8-2 Ekstrakcije u analitici lijekova

Razdvajanje komponenata najee je izuzetno komplikovano zbog njihove velike slinosti i sloenosti
sastava uzorka. Kod prirodnih uzoraka kompleksnost postupka poveava i osjetljivost komponenata
na uticaje zraenja (svjetlosti), temperature, pH vrijednosti, razliitih oksidansa i dr.

VRSTE EKSTRAKCIJA:

1. Teno tena ekstrakcija (TTE) (rastvaraima)

Ekstrakcija predstavlja metodu razdvajanja kojom se vri djelimino ili potpuno razdvajanje
komponenata smjee koje imaju razliitu rastvorljivost u razliitim rastvaraima. Smjei supstanci
dodaje se rastvara, kako bi se iz nje izdvojila komponenta koja se bolje rastvara u datom rastvarau -
i time izdvaja kao rastvorak. Lake rastvorljiva komponenta smjee prelazi u rastvor. TTE - zasniva se
na difuziji mase usljed prisustva gradijenta koncentracije.

Efikasnost ekstrakcije vrstih supstanci se postie poveanjem:

- dodirne povrine izmeu faza tj.

- usitnjavanjem i mukanjem a u sluaju veih koncentracija,
- duim trajanjem ekstrakcije ili
- poveanjem zapremine rastvaraa

FAZE:

1. Smjea koja podlijee ekstrakciji dovodi se u kontakt sa rastvaraem mukanje 5-10min.

2.Razdvajanje nastalih novoformiranih faza

3. Uklanjanje i regeneracija rastvaraa iz svake faze.

2. Teno vrsta ekstrakcija (na vrstoj podlozi - patrone)-SPE

Postoji:

- Ekstrakcija vrstih supstanci tenostima

- Ekstrakcija tenih supstanci tenostima
- Ekstrakcija teno-vrstih sistema - suspenzija

Ekstrakcije mogu biti: jednostuke i viestruke.

VRSTE SMJEA - PREMA DISTRIBUCIJI KOMPONENATA:

voda + alkohol = homogena tena = smjea rastvor

voda + rastvorene sup. + pulpa = heterogena smjea = suspenzija

JEDNOSTAVNE METODE SEPARACIJE HETEROGENIH TENO/VRSTIH DISPERZNIH SISTEMA
SUSPENZIJA

Tehnoloke operacije:

- Dekantiranje
- Filtracija pomou filtracionog medija
- Vakuum filtracija efikasnost poveava p (atm/vakuum)

EKSTRAKCIONE TEHNIKE - EKSTRAKCIJA VRSTIH SUPSTANCI TENOSTIMA

Aparat za filter kafu odgovarajui rastvara (vrela voda) dodaje se vrstoj smjei (mljevena kafa ) sa
ciljem da se jedna ili vie komponenti vrste faze rastvore u tenom rastvarau.

Vrela voda poveanje brzine difuzije i rastvaranja

TENO-TENA EKSTRAKCIJA

Primjena: farmaceutski oblici

Mehanizam : raspodjela analita u binarnom sistemu rastvaraa S1/S2

Kp = CS1/CS2

Kp = podioni koeficijent

CS1= koncentracija analita u rastvarau (S1)

CS2 = koncentracija analita u rastvarau (S2)

ODREIVANJE PODIONOG KOEFICIJENTA (Kp)

a) Kvantitativna analiza poznatih koncentracija supstance u gornjoj i donjoj fazi nakon ekstrakcije
poznatim zapreminama ekstraktanta

b) Interpolacijom iz distribucione izoterme

Linearnost potvruje konstantnu vrijednost Kp! Distribuciona izoterma.

EFIKASNOST EKSTRAKCIJE

Zavisi od:

- koliine uzorka,
- podionog koeficijenta,
- stepena meusobnog mjeanja rastvaraa i ekstraktanta (manji stepen mjeanja - bolja
efikasnost)
- volumena upotrijebljenog ekstraktanta (poveava se sa volumenom rastvaraa kao i
poveanjem broja ekstrakcija)

mukanje 5-10 min. (Ne jako i ne predugo da se ne stvore emulzije). NH4(SO4)2 se dodaje da sprijei
nastajanje emulzija kod npr. ekstrakcija ionskih jedinjenja organskim rastvaraima iz vodenih
uzoraka. Za kvantitativnu analizu potrebno je da efikasnost ekstrakcije bude najmanje 97%

PRIMJER IZRAUNAVANJA KOLIINE EKSTRAHOVANE SUPSTANCE

Teno-tena ekstrakcija

dvije ljekovite supstance zajedno istim ekstraktantom mogua samo ako su vrijednosti Kp bliske! Tj.
~1

Mehanizam: viekratna ekstrakcija

Raspodjela ljekovitih supstanci P i Q u binarnom sistemu rastvaraa S1/S2

Kp1 = C1P (S1)/C2P (S2) Kp2 =C1Q (S1)/C2Q (S2)

= Kp1 / Kp2 ~ 1

= separacioni faktor

Kp1 = podioni koeficijent supstance P

Kp2 = podioni koeficijent supstance Q

Teno-tena ekstrakcija meusobno razdvajanje dvije ljekovite supstance uslov: dovoljno razliiti
Kp, 1 >> >>1
Uslovi za dobro razdvajanje dvije supstance

I Kp1 >> Kp2

Kp1<< Kp2

1 >> >>1

II razliit pH i razliita polarnost ljekovitih supstanci

FAKTORI KOJI UTIU NA TENO TENU EKSTRAKCIJU I IZBOR RASTVARAA

a) Fiziki: temperatura i prisustvo drugih supstanci

b) Hemijski: - hemijske reakcije izmeuaktivnih supstanci i rastvaraa (aceton/keton stvara sa

primarnim aminima Shifove baze; aldehidi i ketoni sa alkoholima poluacetale i acetale - problem!!!)

I. Polarnost rastvaraa, po principu "slino se u slinom otapa"

Izbor rastvaraa (ekstraktanta S1) kada je S2 voda

1. ne rastvaraju se u vodi i ne mijeaju se sa vodom

2. nepolarni nedisocirajui (inertni): hloroform, cikloheksan, ugljentetrahlorid, dietiletar.

polarni rastvarai alkoholi - amil alkohol

1. ne rastvaraju se u inertnim (nepolarnim) rastvaraima

2. amfiprotonski rastvarai (amfoterni): voda, metanol, etanol, acetonitril, etilacetat (pri pH manjem
od 9), superkritine tenosti (CO2), pod pritiskom je suhi led, a kad pitisak opadne direktno prelazi u
gasovito stanje; postepenim poveavanjem pritiska nastaje teni CO2 koji je dobar rastvara za dosta
supstanci (selektivna ekstrakcija, netoksian, nezapaljiv, na niskoj krit.t.31.1C, pogodan za
termolabilne supstance, isparava i ostavlja ist uzorak).

Mehanizam :

S1 (gornja faza) } nepolarni rastvara

S2 (donja faza) } voda

S1 (gornja faza) } voda

S2 (donja faza) } nepolarni rastvara

Izbor rastvaraa zavisi i od tehnike koja e se koristiti za kvantitativnu analizu. Za UV/VIS analizu ne
smije apsorbovati u toj oblasti! Za HPLC analizu mora biti HPLC istoe! Ukoliko je potrebno
uparavanje rastvaraa potrebno je upotrijebiti lahko isparljiv rastvara.
II Jonska jaina - znaaj u ekstrakciji neelektrolita

- smanjuju rastvorljivost neelektrolita u vodi,

- smanjuje mijeanje rastvaraa uzorka i ekstraktanta (etar, aceton u vodi)
- smanjuju zapremine potrebnog ekstraktanta u sluaju velike koncent. aktivne supstance u
vodenoj fazi. Jonska jaina : 2M 4M rastvori soli KCl, NaCl, CaCl2, KNO3

Mehanizam :

S1 (gornja faza) } nepolarni rastvarai

S2 (donja faza) } micelarni rastvor (voda + so)

salting out efekat efekat isoljavanja H2O + ion soli = jake jon-dipol sile

micela { hidratisani omota oko jona } = smanjuje se rastvorljivost ljekovite supstance u vodi =

organska supstanca prelazi u S1 fazu (org.rastvara). Primjeri: Antibiotici - velika koncentacija

ljekovite supstance u S2 fazi, estri

III Uticaj pH na ekstrakciju

Dodavanje pufera : u S2 fazu i u S1 fazu

Mehanizam je podjeljen prema hemijskoj prirodi ljekovite supstance :

ljekovite supstance slabe organske kiseline: karboksilna grupa, enolna, fenolna

ljekovite supstance slabe organske baze: amino grupe, heterociklusi sa dusikom

ljekovite supstance soli organskih kiselina: K, Na, Ca

ljekovite supstance soli slabih organskih baza: hidohloridi, sulfati, citrati, tartarati

Soli slabih organskih kiselina

S1 - organski nepolarni rastvara a S2 - voda + pufer

Mehanizam rastvaranja u vodi:HA + H2O -> H3O+ + A-

Soli slabih organskih baza

S1 - organski nepolarni rastvara a S2 - voda + pufer

Mehanizam rastvaranja u vodi: B + H2O -> HB+ + OH-

EKSTRAKCIJA CIKLIZIN LAKTATA IZ INJEKCIJA

Uzorak se razblai sumpornom kis. I komponente ekscipijensa ekstrahuju eterom. Rastvor se

zaalkalie, ciklizin ce prei u bazu (molekulski oblik) i ekstrakcija se izvri eterom, laktat ostaje u
vodenom sloju (ionski oblik). Nakon razdvajanja slojeva, ponovo se ciklizin zakiseli sumpornom
kiselinom, razblai i mjeri UV/Vis spektrofotometrijski.

Drugi vidovi:

- anioni organ. kis. ako mogu da grade komplekse - helatni agensi- prevee se u helate koji e
se ekstrahovati nepolarnim organskim rastvaraem.
- Kationi org. baza ili anioni org. kis. mogu da grade ionske parove koji se mogu ekstrahovati
nepolarnim organskim rastvaraem.

Ion par ekstrakcija za kationske surfaktante kao npr. Cetrimid. Moe se ispitivati kao lipofilni ion par
sa bromkrezol crvenim, ekstrakcija hloroformom, u VIS oblasti. Primjeri: Clonidin injekcije, Benzhexol
tablete. Amini i fenoli kao polarni mogu da se acetiluju za Ion par ekstrakciju. Primjer: acetilovanje
taurina (amino kiselina) sa benzoilhloridom i prevoenje u amid, sa tetrabutilamonijum sulfatom
gradi se ion par i ekstrakcija vri sa hloroformom za odreivanje GCMS

ACETILOVANJE TAURINA ZA ION PAR EKSTRAKCIJU

Primjer: smjea kiseline i baze. Podesiti pH vodene faze pri kome e jedna supstanca potpuno prei u
molekulski oblik, a druga u ionski. U sluaju ekstrakcije baze organskim rastvaraem potrebno je da
se pH vodene faze povea za najmanje 3 pH jedinice u odnosu na pKa baze, dok u sluaju ekstrakcije
kiseline organskim rastvarace pH vodene faze se smanjuje za 3 pH jedinice.

Ljekovite supstance (uzorak) nerastvorne u vodi potrebno je prevesti u jonski oblik ili u soli i estre koji
su rastvorljivi u vodi!
Mehanizam

S1 - voda + pufer a S2 - organski nepolaran rastvara

S1 - voda + acetonitril + pufer a S2 - organski nepolaran rastvara

S1 - voda + metanol + pufer a S2 - organski nepolaran rastvara

Uslov: molekulski oblik ljekovite supstance = jonski oblici

Mehanizam

S1 voda a S2 - organski nepolaran rastvara + kiselina

S1 voda a S2 - organski nepolaran rastvara + baza

Uslov: molekulski oblik ljekovite supstance = soli ili estri

IZVOENJE TENO-TENE EKSTRAKCIJE

Pomou lijevka za odvajanje: esto su potrebna 3 lijevka.

PRIMJER: EKSTRAKCIJA FENOBARBITONA IZ TABLETA - FENOBARBITON-NA

Odmjeri se odreena koliina spraenih fenobarbiton tableta, kvantitativno prenese u lijevak za

odvajanje br.1., doda 50ml vode i 10 ml HCl. HCl e istisnuti fenobarbiton iz soli i potisnuti ga u
organski sloj etar. Doda se 50ml etera i muka uz povremeno otvaranje zatvaraa kako bi se
ispustile pare etera. Ostavi se da stoji. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj ispusti u lijevak 2. Na vodeni
sloj se doda ponovo eter i postupak ekstrakcije ponovi isputajui vodeni sloj u lijevak 3, a etarski u
lijevak 1. Vodeni sloj u lijevku 3 se tretira eterom i vri ekstrakcija. Eterski sloj se prebaci u lijevak 1, a
vodeni u lijevak 2. Skupljeni eterski ekstrakti se isperu sa vodom 2- 3 puta i eterski sloj prenese u
suhu istu porculansku zdjelu, doda bezvodni Na2SO4, i upari do suha. Sadraj fenobarbitona se
odredi nekom pogodnom analitikom metodom (gravimetrijski, UV-VIS, HPLC itd. )

Ekstrakcija u lijevku za odvajanje: Ekstraktant: tei od vode kako bi se isputao sloj sa

ekstrahovanom supstancom - manja mogunost oneienja i gubitaka

Ekstrakcija centrifugiranjem: Ekstraktant: laki od vode.

RAZDVAJANJE SLOJEVA I UKLANJANJE RASTVARAA : Razdvajanje slojeva: u lijevku za odvajanje,

centrifugiranjem, dekantovanjem nakon zamrzavanja vodenog sloja ili aspiracijom vakumom pomou
Pasterove pipete, injiciranjem kristalizacije ili taloenjem. Uklanjanje rastvaraa: suenje organskog
rastvaraa, uparavanje, zagrijavanje i destilacija
Kristalizacija vodenog rastvora bakar sulfata: Isparavanjem vode iz rastvora, dolazi do formiranja
plavih kristala CuSO4. CuSO4 je razdvojen od rastvaraa iz homogenog vodenog rastvora.

OTKLANJANJE RASTVARAA UPARAVANJEM:

- rastvara se svede na mali volumen ili potpuno ukloni (za daljnju analizu HPLC.
- Aparat: rotirajui evaporator ujedno regenerie rastvara
- na vodenom ili pjeanom kupatilu uz termostat ne smije doi do kljuanja i prskanja -dodaju
se staklene kuglice
- Ne smije doi do lijepljenja supstance na staklene zidove suda u kome se uparava (dodatak
amil alkohola, 2% etanola ili 5% propilen glikola)

EKSTRAKCIJA ALKALOIDA

Ekstrakacija rastvaraima: teno-tena ekstrakcija alkaloida

EKSTRAKCIJA IZ TABLETA I KAPSULA

Najbolja je ekstrakcija sa H2O. Komponente podloge: laktoza, polimerni eeri, celuloza su takoer
rastvorljive u vodi (ne ometaju HPLC analizu, nemaju UV apsorpciju). Metanol i etanol rastvaraju i
mnoge organske komponente.

Lubrikansi (Mg - stearat, stearinska kis., polietilenglikol ine 1-2% tabletnog punjenja mala
mogunost interferencije, takoe nemaju hromofore

Sredstva za oblaganje su do 3% tabletne mase, rastvorljivi u vodi, ali nemaju hromofore (polimerni
eeri, hidroksipropilmetilceluloza)

Sredstva za bojenje organometalne boje i metalni oksidi apsorbuju u UV/VIS, ali se ne rastvaraju u
vodi i mogu biti otklonjeni filtriranjem

Kapsule omotai kapsula se odbacuju prije ekstrakcije

SUSPENZIJE I RASTVORI

Boje - prirodni pigmenti kao to su hlorofil, karotenoidi, antocijani se teko uklanjaju i za njih je
preporuena SPE- ionske izmjene za uklanjanje kationskih i anionskih boja, ili se koristi smjea
rastvaraa razliite polarnosti npr: smjea vode i organskih rastvaraa. Boje ostaju u vodi.

Konzervansi i antioksidansi kao to su fenoli, kvaternerni amini benzalkonijum hlorid imaju

hromofore i mogu da interferiraju u UV oblasti sa analitom, potrebno razdvajanje. Polietilenglikol
surfaktant ne ometa UV apsorpciju.

KREME I MASTI

Na i K soli masnih kiselina, trigliceridi, kationski surfaktanti i neionskib surfaktanti su komponente

masti i krema. One nemaju hromofore, ali mogu da zaprljaju RP-HPLC kolonu (lo pik). Trigliceridi i
ostale lipofilne komponente se mogu ekstrahovati metanolom ili smjeom MeOH/ heksan. U heksanu
e ostati vie lipofilne komponente.

EKSTRAKCIJA SMJESOM ORGANSKIH RASTVARAA

Koristi se za ekstrakciju analita iz uljanih ekscipijenasa kao to je ekstrakcija steroida iz krema za HPLC
analizu ili vitamina E iz kozmetikih krema

Smjesa rastvaraa: Metanol/ heksan; voda/ etanol/ heksan; ACN/ heksan

Postupak: krema se obino disperguje zagrijevanjem u heksanu i analit ekstrahuje jednakim

zapreminama metanola, dok se uljani ekscipijens zadrava u heksanu. U ekstrakciji neophodno
koristiti interni standard (IS) radi poveanja preciznosti ekstrakcije

Primjeri - kortikosteroidi u kremama: hidrokortizon acetat krema, fluocinolon krema i beklometazon

krema.

8b vrsto tena ekstrakcija (SPE)

- Selektivna ekstrakcija analita i preiavanje uzorka

- Priprema uzorka za HPLC, GC, RIA,UV i VIS, itd.
- Prekoncentrisanje rastvora uzorka

Prednosti SPE nad tenotenom ekstrakcijom :

- Bolja Recovery vrijednost: ali se preporuuje korienje internog standarda;

- Dostupni rastvarai za ispiranje
- Minimalno isparavanje bolja stabilnost za labilne komponente
- Bezbjednija metoda zbog manje upotrebe organskih rastvaraa
- Ne stvaraju se emulzije sa vodenim rastvorima koje je teko ekstrahovati
- Lako se moe automatizovati, vie uzoraka analizirati istovremeno, male zapremine uzorka
- Prekoncentrisanje uzorka
Dva koncepta izolovanja analita

a) proputanje analita

b) zadravanje analita

Izvoenje SPE - 4-5 koraka ekstrakcije:

1. Kondicioniranje sorbensa, ispiranje

2. Adsorpcija uzorka

3-4. Ispiranje interferirajuih komponenti

5. Eluiranje uzorka sa kolone

Kondicioniranje (ispiranje) sorbensa :

A) bez kondicioniranja

B) djelimino kondicionirana

C) sasvim kondicionirana

Vrste sorbensa :

1. Revezno fazni: R: (CH3)2 C18H37, C18H37, (CH3)2, C2H5

.Stiren divinilbenzenski polimerni gelovi. Upotreba: za nepolarne komponente

Ekstrakcija na lipofilnim sorbensima

Bazne komponente: Nakon ispiranja alkalnim puferom, vodom (metanolom); Bazne komponente se
adsorbuju iz vodenih uzoraka podeavanjem baznog pH; Eluiranje kiselim puferom ili metanolom.

Primjer: Oralna suspenzija hlorpromazina / bazne komponente. Sadri: Hlorpromazin, Metilparaben,

neutralnu hidrofilnu boju, Nalaktatni pufer, lipofilni korigens ukusa. U 5ml uzoraka doda se 0.5ml
amonijanog pufera pH 9.5. Kondicioniranje sorbensa: amonijanim puferom. Hlorpromazin se nalazi
u formi slobodne baze i adsorbuje se na ODS (C18) SPE adsorbens. Kisele komponente:Ispiranje
sorbensa: razblaenom kiselinom, vodom (metanolom). Kisele komponente se adsorbuju iz vodenih
uzoraka podeavanjem kiselog pH. Eluiranje: metanolom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom ili
alkalnim puferom

Neutralne komponente: Mogu biti ekstrahovane bez kontrolisanja pH. Ispiranje sorbensa: r.
kiselinom, alkalnim puferom (uklanjanje ionizabilnih supstanci) ili smjeom metanol/voda. Eluiranje:
MeOH, C2H5OH, CHCl3
2. Normalno fazni: R: (CH2)3 NH2, (CH3)2 (CH2)3 CN, (CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH

Upotreba: za polarne komponente.

Ekstrakcija na polarnim sorbensima

Sorbens se kondicionira sa rastvaraem koji e biti koriten kao eluent (polaran). Uzorak je rastvoren
u rastvarau koji je slabije polaran od eluenta ili nepolaran. Ispiranje sorbenta: metilen hlorid.
Eluiranje baznog polarnog analita: metanol/ kiseli pufer. Eluiranje kiselog polarnog analita: metanol/
bazni pufer.

3. Jonoizmjenjivake (JI) smole

Punila: Neorganska (silikagel) ili organska visokomolekularni polimeri (stirenske i akrilne smole)

Kationski izmjenjivai:

- Sulfonske kiseline (Jaki Kationski Izmjenjivai)

- Karbonske kiseline (Slabi Kationski Izmjenjivai)

Anionski izmjenjivai

- Kvaternerna amonijumova jedinjenja (Jaki Anionski Izmjenjivai)

- Primarni, sekundarni i tercijarni amini (Slabi Anionski Izmjenjivai)

Ekstrakcija na anionskim izmjenjivaima

Kondicioniranje: ispiranjem puferom pH bliskog uzorku (0.010.1M) koji sadri ione: C2H5COO,
CH3COO, F (lahko izmjenjivi). Uzorak: Kiseli rastvor uzorka (pH 12 jedinice iznad pKa analita)

Ekstrakcija meticilina

Moe se ekstrahovati na jakim anionskim i slabim anionskim izmjenjivaima jer je relativno jaka
kiselina. Ispiranje sorbensa: pufer, deionizovana voda, organski rastvara. Uzorak: Rastvor u puferu
(pH 3.84.8). Eluiranje: pufer koji sadri suprotan ion u visokoj koncentraciji Cl ion koji kompetitivno
istiskuje metacilin; (1MNaCl ili citrat).

Ekstrakcija na kationskim izmjenjivaima

Kondicioniranje: ispiranjem puferom pH bliskog uzorku (0.010.1M) koji sadri ione: K, Na, NH4+
(lahko izmenljivi sa kationom smole). Uzorak: Rastvor uzorka u puferu (pH 12 jedinice ispod pKa
analita)

Ekstrakcija adrenalina

Ispiranje sorbensa: pufer, deionizovana voda, organski rastvara. Uzorak: rastvor u puferu NH4Cl (pH
8.3). Eluiranje: pufer koji sadri suprotan ion NH4+ u visokoj koncentraciji; (1M NH4Cl) ili za lipofilnije
supstance: metanol ili etanol.
Sorbensi vezanih faza :

- Monofunkcionalna reverzno fazna (RP) silika

Povrina silike + Monohlordimetiloktilsilan -> C8 sorbens, modifikovana povrina silike

Za polarnije analite sa baznim grupama !

- Trifunkcionalna reverzno fazna (RP) silika

Povrina silike + Trihloroktilsilan -> C8 sorbens, modifikovana povrina silike

Za kiseli pH analita !

- "END Capped" sorbensi :

Trimetilhlorsilan Heksametildisilazan

Hidrofobna povrina, smanjena mogunost sekundarnih interakcija !

Za poveanje selektivnosti kod ekstrakcije sloenih uzoraka koriste se: Kombinovani sorbensi.
Polimerni sorbensi. : polimeri mono- i trifunkcionalnih silika, stiren-divinilbenzena (vea ukupna
povrina, vei kapacitet, ak i za polarne supstance, hidrofobnije su i slue za RP i JI, stabilni u irem
opsegu pH )
 9 UVOD U ANALITIKU

Analitika lijekova pitanja :

- identitet i istoa aktivne tvari koja se koristi za pripremu ljekovitog oblika?

- identitet i istoa pomonih tvari u ljekovitom obliku?
- oneienja u samoj aktivnoj tvari?
- pKa, podioni koeficijent, topljivost i stabilnost aktivne tvari?
- identitet aktivne tvari u gotovom lijeku?
- sadraj aktivne tvari u dozirnom obliku?
- oneienja u farmaceutskom dozirnom obliku?
- stabilnost aktivne tvari u gotovom lijeku?
- brzina oslobaanja aktivne tvari iz ljekovitog oblika?
- koncentracija lijeka u biolokim tekuinama?
- kvalitet lijeka u prometu s obzirom na kvalitativni i kvantitativni sastav deklariran u postupku
dobivanja odobrenja za stavljanje gotovog lijeka u promet?

Ispitivanje lijekova

Djelotvornost = klinika ispitivanja

Nekodljivost = toksikoloko-farmakoloka ispitivanja

kvalitet = kemijska analiticka ispitivanja, fizika analiticka ispitivanja , bioloka analiticka ispitivanja ,
farmaceutsko-tehnoloka svojstva (Odobrenje za stavljanje lijeka u promet (registracija lijeka))

Analitika ispitivanja lijekova

- identifikacija, ispitivanje istoe i odreivanje sadraja farmaceutskih sirovina

- ispitivanje stabilnosti farmaceutskih dozirnih oblika
- ispitivanje oslobaanja aktivnih tvari iz ljekovitih oblika
- otkrivanje i odreivanje oneienja nastalih tijekom sinteze kao i razgradnih produkata
- odreivanje koncentracije lijekova i njihovih metabolita u biolokim tekuinama
- provjera kvalitete lijekova u prometu

Uloga analitike lijekova : proizvodnja lijekova, konrola kvalitete lijekova, istraivanje i razvoj lijekova.

Pristup u analizi lijekova : Postavljanje problema, dizajniranje eksperimenta, izvoenje

eksperimenta, analiza dobivenih podataka (kalibracija instrumenta, standardizacija reagensa
sakupljanje podataka ) , rjeenje problema.

Izovenje eksperimenta se sastoji od :

- postavljanje kriterija osjetljivost, selektivnost, tanost, preciznost, trokovi i brzina analize

- izbor analitike metode
- strategija uzorkovanja
- definiranje interferencija
Lijekovi mogu biti:

- kemijskog porijekla: elementi, tvari dobivene kemijskom sintezom, prirodne kemijske tvari
- biljnog porijekla: biljke i njihove izluevine, ekstrakti biljnih tvari
- ivotinjskog porijekla: mikroorganizmi, genski modificirani organizmi, ivotinjska tkiva,
dijelovi i ekstrakti organa, toksini
- ljudskog porijekla krv i proizvodi iz krvi, plazma, enzimi i hormoni iz placente i urina
- ljekovite tvari
- gotovi lijekovi
- galenski pripravci
- magistralni pripravci
- bioloki lijekovi (imunoloki) : cjepiva, serumi, toksini, alergeni, lijekovi iz ljudske krvi ili
plazme, lijekovi dobiveni rekombinantnom DNA tehnologijom, monoklonska antitijela,
enzimi, hormoni
- biljne droge

Analitika metodologija

- Analitika tehnika : fizikalna i kemijska naela koja se koriste u istraivanju analita ( AAS,
atomizacija, apsorpcija svjetla
- Analitika metoda : primjena tehnike za analizu odreenog analita u odreenom matriksu
- Analitiki postupak : napisane smjernice kako primijeniti metodu na odreeni uzorak,
ukljuujui uzorkovanje i validaciju rezultata

Farmaceutski uzorak -> uzorkovanje -> priprema uzorka -> mjerenje -> iraunavanje rezultata ->
procjena pouzdanosti rezultata ->Analitika informacija o ispitivanom uzorku.

Razvoj novih analitikih metoda :

istraivanje i razvoj lijekova : Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

originalni i generiki lijekovi

postupak registracije lijeka

Analitike metode za kontrolu lijekova: kontrola kvalitete lijekova, slubene metode definirane u
farmakopeji, provjera kvalitete prema drugim meunarodno priznatim normama.

Kvalitet gotovog lijeka - Farmaceutska industrija

Kvalitet magistralnog ili galenskog pripravka - Laboratorij za provjeru kvaliteta galenskih pripravaka i
identifikaciju ljekovitih tvari
Analitika ispitivanja lijekova

Potvrda identiteta :

- spektroskopske metode: IR, UV, NMR, MS

- kromatografske metode: TLC, HPLC, GC
- odreivanje fizikih konstanti: talite, taka vrenja, specifino optiko zakretanje
polarizovane svjetlosti, relativna gustoa, indeks refrakcije, viskoznost
- kemijske reakcije identifikacije

Ispitivanje profila istoe :

- kromatografske metode: HPLC, TLC, GC

- spektroskopske metode: UV, AAS
- elektroforeza
- odreivanje fizikih konstanti: specifino optiko zakretanje polarizovane svjetlosti,
specifina apsorbancija, pH
- odreivanje udjela vode
- ispitivanja graninih vrijednosti
- gravimetrijska ispitivanja istoe

Odreivanje sadraja:

- klasine titracijske metode analize

- instrumentalne metode: UV, HPLC, GC
- mikrobioloka analiza i imunokemijske metode

Kvalitaivna analiza lijekova :

- ispitivanja fizikih svojstava

- potvrda identiteta
- kemijske reakcije identifikacije
- ispitivanja istoe (polukvantitativan karakter)

Kvantitativna analiza lijekova :

- odreivanje sadraja aktivne tvari

- odreivanje sadraja pomonih tvari
- odreivanje izvjesnih primjesa: oneienja, vlaga, kristalna voda, rezidualna otapala

Pristup analizi ovisi o tome da li se radi o ljekovitoj tvari u istom obliku (bulk form) ili ljekovitoj tvari
u farmaceutskim dozirnim oblicima ili biolokim tekuinama

Provjera kvaliteta :

- polazne sirovine za izradu lijekova

- meuproizvodi u izradi lijekova
- gotovi lijekovi
- pakovni materijal lijekova
- reagensi i poredbene tvari za ispitivanje lijekova
 9b STANDARDNE SUPSTANCE

Standardne supstance su materijali dobro utvrenih i ovjerenih (certificiranih) svojstava.

Upotrebljavaju se u odreenim ispitivanjima i odreivanjima kako bi se postigla tanost i
reproducibilnost analitikih rezultata.

Vrste standarda :

- primarni : izraen i certificiran u ovlatenom nacionalnom laboratoriju ili meunarodno

poznatoj instituciji(npr. National Institute for Standards and Technology in the United States
EDQM laboratory
- sekundarni : izraen usporedbom svojstava s primarnim standardom u posebno ovlatenim
laboratorijim. Ima certifikat analize proizvoaa (npr. Fluka, Sigma-Aldrich)
- radni : razvijen u bilo kojem laboratoriju za vlastitu upotrebu i usporeen s primarnim ili
sekundarnim standardom.

Primjena kemijskih standardnih supstanci Evropske farmakopeje :

- potvrda identiteta: IR spektrofotometrija i kromatografske metode

- ispitivanje istoe u odreivanju specifinih oneienja: kromatografske metode
- odreivanje sadraja: UV spektrofotometrija, HPLC i GC, mikrobioloko
- ispitivanje prikladnosti sistema: kromatografske metode, elektroforeza
- kalibracija instrumenata

Ispitivanja kemijskih standardnih supstanci :

- ovisno o namjeni standardne supstance propisuju se potrebna ispitivanja i kvalitet

- za svrhe identifikacije : kontrola kvaliteta standardne supstance u Laboratoriju evropske
farmakopejei certifikat analiza od proizvoaa
- za odreivanja sadraja ili kalibraciju: nekoliko saradnikih laboratorija ispitaju predloenu
tvar koristei razliite tehnike kako bi bili sigurni da je prikladna
Kvalitet standardnih supstanci :

- potvrda o ispravnosti (certifikat) ugledne ustanove

- kvalitet treba biti primjeren odreenoj namjeni u ispitivanju i kontroli kvaliteta lijekova
- homogene i stabilne
- lahko dostupne i prihvatljive cijene
- uvaju se u zapeaenim ampulama ili bocama sa sigurnosnim zatvaraima.

Bioloki poredbeni preparati :

- poznate bioloke aktivnosti

- sva bioloka ispitivanja provode se paralelno s odgovarajuim poredbenim materijalom

Identifikacija + ispitivanje homogenosti ili istoe + odreivanje bioloke aktivnosti

Odreivanje bioloke aktivnosti : osiguravaju ujednaenu aktivnost lijekova ije vrijednosti ne mogu
biti izraene kao kemijske ili fizike veliine. Primjer : BIOLOGICAL TESTS TEST FOR BACTERIAL
ENDOTOXINS

Reagensi :

- reagensi analitikog stepena istoe

- ime i formula reagensa: registarski broj Chemical Abstract Service (CAS broj)
- priprema otopine reagensa
- otopine za jednokratnu upotrebu opisane su u pojedinoj monografiji
- u propisu monografije uz ime reagensa stoji oznaka R
- broj uz oznaku R (R1, R2, ...) oznaava reagens koji se prema propisu priprema iz
pripadajueg reagensa R

Primjeri : Feri hlorid, 2-Butanol, Fuksin

9c Oneiena u lijekovima
Oneienje je bilo koji sastojak ljekovite tvari koji nema definisan kemijski entitet kao ljekovitu tvar.
Zahtjevi kvaliteta lijeka definiu prihvatljive granice za oneienja koja se dozvoljavaju u roku
trajanja farmaceutskog proizvoda. U interesu javnog zdravlja broj ispitivanja i postavljene granice
oneienja trebaju biti :

- smanjene tako da odgovaraju farmaceutskim zahtjevima

- izbjei pretjerano ienje

Vanost ispitivanja istoe farmaceutskih tvari :

- potencijalne aktivnosti i neeljeni uinci oneienja

- razvoj sofisticiranih analitikih tehnika
- sloeniji zahtjevi zakonske regulative
Izvor oneienja :

- oneienja u polaznim sirovinama

- nusprodukti i meuprodukti u proizvodnom postupku
- produkti razgradnje lijeka koji nastaju tokom uvanja i/ili djelovanjem svjetla, temperature,
pH ili vode
- produkti koji nastaju reakcijom s pomonim tvarima ili pakovnim materijalom
- usput ekstrahirane tvari iz prirodnih produkata

Posebna panja !!!

- oneienja s toksinim svojstvima

- fakrmakoloki aktivna oneienja
- oneienja koja mijenjaju aktivnost i djeluju na stabilnost same ljekovite tvari
- oneienja koja utiu na analitike rezultate

KONTROLA ONEIENJA u skladu sa ICH smjernicama:

- Oneienja u novim aktivnim supstancama (ICH, dio Q3A)

- Oneienja u novim farmaceutskim proizvodima (ICH, dio Q3B)

Organska oneienja : prihvatljive granice navedene u ICH dokumentu

Anorganska oneienja : granice ovise o namjeni ispitivanog materijala, koliini i nainu doziranja

Rezidualna otapala: zaostale, hlapljive, organske hemikalije koje se koriste ili nastaju u postupku
proizvodnje.

Nova oneienja : mogu se pronai u poznatoj tvari uslijed izmjene postupka proizvodnje

VRSTE ONEIENJA

1. Specificirana oneienja (specified impurities)

- poznata (stvarna) oneienja

- organska oneienja prisutna u koliini veoj od 0.1 %

- dnevna doza aktivne tvari > 2 g -> prag 0.05%

- oneienja koja imaju farmakoloki uinak (razina nia od 0.1%)

identificirana oneienja

- karakterizirana hemijska struktura

neidentificirana oneienja

- definirana iskljuivo kvalitativnim analitikim svojstvima (npr. kromatografsko vrijeme

zadravanja)
- moe ga biti do 0.1%

Definirani pragovi oneienja ne odnose se na:

- pomone tvari
- bioloke i biotehnoloke proizvode
- Peptide
- Oligonukleotide
- Radiofarmaceutike
- fermentacijske i polusintetske proizvode
- biljne proizvode
- produkte iz biljnih i ivotinjskih izvora

Srodne tvari (related substances)

Poznata oneienja, esto srodne strukture, mogu biti identificirana ili neidentificirana. Poglavlje
Ispitivanja u monografijama organskih spojeva ispitivanja organskih oneienja :

kvantitativne metode - LC, GC, CE

TLC

UV-Vis

ljekovite tvari pod patentnom zatitom - lista oneienja ne mora biti publicirana potrebne
informacije dostupne su kod proizvoaa.

2. Druga oneienja koja se mogu otkriti (other detectable impurities)

- potencijalna oneienja

- nisu detektovana niti u jednom ispitivanom uzorku tokom izrade monografije, ali su ograniena -
ispitivanjima u Ph.Eur.

- mogu nastati u proizvodnom postupku ili stajanjem mogu, ili ne moraju, trenutno biti prisutni u
ljekovitoj tvari.

Primjeri : Ciprofloksacin hidroklorid, Alfakalcidol

 10. ULTRALJUBIASTA I VIDLJIVA (UV-Vis) SPEKTROFOTOMETRIJA

Naelo metode
-molekulska apsorpcijska spektroskopija

-mjerenje koliine apsorbirane svjetlosti u UV (190-380 nm) i vidljivom podruju (380-800 nm)
-apsorpcija UV i Vis zraenja u organskim molekulama

prelaze- iz osnovnog u jednu od vibracijskih i rotacijskih razina pobuenog elektronskog energijskog

stanja

Faktori koji utiu na apsorpciju u UV/Vis podruju

-talasna duljina pri kojoj molekula apsorbira ovisi o jakosti kojom su vezani njezini elektroni ( e- )

-kromofori - nezasiene organske funkcionalne skupine

-auksokromi - grupe s jednim ili vie nesparenih elektronskih parova

-batokromni i hiperkromni pomak

Lambert-Beerov zakon

A = - log T = log Io / I = k c l

k = e = molarna apsorptivnost
A=ecl

UV-Vis-spektrofotometar
izvor zraenja: hidrogenova ili ivina lampa, volframova lampa

monokromator: prizma ili reetka s ulaznom i izlaznom pukotinom

nosa uzorka

detektor zraenja
Kalibracija instrumenta
- skala talasnih duljina :
otopina holmijeva perhlorata

dozvoljeno odstupanje 1nm (UV) i 3 nm (Vis)

- mjerna skala

otopina kalijeva dihromata

dozvoljeno odstupanje apsorbancije 0.01

-rezolucija (za kvalitativnu analizu)

kontrolisana irinom pukotine

otopina toluena u heksanu,

omjer maksimuma (269 nm) i minimuma (266 nm) apsorpcije

Primjena UV/Vis spektrofotometrije u analitici lijekova

1. kvalitativna ispitivanja
- potvrda identiteta lijekova: Ph. Eur.- Sekundarna identifikacija

-u monografiji je definisana talasna duzina maksimuma ( 2 nm) i specifina apsorbancija ili omjer
apsorbancija na razliitim talasnim duzinama

-specifina apsorbancija
A1cm1% = 10e/Mr
apsorbancija otopine koja u 100 ml sadri 1 g ispitivane tvari, debljina sloja 1cm

Primjeri u Ph. Eur.- MERKAPTOPURIN-Mercaptopurinum, MORFIN HIDROHLORID-Morphini

hydrochloridum, IBUPROFEN-Ibuprofenum,

2. ispitivanje istoe lijekova

-ispitivano oneienje i ljekovita tvar imaju apsorpcijski maksimum na razliitim talasnim duzinama
ili razliitu specifinu apsorbanciju na istoj talasnoj duzini

a) specifina apsorbancija (A1cm1%) Primjer-OKSITETRACIKLIN-Oxytetracyclinum

b) apsorbancija (A) Primjer- ADRENALIN TARTARAT-Adrenalini tartras, REZERPIN-Reserpinum,

OMEPRAZOL-Omeprazolum,

ne smije prei odreenu vrijednost

ne smije biti vea od apsorbancije poredbene otopine koja sadri gornju dozvoljenu koliinu
oneienja

c) omjer apsorbancija (A1/A2) na dvije razliite talasne duzine (ispitivana tvar, oneienje)-
BACITRACIN-Bacitracinum
3. Kvantitativna analiza lijekova

- odreivanje pomou specifine apsorbancije c=
1%11

-odreivanje pomou poredbene otopine

- odreivanje pomou kalibracione krive

kalibraciona kriva prireena pomou poredbenih otopina

linearan odnos apsorbancije i koncentracije

sadraj ispitivane tvari odredi se interpolacijom (povlaenjem pravca)

Primjer u Ph.Eur. HLORAMFENIKOL-Chloramphenicolum, DIENESTROL-Dienestrolum

Poveanje selektivnosti i osjetljivosti u kvantitativnoj analizi

1. derivatizacija analita prije odreivanja

Primjer
-analiza adrenalina u prisutnosti lokalnih anestetika

-apsorpcijski maksimumi u istom UV podruju

-kompleks adrenalina s Fe2+

2. derivatizacija oneienja prije kvantitativne analize

Primjer- KARBASALAT KALCIJUM- Carbasalatum calcicum,

3. pomak apsorpcijskog maksimuma podeavanjem pH vrijednosti otopine analita

Primjer
- analiza acetilsalicilne kiseline u prisutnosti kofeina i dekstropropoksifena

4. derivativni spektri

-znaajan utjecaj kod irokih apsorpcijskih maksimuma slabog nagiba

4. odreivanje fizikalno-kemijskih svojstava lijekova
(pretformulacijska i formulacijska istraivanja)

a) odreivanje topljivosti lijeka

otapanje lijeka u vodi ili puferu i mjerenje apsorbancije nakon uspostavljanja ravnotee
prevoenje lijeka u neionizirani oblik i mjerenje zamuenja

b) odreivanje koeficijenta raspodjele lijeka

c) ispitivanje stabilnosti lijeka

razgradni produkti imaju razliit apsorpcijski maksimum od ishodne ispitivane tvari

praenje kinetike razgradnje lijeka

d) odreivanje pKa vrijednosti

pH ovisan UV pomak ionizirane i neionizirane grupe

pKa= +

A - apsorbancija u puferu poznate pH vrijednosti
Ai - apsorbancija potpuno ionizirane vrste
Au- apsorbancija potpuno neionizirane vrste

e) odreivanje oslobaanja lijeka iz formulacije (dissolution testing)

rutinska metoda za praenje oslobaanja aktivne tvari

Posebnosti metode
-jednostavna, jeftina, izdrljiva i precizna metoda za odreivanje lijekova

-rutinska metoda za odreivanje fizikalno-kemijskih svojstava lijekova

-upotreba derivativnih spektara rjeava probleme osnovne metode

Ogranienja metode
-umjereno selektivna; selektivnost ovisi o kromoforu pojedinog lijeka

- slabo primjenjiva u analizi smjesa

 11. INFRACRVENA (IR) SPEKTROFOTOMETRIJA
Naelo metode
-apsorpcija elektromagnetskog zraenja talasne duzine 2.5-50 mm (4000-200 cm-1) u molekuli
uzrokuje promjenu vibracijske energije
-infracrveno zraenje nema dovoljno energije za poticanje elektronskih prelaza

Vibracije molekula
-promjene u duini veze i orijentacije atoma s obzirom na os veze
1. Vibracije rastezanja veze (stretching)
simetrine i nesimetrine
2. Vibracije savijanja veze (bending)
njihanje u ravnini i izvan ravnine, uvijanje u ravnini i izvan ravnine

-IR-apsorpcijska vrpca pojavljuje se kad vibracija uzrokuje promjenu u raspodjeli naboja unutar
molekule

-vibracije molekula ovise o:

-masi atoma
-jaini veze izmeu atoma:
jednostruke veze (n=700-1500 cm-1)
dvostruke veze (n=1600-1800 cm-1)
trostruke veze (n=2000-2500 cm-1)

-broju atoma u molekuli (3n-6)

-prostornom rasporedu atoma

Interpretacija IR spektra

1. Poloaj apsorpcijske vrpce

Evib

k = konst. ovisi o vrstoi veze

12
=
1+2

odreen je vrhom ili intervalom talasnih brojeva

ovisi o vrstoi veze i masi atoma
-vra veza i manja masa=via frekvencija kod koje dolazi do absorpcije

O-H > N-H > C-H > C N > C C > C=O > C=C > C-O > C-C > C-F > C-Cl
uticaj susjednih grupa
solvatacija, intermolekulske vodikove veze
2. Intenzitet apsorpcijske vrpce
apsorpcijska vrpca je intenzivnija to je vea promjena u raspodjeli naboja unutar molekule
C-O > C-N > C-C-OH > C-C-H OH > NH >CH C=C-C=O > C=C-C=C > C=C-C-

intenzitet vrpce ovisi o elektronegativnosti atoma

-vrlo jake vrpce C-N, C-O, C=O, C=N

u kvalitativnoj primjeni intenzitet se izraava od vrlo jaka do vrlo slaba vrpca

manje je zadovoljavajua metoda za kvantitat vnu analizu !!!

3. Podruje funkcionalnih skupina

karakteristine apsorpcijske vrpce (3500-1500 cm-1)

4. Podruje otiska prsta (fingerprint)

apsorpcija karakteristina za svaku molekulu (1500-910 cm-1)
brojne vrpce sloenih sprezanja temeljnih vibracija
velika osjetljivost poloaja maksimuma na vrlo male promjene u strukturi

5. Podruje aromatske strukture spoja

apsorpcijske vrpce zbog savijanja prstena i C-H veza izvan ravnine molekule

IR-spektrofotometar
izvor zraenja
nosa uzorka
monohromator s pukotinom za odabir zrake odreene talasne duzine
detektor

Kod IR-FT instrumenta monohromator je zamijenjen interferometrom

Kalibracija instrumenta
-provjeravanje skale talasnih brojeva

-ispitivanja pomou apsorpcijskih maksimuma polistirenskog filma

-kontrola rezolucije

Priprema uzorka
vrsti uzorak

1. otopljen u pogodnom otapalu (CCl4, CHCl3, CH2Cl2, CS2)

2. pomijean s tekuim parafinom (komercijalno ime: Nujol) suspenzija se nanese izmeu ploica
NaCl u obliku vrlo tankog filma
-identifikacija razliitih kristalnih formi lijeka

3. pomijean s pulveriziranim i osuenim KBr ili KCl u omjeru (1:100) stlaen u tanki disk (d=13 mm)
-vlanost uzorka (snane apsorpcijske vrpce vode kod 1639 i 3448 cm-1)

4. difuzna refleksija (monokromatsko svjetlo, raspreno svjetlo, fotoelija i uzorak dispergiran u KBr)
Tekui uzorak

1. kivete nainjene od NaCl, AgCl, ZnSe, CaF2 (optiki put 0.02-1 mm)

2. tanki sloj tekuine izmeu ploica NaCl ili KCl

Plinoviti uzorak

1. napunjen u kivetama (optiki put 100 mm) pod odreenim pritiskom za ispitivanje stupnja
istoe

Primjena IR spektrofotometrije
- 'fingerprint' tehnika u analitici lijekova svaka molekulska vrsta ima jedinstven infracrveni
apsorpcijski spektar vrpce < 1500 cm-1

-identifikacija lijekova: Ph.Eur. - Prva identifikacija

- identifikacija sirovina za proizvodnju lijekova, plastinih spremnika

- potvrda identiteta i razjanjenje strukture produkata u sintezi lijekova

-karakterizacija uzoraka u vrstom i poluvrstom stanju (tablete i kreme)

-u istraivanju polimorfa lijekova:

POLIMORFI
- pojedine ljekovite tvari postoje u razliitim kristalnim oblicima

-isti kemijski sastav, razliita unutranja struktura

-razliita fizikalna svojstva
-farmaceutska vanost polimorfa

Farmaceutska vanost polimorfa

- topljivost, stabilnost, tvrdoa, gustoa

-oslobaanje aktivne tvari

-bioraspoloivost

-priprema formulacija

-stabilnost i kvalitet proizvoda

-intelektualno vlasnitvo: novi proizvod-novi kristalni oblik tvari je nova ljekovita tvar
IR spektrofotometrija kao tehnika otiska prsta ( eng. fingerprint )
1.Usporedba s poredbenim tvarima
- ispitivana i poredbena tvar pripreme se na isti nain; snime se spektri pod istim uvjetima
-cijeli spektar se usporeuje sa spektrom poredbene tvari

IR-spektar ispitivane tvari mora imati maksimume apsorpcije na istim talasnim duzinama kao
poredbena tvar

- kod vrstih uzoraka nepodudaranje IR-spektara moe biti zbog razliitih kristalnih oblika-
prekristalizacija iz istog otapala

2. Usporedba s poredbenim spektrima

-kalibracija instrumenta
- ispitivana tvar pripremi se prema propisu za izradu poredbenog spektra

poloaji maksimuma ispitivane i poredbene tvari ne smiju se razlikovati vie od 0.5%

Primjeri u Ph. Eur.- ACIKLOVIR-Aciclovirum, ATENOLOL-Atenololum

IR spektrofotometrija kao metoda identifikacije polimorfa

- karakterizacija razliitih kristalnih oblika lijekova
razliit raspored pojedinih grupa u prostoru i vodikove veze u kristalu= razliit IR spektar

- uzorak pripremljen u tekuem parafinu

slabije polaran uzorak mogao bi se otopiti u tekuem parafinu

Posebnosti metode
-daje sloeni 'fingerprint' koji je jedinstven za svaku ispitivanu tvar

-usporedba spektra ispitivane tvari s podrujem otiska prsta standarda

Ogranienja metode
- vrlo rijetko se koristi kao kvantitativna tehnika

- moe detektirati samo velika oneienja u uzorku

- priprema uzorka zahtijeva odreenu vjetinu

- tehnika ima malu izdrljivost zbog uticaja pripreme uzorka na dobiveni spektar
 12. NEAR-INFRARED SPEKTROFOTOMETRIJA (NIR)

Naelo metode
-zraenje talasne duzine 800-2500 nm (12500-4000 cm-1) slabo apsorbiraju C-H, N-H, O-H i S-H veze u
molekuli
vea energija od IR zraenja
vanjsko elektronske molekulske vibracije
overtones rezonancije i kombinacije osnovnih molekulskih vibracija
- zraenje prodire nekoliko milimetara u vrsti uzorak
- dosta materijala je transparentno u tom podruju (spremnici lijekova)- mogue je mjerenje bez
prethodne obrade uzorka !!
- fizikalna i kemijska svojstva ljekovitih i pomonih tvari; kvalitativna i kvantitativna analiza
-talasna duzina apsorbiranog zraenja karakteristina je za pojedinu vezu
-nije mogua direktna usporedba spektra sa spektrom poredbene tvari
NIR vrpce su slabije od osnovnih IR vibracija
preklapanje vrpci u NIR podruju-nuna matematika obrada podataka

NIR-spektrofotometar
Transmisija-izvor zraenja, monohromator, uzorak, detektor
Difuzna refleksija-izvor zraenja, monohromator, detektori, uzorak

Odreivanje aktivnih tvari u zapakiranim tabletama

-brza, nedestruktivna tehnika, ne zahtjeva pripremu uzorka

- identifikacija sastojaka tablete i njihovo istodobno odreivanje unutar spremnika
-sonda s optikim vlaknima

Analiza vrstih dozirnih oblika

- sastav gotovog proizvoda
- ujednaenost sadraja
- uvid u kemijski sastav i fizikalnu strukturu formulacije

Odreivanje veliine estica

- linearan odnos NIR apsorpcije i veliine estica
- apsorbancija uzorka raste smanjenjem veliine estica- vana kontrola u proizvodnji doziranih oblika

Odreivanje vlage
-voda jako apsorbira u NIR podruju (~ 1920 i 1420 nm)
- odreivanje vlage

liofilizirane ljekovite tvari (Ph. Eur.)

higroskopne ljekovite i pomone tvari

praenje procesa granulacije

Procesna kontrola kontituenata formulacije
-uzorci formulacije uzimaju se u razliitim fazama procesa proizvodnje
-korelacija apsorbancije na razliitim talasnim duzinama i koncentracije sastojaka formulacije
odreene referentnom metodom
-specijalne sonde uranjaju se izravno u smjese tokom proizvodnog postupka
(u ekstremnim uslovima temperatur e i pritiska)

Primjeri u Ph. Eur.- HUMANI FAKOR KOAGULACIJE VII-Factor VII coagulationis humanus

Posebnosti metode
-nije potrebna predobrada uzorka (vrsti, tekui i plinoviti)
- moe se mjeriti u debljem sloju izravno kroz staklo i plastine spremnike ili pomou sonde
usmjeravanjem zrake optikim vlaknom na uzorak
- pogodna metoda za 'on-line' praenje i kontrolu procesa proizvodnje
-brza i jeftina analiza viekomponentnih uzoraka
-mogua zamjena hromatografiji ?

Ogranienja metode
- apsorpcijske vrpce su slabije i ire, tee se pridruzuju/ oznaavaju pa je nuna sloena obrada
statistikim i kemometrijskim metodama
-dugotrajan razvoj metode
- instrument je skuplji od IR spektrofotometra

13 Kromatografija

Povijest kromatografije

Profesor iz Bazela Friedrich Goppelsrder je 1861. objavio osvrt na rad M. Schnbeina. Schnbein je
utvrdio da filter papir upija otopine raznih supstanci razliitom brzinom i raliitim intenzitetom.
Goppelsrder je ovaj fenomen razradio i doveo do nastanka preparativne papirne kromatografije.
Izolirao je, izmeu ostalog, azulen. Mihail Semenovi Cvet je botaniar, roen 1872. u Italiji, umro
1919 u Rusiji. Iako nije otkrio kromatografiju, Cvet je najznaajniji pionir kromatografije koji je
objavio prvi rad o razdvajanju klorofila 1906. Razliitim prakovima je punio staklene cijevi i na njima
odvajao komponente ekstrakta lia.

Princip kromatografije

Kromatografija je metoda razdvajanja komponenti iz smjese, pri emu dolazi do preraspodjele

izmeu dvije faze koje se ne mijeaju i od kojih je jedna pokretna, a druga nepokretna. Faze su
odabrane tako da komponente smjese imaju razliit afinitet prema njima. Razliito kretanje
komponenti smjese omoguava njihovo razdvajanje.
Osnovne faze procesa

Uspravna staklena cijev (kolona)b se ispuni fino spraenom vrstom supstancom (stacionarna faza).
Na vrh kolone se nanese mala zapremina otopine smjese koja se razdvaja. Na kolonu se dodaje
mobilna faza koja pod utjecajem gravitacije putuje niz kolonu. Razliite supstance razliitom brzinom
putuju u mobilnoj fazi. Komponente smjese se identificiraju u razliitim frakcijama eluata.

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC)

Naelo metode

- sastojci smjese noeni mobilnom fazom putuju razliitom brzinom du tankog sloja
stacionarne faze. Brzina ovisi o omjeru raspodjele sastojaka izmenu faza. Omjer raspodjele
povezan je s kemijskom prirodom stacionarne i mobilne faze.
- elektrostatske sile stacionarne faze
- razliita topljivost sastojaka uzorka u mobilnoj fazi

Priprema tankog sloja

- homogena suspenzija stacionarne faze

- debljina sloja 0.1-0.3 mm
- suenje na 100-105C 1 h

Nanoenje uzorka i razvijanje kromatograma

- mikropipete i kalibrirane kapilare (~20 mg uzorka)

- zatvorena komora sa zasienim parama razvijaa
- jednodimenzionalna i dvodimenzionalna kromatografija

Aparatura za TLC

- ploe presvuene slojem stacionarne faze (npr. Merck, Darmstadt, Njemaka)

- kromatografske komore
- mikropipete, mikrotrcaljke i kalibrirane kapilare (npr. Hamilton, Reno, USA)
- lampe za detekciju
- reagensi za vizualizaciju odijeljenih sastojaka

Stacionarna faza

- nanesena na ravnu plohu u tankom, jednolinom sloju

- nosa: staklena ploa, plastina ili metalna folija (mogue rezati)
- usitnjena vrsta tvar :

anorganska: silikagel, oksidi, hidroksidi, dijatomejska zemlja

organska: celuloza, dekstran, krobni praci, poliamidi

Modifikacije TLC adsorbensa

silanizacija silikagela

povrina silikagela postaje nepolarna

- obrada slikagela s odgovarajuim otapalom ( npr. KOH u analizi bazinih lijekova jer njihove
soli ulaze u interakciju sa silanolnim grupama )

Mobilna faza - bolja odjeljivanja postiu se upotrebom smjesa otapala razliite polarnosti.

Detekcija odijeljenih sastojaka

- UV detekcija :
o analit apsorbira UV svjetlo pa gasi fluorescenciju ploe (254 nm)
o analit pokazuje fluorescenciju (356 nm)
- Reakcija analita s reagensom
o pare joda, kalijev permanganat, otopina ninhidrina, .....
- Radioaktivne metode
- Bioloke metode detekcije
o antibiotici, enzimatske metode

Procjena kromatograma :

- odrenivanje Rf vrijednosti (Rf x 100)

- karakteristina boja produkta nastalog reakcijom ispitivane tvari s odgovarajuim reagensom
- usporedba s kromatogramom poredbene tvari

Primjena u farmaceutskoj analitici :

- osnovna potvrda identiteta

- vrlo zastupljena u farmakopejskim monografijama u identifikaciji
- ispitivanje istoe farmaceutskih sirovina i ljekovitih oblika
- razvijena kao osnovna tehnika u kontroli kvalitete za odrenivanje tragova oneienja
- veinom pol ukvantit ati vna anali za !!!!

Primjeri : Nifedipin
Ispitivanje istoe tankoslojnom kromatografijom

- u farmakopejskim monografijama temelje se na usporedbi intenziteta mrlje koncentrirane

otopine analita i razrjenenje otopine oneienja
- struktura oneienja poznata : usporedba s poredbenim otopinama oneienja.
- struktura oneienja nepoznata : obuhvaa niz oneienja sline strukture ispitivanoj tvari
usporedba s razrijenenom otopinom ispitivane tvari. Primjer : Kodein

Kvantitativna analiza

- struganje sloja s uzorkom, ekstrahiranje sastojka sa stacionarne faze : odrenivanje fizikalno-

kemijskom metodom.
- izravno odrenivanje na kromatogramu mjerenjem zraenja mrlje pomou denzitometra
- usporenivanje povrine mrlja ispitivanog uzorka s povrinom poredbene tvari odrenene
koncentracije.

Posebnosti metode

- moe se primijeniti u analizi gotovo svakog spoja

- mogu se detektirati sve komponente smjese, za razliku od kolonske kromatografije u kojoj
neke mogu ne eluirati iz kolone !!!!
- izdrljiva i jeftina
- moe se koristiti kao kvantitativna tehnika u kombinaciji s denzitometrom za spojeve koji
nemaju kromofore

Ogranienja metode

- ogranien broj teorijskih tavana u rutinskim TLC sustavima

- ograniena osjetljivost
- nije prikladna za hlapljive spojeve

TLC VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPTLC)

- manja veliina estica silikagela (2-10 mm) = vei broj teorijskih tavana
- horizontalno razvijanje kromatograma :

bre putovanje mobilne faze

manje isparavanje otapala s povrine ploe

jednakomjerno putovanje otapala

Primjena HPTLC kromatografije :

- primjenjuje se kao kvantitativna metoda

- denzitometrijsko odrenivanje apsorpcije ili fluorescencije UV svjetla

Primjer : - odrenivanje farmakoloki aktivnih tiola (kaptopril) koji nemaju jaki kromofor. (kaptopril)
 - odrenivanje aktivnih tvari u formulaciji ( izoniazid, Rimfapicin, pirazinamid )

PAPIRNA KROMATOGRAFIJA

- odjeljuju se sastojci smjese na papiru za kromatografiranje : raspodjela izmenu dvije tekue

faze
- papir obranen s drugim tekuinama
- papir obranen silikonskim uljem
- sadri adsorbens ili ionski izmjenjiva
- silazna ili uzlazna : Ph. Eur. - ispitivanje radiokemijske istoe radiofarmaceutika

TEKUINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE EFIKASNOSTI (HPLC)

Naelo metode: tena mobilna faza pod pritiskom prolazi kroz elinu kolonu napunjenu esticama
stacionarne faze (3-10 mm) nosei komponente uzorka -> uzorak se unosi preko ventila s vie
izmjenjivih petlji -> mehanizam odjeljivanje ovisi o vrsti stacionarne faze

Mehanizam odjeljivanja

- Razdioba: stacionarna faza: tekuina adsorbirana na vrstoj tvari ili organski spojevi vezani na
vrsti nosa. Na odjeljivanje utjee: polarnost sastojaka, polarnost mobilne i stacionarne
faze.
- Adsorpcija: stacionarna faza: polarna (silikagel)

Ionska izmjena

- stacionarna faza: ionski izmjenjiva :

o polimeri sa sulfonskim i karboksilnim kiselim skupinama
o polimeri s bazinim aminskim skupinama : odjeljivanje tvari ionskog karaktera

Raspodjela prema veliini estica

- stacionarna faza: polimerni gelovi razliitih veliine pora

- smjesa tvari s razlikama u veliini estica

Stereokemijske interakcije

- stacionarna faza: celulozni derivati, proteini i peptidi, ciklodekstrini

- odjeljivanje enantiomera (kiralna kromatografija)

Tekuinski kromatograf :

1. spremnici mobilne faze

2. sistem za obradu otapala (otopljeni plinovi)

3. pumpa: visoki pritisci, do 300 bara (300x vei od atmosferskog p. !!)

4. sistem za unoenje uzorka: 1-200 ml

5. kolona: zrna punjenja kolone 3-10 mm

6. detektor

Razdjelna kromatografija

Stacionarna faza

- reakcija organoklorsilana sa -OH skupinama na povrini silikagela

- polarnost stacionarne faze ovisi o vezanim skupinama (R)

Uticaj strukture spoja na brzinu eluacije

Neutralni spojevi :

- polarne i lipofilne grupe molekule lijeka : kolona obrnutih faza najdue zadrava lipofilan spoj =
najpolarniji sastojak smjese eluira prvi

- redoslijed eluacije na koloni moe se predviditi iz strukture

Ionski spojevi

- spojevi iji stupen ionizacije zavisi o pH : kontrola brzine elucije podeavanjem pH vrijednosti
mobilne faze
- najvei uticaj promjene pH je 1 pH jedinica pKa vrijednosti lijeka

Moblna faza

- sastav mobilne faze: smjesa otapala razliite polarnosti = koeficjent selektvnosti

- smanjenje koliine organskog otapala u mobilnoj fazi kod obrnutih faza = poveanje tr
- otopine pufera = dodatak organskog otapala potiskuje ionizaciju kiseline
- izbor optimalne mobilne faze = vaan u ispitivanju profila istoe lijeka

Izokratino euliranje : ne mijenja se sastav mobilne faze tokom elucije

Gradijentno eluiranje : sastav mobilne faze se mijenja kontinuirano ili skokovito

Detektori

Diode array UV detektor (DAD)

- istovremeno pokriva cijelo UV podruje (rezolucija 1 nm)

- cijeli UV spektar svakog pika u kromatrogramu
- primjenjuje se za analizu uzoraka u kojima

Elektrokemijski detektor

- odijeljeni analiti se oksidiraju ili reduciraju promjenom potencijala izmenu radne i referentne
elektrode (mjeri struju koja tee izmenu radne i pomone elektrode)

Detektor indeksa loma (indeksa refrakcije)

- mjeri promjene u indeksu loma mobilne faze prolaskom analita

Fluorescentni detektor

- mjeri fluorescencijsku emisiju nakon pobunivanja analita odrenenom talasnom duzinom

Maseni detektor

Primjena HPLC u analitici lijekova

- odrenivanje oneienja u farmaceutskim tvarima

- tana, precizna i izdrljiva metoda za kvantitativnu analizu farmaceutskih tvari i gotovih
proizvoda; rutinska metoda u industriji i kontroli kvalitete lijeka
- praenje stabilnosti istih ljekovitih tvari i dozirnih oblika, te odrenivanje razgradnih
produkata
- odrenivanje lijekova i njihovih metabolita u biolokim tekuinama
- odrenivanje koeficijenta razdjeljenja i pKa vrijednosti molekule lijeka, vezanje lijekova na
proteine

Kvantitativna analiza lijekova u dozirnim oblicima

Kalibracija s eksternim standardom

- za analizu aktivne tvari u formulaciji kalibraciju je potrebno izvesti u koncentracijskom

rasponu 20% od oekivane koncentracije
- kalibracijska serija otopina standarda
- ekstrakcija aktivne tvari iz formulacije (odrenivanje koncentracije ispitivane tvari iz
kalibracione krive)

Kalibracija s internim standardom ( IS )

- analiza formulacija u kojima nije postignut zadovoljavajui prinos (recovery, %) nakon

ekstrakcije (masti, kreme, terapijski sistemi s polimernim matriksom)
- uzorak se ekstrahira s otopinom koja sadri interni standard
 - omjer povrine kromatografskog pika za jednaku koliinu analita i internog standarda
Primjeri : Cefaleksin

HPLC analiza proteina

- oneienja peptidnih lijekova sa srodnim peptidima

- analiza proteina gradijentnom elucijom
- C18 stacionarna faza s veim porama Primjer : Inzulin

Ionska kromatografija

- mobilna faza sadri:

metansulfonsku kiselinu za kationsku izmjenu

natrijev hidroksid za anionsku izmjenu

- elektrokemijski detektor mjeri vodljivost mobilne faze

Gel kromatografija (size-exclusion)

- odjeljivanje prema veliini molekula prisutnih u smjesi (ekskluzijska kromatografija)

Gel permeacijska kromatografija (odjeljivanje nepolarnih spojeva)

hidrofobna stacionarna faza

nepolarne organske mobilne faze

Gel filtracijska kromatografija (odjeljivanje polarnih spojeva)

hidrofilna stacionarna faza

vodena mobilna faza

Stacionarna faza

- unakrsno povezani polimeri (poliakrilamid, agaroza, dekstran)

- izmjena otopljenih molekula izmenu otapala mobilne faze i istog otapala u porama
stacionarne faze
- zadravanje molekula uzorka u porama ovisi o njihovoj veliini

Distribucijski koeficijent (KD)

- opisuje elucijske karakteristike spoja na koloni

VR volumen zadravanja ispitivanog sastojaka

Vt ukupni permeacijski volumen (volumen zadravanja sastojka ije su molekule dovoljno male da
ulaze u sve pore)

Vo ekskluzijski volumen (volumen zadravanja sastojka ije su molekule vee od pora pa se ne

zadravaju)

Primjena gel kromatografije

- odrenivanje sastava smjesa spojeva velike molekulske mase: relativne koliine svakog
sastojka i sadraj iz kalibracione krive
- odreivanje molekulske mase ( logaritam molekulske mase vs. volumen zadravanja )
- odrenivanje molekulskih masa polimera (kolona se kalibrira s polimerom poznate molekulske
mase)

Posebnosti HPLC metode

- mogunost analize nehlapljivih i termolabilnih tvari, anorganskih iona, makromolekula i slabo

stabilnih prirodnih produkata
- manja mogunost razgradnje uzorka od GC metode
- precizna i automatizirana metoda
- razliite kolone i detektori omoguavaju razvoj selektivne metode
- kromatografska tehnika koja se najintenzivnije razvija !!

Ogranienja HPLC metode

- potreban razvoj jeftinih detektora za praenje spojeva koji nemaju kromofore

- ljekovite tvari se moraju ekstrahirati iz dozirnog oblika prije odrenivanja
- troi se velika koliina organskih otapala

Identifikacija peptidnih lijekova

- cijepanje proteina u male peptidne jedinice (odjeljuju se tekuinskom kromatografijom)

- maseni spektar otkriva sekvence aminokiselina
- identifikacija proteina pomou baza podataka proteinskih struktura

Koncept vremena zadravanja

Vrijeme koje u koloni provede supstanca koja ne stupa u nikakvu interakciju sa stacionarnom fazom
se zove vrijeme zadravanja nezadrane supstance (tM). Vrijeme zadravanja (tR) se mjeri od
momenta unoenja uzorka do maksimuma signala. Reducirano vrijeme zadravanja (tR) je razlika
vremena zadravanja i vremena zadravanja nezadrane supstance. Pik idealnog oblika ima izgled
grafikog prikaza zakona normalne raspodjele (Gaussova kriva).

= vrijeme zadravanja

= standardna devijacija
 2= varijansa

y = odrziv detektora u funkciji vremena x

Razlozi za odstupanje od idealnog sluaja

- Nepravilnosti u koncentraciji uzorka na poetku kolone nastale pri nanoenju uzorka.

- Razliita brzina mobilne faze u sredini kolone i uz zidove kolone.
- Difuzija analita u mobilnoj fazi.
- Otpor pri prelasku analita iz stacionarne u mobilnu izmobilne u stacionarnu fazu.

Dva naina izraunavanja asimetrije pika

- Skewing faktor, a (prema USP), mjeri se na 10% visine od bazne linije.

- Tailing faktor ili faktor simetrije, TF (prema Ph. Eur.) mjeri se na 5% visine od bazne linije

Teoretski tavani

Model teoretskih tavana slui za objanjavanje kretanja supstanci kroz kolonu. Sam naziv je preuzet iz
teorije frakcione destilacije. Prema modelu teoretskih tavana, itava duina kolone L podijeljena je na
male, uske dijelove jednake irine H. U svakom od ovih dijelova koncentracija analita u mobilnoj fazi
je u ravnotei s koncentracijom analita u stacionarnoj fazi. U svakom slijedeem uspostavljanju
ravnotee, supstanca putuje za duinu kolone H to odgovara visini teoretskog tavana.

Efikasnost kolone kao broj teoretskih tavana

Kako supstanca putuje kroz kolonu, prostor u kojem se nalazi se stalno iri. Linearna disperzija koja se
izraava kao varijansa 2 na kraju kolone iznosi: 2 = H.L. Broj teoretskih tavana u koloni duine L
iznosi: N=L/H.

14. Gasna kromatografija (GC)

GC-MS
Rezidualna otapala

Gasna kromatografija (GC Gas Chromatography,eng) je metoda kod koje je mobilna faza gasovita
- nosei gas (mobilna faza) ne reaguje ni sa komponentama uzorka ni sa stacionarnom fazom
- uzorak je gasovit na radnoj temperaturi kromatografske kolone: dakle uzorak je ili gas ili lahko
isparljiva tenost
- stacionarna faza je teko isparljiva tenost ili vrsta supstanca
- gasna kromatografija moe biti gasno-tena podiona (tanak film tenosti nanesen na inertnu vrstu
supstancu, komponenta se dijeli izmeu gasne faze i tenosti u kojoj se rastvara) ili gasno-vrsta
adsorpciona (komponenta se dijeli izmeu mobilne faze i stacionarne faze na koju se adsorbuje)

GASNA KROMATOGRAFIJA ( GC )
Naelo metode
- uzorak se unosi na kolonu putem grijanog sistema za utrcavanje gdje ispari gasna mobilna faza
-gasna mobilna faza pod pritiskom prolazi kroz grijanu kolonu prevuenu tekuom stacionarnom
fazom ili punjenu vrstim nosaem impregniranim tekuom stacionarnom fazom
-odjeljivanje smjese u skladu s vremenom provedenim u stacionarnoj fazi

Gasni kromatograf
1. dovod gasa nosaa: helij, nitrogen, vodik
2. ureaj za regulaciju pritiska i protoka gasova
3. sistem za utrcavanje uzorka (injektor)
4. kromatografska kolona
5. penica (do ~ 400 C)
6. detektor

Sistem za utrcavanje uzorka (injektor)

-unosi se mala koliina uzorka (0.5 2 ml)
-smanjeno irenje zona

- split / splitless injektiranje

kod kapilarnih kolona uzorak se ne unosi direktno u kolonu
uzorak se podijeli u dva nejednaka dijela i vei dio odventilira
-uklanja ekspanziju otpala u kojem je
-uzorak otopljen

- teni uzorak se unosi mikropricom, uobiajene zapremine su 0.1 - 10 L

- gasni uzorak (0.5 10 mL) pomou posebnog ventila za gasno uzorkovanje koji se spoji na sud koji
sadri gas koji treba da se analizira
- injektor je dio kromatografa koji prihvata uzorak, priprema ga i prenosi u kromatografsku kolonu
- od okoline je odvojen septumom (od silikonske gume), uzorak se unosi probadanjem igle
mikroprice
- injektor je na dovoljno visokoj temperaturi da brzo ispari uzorak
- u injektoru se ispareni uzorak moe razblaiti u odgovarajuoj zapremini noseeg gasa pa se onda
uvodi u kolonu
- ako se uzorak ne ispari dovoljno brzo, kromatografski pikovi nee biti dovoljno uski
- Injektor sa razdjelom protoka samo mali dio uzorka uvodi u kolonu, to obezbjeuje ravnotene
uslove u koloni, zbog velikog razblaenja (split injection);
- Sa druge strane, to nije zgodno ako se trae tragovi komponenti (splitless injection);
- Uzorak direktno u kolonu, uz prethodno isparavanje (on-column injection).

Split/splitless injektor- septum, izlazni ventil, komora, kolona, gas nosa, grijani metalni blok, liner

GC penica
-termostatiranje kolone
1. izotermalno (konstantna temperatura)
2. programirano povienje temperature

kontinuirano ili skokovito povisivanje temperature kolone tokom elucije

npr.: 60C (1 min) / 5C/min do 100C (5 min) /10C/min do 200C (5 min)

uzorci ireg raspona vrelita

injektiranje uzorka moe biti na nioj temperaturi

Vrste kolona
Punjene kolone
- staklene, metalne ili teflonske cijevi; d=1-3 m, f=2-5 mm, punjene vrstim nosaem velike specifine
povrine (kalcijev silikat) impregniran tankim slojem tekue stacionarne faze
-vrsti nosa se silanizira- smanjena adsorpcija polarnih sastojaka
- manjeg razluivanja, temperature do ~280C- na viim temperaturama isparava tekua stacionarna
faza

Kapilarne kolone
- kapilarne kolone od izvuena kvarca duljine 12-50 m, promjera 0.2-0.5 mm
- unutranja stjenka presvuena tankim slojem stacionarne faze 0.1-5 mm
-kemijski se vee na silanolne grupe stijenke kolone
- vea djelotvornost od punjenih kolona, podnose vie temperature

Parametri koji utiu na djelotvornost GC

-Vrsta i protok gasa nosaa
nitrogen i helij- djelotvorniji kod brih protoka
nitrogen se dodaje prije ulaska u detektor (make up)
brzina protoka gasa smanjuje se porastom temperature

- Temperatura kolone
nia temperatura-bolje razluivanje

- Duzina kolone
mo odjeljivanja kolone
-raste s drugim korijenom duljine kolone
-poveanje duzine kolone produava vrijeme analize

- Unutranji promjer
kolona manjeg promjera
-bolja djelotvornost

- Debljina tekue stacionarne faze

deblji sloj
-due vrijeme zadravanja analita

Detektori
-Plamenoionizacijski detektor (FID)
sagorijevanje organskih spojeva u plamenu
-nastaju ionski meuprodukti i elektroni
-elektroda u detektoru biljei pojaanje struje

Zrak. plamen, izlaz iz kolone, kolektor, vodik

-Detektor apsorpcije elektrona

radioaktivni izvor ionizira gas nosa
-u prisutnosti organskih molekula struja se smanjuje

- Detektor toplinske vodljivosti

promjena toplinske vodljivosti struje gasa nosaa zbog prisutnosti analita

- Selektivni detektori
spektroskopski (IR, maseni) detektori

Primjena GC u analitici lijekova

- ispitivanja hlapljivih oneienja u ljekovitim tvarima
-odreivanje rezidualnih otapala u ljekovitim tvarima
- odreivanje ljekovitih tvari u formulacijama, posebno onih koji nemaju kromofore
 -odreivanje lijekova i njihovih metabolita u biolokim tekuinama
- karakterizacija ishodnih materijala u sintezi molekule lijeka
- karakterizacija hlapljivih ulja koji se upotrebljavaju kao pomone tvari u formulacijama i masnih
kiselina u uljima

Svojstva internog standarda ( IS )

srodna struktura analitu (propanol kao interni standard za odreivanje etanola)
stabilan
dobro razdvajanje kromatografskih pikova internog standarda, analita, kao i pomonih tvari
prisutnih u ekstraktu
elucija slina analitu
ispitivana koncentracija treba dati odgovor detektora slian onom koji daje analit

Odreivanje hlapljivih oneienja u farmaceutskim tvarima

Primjeri u Ph. Eur.
-odreivanje srodnih tvari u ispitivanjima istoe ljekovite tvari
Kamfor
Klorokrezol
Grizeofulvin
Dietilftalat
Amantadini hidroklorid

-odreivanje hlapljivih oneienja:

timola u halotanu
benzaldehida u benzilnom alkoholu
hlapljivih oneienja u etanolu (MeOH, acetaldehid, benzen)
dietilenglikola u glicerolu
vinilklorida u plastinim spremnicima
etilen oksida u sterilnim pricama i plastinim spremnicima

Primjena derivatizacije u GC
- derivatizacija izrazito polarnih, slabo topljivih spojeva prije GC analize
Odreivanje atropina u kapima za oi
-homatropin kao interni standard-trimetilsilil grupa maskira polarnu OH skupinu

Primjena GC u bioanalitici
-analiza lijekova i njihovih metabolita u krvi, urinu i tkivima
-odrediti optimalni reim doziranja
-istraiti naine biotransformacije
-vee interferencije s biolokim matriksom

Posebnosti metode
-tana i precizna metoda analize, posebno kad se koristi interni standard
-vea mo razdvajanja nego u HPLC-u kad se koriste kapilarne kolone
-automatizirana (autosampler kod injektiranja)
-moe se koristiti za odreivanje spojeva koji nemaju kromofore
-mobilna faza jeftinija (ak i kad se helij koristi kao gas nosa) u usporedbi s organskim rastvaraima
kod HPLC

Ogranienja metode
-mogu se analizirati samo termostabilne i hlapljive tvari
- neki uzorci zahtijevaju derivatizaciju kako bi postali hlapljivi, no to unosi dodatni korak u analizu i
mogue interferencije
- moraju se injektirati vrlo mali volumeni uzorka to oteava njegovo kvantitativno uvoenje
-vodene otopine i soli ne mogu se injektirati

GC-MS

-identifikacija oneienja (> 0.1%)

-oneienje ima due vrijeme retencije-vea molekulska masa

REZIDUALNA OTAPALA

Ph. Eur. opa monografija tvari za farmaceutsku primjenu (Substances for pharmaceutical use)

-Identifikacija i kontrola rezidualnih otapala u ispitivanju graninih vrijednosti

-Rezidualna otapala u opim tekstovima
-propisuje granice otapala koja mogu zaostati u aktivnim i pomonim tvarima nakon proizvodnje

Podjela rezidualnih otapala

Prva skupina
otapala koja treba izbjegavati
uzrokuju neprihvatljivu toksinost
kancerogeni i opasni za okoli
benzen, tetraklor ugljik, dikloretan, trikloretan

Druga skupina
otapala koja treba ograniiti (0.1 mg/dan, konc.10 ppm)
 toksina
acetonitril, formamid, kloroform, heksan, diklormetan, metanol, dioksan, piridin, etilenglikol, toluen..

Trea skupina
otapala male toksinosti (do 50 mg/dan, konc. 5000 ppm)
aceton, acetonitril, etanol, octena kiselina, butanol, dimetilsulfoksid, propanol, etilacetat..

Kontrola rezidualnih otapala

-propisane granice za rezidualna otapala ovise o:
-toksinosti otapala
-nainu primjene i dozama farmaceutske tvari

Koncentracija (ppm) = 1000 x doputeno dnevno izlaganje (mg/dan) / doza (g/dan)

Identifikacija i odreivanje rezidualnih otapala

- identifikacija nepoznatih otapala
- utvrivanje graninih vrijednosti oneienja otapalima
-prva i druga skupina
-kvantitativna analiza otapala
- druga skupina > 1000 ppm
-trea skupina kad je potrebno

Metode analize rezidualnih otapala

- gasna kromatografija sa statikim head-space injektiranjem
uzorak se dri dovoljno dugo na odreenoj temperaturi dok se

ne uspostavi ravnotea izmeu gasne i krute/tekue faze

analiza gasne faze koja sadri rezidualno otapalo -gas nosa uvodi se u kolonu gasnog kromatografa

- gubitak suenjem (nespecifina metoda samo otapala iz tree skupine )

Purge trap analiza

- gas propuhuje uzorak koji je otopljen u odgovarajuem otapalu (nehlapljivo i ne interferira s

mjerenjem)
- hlapljive oneienja sa strujom gasa dolaze do polimernog adsorbensa => grijanjem se
koncentrirana oneienja desorbiraju => struja gasa hlapljiva oneienja nosi u GC

Primjer : Budesonid
 15 TERMOANALITIKE METODE

- skupina tehnika kod kojih se mjeri promjena fizikalnog svojstva tvari kao funkcija temperature
- svaka tvar karakterizirana je svojom slobodnom energijom (G, G=H-TS)
- karakterizirana je temperaturom pri kojoj do nje dolazi i promjenom sadraja topline

16 Validaciju analitikih metoda treba provesti:

- pri razvoju i uvoenju nove metode
- pri promjeni bilo kojeg dijela analitike metode koja je ve bila validirana

prenamjena postojee metode

poboljanje i prilagodba postojee metode
prenoenje metode u drugi laboratorij
prenoenje metode na drugi instrument
promjene u sintezi glavne komponente, sastavu gotovog proizvoda ili analitikom postupku

Pristup validaciji

Definicija problema i plan rada -> mjerenje i obrada podataka -> izrada dokumentacije

standardni operativni postupci, izvjetaj o eksperimentima i rezultatima validacije

Analitiki parametri koji se odreuju u postupku validacije:

1. tanost
2. preciznost
3. specifinost/selektivnost
4. granica dokazivanja (LOD)
5. granica odreivanja (LOQ)

6. linearnost i koncentracijsko podruje

7. izdrljivost/otpornost

Parametri u validaciji pojedinih analitikih postupaka

Tanost (ispravnost) pokazuje slaganje srednje vrijednosti dobivenih rezultata i stvarnih, ili
prihvaenih, referentnih vrijednosti. Analiza uzoraka poznate koncentracije, usporedba izmjerenih i
stvarnih vrijednosti. Najmanje tri mjerenja uzorka za najmanje tri koncentracije u radnom podruju
metode. Tanost metode ukazuje na sistemske greke.

Preciznost (pouzdanost) pokazuje slaganje izmeu niza ponovljenih mjerenja iz istog homogenog
uzorka, pri istim propisanim uvjetima. Pet-est odreivanja na 2-3 razliite koncentracije. Izraava se
kao SD, RSD (1%) ili interval pouzdanosti oko srednje vrijednosti.

Granice prihvatljivosti za RSD vrijednosti ovise o tipu analize i koncentraciji analita.

Preciznost se iskazuje kao:

1. Ponovljivost (podudaranje rezultata dobivenih uzastopnim mjerenjem istog uzorka, istom
metodom, pod istim uvjetima isti analitiat, isti instrument, jedan laboratorij, u kratkom
vremenskom razdoblju)

2. Srednja preciznost (odstupanje rezultata dobivenih mjerenjem istog uzorka, istom metodom, pod
razliitim uvjetima u istom laboratoriju razliit analitiar, razliit instrument, reagensi razliitih
dobavljaa, dui period)
3. Obnovljivost (podudaranje rezultata dobivenih uzastopnih mjerenjem nekoliko istih uzoraka, istom
metodom, u razliitim laboratorijama razliit analitiar, razliiti radni uvjeti unutar specifiranih
parametara metode)
Specifinost/selektivnost, pojmovi se esto poistovjeuju.

Specifinost je sposobnost metode da nedvojbeno razlikuje jedan analit od ostalih komponenti

uzorka.
Selektivnost je mogunost metode da moe tano odrediti eljeni analit u prisutnosti ostalih
komponenata uzorka. Odreivanje selektivnosti:
1. Identifikacija (usporedba rezultata analize)
2. Ispitivanja istoe i odreivanje sadraja (razlikovanje analita u prisutnosti oneienja
i/ili pomonih tvari)

Linearnost je sposobnost metode da unutar odreenog intervala daje rezultate koji su izravno
proporcionalni koncentraciji analita.
- serija uzoraka s razliitim koncentracijama analita, 3-6 odreivanja na najmanje 5
koncentracija (dobije se kalibraciona kriva)
- grafiki prikaz ovisnosti signala o koncentraciji analita (regresioni pravac, k > 0.999)
- grafiki prikaz omjera signala i odgovarajue koncentracije vs. log koncentracije analita (u
linearnom podruju linija horizontalna)

Radno podruje je raspon izmeu gornje i donje koncentracije analita unutar kojega analitika
metoda ima prihvatljivu tanost, preciznost i linearnost. Preporueno radno podruje za odreivanje
sadraja aktivne tvari je 80-120%.

Granica dokazivanja (LOD) je najnia koncentracija analita u uzorku koja moe biti dokazana, ali ne i
odreena, pri zadanim uslovima metode.
Granica odreivanja (LOQ) je najnia koncentracija analita koju je mogue odrediti s prihvatljivom
tanou i preciznou pri propisanim uslovima metode.

LOD i LOQ odreuju se razrjeivanjem ispitivane otopine.

- Omjer signal/um usporeuju se signali uzorka poznatih niskih koncentracija analita sa

signalom slijepog pokusa.
Prihvatljivi omjeri: LOD 3:1 ili 2:1, LOQ 10:1

- Standardna devijacija signala i nagiba kalibracionog pravca (alfa)

1. standardna devijacija odgovarajueg broja mjerenja signala slijepog uzorka

2. standardna devijacija regresionog pravca
3. standardna devijacija y-odsjeka regresionog pravca
 - Ako se zahtijeva odreena preciznost na granici odreivanja, LOQ se odredi iz grafikog
prikaza, preciznost (RSD) vs. odgovarajua koncentracija

Izdrljivost otpornost je mjera sposobnosti analitikog postupka da ostane nepromijenjen pod

uticajem malih, ali namjernih promjena parametara metode. Procjenjuje se variranjem jednog
faktora, dok ostali ostaju nepromijenjeni.
Indikator pouzdanosti metode tokom normalne primjene, uz male promjene uvjeta u kojima se
realno provode ispitivanja. Identificiraju se faktori koji utiu na metodu, a analitiar definie uslove
koje mora strogo kontrolisati tokom provoenja metode.

17 BIOFARMACEUTSKA KARAKTERIZACIJA LIJEKOVA - TESTIRANJA BRZINE

OTAPANJA

Apsorpcija aktivnih principa, to jest, proces prolaska lijeka kroz bioloke membrane koje razdvajaju
mjesto apsorpcije od sistemske cirkulacije, zavisi od procesa otapanja (brzine otapanja ili disolucije)
koja se odvija na mjestu primjene u koju je dospio oblik doziranja.

U sluaju peroralnog puta primjene i farmaceutskih oblika sa brzim oslobaanjem, proces otapanja
se konkretizuje brzinom disolucije lijeka u intestinalnom lumenu.

Bioraspoloivost se definie kao brzina i stupanj apsorpcije ljekovite supstance iz farmaceutskog

oblika i definisana je krivuljom odnosa koncentracije i vremena u sistemskoj cirkulaciji ili nakon
izluivanja u urinu.

Bioekvivalencija lijekova podrazumijeva da su dva farmaceutska ekvivalenta (sadre isti iznos istog
aktivnog principa u istom farmaceutskom obliku i namjenjeni su za isti nain primjene) i njihova
bioraspoloivost (stepen i irina apsorbcije) nakon primjene u istom molarnom odnosu slini do te
mjere, da e njihov uinak, uzimajui u obzir djelotvornost i nekodljivost biti isti.

Disolucione studije mogu sluiti za:

1. Testiranje kvaliteta proizvoda:

- U razvoju farmaceutskog oblika
- U ispitivanju ujednaenosti proizvodnog postupka i konzistentnosti proizvodnih serija
- U kontroli kvaliteta gotovih lijekova u toku roka trajanja
- U sluaju eventualnih promjena u formulaciji, proizvodnom postupku ili mjestu proizvodnje
- U dobijanju informacija o testiranim serijama upotrijebljenim u studijama bioraspoloivosti/
bioekvivalencije i prvim klinikim studijama, da se podri specifikacija za kontrolu kvaliteta

2. Mogunost surogata bioekvivalencije:

- Da potpomogne pretpostavku o slinosti izmeu referentnih proizvoda iz razliitih zemalja pod
uslovom da su proces proizvodnje, sastav i specifikacije slini
- Da demonstrira, u odreenim sluajevima, slinost izmeu razliitih formulacija neke aktivne
supstance i referentnog medicinskog proizvoda (npr. biowaivers, varijacije, promjene u formulaciji u
toku razvoja i generiki proizvodi)
- Da istrai konzistentnost proizvodnih serija proizvoda (testiranog i referentnog) to se koristi kao
osnova za odabir odgovarajuih serija za in vivo studiju
Evaluacija faktora slinosti bazira se na sljedeim uslovima:
- Minimumu od tri vremenske take (nula je iskljuena)
- Vremenske take trebaju biti iste za dvije formulacije
- Dvanaest pojedinanih vrijednosti za svaku vremensku taku i za svaku formulaciju
- Ne vie od jedne prosjene vrijednosti >85% otopljenog lijeka za bilo koju formulaciju
- Relativna standardna devijacija ili koeficijent varijacije mora biti manji od 20% za prvu taku i manji
od 10% za drugu i zadnju taku

Topivost lijekova odreuje se u vodenom mediju i visoko topivim se smatraju oni lijekovi ija se
najvea jaina otapa u 250 mL ili manje medija kojem je pH u rasponu od 1,00 do 7,50. Volumen od
250 mL ili manje, odreen je na osnovu testova bioekvivalencije na humanim dobrovoljcima koji
ispitivani lijek uzimaju per os uz au vode (250 mL ili manje).

Permeabilnost se odreuje in vivo ispitivanjima na osnovu apsolutne bioraspoloivosti, u kojoj se

poredi koliina apsorbovanog lijeka per os u odnosu na i.v. primjenu iste koliine ispitivanog lijeka.
Alternativno, za odreivanje permeabilnosti mogu se koristiti animalni in situ perfuzioni modeli ili in
vitro modeli zasnovani na elijskim kulturama.

Brzina otapanja farmaceutskog oblika sa trenutnim oslobaanjem je odgovarajua ukoliko se otopi,

ne manje od 85% deklarisanog sadraja, unutar 30 minuta uz upotrebu aparature koarica, pri brzini
od 100 obrtaja/min (ili aparature lopatica pri brzini od 50 obrtaja/ min) u 900 mL ili manje, u svakom
od sljedeih disolucionih medija:
- 0,1N HCl ili USP vjetaki gastrini medij bez enzima;
- pufer pH 4,5;
- pufer pH 6,8 ili USP vjetaki intestinalni medij bez enzima.

WHO i FDA, od samog poetka razvoja BCS, podrava ovakav koncept testiranja kako bi se smanjila
cijena kotanja esencijalnih generikih lijekova, to bi trebalo da povea dostupnost lijeka pacijentu.

Testiranje bioekvivalencije predstavlja jedan od nadomjestaka u provjeri kvaliteta lijeka i omoguava

da nakon isteka patentnih prava, brojni proizvoai generikih lijekova uspiju napraviti kopije lijekova
koje e konkurirati lijekovima originatora.

Od 90-ih godina kontinuirano do danas, nizom zakonskih uredbi i Evropska komisija, u prvom redu
EMEA (eng. European Medicines Agency) potie razvoj generikih lijekova uz naglasak na
transparentnosti i sljedivosti postupaka.

RAZVOJ TESTIRANJA BRZINE OTAPANJA/ PROFILA OSLOBAANJA FARMACEUTSKIH OBLIKA:

U veini sluajeva dezintegracija predstavlja preduvjet otapanja aktivne supstance, to je u skladu sa

injenicom da je u periodu od 1945.-1950. vrijeme raspadanja (dezintegracije)
bila osnova testiranja tableta i kapsula u skladu sa BP i USP. Odstupanja su uoena za preparate
pojedinih lipofilnih vitamina i slabo topivih aktivnih supstanci.

Zvanino je u USP 18 (1970. godina) uvrtena aparatura koarica (aparatura 1) koja je odmah
usvojena u est monografija. 1978. godine je usvojena i aparatura lopatica (aparatura 2).
U USP 21 (1985. godina) uvrteno je opte poglavlje Drug Release.

Broj zvaninih monografija koji predvia testiranje brzine otapanja/profila oslobaanja porastao je sa
6 u 1970. godini na 400 u 1985. godini.

Aparatura 1 prvenstveno je namjenjena za ispitivanje kapsula, granula/ peleta, film obloenih

preparata sa odgoenim otputanjem (gastrorezistentni preparati), preparata koji imaju tendenciju
da plutaju na povrini disolucionog medija i za testiranje preparata uz upotrebu odgovarajueg
surfaktanta u disolucionom mediju.

Veliki broj monografija, automatizacija testiranja je znaajna prednost za rutinsku upotrebu i u veini
sluajeva mogua je brza, potpuna izmjena disolucionog medija.

Ogranienja upotrebe ove aparature u prvom redu su vezana za postojanje mrtve zone ispod
koarica, mogunost formiranja zranih meuprostora, koji mogu da dovedu do slabije difuzije
otopljene aktivne supstance i lano snienih rezultata (neophodna adekvatna deareacija disolucionog
medija).

Aparatura 2 predstavlja metodu prvog izbora za ispitivanje tableta ali i kapsula, granula/ peleta, film-
obloenih preparata sa odgoenim otputanjem (gastrorezistentni preparati).
Posjeduje praktino sve pozitivne odlike aparature I, a nedostaci vezani uz eventualno plutanje
preparata na povrini disolucionog medija mogu biti prevazieni upotrebom adekvatnih sinkera.
Dodatna ogranienja su vezana za oteanu, potpunu izmjenu disolucionog medija pojavu mrtve
zone ispod lopatice na to upuuje formiranje konusa.
U toku razvoja farmaceutskog proizvoda, uticaj formiranja konusa se prevazilazi upotrebom
takozvanih peak posuda koje sprjeavaju formiranje mrtve zone ali koje takoer nisu u skladu sa
farmakopejskim specifikacijama za aparaturu I i II.

Aparatura 1 - Koarice

Sastoji se od:
1. Disolucione posude cilindrinog oblika, polukrunog dna prenik je 98-106 mm i normalan
volumen 1000 ml
2. Metalnog, motoriziranog nosaa (konstantna brzina vrtnje) - izraen od nehrajueg elika
(esto obloen teflonom)
3. Cilindrine koarice, esto obloene zlatom debljine sloj 2.5 m

Prednosti:

- Mogua potpuna promjena pH tokom testiranja

- Testiranje moe biti u potpunosti automatizirano = rutinska upotreba

Nedostaci:

- Dezintegracija - disolucija interakcije

- hidrodinamika mrtva zona ispod koarice
- Iznimno je vana degasifikacija disolucionog medija
Aparatura 2 - Lopatice

Sastoji se od slinih dijelova kao i aparatura I, izuzev to umjesto koarica, na motoriziranim

nasaima su postavljene lopatice. Motorizirani nosai lopatice ine jedinstvenu formaciju vrlo esto
obloenu inertnim materijalom (npr. teflon).

Aparaturom II najee testiramo:

- tablete
- kapsule
- obloene peroralne oblike za odgoenim djelovanjem (gastrorezistentni oblici)
Najei volumen disolucionog medija: 900/1000 ml.

Prednosti:

- Jednostavna za upotrebu
- Mogua promjena pH medija
- Testiranje moe biti u potpunosti automatizirano = rutinska upotreba

Nedostaci:

- Promjena pH medija je esto vrlo teka u praksi

- Hidrodinamika je kompleksna i ovisna o poziciji ispitivanog oblika u disolucionoj posudi (mogua
pojava plutanja, lijepljenja i sl.) = znaajna razlika u dobivenim rezultatima
- Upotreba sinkera u sluaju problema sa plutanjem

HIDRODINAMIKA

Pored farmakopejskih zahtjeva koje svaka aparatura mora da zadovoljava, USP od 1978. godine
propisuje test prikladnosti aparature zasnovan na upotrebi kalibracionih tableta, koji treba da osigura
provjeru sistema u cjelini i onih parametara koji se ne mjere na konvencionalan nain:
- stepen vibracija,
- istou dijelova aparata koji su u kontaktu sa disolucionim medijem,
- stepen deaerecije disolucionog medija.

Koriste se USP kalibracione tablete za aparaturu I, II i V (prednizon tablete 10 mg i do prije par godina
salicilna kiselina tablete 300 mg) i aparaturu III (klorfeniramin maleat tablete sa produenim
otputanjem 16 mg).

Posljednjih godina, FDA kao alternativu upotrebi kalibracionih tableta otvara mogunost koritenja
mehanike kalibracije, kojom se, uz upotrebu odgovarajuih, certificiranih instrumenata provjeravaju
sljedei parametri:
- stepen centriranosti i vertikalna orijentacija nosaa lopatica/ koarica,
- stepen centriranosti koarica,
- stepen centriranosti i vertikalna orijentacija posuda,
- stepen uranjanja i brzina vrtnje lopatica/ koarica.
Mehanika kvalifikacija kao iri pojam dodatno obuhvata provjeru dimenzija aparature u skladu sa
specifikacijama navedenim u USP ili Ph.Eur.

istoa posuda ili povrine lopatica/ koarica moe da bude uzrok lano povienih rezultata ukoliko
su prisutna povrinska oneienja koja uzrokuju lokalno vrtloenje i mijenjaju hidrodinamska
svojstva u disolucionom mediju.

Prisustvo ogrebotina metalnih ili staklenih povrina moe uzrokovati identine probleme to sugerie
da je potrebno paljivo ienje i eventualna zamjena izgrebanih i oteenih dijelova. Prisustvo
otopljenih gasova u disolucionom mediju moe uzrokovati lano sniene rezultate stepena
disocijacije pojedinih lijekova a farmakopejski propisi u principu sugeriu ili koritenje navedenih ili
razvoj alternativnih metoda deaeracije koji bi bili validirani u
laboratorijskim uslovima.

Najee metode deaeracije su:

- zagrijavanje disolucionog medija na 410C;
- vakuum filtracija kroz filter poroznosti 0,45 m;
- tretiranje medija na ultrasoninom kupatilu;
- uvoenje helijuma u disolucioni medij (zbog cijene kotanja rjee se koristi).

Deaerirani disolucioni medij treba paljivo usuti u posude i to prije zapoeti testiranje zbog
dvosmjernosti procesa i postupne aeracije medija.
Na tritu postoje MPS (eng. Media Preparation Station) ureaji vie proizvoaa koji slue za
automatsku pripremu, deaeraciju i odmjeravanje tanog volumena disolucionog medija.

Aparatura 3 sa rotirajuim cilindrom

Koristi se za:
- tablete
- Preparate sa kontrolisanim otputanjem
Standardni volumen: 200-250 ml po cilindru.

Prednosti:
- jednostavna promjena pH medija
- pH-profilisanje
- hidrodinamika moe direktno varirati promjenom frekvence uranjanja

Nedostaci:
- mali volumen (max. 250 ml)
- ogranieno iskustvo u radu
- ogranieni eksperimentalni podaci

Aparatura 4 sa protonom elijom

Koristi se za:
- slabo topive lijekove
- mikroestice
- implantate
- supozitorije
- formulacije sa kontrolisanim oslobaanjem
Varijacije:
- otvoreni sistem
-zatvoreni sistem

Prednosti:
- jednostavna promjena pH media
- mogue pH-profilisanje
- Sink uslovi

Nedostaci:
- neophodna deaeracija medija i velika koliina medija
- laboratorijski zahtjevno testiranje

Aparatura 5 sa lopaticom iznad diska

Koristi se za: transdermalne flastere. Prosjean volumen: 900 ml.

Prednosti: Standardna oprema se moe koristiti (aparatura 2 - lopatice) uz dodatak diska od
nehrajueg elika
Nedostaci: Veliina diska odreuje ograniava veliinu flastera kojeg je mogue testirati

Aparatura 6 i 7 (sa rotirajuim nosaem), vrlo vjerovatno e biti uklonjene iz USP.

17 BIOFARMACEUTSKA KARAKTERIZACIJA LIJEKOVA -PULMONARNA

APSORBCIJA LIJEKOVA
Prolaz lijekova stanine barijere I

- sluznica probavnog/pulmonarnog sistema

- krvno modana barijera
- stanice bubrenih tubula
- placenta

Jedan od glavnih momenata u kretanju lijeka u organizmu je njegov prolaz kroz stanine membrane.
Prolaz ovisi o fizikalnohemijskim svojstvima lijeka i o grai membrane.

Prolaz lijekova kroz lipidne membrane II

Pasivna difuzija ili prolaz posredovan elijskim transporterima. Glavni faktor prolaza lijeka kroz
membranu pasivnom difuzijom je liposolubilnost same molekule.
Veina lijekova slabe kiseline ili baze: njihovo stanje ionizacije varira prema pH sredini (Henderson-
Hasselbalch-ova jednaina).

Prolaz lijekova kroz lipidne membrane III

Samo neionizirani oblici: protonirani oblik slabe kiseline ili neprotonirani oblik slabe baze mogu
prolaziti kroz lipidne membrane; pH particioni koeficijent. pH particioni koeficijent: slabe kiseline
imaju sklonost kumulacije u sredini s visokim pH, za baze obrnuto.
Transport posredovan elijskim transporterima: bubreni tubul, epitel probavnog sustava; neki
lijekovi hemijski slini endogenim tvarima.

APSORBCIJA

Prelaz lijeka s mjesta primjene u krv: definicija vrijedi za sve naine primjene osim za intravenski.
Glavni naini primjene:

- oralni
- sublingvalni
- primjena preko drugih povrina epitela: koa, ronica, slunica nosne upljine
- inhalacije

Injekcije:
supkutana
intramuskularna
intravenska
intratekalna

Pulmonarna apsorbcija

Gasovi i inhalacioni lijekovi mogu biti apsorbirani kroz pulmonarni epitelium i mukoznu membranu
respiratornog trakta.

- gotovo trenutna apsorbcija

- izbjegavanje metabolizma prvog prolaza kroz jetru
- lokalna primjena

Metabolizam inhalacionih lijekova

Koliina lijeka koja dostie sistemsku cirkulaciju = pulmonarna + oralno/gastrointestinalno

biodostupna frakcija lijeka.

Aerosoli primjena lijekova putem pulmonarne apsorbcije. Aerosoli se definiu kao dozirni oblici pod
pritiskom koji sadre jednu ili vie aktivnih supstanci koje nakon primjene oslobaaju disperziju tene
ili vrste supstance u gasu-nosau.

Tri glavna tipa ureaja za proizvodnju aerosola su:

i. Metered dose inhaleri (MDI).

ii. Dry powder inhaleri (DPI).
iii. Nebulizatori.

U MDI, lijek je ili otopljen ili suspendiran u tenom CFC ili ekvivalentnom propelentu
zajedno sa ostalim ekscipijensima, u kontejneru pod pritiskom i ventilom za aplikaciju.

Definisana doza lijeka oslobaa se kao sprej osloboen kroz ventil za aplikaciju.
- U DPI sistemima lijek je inhaliran kao oblak finih estica.
- DPI formulacije ne sadre CFC ili ekvivalentni propelent
- DPI sistemi se aktiviraju disanjem