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PRESENTA
Q.F.B. Carmen Josefina Jurez Casteln
Directora de tesis:
Dra. Concepcin Keiko Shirai Matsumoto1
Asesores:
Dra. Neith A. Pacheco Lpez2
Dr. Miquel Gimeno Seco3
1
Departamento de Biotecnologa, Laboratorio de Biopolmeros, UAM-I.
2
CIATEJ Unidad Sureste.
3
Departamento de Alimentos y Biotecnologa, Facultad de Qumica, UNAM.
Comit tutoral:
Directora de tesis: Dra. Concepcin Keiko Shirai Matsumoto.
Universidad Autnoma Metropolitana-Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa.
Laboratorio de Biopolmeros.
Presidente:
Dr. Miquel Gimeno Seco. _____________________
Departamento de Alimentos y Biotecnologa, Facultad de Qumica, Universidad Nacional
Autnoma de Mxico.
Secretario:
Dr. Alberto Lpez Luna. ____________________
Departamento de Biotecnologa, Universidad Autnoma Metropolitana-Iztapalapa.
Sinodales:
Dra. Neith Araceli Pacheco Lpez. ____________________
Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco, A. C.
(CIATEJ) Unidad Sureste.
Al Dr. Alberto Lpez por sus observaciones, consejos y tiempo dedicado que
ayudaron al desarrollo y revisin de esta tesis y por su amistad.
Al Dr. Ladislao Arias Margarito por el apoyo que me otorgo durante la parte
prctica de este trabajo.
De manera muy especial quiero agradecer a la Sra. Marina Navarro por su gran
apoyo incondicional que me ha brindado da a da para poder lograr esta meta y a
Victor Carrasco.
D E D I C A TO R I A S
A mis padres, Elvira y Jess, por darme la vida y por apoyarme en todo lo que he
necesitado, ahora empiezo a entender lo que es ser madre, los amo.
A Gaby, Vero, Jess, Jimena, Diego, Daniela, Victoria, Andrea, Emiliano, Javier y
Rene, por todo su apoyo y siempre estar al pendiente de lo que me pasa, son muy
importantes en mi vida, los quiero mucho.
8. RESULTADOS Y DISCUSIN..................................................................................... 30
8.1 FAL ........................................................................................................................ 30
8.1.1 Cintica de pH y produccin de cido lctico ................................................... 30
8.1.2 DM y DP del desperdicio de camarn mediante FAL (6.5 y 50 Kg) .................. 33
8.2 Anlisis qumico proximal ....................................................................................... 35
9. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 52
10. PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 53
11. BIBLIOGRAFA .......................................................................................................... 54
11.1 Citas electrnicas ................................................................................................. 58
DM: Desmineralizacin
DMAc: Dimetilacetoamida
DP: Desproteinizacin
kDa: Kilodaltones
QT: Quitosano
Ao Produccin de camarn
(miles de toneladas)
2000...80
2001...90
2002...87
2003110
2004113
2005142
2006161
2007166
2008180
2009181
2010149
Fuente: SIAP con cifras del Anuario Estadstico 2010 de la CONAPESCA.
Los biopolmeros de origen marino han sido estudiados y utilizados durante varios aos
en aplicaciones comerciales y desarrollo de nuevos productos. Algunos de los
biopolmeros utilizados actualmente en los mbitos de la biomedicina y el farmacutico
son la quitina y el quitosano (F2103 01, 2007; F2260 03, 2008). Una de las fuentes de
obtencin de estos biopolmeros son a partir de cabezas de camarn que constituye
aproximadamente un 45% del total de la produccin de este crustceo (Cira y col., 2002;
Duarte de Holanda y Netto, 2006).
La quitina y su derivado principal, el quitosano, son biopolmeros con una gran diversidad
de aplicaciones en diversos campos de la actividad humana. La quitina se encuentra
ampliamente distribuida en la naturaleza, tanto en el reino animal como en el vegetal,
siendo el segundo biopolmero ms abundante despus de la celulosa, por lo que
constituye un importante recurso renovable. La quitina se encuentra presente en
artrpodos, insectos, arcnidos, moluscos, hongos y algas, entre otros organismos. En los
animales aparece asociada a otros constituyentes, tales como lpidos, pigmentos,
carbonato de calcio y protenas (Peniche, 2006).
1.5 Proteasas
Las enzimas son catalizadores complejos, constituidos por protenas globulares, que,
aceleran la velocidad de las reacciones qumicas en un factor de 1012 a 1020 respecto a las
reacciones no catalizadas enzimticamente (Fennema, 1985) dentro de las cuales
encontramos a las proteasas. Las proteasas tambin conocidas como peptidasas, o
enzimas proteolticas constituyen el grupo ms importante de las enzimas industriales
frecuentemente usadas, teniendo mltiples aplicaciones en alimentos, farmacia y
detergentes industriales, as como en la preparacin de cuero y lana, entre otros. Las
Las proteasas pueden ser clasificadas, por su origen, (animal, vegetal, bacteriano o
fngico), por su modo de accin (endo- o exo-actividad) o con base en su sitio cataltico.
Las endoproteasas hidrolizan enlaces peptdicos dentro de la cadena de la protena. Las
exoproteasas, por el contrario, hidrolizan aminocidos terminales de las protenas o
pptidos. El centro activo contiene aminocidos o bien cationes metlicos que promueven
la catlisis, denominndose serinproteasas, cisteinproteasas, aspartato proteasas, segn
los aminocidos que intervengan (serina, cistena o cido asprtico). En las metalo-
proteasas la actividad est promovida por un catin metlico, siendo el zinc el ms
frecuente. Todas las serinproteasas tienen actividad endo en comparacin con las
metaloproteasas que son sobre todo exo-proteasas (Bentez y col., 2008; Gnzalez-
Rbade y col., 2011).
Muchos estudios han arrojado que la hidrlisis y sus productos a menudo se ven
afectados por diferentes factores como porcentaje de enzima, tiempo de incubacin,
temperatura, pH, relacin enzima-sustrato (Whitaker, 1972), as como el tipo de proteasa
y la relacin sustrato:volumen, las cuales definen el resultado de la reaccin (Bentez y
col., 2008; Cheung y Li Chan, 2010). Estos factores determinan la velocidad de reaccin
y pueden influir en la especificidad de la enzima (Bentez y col., 2008). De acuerdo al pH
en que las enzimas presentan la mayor actividad, las proteasas se pueden clasificar en:
proteasas cidas, neutras y alcalinas. La mayora de las proteasas comerciales,
principalmente las neutras y alcalinas, son producidas por microorganismos que
pertenecen al gnero Bacillus. Las proteasas cidas tienen actividad en un intervalo de
pH 2 a 6 (Rao y col., 1998). Las proteasas bacterianas neutras son activas en un estrecho
intervalo de pH (5 a 8), en condiciones cidas su actividad disminuye y son poco
termoestables (Rao y col., 1998). Las proteasas bacterianas alcalinas se caracterizan por
tener una alta actividad en un intervalo de pH de 8 a 13. Su temperatura ptima est
alrededor de los 60C (Rao y col., 1998). En este trabajo se evaluaron proteasas
bacterianas neutras y alcalinas (Tabla 3).
Los polmeros naturales como la quitina y quitosano cuentan con diferentes propiedades
fsico-qumicas como son el PM, el DA y el contenido de solubles (Pillai y col., 2009;
Pacheco, 2010) que determinan en muchas ocasiones su aplicacin, las cuales se ven
afectadas por el mtodo de obtencin. En la Tabla 2 se muestran los intervalos de
algunas de las propiedades generales de la quitina y quitosano.
DA DA > 40 0 a 40
Humedad (%) 8 10 67
TCA (cido tricloro actico), MC (diclorometano) (Pillai y col., 2009; Pacheco, 2010)
A nivel comercial la quitina y quitosano son compuestos de gran inters, ya que son
obtenidos de fuentes naturales, son biocompatibles, biodegradables y no txicos en
comparacin con los materiales sintticos (Rabea y col., 2003). El proceso de manufactura
puede influenciar en las propiedades y caractersticas de la quitina y quitosano como el DA
y PM, variando su aplicacin. La quitina tiene tres grupos funcionales reactivos, un grupo
amino acetilado en C-2 y dos grupos hidroxilo en C-3 y C-5, cuando se lleva a cabo la
obtencin del quitosano se lleva a cabo la desacetilacin del C-2 determinando el DA
conforme al porcentaje de acetilos eliminados, el PM es determinado conforme al grado de
depolimerizacin que ocurre en los diferentes tratamientos llevados a cabo (Tsigos y col.,
2000; Pacheco, 2007). Algunas de las reas de aplicacin de la quitina y quitosano se
muestran en la Tabla 3.
Este grupo lo constituyen las protenas de la clula muscular que no estn asociadas al
aparato contrctil. Estn formadas por una gran cantidad de protenas solubles en agua,
llamadas migeno, tambin solubles en soluciones salinas de baja fuerza inica, ests se
componen principalmente por mioglobina, cientos de enzimas y otras albuminas, son
fundamentalmente enzimas responsables del metabolismo celular (Haard, 1992).
Las protenas miofibrilares forman parte del aparato contrctil. Las protenas miofibrilares
que se encuentran en mayor proporcin en el msculo de organismos marinos son la
miosina, actina, tropomiosina. Este tipo de protenas pueden ser extradas con soluciones
salinas concentradas como el KCl (Haard, 1992).
Existen diferentes mtodos para la obtencin de quitina y quitosano, los cuales han sido
estudiados en las ltimas dcadas, estos biopolmeros deben de cumplir con ciertas
caractersticas fsicas y qumicas como lo es el PM, el DA y el contenido de protena,
caractersticas que suelen variar segn la fuente del sustrato y el proceso de obtencin de
utilizado. El mtodo utilizado tradicionalmente para la obtencin de estos polmeros
naturales es el qumico, que consiste en la DM y DP del desperdicio de camarn
empleando cidos y lcalis como el HCl, HNO3, H2SO4, entre otros y el NaOH, Na2CO3,
Na2SO4 (Peniche, 20006; Lrez, 2006), respectivamente, se emplea acetona para la
extraccin de pigmentos como la astaxantina (Gimeno y col., 2007). Para la obtencin de
quitosano se realiza una desacetilacin homognea o heterogneamente (NaOH o KOH
del 40 al 65%) con calor en la cual se lleva a cabo la hidrlisis del grupo acetamida
(Peniche, 2006; Nemtsev y col., 2002).
Desperdicio de Alcalasa 1.8 pH 8.25, 59.37C, 84.42 min. 33.13 Dey S y Dora K., (2011)
camarn
En los ltimos aos, ha existido un gran inters en la bsqueda de nuevos mtodos para
la obtencin de quitina y su principal producto el quitosano a partir del desperdicio de
camarn, estos polmeros tienen una amplia rea de aplicaciones en donde cada una de
ellas requiere caractersticas especificas de PM, DA y contenido de protena.
A pesar de que se han realizado estudios para la obtencin de la quitina, estos han sido
en su gran mayora procesos termoqumicos, utilizando cidos y lcalis que afectan la
estructura de la quitina e. g. hidrlisis del polmero. Otro mtodo de obtencin de la quitina
es la FAL, proceso biolgico en donde se lleva a cabo la DM y DP de la quitina
reduciendo en gran medida el uso de reactivos qumicos. Sin embargo, en ambos
procesos la quitina resulta con residuos de protena la cual puede causar alergias a
consumidores hipersensibles, motivo por el cual las reas de aplicacin para la quitina
disminuyen. Se ha reportado que la quitina obtenida por FAL posee caractersticas
estructurales, i.e. cristalinidad y PM diferentes a aquellas extradas qumicamente
(Pacheco y col., 2011).
Por estos motivos, en este trabajo se ha propuesto combinar la FAL seguida de una DP
con proteasas comerciales, las cuales hidrolizan las protenas presentes en la quitina
debido a su especificidad, en donde se buscar la obtencin de una quitina totalmente
biolgica, sustituyendo al mtodo qumico por mtodo biolgico.
Objetivo General
Objetivos Particulares
6.2 Microorganismo
La FAL se llev a cabo en un reactor tipo columna con capacidad de 80 Kg, en el cual se
coloc la mezcla del desperdicio de camarn, 5% (v/p) de inculo de Lactobacillus spp.
(B2) y 10% (p/p) azcar de caa, se mantuvo en una cmara de incubacin a 30C durante
120 h, segn las condiciones reportadas por Cira y col., (2002). La fraccin slida que
corresponde al DCF (desperdicio de camarn fermentado) fue enjuagada con agua
corriente, secada, molida, tamizada (# 30, tamao de partcula < 0.59 m) y almacenada
para su caracterizacin y utilizacin en la desproteinizacin enzimtica, mientras que el
licor fue desechado.
Protamex
(Novozymes): complejo de proteasas de Bacillus, desarrollado para la
hidrlisis de las protenas de alimentos (Kechaou y col, 2009; www.dsm.com;
www.novozymes.com).
HT Proteolitic
200 (ENMEX): enzima proteoltica bacteriana neutra, grado
alimenticio, derivada de Bacillus subtilis variant. La HT Proteolitic tiene su mayor
actividad en un intervalo de pH 6.5 a 8 a 40C, presenta actividad en un pH 5.5 a 9
y es estable en un rango de pH 5.5 a 10 manejando temperaturas menores a
50C. A temperaturas mayores a 60C, la enzima se inactiva
(www.enmex.com.mx; www.deerland-enzymes.com).
Deterzyme
L 660 (ENMEX): proteasa alcalina bacteriana (Bacillus
licheniformis), endopeptidasa estable a temperaturas elevadas en soluciones
alcalinas, utilizada para la formulacin de detergentes biolgicos lquidos. Presenta
una mxima actividad a pH 9 a 10, su mxima actividad es registrada a 70C
(www.enmex.com.mx; www.deerland-enzymes.com).
Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que produce
un cambio en la absorbancia a 280 nm de 0.001 por minuto en las condiciones descritas
anteriormente (Kunitz, 1946).
Para determinar el efecto que tiene cada una de las proteasas comerciales sobre la QPP,
se prepararon soluciones al 0.1 y 1.2% de cada enzima a probar (Protamex, HT
Proteolitic, Deterzyme y Proteasa N), se ajust el pH con NaOH o HCl 0.1M, y se agit
suavemente. Se adicion a la QPP conforme a las condiciones mencionadas en la Tabla
6, se incub durante 8 h, se obtuvieron muestras en el tiempo inicial (0 h) y final (8 h) (los
tratamientos se realizaron por triplicado), de la misma forma se corrieron muestras control.
La enzima fue inactivada por calentamiento (~90C, durante 10min), se filtr y enjuag
cada muestra con 100 ml de agua desionizada. La fase slida fue secada a 30 C durante
24 h y almacenada para su posterior anlisis, obteniendo como producto final quitina
biolgica (Gildberg y Stenberg, 2001).
Proteasa N 7.5
(Prot N) 0.1 y 1.2 40
HT Proteolitic 6.0
200 (HT)
Deterzyme L 7.5
660
(Det)
Relacin 1:12 (sustrato:volumen). Agitacin 140 rpm.
Para determinar el efecto que tiene la temperatura sobre la actividad proteoltica, se sigui
la metodologa descrita en el apartado 6.7.1, variando nicamente los niveles de
temperatura (30, 40, 50, 60 y 70C) (Tabla 7). Est prueba se realiz con la Proteasa N y
pH 7.5, los cuales presentaron mayor actividad.
Fermentacin c. Inactivacin de la
lctica enzima QT
(Cira y col . 2002) (90C, 10 min)
Filtracin (vaco)
Enjuague
(agua corriente)
(partcula < 0.59 m)
Fraccin
Fraccin slida
liquida
QPP Enjuague
Secado
QB
Quitina
Desperdicio parcialmente Quitina
Quitosano
de camarn purificada biolgica
Caracterizacin
% Humedad
Gravimetra
Quitosano
DA (RMN)
% Cenizas
PM
% Grasa (Viscosidad)
Quitina biolgica
Caracterizacin
PM
Kjeldahl % Protena
(Viscosidad)
FTIR DA (CHN)
El nitrgeno total fue determinado por el mtodo de Kjeldahl (Bchi K-424 y B-339, Suiza),
llevando a cabo una combustin en base seco de la muestra por calentamiento con cido
Sulfrico concentrado en presencia de catalizadores para reducir el nitrgeno orgnico de
la muestra hasta amoniaco, el sulfato de amonio producido se alcaliniza y se destila para
desprender el amoniaco que posteriormente es atrapado y titulado (Ecuacin 5) (Cira y
col., 2002).
7.7 Determinacin de DA
QB
QT
Constantes
Los espectros infrarrojo de las siguientes muestras (tamao de partcula < 0.59 m):
desperdicios de camarn, QPP, QB, quitina pura obtenida por mtodo qumico y QT
obtenido a partir de quitina biolgica, fueron obtenidos de un sistema ATR equipado con
un cristal de zinc y selenio (Spectrum 100 ATR FTIR Perkin Elmer, Estados Unidos)
aplicando 16 escaneos por muestra.
8.1 FAL
En este trabajo se llevaron a cabo tres FAL dos con una carga de 6.5 Kg y una de 50 Kg,
adicionando 5% de inculo (Lactobacillus spp. (B2)) y 10% de azcar de caa como
fuente de carbono condiciones reportadas por Cira y col., (2002). Los resultados
reportados ms adelante son el promedio de dos FAL de 6.5 Kg comparados con los
resultados obtenidos de la FAL de 50 Kg de desperdicio de camarn.
Los cambios en los valores experimentales de pH obtenidos en el licor de las FAL durante
las 120 h del proceso, se muestran en la Figura 5. Como se puede observar el pH inicial
para las FAL se reporta a las 24 h ya que a las 0 h no se produjo lixiviacin. El pH de las
FAL de 6.5 Kg inicia en 5.63 0.028 a las 24 h, el cual va disminuyendo constantemente
hasta llegar a un pH final de 4.43 0.14 a las 120 h. Los valores son similares a los
obtenidos en la FAL de 50 Kg la cual tiene un pH inicial de 5.21 0.02 y un pH final de
4.90 0.03, cabe mencionar que est FAL tuvo una duracin de 168 h sin presentar algn
cambio significativo en pH. Se determin el pH inicial (0h) y final (120 h) en la fase slida
de ambas FAL. El pH inicial para la FAL de 6.5 Kg fue de 7.41 0.02 y el pH final fue de
4.69 0.07, la FAL de 50 Kg tuvo un pH inicial de 7.92 0.02 y un pH final de 4.58 0.0,
en ambas FAL se observ la disminucin de pH, lo nos indica la acidificacin en la fase
slida.
La mayor acidificacin alcanzada por Cira y col., (2002) se obtuvo a las 96 h reportando
un pH 4.5 en la fraccin slida de la FAL, pH similar a los mencionados en este trabajo.
Pacheco y col., (2009) realizaron FAL de 3.5 Kg, utilizando condiciones similares a las
empleadas en este trabajo, en donde evaluaron diferentes temperaturas sobre el proceso
fermentativo (15 a 45C), obtuvieron que entre 30 y 40C se presentaron los valores de
pH ms bajos. A 30C reportaron un valor de pH de 4.4 aproximadamente en la fraccin
lquida despus de las 144 h de la FAL de desperdicio de camarn, valor que es muy
similar al obtenido en este estudio.
5.5
5
pH
4.5
6 Kg 50 Kg
3.5
3
0 24 48 72 96 120
Tiempo (h)
Sin embargo Cira y col., (2002) reportaron 0.45 mmol/g de cido lctico a las 96 h de
fermentacin del desperdicio de camarn empleando las mismas condiciones, comparado
con los datos de este trabajo la cantidad de cido lctico producido es menor en las
fermentaciones de 6.5 y 50 Kg, este resultado se vio reflejado en los porcentajes de DM
mencionados ms adelante.
0.30
0.25
c. Lctico (mmol)
0.20
0.15
0.10 6 Kg 50 Kg
0.05
0.00
0 24 48 72 96 120
Tiempo (h)
Por otra parte, los valores de DP en las FAL estudiadas fueron similares a los reportados
por Cira y col., (2002) y por Pacheco y col., (2009), valores que aumentaron al momento
de lavar el desperdicio fermentado, logrando remover las protenas que se encontraban
solubles en dicho desperdicio, lo cual nos indic que las BL endgenas del camarn
presentaron una buena actividad proteoltica.
Por otra parte se determin la composicin qumica en base seca del desperdicio de
camarn, desperdicio de camarn fermentado y de la QPP. Los resultados promedio del
anlisis qumico proximal se muestran en la Tabla 9.
Todos los resultados son la media de tres determinaciones en base seca, expresadas como masa o
porcentaje. DC: Desperdicio de camarn. DCF: Desperdicio de camarn fermentado. QPP: Quitina purificada
parcialmente.
La QPP obtenida de la FAL de 50 Kg fue la utilizada como sustrato para la DP con las
enzimas comerciales.
Existen diferentes mtodos para determinar la actividad de las enzimas proteolticas, que
utilizan protenas y compuestos sintticos como sustratos. Las proteasas tienen la
capacidad de hidrolizar pequeas molculas sintticas. Un mtodo ampliamente utilizado
se basa en el cambio en la solubilidad de una protena en TCA cuando se somete a la
accin de una enzima proteoltica. Dos protenas usadas comnmente como estndares
son la: casena y hemoglobina desnaturalizadas. Cuando una enzima proteoltica acta
sobre la protena, el promedio de pptidos solubles producidos est en proporcin a la
cantidad de enzima y el tiempo de accin (Whitaker, 1972).
Protamex 4.29 1.47
HT Proteolitic 200 9.44 0.30
Deterzyme L - 660 45.75 1.79
Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que produce un cambio en la
absorbancia a 280 nm de 0.001 por minuto en las condiciones descritas (Kunitz, 1946).
Ucas (unidad de actividad caseinoltica)
La enzima comercial Proteasa N en una concentracin del 1.2% (p/p) present a las 8 h
de reaccin la mayor actividad proteoltica, conteniendo solamente 0.85 0.16% de
protena presente en la muestra, lo que lleva a un 99.28.4 0.95% DP en la QPP,
recordando que el contenido inicial de protena en la QPP fue de 3.93%. A una
concentracin de enzima de 0.1% la Proteasa N desproteinizo el 95.92 1.04% de
protena, no hidrolizando el 1.25 0.32 de protena presente en la QPP. Se encontr
diferencia significativa con estas dos concentraciones ( 0.05).
3.0
[0.1%] [1.2%] d
2.5
c
2.0 c
Protena (%)
b b b-c
b
1.5
a
1.0
0.5
0.0
Deterzyme HT Proteolitic Proteasa N Protamex
Enzima
Figura 7. Efecto de las enzimas comerciales a 0.1% y 1.2% p/p sobre la QPP.
Letras diferentes indican diferencia significativa entre las medias de dos determinaciones
( 0.05).
Por lo tanto y de acuerdo a los valores obtenidos en este trabajo, se puede establecer
que el pH de 7.5 es el ptimo para la actividad de la Proteasa N sobre la QPP, lo que
indica que puede ser clasificada como una proteasa neutra. Las proteasas neutras
bacterianas presentan una mayor actividad en un intervalo de pH (5 a 8) y son poco
termoestables (Rao y col., 1998). Dado que el pH del sustrato en su estado nativo se
encuentra entre 6.2 y 7, el uso de este enzima representara una ventaja, ya que no se
necesit ajustar el pH para aplicaciones futuras.
2.5
b
2.0 b b
Protena (%)
b
1.5 b
a
1.0
0.5
0.0
3 5 6 7.5 8 9 11
pH
b
3.0
2.5
a-b
2.0 a-b
Protena (%)
1.5 a
a
1.0
0.5
0.0
30 40 50 60 70
Temperatura (C)
Figura 9. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la Proteasa N en quitina cruda.
Letras diferentes indican diferencia significativa entre las medias de tres determinaciones
( 0.05).
Cheun y Li-Chan (2010) probaron cuatro diferentes concentraciones de enzima (0.2, 0.4,
0.6 y 0.8%) para la hidrlisis de protena de camarn con enzimas comerciales (Alcalasa,
Flavourzyme y Protamex), siendo Alcalasa (0.8%) la que produjo un mayor porcentaje de
hidrlisis.
De acuerdo a los resultados del trabajo, se obtuvo una buena hidrlisis de la protena, sin
embargo no fue completa, por lo que se recomienda una DM previa al tratamiento
enzimtico que pudiera incrementar la permeabilidad de la enzima y por lo tanto la
penetracin para lograr una mayor hidrlisis. Sin embargo el uso de cidos para la DM de
la quitina (HCl) puede cambiar la estructura y en consecuencia afectar los sitios activos de
las proteasas (Valdez-Pea y col., 2010).
En este trabajo se evit el uso de HCl y la DM fue producida por el cido lctico producido
por las BL esto podra explicar la alta, pero no completa remocin proteica de la QPP.
3.5
3.0
b
2.5 b
Protena (%)
2.0
b
a-b
1.5
a
1.0
0.5
0.0
0.1 0.5 1.2 1.5 2
Concentracin de enzima (%)
La quitina biolgica obtenida, fue desacetilada para obtener QT por el mtodo qumico,
con NaOH 50% (4 h), mediante las condiciones reportadas por Jurez, (2010). Ambos
productos fueron analizados qumicamente y caracterizados. Los porcentajes
determinados de la QB y del QT se muestran en la siguiente tabla.
QB A C E
2.96 1.59 23.18 0.38 0.51 0.008 0.85 0.014 78 110.98 3.49 1128
(1.64 Kg)
QT B D F
4.33 1.07 19.05 0.21 0.23 0.002 0 0.0047 88 21.08 0.40 255.2
(1.12 Kg)
A B
ND (No determinado). QB (Quitina biolgica). QT (Quitosano). (Solubles en DMAc/LiCl (5%). (Solubles en
C D E-F
c. actico/acetato de sodio). (DA determinado por anlisis elemental). (DA determinado por RMN). (PM
determinado por viscosidad intrnseca)
La QB obtenida en este trabajo se encuentra dentro de los valores reportados por otros
autores que obtienen estos biopolmeros por mtodo qumico (protena, solubles y DA)
(Tabla 12), sin embargo el contenido de minerales es alto, probablemente porque durante
la DP enzimtica no se llev a cabo ningn proceso adicional para desmineralizar y slo
se llev a cabo el producido durante FAL. Uno de los parmetros de calidad de la quitina
es el contenido de minerales, el cual debe de ser menor a 0.5% (Shirai, 1999).
ND (No determinado). MQ (Mtodo qumico). QLL (Quitina enjuagada con agua corriente). QD (Quitina
enjuagada con agua destilada). Q1 (Quitosano 1). Q2 (Quitosano 2)
102
101
100 QSQS
99
98
97
96 2850
3262.38609
%T 3262 C-H
95
N-H
94
93
92 1622.58580
1546.67909
91 1570 1019.53546
NH2 1019
90 C-O-C
89
88.0
4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650.0
cm-1
95
90
1664
2962
C=O
C-H
3430
%T -OH 1547
85
NH2
3250
NH
80
1074 1074
CO C-O-C
75
71.6
4000.0 3000 2000 1500 1000 650.0
cm-1
Figura 12. Espectro infrarrojo de absorcin del QT obtenido a partir de la QPP y de QTF
(Quitosano comercial Fluka).
6 CH3
5
4
1
Masivo A
3 2
n
6, 4, 3
Masivo B
6, 5
2
PPM 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8
8.7 Rendimientos
En la Tabla 13, se presentan los rendimientos que se obtuvieron en este trabajo, en los
diferentes procesos para la obtencin de QPP, QB y QT, a partir de desperdicio de
camarn. El RG (rendimiento global) del proceso fue obtenido utilizando la siguiente
expresin:
Donde
a b
Producto RG RG
(%) (%)
DCF 38.97 38.97
QB 13.47 90.6
QT 9.13 68.74
a b
(RG a partir de DC en base seca). (RG a partir del producto anterior en base seca). DCF (desperdicio de
camarn fermentado). QB (quitina biolgica). QT (quitosano).
Cocoletzi y col., (2009), procesaron desperdicio de camarn lavado tenazmente con agua
y secado por mtodo qumico (DM, DP y desacetilacin), para la obtencin de quitosano,
reportaron un RG de 51.94%.
Mrmol y col., (2004), obtuvieron quitina y quitosano por mtodo qumico, partir de
desperdicio de camarn lavado y secado. Reportaron un RG de 24.06% para quitina y un
76.56% para quitosano (con respecto al desperdicio de camarn).
Realizar un estudio en donde se evalu el efecto que tiene emplear una mezcla de
enzimas comerciales como Proteasa N y Deterzyme, ya que estas fueron las enzimas que
presentaron mayor porcentaje de DP en este trabajo y poder incrementar el porcentaje de
DP.
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Enzima
Se realiz una solucin de 1mg/ml de enzima, disuelta en un amortiguador de fosfatos pH
7.5.
Procedimiento
75 L de enzima se adicionaron a 500L de una solucin de casena al 1%, se incub
durante una hora a 30C. Posteriormente se adicion 1 ml de TCA al 5%, se centrifug a
12000 rpm durante 10 min y al sobrenadante se le determin absorbancia a 280nm (este
ensayo se realiz por quintuplicado).
Se prepar un testigo para cada enzima, en el cual los 75L del extracto enzimtico se
adicionaron despus del TCA (sin incubar) (este ensayo se realiz por triplicado).
Soluciones amortiguadoras