TIPOS DE CROMATOGRAFIA Y ESPECTROFOTOMETRIA

Aprendices:
Neider Andrs Beltrn Ceden
Quelis Yojana Carmona Suarez

Ficha: 1217055

Instructor
Ubaldo Calle Ruiz

Tecnlogo en Control de calidad de alimentos

SENA
AGROEMPRESARIAL Y MINERO
REGIONAL - BOLVAR
2017
Tipos de cromatografa
Cromatografa de lquidos (fase mvil liquida)
Fase estacionaria slida: se trata de slidos finamente divididos (con gran
superficie especfica)
Cromatografa de adsorcin: Ia fase estacionaria slida retiene a los
solutos por un doble efecto de adsorcin fsica y qumica. Las interacciones
implicadas son del tipo de fuerzas de van der Waals.
Cromatografa de cambio inico: el slido retiene a los solutos gracias a
atracciones electrostticas. La fase estacionaria slida lleva en Ia superficie
cargas electrostticas fijas, que retienen contra iones mviles que pueden
intercambiarse por iones de Ia fase mvil.
Cromatografa de exclusin: Ia fase estacionaria es un material poroso,
que retiene a las molculas en funcin de su tamao. en ocasiones se
denomina tambin cromatografa de filtracin sobre geles o de
permeabilidad en geles (GPC).
Fase estacionaria lquida:
Cromatografa de reparto: Ia fase estacionaria es un lquidos
inmovilizados sobre un material inerte slido que slo acta de soporte.
Cromatografa de afinidad o de fases enlazadas: Ia fase estacionaria es
generalmente un polmero de tipo lquido inmovilizado sobre un slido inerte
por enlaces covalentes.
En ambos casos Ia separacin se debe a equilibrios de distribucin de los
solutos entre Ias fases mvil y estacionaria controlados por Ia diferente
solubilidad de los mismos en Ias distintas fases.

CROMATOGRAFA DE GASES (fase mvil gaseosa)

Cromatografa de adsorcin (o cromatografa gas-slido) Ia fase

estacionaria es un slido finamente dividido, que retiene a los solutos
por adsorcin, cromatografa de particin o reparto ia ase
estacionaria es un lquido retenido por impregnacin o por enlace
sobre un slido inerte. Se basa en equilibrios de distribucin.
Cromatografa de particin o reparto Ia fase estacionaria es un
lquido retenido por impregnacin o por enlace sobre un slido inerte.
Se basa en equilibrios de distribucin.

C. CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS (Ia fase mvil es un fluido

supercrtico).
 Un fluido supercrtico es un fluido calentado a ta y p superiores a Ias
crticas. Posee algunas caractersticas propias de un gas y algunas propias
de un lquido. Ia fase estacionaria puede ser lquida o slida.
Clasificacin atendiendo al modo se lleva a cabo Ia separacin (cmo se
ponen en contacto Ias fases):

Cromatografa en columna: Ia fase estacionaria se introduce en un tobo

estrecho a travs del cual se hace pasar Ia fase mvil. Esta se desplaza por
capilaridad, gravedad o presin. Pueden emplearse fases mviles lquidas,
gaseosa o fluidos supercrticos.

Cromatografa plana: Ia fase estacionaria se coloca en un soporte plano.

En cromatografa plana el flujo de fase mvil se consigue por capilaridad o
por capilaridad y gravedad. Slo pueden emplearse lquidos como fases
mviles. Existen:
Cromatografa en papel: Ia fase estacionaria est constituida por el agua
retenida en Ia celulosa. Tambin existen papeles cambiadores de iones.
Cromatografa en capa fina (TLC): Ia fase estacionaria es un slido
adsorbente finamente dividido o un lquido inmovilizado sobre un slido
colocado sobre una placa plana.
La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultneamente la
muestra y el patrn, mientras que en la cromatografa en columna las
muestras se analizan individualmente. Adems, las muestras que son
difciles de separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes
por desarrollo de la placa en direcciones perpendiculares.
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre
con relacin a la distancia recorrida por la fase mvil. El grado de retencin
en cromatografa plana de superficie se expresa como el factor de
retardacin, o ndice de retencin Rf:

Cromatografa de particin: la fase estacionaria es un lquido soportado

en un slido inerte. Otra vez, la fase mvil puede ser un lquido
(cromatografa de particin lquido-lquido) o un gas (cromatografa de
particin gas-lquido, GLC). La cromatografa en papel es un tipo de
cromatografa de particin en la cual la fase estacionaria es una capa de
agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografa de gases (GC) y de
alta resolucin (HPLC) son tcnicas de particin ampliamente empleadas.

Cromatografa de fase reversa: el mecanismo de separacin

depende de interacciones hidrofobias entre las molculas de soluto
 en la fase mvil y el ligando hidrolgico inmovilizado en la fase
estacionaria.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

La separacin en la cromatografa de intercambio inico depende la
adsorcin reversible de molculas de soluto cargadas, a una resina con
grupos inicos de carga opuesta. Muchos de los experimento de
intercambio inico se llevan a cabo en tres etapas.

La primera etapa: es un equilibrio en el cual el intercambiador inico

se encuentra en las condiciones apropiadas de pH y fuerza inica, lo
que permitir la unin de las molculas de soluto. En este estado
inicial, los grupos que se intercambiarn estn asociados con sus
respectivos contra-iones (usualmente aniones ocasiones simples,
como cloruro o sodio).

En una segunda etapa: se encuentra la aplicacin de la muestra y

su adsorcin, en la cual las molculas del soluto llevan a cabo el
apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen
reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eludas
de la cama del intercambiador usando el buffer inicial.

En la tercera etapa: se lleva a cabo la desorcin de la muestra

cambiando las condiciones de elusin, al desfavorecer la formacin
del enlace inico de las molculas de la muestra y la cama del
intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza
inica del buffer de elusin o cambiando su pH. En la cuarta y la
quinta etapas corresponden a la remocin de sustancia no eludas
bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio
de las condiciones iniciales para la siguiente purificacin.

La matriz: Un intercambiador inico consiste de una matriz slida

insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los
grupos cargados se asocian a contra-iones mviles. Estos contra-
iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la
misma carga sin alterar la matriz.

Grupos cargados: La presencia de grupos cargados es una

propiedad fundamental de un intercambiador inico, y el tipo de
grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador inico; su nmero
total y disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de
grupos
 que pueden escogerse para usarse en intercambiadores inicos;
algunos de estos se muestran a continuacin.

CROMATOGRAFA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)

Fundamentos y principios bsicos

El proceso cromatogrfico puede ser considerado como: un conjunto
de fuerzas que compiten de manera selectiva por un compuesto
(analito o soluto) para, por una parte, fijarlo al relleno de la columna o
fase estacionaria, o llevarlo disuelto en los lquidos que fluyen a
travs de la columna o fase mvil. Los distintos tipos de fuerzas
entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de
cromatografa.
En la cromatografa de reparto: se utilizan fases estacionarias
polares (slice, almina, hidroxiapatito) y fases mviles apolares
(ciclo hexano, isooctano, tetracloruro de carbono, etc.), aplicndose
a la separacin desolutos apolares.
En la de particin la fase: estacionaria es lquida, es necesario
ligarla o embeberla sobre partculas inertes
(Generalmente de slice) para que permanezca fija en la columna.
En cromatografa de intercambio inico: la fase mvil compite con
la estacionaria por los solutos mediante fuerzas inicas. La limitacin
es que el soluto sea inico (un anin o un catin).
La cromatografa de exclusin molecular: separa los solutos en
funcin de su tamao molecular. El principal inconveniente es que se
trata de un mtodo de baja resolucin.

Las reglas bsicas en HPLC son cuatro:

1. Fase mvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta.
2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase mvil (es decir, polaridad
similar).
3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagacin).
4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migracin
diferencial).

La velocidad: a la cual un soluto migra depende de la fraccin de

tiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es
detectado por un detector.
La cromatografa cuantitativa: se basa en una comparacin de la
altura o del rea del pico de un analito con el de uno o ms
estndares.
 La efectividad: de la columna cromatografa para la separacin de
solutos depende de las velocidades relativas a las cuales las
especies son eludas.

EQUIPO DE CROMATOGRAFIA

ESPECTOFOTROMETRIA

ESPECTROMETRA DE ABSORCIN:

La espectrometra de absorcin se refiere a una variedad de tcnicas

que emplean la interaccin de la radiacin electromagntica con la
materia. En la espectrometra de absorcin, se compara la intensidad
de un haz de luz medida antes y despus de la interaccin con una
muestra. Las palabras transmisin y remisin se refieren a la
direccin de viaje de los haces de luz medidos antes y despus de la
absorcin. Las descripciones experimentales por lo general asumen
que hay una nica direccin de incidencia de la luz sobre la muestra,
y que un plano perpendicular a esta direccin pasa por la muestra.
En la transmisin, la luz es dispersada desde la muestra hacia un
detector en el lado opuesto de la muestra. En la remisin, la luz es
dispersada desde la muestra hacia un detector en el mismo lado de
la muestra. La radiacin remitida puede estar formada por dos clases
de radiacin: reflexin especular (cuando el ngulo de reflexin es
igual al ngulo del frecuencia) y reflexin difusa (en todos los dems
ngulos).
ESPECTROMETRA DE FLUORESCENCIA

La espectrometra de fluorescencia (tambin llamada fluorometra o

espectrofluorimetra) es un tipo de espectroscopia electromagntica que
analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz,
por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las molculas de
ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energa,
generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una tcnica
complementaria es la espectrometra de absorcin.

INSTRUMENTOS

1. En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales

de instrumentos:
2. Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la
luz fluorescente.
3. Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de
difraccin para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.

Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una

fuente de excitacin pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide
sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra,
y algunas de las molculas de la muestra producen una fluorescencia. La
luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz
fluorescente pasa a travs de un segundo filtro o monocromador y llega a
un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90 con respecto al haz
de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o
transmitida llegue al detector.

ESPECTROMETRA DE RAYOS X

La espectrometra de rayos X es un conjunto de tcnicas espectroscpicas

para la determinacin de la estructura electrnica de materiales mediante el
uso de excitacin por rayos X.

Instrumentos: Existen varios diseos eficientes para analizar un espectro

de emisin de rayos X en la regin de los rayos X ultra ligeros. La cifra de
valor para estos instrumentos es el rendimiento espectral, es decir, el
producto de la intensidad detectada y el poder de resolucin espectral. Por
lo general, es posible cambiar los parmetros dentro de un cierto rango,
mientras se mantiene su producto constante.
ESPECTROMETRA DE ABSORCIN ATMICA

En qumica analtica, la espectrometra de absorcin atmica es una

tcnica para determinar la concentracin de un elemento metlico
determinado en una muestra. Puede utilizarse para analizar la
concentracin de ms de 62 metales diferentes en una solucin.

INSTRUMENTOS

Para analizar los constituyentes atmicos de una muestra es necesario

atomizarla. La muestra debe ser iluminada por la luz. Finalmente, la luz es
transmitida y medida por un detector. Con el fin de reducir el efecto de
emisin del atomizador (por ejemplo, la radiacin de cuerpo negro) o del
ambiente, normalmente se usa un espectrmetro entre el atomizador y el
detector.

ESPECTROMETRA DE EMISIN

La espectrometra de emisin es una tcnica espectroscpica que analiza

las longitudes de onda de los fotones emitidos por los tomos o molculas
durante su transicin desde un estado excitado a un estado de inferior
energa. Cada elemento emite un conjunto caracterstico de longitudes de
onda discretas en funcin de su estructura electrnica. Mediante la
observacin de estas longitudes de onda puede determinarse la
composicin elemental de la muestra. La espectrometra de emisin se
desarroll a finales del siglo 19, y los esfuerzos tericos para explicar los
espectros de emisin atmica condujeron a la mecnica cuntica.
La espectrometra de emisin suele llamarse a menudo espectrometra de
emisin ptica, debido a la naturaleza de la luz que se emite.

TCNICA EXPERIMENTAL EN LA ESPECTROMETRA DE EMISIN

POR LLAMA

La solucin que contiene la sustancia que va a ser analizada se conduce al

quemador y se dispersa en la llama como un spray fino. El solvente se
evapora en primer lugar, dejando partculas slidas finamente divididas que
se desplazan a la regin ms caliente de la llama, donde se producen
tomos e iones gaseosos. Los electrones son entonces excitados, tal como
se describi ms arriba. Es comn usar un monocromador para permitir una
deteccin fcil.
 Hay cuatro etapas principales durante la espectrometra de emisin por
llama:

Evaporacin: La muestra que contiene partculas metlicas se deshidrata

por el calor de la llama, y el disolvente se evapora. Disolvente se reducen a
tomos de metal. Por ejemplo, Mg2 + (aq) + 2e Mg (g). Los electrones
en los tomos de metal absorben la energa del calor de la llama y pasan a
niveles ms altos de energa.

Excitacin: Los electrones en estado basal de los tomos de metal son

ahora capaces de absorber la energa del calor de la llama. El cuanto
(cantidad) de energa absorbido depende de las fuerzas electrostticas de
atraccin entre los electrones con carga negativa y el ncleo de carga
positiva.
Emisin de radiacin: Los electrones en estado excitado son muy
inestables y se mueven hacia un estado basal con bastante rapidez.
Cuando lo hacen, emiten la energa que absorbieron.

ESPECTROMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

La espectrometra ultravioleta-visible o espectrofotometra UV-Vis implica la

espectroscopia de fotones en la regin de radiacin ultravioleta-visible.
Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano
y el infrarrojo (IR) cercano. En esta regin del espectro electromagntico,
las molculas se someten a transiciones electrnicas.

APLICACIONES

La espectrometra UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinacin

cuantitativa de soluciones de iones metlicos de transicin y compuestos
orgnicos muy conjugados.
Soluciones de iones metlicos de transicin

Las soluciones de iones metlicos: de transicin pueden ser

coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los
electrones en los tomos de metal se pueden excitar desde un
estado electrnico a otro. El color de las soluciones de iones
metlicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies,
como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una
solucin diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando
amonaco se intensifica el color y cambia la longitud de onda de
absorcin mxima.
 Compuestos orgnicos:Los compuestos orgnicos, especialmente
aquellos con un alto grado de conjugacin, tambin absorben luz en
las regiones del espectro electromagntico visible o ultravioleta. Los
disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para
los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos
orgnicos solubles.

ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE
Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un grfico de absorbancia de luz
frente a una longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este
espectro puede ser producido directamente con los espectrofotmetros ms
sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con
los instrumentos ms simples.
ESPECTROMETRA INFRARROJA
La espectrometra de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de espectrometra
de absorcin que utiliza la regin infrarroja del espectro electromagntico. Como
las dems tcnicas espectroscpicas, puede ser utilizada para identificar un
compuesto o investigar la composicin de una muestra. La espectrometra
infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces qumicos de las sustancias
tienen frecuencias de vibracin especficas, que corresponden a los niveles de
energa de la molcula. Estas frecuencias dependen de la forma de la superficie
de energa potencial de la molcula, la geometra molecular, las masas atmicas y,
posiblemente, el acoplamiento vibracional.

ESPECTROMETRA DE INFRARROJOS POR TRANSFORMADA DE FOURIER

La espectrometra infrarroja por transformada de Fourier (FTIV) es una tcnica de
anlisis para obtener el espectro infrarrojo con mayor rapidez. En lugar de registrar
los datos variando la frecuencia de luz infrarroja monocromtica, se gua la luz IV
(con todas las longitudes de onda de pista utilizada) a travs de un interfermetro.
Despus de pasar por la muestra, la seal medida da el interferograma. La
realizacin de una transformada de Fourier de la seal produce un espectro
idntico al de la espectrometra infrarroja convencional (dispersiva).
ESPECTROMETRA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR
La espectrometra de resonancia magntica nuclear (RMN), ms comnmente
conocida como espectrometra RMN, es una tcnica que explota las propiedades
magnticas de ciertos ncleos. Las aplicaciones ms importantes para su uso en
qumica orgnica son la espectrometra RMN de protones y la de carbono-13. En
principio, la RMN es aplicable a cualquier ncleo que posea espn.
ESPECTROMETRA DE CORRELACIN
La espectrometra de correlacin es uno de los diversos tipos de espectrometra
de resonancia magntica nuclear (RMN) bidimensional. Este tipo de experimento
RMN es mejor conocido por su acrnimo, COSY. Otros tipos de espectrometra
RMN bidimensional son la espectrometra-J, la de intercambio (EXSY), la de
efecto Overhauser nuclear (NOESY), la de correlacin total (TOCSY), y
experimentos de correlacin heteronuclear como el HSQC, HMQC y HMBC. Los
espectros bidimensionales RMN proporcionan ms informacin acerca de una
molcula que los espectros RMN unidimensionales, y son especialmente tiles
para determinar la estructura de la molcula, en particular para molculas que son
demasiado complicadas para la RMN unidimensional. El primer experimento
bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener, un profesor de la Universit
Libre de Bruxelles, en 1971. Este experimento fue posteriormente implementado
por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst, que publicaron sus trabajos
en 1976.

ESPECTROMETRA RMN APLICADA A PROTENAS

Gran parte de la reciente innovacin dentro de la espectrometra RMN se ha dado
en el campo de estudio de las protenas, y se ha convertido en una tcnica muy
importante en la biologa estructural. Un objetivo comn de estas investigaciones
es obtener una alta resolucin de las estructuras tridimensionales de las protenas,
similar a lo que puede lograrse por cristalografa de rayos X. En contraste con la
cristalografa de rayos X, la RMN se limita sobre todo a las protenas relativamente
pequeas, de menos de 35 kDa, aunque los avances tcnicos permiten la
resolucin de estructuras ms grandes. La espectrometra RMN es a menudo la
nica manera de obtener informacin de alta resolucin, en todo o en parte, de
protenas no estructuradas.
ESPECTROMETRA RAMAN
La espectrometra Raman es una tcnica espectroscpica utilizada en fsica de la
materia condensada y tambin en qumica para el estudio de los modos
vibracionales, rotacionales y otros de baja frecuencia en un sistema. Se basa en la
dispersin inelstica, o dispersin Raman, de la luz monocromtica, que por lo
general procede de un lser en el rango visible, infrarrojo cercano, o ultravioleta
cercano. La luz lser interacta con fonones u otras excitaciones en el sistema,
por lo que la energa de los fotones lser se desplaza hacia arriba o hacia abajo.
Normalmente, la muestra se ilumina con un rayo lser. La luz del punto iluminado
se recoge con una lente y se enva a travs de un monocromador. Las longitudes
de onda cercanas a la lnea lser, debidas a la dispersin elstica de Rayleigh,
son filtradas, mientras que el resto de la luz recogida se dispersa en un detector.
EQUIP DE ESPECTROFOTOMETRIA