AO DE LA DIVERSIFICACION PRODUCTIVA Y EL

FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACION

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA

AGROINDUSTRIAL E INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

INFORME N02: TINCIONES DE GRAM

CURSO: MICROBIOLOGIA

INTEGRANTES:
Calle Daz Josefa

Julca Morales Maybelline Jhanett

DOCENTE: JULIA TICONA MICHILOT

FECHA DE ENTREGA: 11/10/2015

PIURA PER
2015
 I. INTRODUCCIN

La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX. La
Tincin de Gram (o mtodo de Gram) es un mtodo para diferenciar especies
bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-negativas). El nombre
proviene de su inventor, Hans Christian Gram. Tincin de Gram diferencia las bacterias
por las propiedades qumicas y fsicas de sus paredes celulares mediante la deteccin de
peptidoglicano, que est presente en una capa espesa en las bacterias Gram positivas.
Los resultados Gram positivos se denotan por un color prpura / azul, mientras que las
Gram negativas son rosa / rojo. La tincin de Gram es casi siempre el primer paso en la
identificacin de un organismo bacteriano. Mientras que la tincin de Gram es una
herramienta de diagnstico valiosa, tanto en entornos de investigacin clnica, no todas
las bacterias pueden ser clasificadas definitivamente por esta tcnica. Esto da lugar a
grupos de Gram-variables y Gram- indeterminado. (Forbes, 2009)

La Tincin de Gram es una tcnica de laboratorio bacteriolgico se utiliza para

diferenciar especies bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-
negativas) sobre la base de las propiedades fsicas de sus paredes celulares. La Tincin
de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas, anteriormente arqueo bacterias, ya que
estos microorganismos producen muy diversas respuestas que no siguen sus grupos
filogenticos. (Cavallini, 2005)

La tincin de Gram no es una herramienta infalible para el diagnstico, identificacin,

o filogenia, y es de uso muy limitado en la microbiologa ambiental. Se ha sustituido en
gran medida por las tcnicas moleculares, incluso en el laboratorio de microbiologa
mdica. Algunos organismos Gram son variables (que significa, que pueden manchar ya
sea negativo o positivo); algunos organismos no son susceptibles a la mancha ya sea
utilizado por la tcnica de Gram. En un moderno laboratorio del medio ambiente o la
microbiologa molecular, la mayora identificacin se realiza utilizando secuencias
genticas y otras tcnicas moleculares, que son mucho ms especfico e informativo que
la tincin diferencial. (Cavallini, 2005)

Las bacterias Gram-positivas tienen generalmente una sola membrana rodeada por una
gruesa capa de peptidoglicano. Esta regla es seguida de dos filos-Firmicutes (a
excepcin de las clases de Mollicutes y Negativicutes) y Actino bacteria. Por el
contrario, los miembros de la Chloroflexi (bacterias verdes no del azufre) son
monodermas pero poseen una capa delgada de peptidoglicano y pueden manchar
negativo, positivo o indeterminado. Los miembros del grupo Deinococcus-Thermus,
tien positivamente. (Forbes, 2009)

Las bacterias Gram-negativas poseen generalmente una fina capa de peptidoglicano

entre dos membranas (didermas). La mayora son phyla bacteriana Gram-negativas,
incluyendo las cianobacterias, espiroquetas y bacterias verdes del azufre, y la mayora
de Proteo bacteria. (EUNED, 2004)
II. MARCO TEORICO:

La tincin de Gram, tambin conocida como coloracin de Gram, es una tcnica de

laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiolgicos de
las bacterias. Fue diseada por Christian Gram, un cientfico dans, en el ao 1884. El
objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar
diferentes grupos de bacterias para as poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba
result todo un xito y pronto se convirti en una tcnica muy til no solo para el
estudio de las bacterias, sino tambin para poder identificarlas rpidamente en una
infeccin y seleccionar el antibitico ms adecuado para tratarla.

La tcnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen
(esputo, orina, pus, etctera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los
colorantes tien la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se
realiza un lavado del colorante. Despus de eso puede que el colorante permanezca en la
pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecera el color morado, y
se tratara de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendra un color rosado,
y seran Gram negativas.

Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificacin de la
amplia mayora de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de forma diferente a
cada tipo de antibiticos, por eso es una tcnica til para seleccionar el frmaco
antimicrobiano inicial ante una infeccin. Hay que tener en cuenta que en ciertas
situaciones (como la sepsis) es muy importante iniciar un tratamiento antibitico
adecuado de forma precoz, por eso la tincin de Gram se pide de urgencia en muchas
ocasiones.

La tincin de Gram tambin tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen

pared, como por ejemplo lasChlamidias, y no se podrn identificar, al igual que los
virus. En esos casos la tincin no colorear ningn germen. Otro aspecto negativo de la
prueba es que no puede identificar el tipo exacto de bacteria responsable de la infeccin.
Para ello es necesario realizar un cultivo microbiolgico que se acompaa siempre de
un antibiograma para estudiar de forma exacta el antibitico ms efectivo.
QU ES UNA TINCION?

Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biolgicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar
grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo),
poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o incluso
para resaltar organelas dentro de clulas individuales.

TIPOS DE TINCION:

Tinciones simples

Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del
mismo color. Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado
para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para
ser observada.

Tamao, arreglo y forma

Un solo tinte

Directa

Tie bacteria

Negativa

tie el fondo pero no a la bacteria.

Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin
diferencial consta de dos etapas:
Una tincin simple seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se
utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer
colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa.
Separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus
caractersticas.
Ms de un tinte
Ejemplos: Tincin Gram y cido resistente

Tincin de Gram: es un tipo de tincin diferencial empleado en bacteriologa

para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder
realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
considerndose bacterias Gram positivas a las que se visualizan de color
morado, y bacterias Gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o
grosella.
Tincin cido Resistente: es la propiedad fsica de algunas bacterias a la
resistencia a la decoloracin de la fucsina bsica (rojo) la cual penetra en la
clula por accin del fenol y el calor. Las bacterias cido-alcohol resistentes no
pueden ser clasificados segn la tincin de Gram, la cual es la tcnica ms
comn en la microbiologa contempornea, sin embargo puede ser teido con
algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teida tiene la
capacidad de resistir la decoloracin de una combinacin de alcohol- cido, el
cual es el decolorante ms comn en los protocolos de tincin de bacterias, de
donde viene el nombre Alcohol-cido resistente.
Tinciones especficas

Se utilizan para incrementar el contraste en las clulas microbianas y revelan

estructuras particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cpsulas.

Para identificar estructuras:

Ejemplos: Tincin de flagelos, cpsulas y esporas.

Tincin de Esporas: La bacteria es una estructura muy pequea, sin embargo,

por medio de esta tincin pudimos observar la estructura interna de la clula
bacteriana, particularmente las endosporas, en este experimento se utiliza una
 tincin simple debido a que la misma permite que se coloree toda la clula
excepto la espora que se observa de un tamao bien aceptable. Se usa verde de
malaquita en contraste con safranina.
Tincin de Cpsula: Colorante nigrosuna, aqu se observa microorganismos
encapsulados creando resistencias.
Tincin de Flagelos: Se usa mordiente el cual aumenta el tamao
del microorganismo.
Tincin adecuada

En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin puede implicar la inmersin de

la muestra en la solucin colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar
el exceso de colorante y la observacin. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso
de un mordiente. Cuando la solucin de colorante en exceso se elimina durante el
aclarado, la tincin mordentada permanece.

Tincin negativa

Un mtodo sencillo de tincin para bacterias, que adems es un claro caso de

cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los mtodos de tincin positiva
fallan, es la tincin negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la
muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o
tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de
esto, los microorganismos pueden ser observados fcilmente por medio de microscopa
en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro
que las rodea

Tincin indirecta

Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente
habitual es el cido tnico.

Tincin directa

Hablamos de tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con el

sustrato, sin otro tratamiento previo.
III. OBJETIVO

Reconoce los grupos de bacterias

Conocer el procedimiento de la tincin de Gram
 IV. PROCEDIMIENTO
1. limpiar el rea de 4x3 que vas a utilizar con algodn y alcohol.
2. Limpiar la laminilla con algodn y alcohol.
3. prender el mechero de alcohol
4. flamear el portaobjeto por el mechero pero no muy cerca
5. esterilizar el asa kolle
6. Flamear la boca de la botella del agua esterilizada por el mechero.
7. Sacar una pequea muestra del agua esterilizada con el asa kolle y agregarla al
portaobjeto.
8. Flamear nuevamente el asa kolle y dejarla a un lado.
9. Coger la otra asa bacteriolgica y esterilizarla.
10. Coger el microorganismo y pasar la boca del frasco del microorganismo por el
mechero.
11. Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos.
12. Posteriormente esterilizar el asa
13. Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la
muestra.
14. Colocar el portaobjetos sobre un soporte
15. Cubrir la muestra con cristal violeta(4gotas)
16. Esperar que transcurra 2 minutos a 3 minutos hasta que se seque.
17. Despus que la muestra este seca se lava la muestra con agua destilada y
escurrimos hasta que seque nuevamente.
18. Cubrir la muestra con solucin de lugol (4gotas) y esperar que transcurra 2 a 3
minutos.
19. Lavar con agua destilada la muestra y esperar que seque.
20. Cubrir la muestra con alcohol cetona (4gotas).
21. Dejar secar ya que este no necesita de lavarse.
22. Cubrir la muestra con safranina (3gotas) y esperar que seque.
23. Lavar la muestra y escurrir.
24. Dejar secar la muestra
25. Agregar una gota de aceite de inmersin (aceite de cedro).
26. Observar al microscopio a 1000X.

4.-flamear la porta objeto para 5.-esterilizar el asa kolle en el 7.-sacar una gota de agua
esterilizarlo. mechero. esterilizada.
 8.-flamear
7.-diluir
9.-esterilizar
lanuevamente
muestraelsobre
asala asa
el
bacteriolgica.
portaobjetos.
kolle.

11.-diluir
10.- 10.-introducir
tomaelunamicroorganismo
cepaeldel
asafrasco
bacteriolgica
sobre
del microorganismo.
el portaobjetos.
en el frasco.

13.-flamear nuevamente el
14.-colocar la muestra sobre un
12.-flamear
portaobjetosnuevamente
sobre el mechero
el asa.
soporte.
sin que se queme la muestra.
 15.-agregar azul violeta 16.-dejar secar la muestra y
18.-agregar 4 gotas de lugol.
sobre la muestra 4 gotas. luego enjuagarla.

22.- agregar 3 gotas de 23.-enjuagarla para luego ser

19.-dejar secar la muestra.
safranina. llevada al microscopio.

V. RESULTADOS

Se observaron bacilos Gram +

Aparecen teidos de color azul y estos son

los bacillos
 Se observan los Gram

Aparecen de color rojo que son los cocos.

 Observamos una coloracin

Simple: un solo colorante, aqu se

Le aplica azul de metileno. Por lo

que todas las estructuras celulares

se tien con la misma tonalidad

(Tinta china, Azul Metileno de

Loeffler, Azul de lacto fenol).

Para observacin de levaduras

Y protozoos intestinales

VI. DISCUSION
1. PORQUE LOS COLORES DE LA TINCION?

Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tie la bacteria color violeta.

Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir

el tinte a la clula. Ayuda a resistir la decoloracin.

Agente decolorizante- alcohol etlico al 95%, sirve como solvente de lpidos y

agente deshidratante de protenas. Remueve el cristal violeta.

Contratinte- Safranina, tie de rojo la bacteria.
2. POR QU SE PINTAN LAS GRAM?

Membrana externa de las Gram

es soluble en solventes orgnicos como el alcohol.

la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el complejo
cristal violeta/yodo que se form.
por lo que va perdindose el color azul-violeta.

Las Gram +

no tienen su capa susceptible a la accin de solventes orgnicos.

se deshidratan los poros y se cierran.
retenindose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color azul-
violeta.
3. PARA QU SE NECESITA EL ACEITE DE INMERSIN?

El aceite de inmersin tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio (1,5

aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.

4. D QUE EST HECHA LA PARED DE LAS BACTERIAS?

La pared celular bacteriana est hecha de peptidoglucano (tambin denominado

murena), que est formado por cadenas de polisacrido entrecruzadas por
pptidos inusuales que contienen aminocidos D.
 La pared celular es esencial para la supervivencia de muchas bacterias y el
antibitico penicilina puede matar a las bacterias inhibiendo un paso en la
sntesis del peptidoglicano.

Existen dos tipos distintos de pared celular en las bacterias, denominadas Gram-
positiva y Gram-negativa, respectivamente. Los nombres provienen de su
reaccin a la tincin de Gram, una prueba extensamente empleada en la
clasificacin de las especies bacterianas.

En las bacterias Gram-positivas: la pared celular contiene una capa gruesa de

peptidoglicano adems de cidos teicoicos, que son polmeros de glicerol o
ribitol fosfato. Los cidos teicoicos se unen al peptidoglicano o a la membrana
citoplasmtica.
En las bacterias Gram-negativas: la capa de peptidoglicano es relativamente fina
y se encuentra rodeada por a una segunda membrana lpida exterior que contiene
lipopolisacridos y lipoprotenas. La capa de peptidoglicano se une a la
membrana externa por medio de lipoprotenas.
5. CARACTERSTICAS DE LAS BACTERIAS

Una de las caractersticas de las bacterias es su forma, ya que se clasifican de acuerdo

a ella, puesto que si es esfrica reciben el nombre de cocos, si tienen una forma espiral
se denominan espirilos y si tienen forma de bastn se denominan bacilos.

Otra de las caractersticas de las bacterias es que en su pared celular proseen flagelos,
los cuales utilizan para desplazarse.

VII. CONCLUSIONES
Llegamos a realizar nuestros objetivos con este mtodo de tincin de
Gram o coloracin de Gram ya que es un tipo de tincin diferencial empleado
en bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras
clnicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana,
como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin
bacteriana, considerndose en la observaciones bacterias Gram positivas a las
 que se visualizan de color azul violeta, y bacterias Gram negativas a las que se
visualizan de color rosa, rojo o grosella.
Conocimos los procedimientos de tincin aunque tuvimos algunos errores al
agregar los elementos de tincin ya que es muy importante saber las
cantidades necesarias y los pasos exactos.