
Una longitud
de onda
Muchas Luminiscencia a muchas
longitudes de onda longitudes de onda

Monocromador
en ngulo de emisin
recto
Una longitud em
de onda

Detector

Registrador
o PC

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Esquema de un espectrofluormetro

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 Esquema de un espectrofluormetro
De mayor potencia que las que se utilizan en absorcin.
La energa radiante emitida en fluorescencia es
Fuente de luz directamente proporcional a la intensidad de la fuente.
Lmpara de arco de mercurio,
Lmpara de arco de xenn,
Lseres de N2 o de Ar

Seleccin ex y em Filtros o rejillas de difraccin

(Monocromadores)

Cubetas Vidrio o cuarzo

Rectangulares, con las cuatro caras pulidas

Detectores Tubos fotomultiplicadores o diodos

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 Fluorescencia
Sensibilidad (ppb)
Gran intervalo lineal
Selectividad
Menor aplicabilidad que los mtodos de absorcin
Mayor interferencia ambiental

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 Fuentes

Lmpara de arco de Mercurio

Lneas intensas 254, 366, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm

Lneas individuales se aslan con filtros

Lmpara de arco de Xenn

Espectro continuo de 300 a 1300 nm

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 Fluormetro

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 Espectrofluormetro

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 Fosformetros

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 Anlisis cuantitativo
Basados en fluorescencia para especies inorgnicas, orgnicas y bioqumicas.

Directos, basados en la reaccin Los indirectos, basados en la disminucin de

del analito con un agente de
complejacin para formar un
complejo fluorescente
Se utilizan para cationes
la fluorescencia, quenching, como resultado
de la interaccin del analito con un reactivo
fluorescente
Se utilizan para aniones y determinacin
de oxgeno en disolucin.

Determinacin de anin F-, se basa en

la desactivacin de la fluorescencia del
complejo GAR - Al (III)
GAR - Al (III) + F- GAR + Al(III)-F

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 Anlisis cuantitativo

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 Determinacin de sustancias orgnicas y bioqumicas

El nmero de aplicaciones compuestos orgnicos es muy elevado

Aminocidos Flavonoides
Protenas cido antranlico
Coenzimas Hidrocarburos policclicos aromticos,
vitaminas Isoniazida
cidos nucleicos Naftoles
cido saliclico
Alcaloides
cido rico
Porfirinas numerosos metabolitos.
Esteroides

Agentes medicinales
Adrenalina
Morfina
Penicilina
Fenobarbital
Procana
cido lisrgico (LSD)
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 Quimiobioluminiscencia

384 a 394 nm

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