MTODOS

CROMATOGRFICOS:
1. Exclusin molecular
2. Intercambio inico
3. Afinidad SSN
Propiedades de una protena que son tiles
para su purificacin por cromatografa

Peso molecular
Carga inica
Hidrofobicidad
Unin especfica a
ligantes
Pasos para purificar a una protena
por cromatografa en columna:
 EXCLUSIN MOLECULAR O
FILTRACIN EN GEL

FUNDAMENTO TERICO

La cromatografa de exclusin o filtracin en gel es una

clase de cromatografa slido-lquido que permite la
separacin de molculas en funcin de su TAMAO.

En este tipo de cromatografa la fase estacionaria es un

gel. El gel est constituido por partculas esfricas que
tienen POROS de un determinado tamao.
 CROMATOGRAFA DE
FILTRACIN EN GEL

Las molculas de tamao

pequeo difunden a travs
de los poros de las
partculas del gel y por
ello son retardadas en su
paso por la columna.

Las molculas grandes

no entran en los poros de
las partculas del gel,
eluyen primero.
Soportes que pueden ser de material variado como:

Inorgnicos Polmeros sintticos Polisacridos

Slica Porosa Poliacrilamida (Biogel P) Celulosa (Cellulafine,

Sephacel)
Vidrio de Poro Polimetacrilato (Spheron)
controlado Dextrano (Sephadex)
Poliestireno
Agarosa (Sepharosa,
Hidroxiapatita Superosa, Ultragel A y
BioGel)

Compuestos Polmero orgnico polisacrido

Poli N,N .- bisacrialmida- dentrano (Sephacryl)
Agarosa dextrano (Superdex)
Agarosa poliacrilamida (Ultradex A A)
DESALADO
Cromatografa Filtracin en gel
 Cromatograma de monitoreo de la
eficiencia de la purificacin

Abs 280 nm
Aplicaciones de la filtracin en gel

separacin de sustancias de distintos pesos

moleculares
determinacin de pesos moleculares de
protenas
Desalar protenas
 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO

Separacin que se basa en la carga elctrica de las

protenas.

Se aplica en una matriz de carga opuesta a la de la

protena que se quiere purificar.

Se debe tener un pH determinado.

Las protenas se eluyen de menor a mayor fuerza de

unin.
 Las protenas son molculas cargadas

Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminocidos

Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

pH solucin> pI= protena carga(-) por desprotonacin.

pH solucin< pI= protena carga(+) por protonacin
pH solucin =pI =protena carga(0) precipitado insoluble
Principio de la cromatografa

Las protenas quedarn

retenidas slo si tienen
carga opuesta a la
matriz.

Si se tienen protenas
retenidas, su tiempo de
retencin ser mayor a
mayor carga.
Factores que afectan la retencin

Fuerza inica

pH (funciona muy bien para cidos y bases dbiles)

Modificadores orgnicos
Intercambio Aninico (molculas a
separar cargadas negativamente)

Resinas Catinicas

Dietil amino etilcelulosa o DEAE

(dbil)

Amina Cuaternarias-CH2-N+(CH3)
Q (fuertes)

Intercambio Catinico (molculas a

separar cargadas positivamente)

Resinas Aninicas
Carboximetil -O-CH2COO(-)
(CM) dbil

Sulfometil -CH2-SO3(-)
S (fuerte)
 Factores para eluir

Aumentar concentracin de NaCl u otra sal en el buffer

eluyente.

Cambio de pH
Iones comnmente usados
Gradiente de NaCl

En pasos

Lineal
 Usos:

Se utiliza principalmente para separar una protena de

otros contaminantes siempre que las diferencias entre
las cargas sean suficientemente grandes.

Separa aminocidos, pptidos, nucletidos y

generalmente compuestos inicos.

En laboratorios clnicos se utiliza para separacin de

hemoglobina, isoenzimas y esteroides.
Cromatografa de afinidad
Se basa en la afinidad biolgica especifica de cada protena
hacia un ligando en particular.
Esta puede ser:
Protena Ligando
Enzima Sustrato
Receptor Hormona
Anticuerpo - Antgeno
Soportes o matrices

Qumicamente inerte.

Tener alta porosidad.

Gran nmero de grupos funcionales capaces de

formar enlaces covalentes con los ligandos.

El ms usado: Agarosa, tambin se usan polmeros

de acrilamida y slices CPG.
 O O
H
H2N R N R

O O O
HOOC R O R
agarosa

agarosa
O O
HS R S R

O O
HO R O R

R = LIGANDO R = LIGANDO
 Ligandos

Unin covalente estable con el gel de agarosa

Alta capacidad para atrapar a la protena en cuestin.

Pueden ser enzimas, anticuerpos, grupos qumicos

especficos.

Si el ligando es una enzima evitar condiciones que la

activen catalticamente.
 Ventajas

Capacidad de explotar sus propiedades bioqumicas

(nicas).

Se evitan varios pasos de purificacin que con otras

tcnicas clsicas.

Normalmente se obtienen altos rendimientos y alta

actividad especifica.

Se pueden separar protenas, enzimas, anticuerpos,

membranas, receptores, vitaminas, antgenos incluso
clulas enteras.
 Esquema de purificacin

1. El ligando se une covalentemente a una matriz.

2. La mezcla de protenas se hace pasar por la matriz.

3. Se une slo la que reconoce al ligando (unin no

covalente)

4. Las dems protenas y el resto se eluye.

5. Se desprende la protena por adicin de sal, pH,

temperatura o exceso de ligando libre
Procedimiento de purificacin
Para eluir a la
protena se puede
usar a su ligando
natural
Procedimiento de purificacin
Para protenas
recombinantes que
contienen una
secuencia marcadora
(extensin de His)
Se usa una columna
con un soporte unido
a metal
Se desplaza la protena
por la adicin de
imidazol, solventes,
EDTA
 Conclusiones

Tcnica muy especfica

Altos rendimientos y eficiencia

Purificacin eficiente con menos pasos posibles

Ampliamente usada en bioqumica para medicina y

farmacia
TAREA: entrega 26 de febrero
Se presenta la siguiente mezcla de protenas
Protena Peso Molecular (Da) Punto
Isoelctrico
Tripsina 34.000 8.0

Pepsina 35.500 2.75-3.0

Gelatinas 100.000 4.8-4.85

Insulina 40.900 5.30-5.35

Con la informacin que cuenta:

1. Prediga (dibujando) los perfiles de elucin bajo las

siguientes operaciones cromatogrficas:
Intercambio Aninico a pH 6.0
Intercambio Catinico a pH 6.0
Filtracin por geles
2. Plantea 2 procesos ptimos para purificar insulina
de la mezcla antes sealada

(Indique tipo de columna y el pH de trabajo en el caso

de ser necesario).

Indique en cada paso que contaminante(s) se estara

eliminando. Considere:
i) el siguiente ranking de eficiencias
Afinidad> Intercambio Inico, HIC >Filtracin por
gel
ii) Adicionalmente considerando que cuenta con las
siguientes matrices
Q-sefarosa
SP-sefarosa
Fenil-sefarosa
Sephadex G-100
Protena M (Especfica para Insulina)
Purificacin de la LDH de msculo
esqueltico de Gallus gallus
Parte II: Desalado y cromatografas
Consideraciones para las
cromatografas