Manual ABC E Ed 3

Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

Departamento de Ciencias Biolgicas
Seccin de Ciencias de la Salud Humana
Licenciatura en Bioqumica Diagnstica
Clave: 105-39
Manual de Prcticas de Laboratorio de

Anlisis Bioqumicos Clnicos
Especiales
Clave 1635
Autores
QFB Ren Damin Santos
M en C Gloria Leticia Arellano Martnez
QFB Ma. De Lourdes Galvn Ruiz
QFB Vernica Ruiz Solorio
M en C Beatriz Luca Gonzlez Maldonado
QFB Luis Antonio Gordillo Resndiz
M en C Heidi Johanna Amezcua Hempel
Enero, 2017
Edicin 3
Manual de Prcticas de Laboratorio de Anlisis Bioqumicos Clnicos Especiales
Contenido
Alcance ii
Presentacin ii
Vinculacin de las prcticas de laboratorio con el
contenido del temario de la asignatura iii
Objetivo general de la asignatura iv
Objetivo del manual iv
Introduccin del manual v
Reglamento de laboratorio vii
Prctica 1. Elaboracin de cartas control 1
Prctica 2. Obtencin de valores de referencia 9
Prctica 3. Espermatobioscopa directa 16
Prctica 4. Evaluacin del lquido cefalorraqudeo 30
Prctica 5. Diferenciacin de exudados y 40
trasudados
Prctica 6. Examen coprolgico 47
Prctica 7. Equilibrio hidroelectroltico y cido-base 59
Prctica 8. Electrolitos del metabolismo mineral 63
Prctica 9. Determinacin de hormonas 68
Practica 10. Cuantificacin de G.C.H. 71
Anexo A 75
2
Anexo B 76
3
ALCANCE
El presente manual debe ser utilizado por los profesores asignados al laboratorio de Anlisis Bioqumicos
Clnicos Especiales, como fuente de informacin bsica, debido a que contiene las actividades a realizar
en cada una de las prcticas correspondientes a este laboratorio de enseanza experimental.
Asimismo, los alumnos inscritos en este laboratorio deben utilizar y consultar este manual, como parte de
las actividades cotidianas que se evaluarn en su desempeo dentro del laboratorio.
PRESENTACIN
El presente manual consta de las prcticas Elaboracin de cartas control, Obtencin de valores de
referencia, Espermatobioscopa directa, Evaluacin del lquido cefalorraqudeo, Diferenciacin de
exudados y trasudados, Examen coprolgico, Cuantificacin de electrolitos y Determinacin de hormonas.
Cada una de las prcticas est redactada bajo el siguiente esquema:
1. la introduccin que introduce al estudiante a los conocimientos previos de la prctica; a
continuacin, una serie de preguntas, bajo el rubro informacin complementaria, que el alumno
debe contestar despus de haber consultado bibliografa actual, para complementar el marco
terico;
2. el objetivo (u objetivos) indica los conocimientos o habilidades que el estudiante debe adquirir al
terminar la prctica;
3. los materiales divididos en biolgicos, por equipo, por grupo y reactivos, para que el alumno
conozca el material que le ser entregado para hacer la prctica;
4. la metodologa, donde se describe el fundamento, el significado clnico y la tcnica de cada
determinacin a realizar durante la prctica;
5. la disposicin de residuos, basada en la NOM-087-SEMARNAT-2002.
Para cumplir con los requisitos que indica el Sistema de Gestin de la Calidad Corporativo de la Facultad
de Estudios Superiores Cuautitln (SGC-C FESC), el manual debe contener espacios para que el alumno
escriba los resultados, la discusin, las conclusiones y las referencias que haya consultado. El grupo
acadmico de profesores ha observado que es adecuado que el documento se divida en un Manual de
prcticas, que contiene toda la informacin indicada en los cinco puntos anteriores y que la informacin
que el alumno obtenga sea registrada en un documento llamado Cuaderno de Prcticas, que complementa
al presente documento.
Los alumnos de la asignatura reciben la versin electrnica en formato PDF (protegido contra cambios) de
este Manual; se les indica que estn en libertad de manejarlo en este formato o de imprimirlo, segn lo
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prefieran. El Cuaderno de prcticas debe imprimirse en hojas de papel bond blanco, dos pginas por hoja
en negro.
VINCULACIN DE LAS PRCTICAS DE LABORATORIO CON EL CONTENIDO DEL

TEMARIO DE LA ASIGNATURA
En el siguiente cuadro se indica la vinculacin de las prcticas que se desarrollan en la enseanza
experimental con el temario correspondiente a esta asignatura.
Unidad (nmero y Prctica con la que se Contenido que permite la vinculacin

nombre) vincula
1. Control de calidad 1. Elaboracin de En la teora se abordan los conceptos bsicos del
en el laboratorio cartas control control de calidad interno (CCI) del laboratorio clnico;
clnico en la prctica se elaboran cartas control y se conocen
los principios para la preparacin de sueros control,
que son dos elementos que forman parte de la etapa
analtica del CCI.
1. Control de calidad 2. Obtencin de Como parte de la calidad que ofrece cada laboratorio,
en el laboratorio clnico valores de deben obtenerse los valores de referencia
referencia. considerando la poblacin a la que brinda servicio.
2. Estudio de lquido 3. Espermatobioscop En la unidad se aborda la anatoma y fisiologa y
seminal a directa patologas relacionadas con el aparato reproductor
masculino; en el laboratorio se realiza una
espermatobioscopa directa, estudio con el que se
inicia la evaluacin de la fertilidad del varn.
3. Estudio de lquido 4. Evaluacin del En la teora se estudia el proceso de formacin del
cefalorraqudeo lquido lquido cefalorraqudeo y se resalta la importancia de
cefalorraqudeo su evaluacin en patologas relacionadas con el
encfalo; en el laboratorio se realizan las pruebas
fsicas, qumicas y microscpicas de este lquido
corporal.
5
4. Estudio de los 5. Diferenciacin de En la teora se explica la funcin de los lquidos

lquidos serosos exudados y serosos, se conocen los principales sitios de derrame
trasudados de estos lquidos corporales; en el laboratorio se
realizan las principales pruebas que permiten
identificar el origen del derrame.
5. Estudio de la 6. Examen coprolgico En la unidad se conocen la anatoma, fisiologa y
evaluacin alteraciones relacionadas con el tracto gastrointestinal;
gastrointestinal en la prctica se realiza el estudio de las heces para
detectar indicios de alteracin (inflamatoria, de
absorcin, de digestin) del sistema digestivo.
6. Evaluacin del 7. Equilibrio Tanto en la teora como en la prctica se describe la
equilibrio hidroelectroltico y funcin de los electrolitos; en el laboratorio se realiza
hidrolectroltico cido-base la cuantificacin de iones relacionados con el
8. Electrolitos del metabolismo mineral y se explica el fundamento de la
metabolismo determinacin de los electrolitos relacionados con la
mineral polarizacin de las membranas biolgicas.
7. Las hormonas y el 9. Hormonas En la teora se abordan la funcin de las hormonas de
laboratorio 10. Cuantificacin importancia diagnstica; en el laboratorio se discuten,
de G.C.H. mediante exposiciones de parte de los alumnos, los
fundamentos de los mtodos de determinacin de las
hormonas, complementando con el estudio de casos
clnicos de perfiles hormonales, que tambin dirigen
los alumnos.
OBJETIVO DE LA ASIGNATURA
Conocer y seleccionar las pruebas especiales del laboratorio clnico en patologas especficas, a travs de
diferentes metodologas para desarrollar un criterio en la tcnica de mayor especificidad al menor costo,
ofreciendo un diagnstico ms exacto y confiable, pero con un alto control de calidad.
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OBJETIVO DEL MANUAL
Describir las pruebas y las determinaciones a realizar en cada sesin correspondiente al laboratorio de
Anlisis Bioqumicos Clnicos Especiales, as como tambin sus fundamentos y utilidad clnica, con la
finalidad de que el alumno tenga informacin precisa y accesible para desempearse satisfactoriamente
durante el desarrollo de la enseanza experimental.
7
INTRODUCCIN DEL MANUAL

La asignatura de Anlisis Bioqumicos Clnicos Especiales forma parte del plan de estudios de la carrera
de Licenciado en Bioqumica Diagnstica, impartida en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitln,
FESC, UNAM.
Se trata de una asignatura primordial en el aprendizaje de los estudiantes de esta carrera, debido a que
describe en su contenido una serie de pruebas y procedimientos realizados en los laboratorios clnicos
como pruebas especiales, es decir, aquellas que no forman parte del trabajo de rutina.
El laboratorio de enseanza experimental correspondiente a esta asignatura permite que el alumno,
adems de conocer los principios, fundamentos y utilidad clnica de las pruebas especiales de laboratorio
clnico en patologas especficas, obtenga las habilidades necesarias para llevarlas a cabo de manera
correcta, de tal manera que en su desempeo profesional pueda aplicarlas oportunamente, apoyando al
diagnstico de los pacientes.
Asimismo, se adentra al estudiante en el proceso de control de calidad en el laboratorio, para que
reconozca la importancia de realizar adecuadamente los procedimientos con la finalidad de ofrecer un
diagnstico ms exacto y confiable.
Para apoyar a las actividades del laboratorio se cuenta con el presente Manual de prcticas, que cumple
adecuadamente con los requisitos que indica el Sistema de Gestin de Calidad Corporativo de la FESC,
debido a que la enseanza experimental en los laboratorios de la FESC est en proceso de certificacin
bajo la norma ISO-9001-2008.
El presente manual consta de las siguientes prcticas:
1. Elaboracin de cartas control, donde se describe el procedimiento para realizar y analizar las cartas
control, que se utilizan en el control de calidad interno de laboratorio; asimismo se conoce el
principio para preparar un suero control, adems de los cuidados necesarios en su preparacin
cuando se trate de un suero comercial.
2. Obtencin de valores de referencia, en esta prctica se describen las caractersticas necesarias de
la poblacin y dos mtodos para la obtencin de valores de referencia.
3. Espermatobioscopa directa, en esta prctica se detalla el estudio del lquido seminal, como prueba
especfica para iniciar la evaluacin de la infertilidad masculina; tambin se da a conocer su
importancia en el seguimiento post- vasectoma.
4. Evaluacin del lquido cefalorraqudeo, donde se describen los exmenes fsico, qumico y
microscpico de esta muestra, adems de resaltar la importancia de su estudio.
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5. Diferenciacin de exudados y trasudados, que son derrames de lquido seroso, debido a causas
mecnicas o inflamatorias; la importancia de diferenciar su origen se basa en la finalidad de apoyar
a un adecuado tratamiento.
6. Examen coprolgico, se trata de un estudio de las heces con la finalidad de determinar si el
paciente presenta alteraciones en el funcionamiento gastrointestinal.
7. Cuantificacin de electrolitos, donde se estudia el fundamento de la determinacin de los
electrolitos relacionados con la polarizacin de las membranas biolgicas, sodio y potasio; adems
se realiza la determinacin de los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral, a travs de
mtodos espectrofotomtricos.
8. Determinacin de hormonas, la cual se trata de una prctica terica donde, por medio de
exposiciones que los alumnos realizan, se explican los fundamentos de los mtodos para
determinar hormonas; tambin se estudian casos clnicos de los perfiles hormonales ms
importantes.
Por lo anteriormente descrito, este manual no solamente pretende ser una fuente de informacin que sirva
de gua para la realizacin de la prctica, sino adems una herramienta de trabajo durante las sesiones
prcticas de este laboratorio.
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PRCTICA No 1.
CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CLNICO
Luis A. Gordillo R.
1.1 Introduccin
El Laboratorio Clnico es el establecimiento pblico, social y privado, legalmente establecido,

independiente o ligado a otro establecimiento para la atencin mdica de pacientes hospitalarios o
ambulatorios, que tenga como finalidad realizar anlisis fsicos, qumicos o biolgico de diversos
componentes y productos del cuerpo humano, cuyos resultados coadyuvan en el estudio, prevencin,
diagnstico, resolucin y tratamiento de los problemas de salud (NOM-007-SSA3-2011).
El laboratorio clnico debe garantizar que los resultados de estos anlisis sean adecuados para el
propsito que se aplican, para tal fin, se ejecutan procedimientos que monitorizan la calidad de los
resultados y permiten aceptar o rechazar las corridas analticas, de manera que se pueda afirmar el
resultado de un paciente es confiable (Prada, et al, 2016).
Debido a lo complejo que resulta mantener la calidad en el laboratorio clnico, los sistemas del
control de calidad se han dividido en dos: el Control de Calidad Interno (CCI) y la evaluacin externa de la
calidad (EEC). En la NOM-007-SSA3-2011 est indicado que el laboratorio clnico debe ejecutar el CCI en
todas las reas de laboratorio, adems de participar en al menos un programa de EEC. El CCI se divide en
tres etapas: preanaltica, analtica y postanaltica, en cada una de ellas existen variables que pueden
afectar el resultado del proceso que se realice (Tetrault, 2010).
En la etapa analtica se utilizan las cartas control, tambin llamadas grficas de Levey-Jennings,
que permiten identificar de manera grfica y estadstica los errores cometidos dentro de esta etapa. Se
utiliza una carta control por cada analito o tipo de anlisis que se realiza en el laboratorio (Westgard, Barry,
Hunt, 1981; Tetrault, 2010; Westgard, 2013).
Para elaborar estas cartas se utiliza un suero o material control, que puede ser comercial o
preparado en el laboratorio. Este material debe emplearse durante 30 das en las condiciones cotidianas
de trabajo, de manera que refleje adecuadamente lo que se realiza en la rutina. Los datos obtenidos se
tratan estadsticamente para elaborar la carta control en la que se graficarn los resultados del suero
control (Westgard, Barry, Hunt, 1981; Tetrault, 2010).
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Las cartas control se evalan aplicando las multirreglas Westgard, que son criterios que estn
basados en mtodos estadsticos. La violacin de estas reglas debe activar una revisin de los
procedimientos de la determinacin de la prueba, el estado actual de los reactivos y la calibracin de los
equipos, adems del rechazo de los resultados obtenidos con las muestras de los pacientes en la
determinacin de la prueba realizada. Las causas que llevaron a la aparicin del resultado debern ser
averiguadas para resolverlas y lograr nuevamente resultados confiables (Westgard, Barry, Hunt, 1981;
Westgard, 2013).
.
1.2 Actividades previas a la prctica

- Definir los siguientes conceptos: calidad, control de calidad, sistema de gestin de calidad, control
de calidad interno (CCI), programa de evaluacin externa de la calidad (PEEC).
- Indicar las diferencias que existen entre normatividad, certificacin y acreditacin.
- Identificar las variables que pueden afectar al resultado en cada una de las etapas del CCI.
- Investigar cules son los PEEC que hay en Mxico.
- Explicar, en un cuadro, las diferencias que existen entre una solucin control, una solucin blanco y
una solucin patrn.
1.3 Objetivos
- Conocer el procedimiento para preparar un suero control que se utilice en el rea de Qumica
Clnica.
- Elaborar una carta control de algn analito del rea de Qumica Clnica, utilizando un suero control
comercial o preparado, segn convenga, para poder identificar las variables que afectan al proceso
realizado a travs de su evaluacin mediante el uso de las Multirreglas Westgard.
- Evaluar la calidad entre los grupos de la asignatura, a travs de las herramientas estadsticas
utilizadas en los PEEC.
1.4 Materiales, equipos y reactivos

Material por equipo
- 1 gradilla - papel para limpiar celdas (que no deje residuos)
- 5 tubos de ensaye - torundas con alcohol (como mnimo, una por alumno)
- 1 ligadura - 1 sistema al vaco (tubo tapn rojo, aguja) por alumno
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Material por grupo

- espectrofotmetro - puntas para micropipeta
- celdas para el espectrofotmetro - agitador vrtex
- micropipeta (capacidad mnima 10 L) - bao mara a 37 C
- matraz Erlenmeyer de 50 mL
Reactivos
Podr utilizarse cualquier reactivo de Qumica Clnica que est disponible y en cantidad suficiente, se
prefieren las determinaciones de glucosa, cido rico, colesterol y triglicridos.
1.5 Procedimiento experimental

1.5.1 Obtencin de la muestra biolgica
- Preparar el suero control comercial de acuerdo a las indicaciones del manual de uso (inserto).
- Para la obtencin de la muestra de sangre y separacin del suero ver anexo A (solamente si se
requiere preparar el suero control).
1.5.2 Preparacin del suero control en el laboratorio

Principio. Los sueros control preparados por el propio laboratorio consisten en una mezcla de varios
sueros remanentes del trabajo del da, pueden necesitarse diariamente sueros de pacientes sanos (control
normal) o con resultados fuera de valores de referencia (control anormal). Los sueros se guardan y
almacenan en botellas de plstico en el congelador a <20 C. Deben despreciarse las muestras de los
sueros hemolizados, ictricos, lipmicos y contaminados as como tambin los sueros de pacientes que se
conozca o sospeche que tengan el virus de la hepatitis C (VHC) o el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH).
Tcnica
- Realizar una toma de muestra, con sistema al vaco y tubo de tapn rojo de 7 ml, a un integrante
de cada equipo del grupo.
- Obtener el suero y recolectarlo en un matraz Erlenmeyer de 50 mL y homogenizarlo suavemente
en vrtex (sin formar burbujas).
- Distribuir a cada integrante de los equipos una porcin de la mezcla (aproximadamente 500 L)
para que realicen la determinacin del analito elegido y se elabore la carta control.
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1.5.3 Elaboracin de la carta control experimental (grfico de Levey-Jennings)

Indicaciones previas. Para realizar la carta control puede utilizarse cualquier analito de Qumica Clnica;
para fines de enseanza experimental, se prefieren aquellos cuya tcnica sea colorimtrica de punto final
(glucosa, cido rico, colesterol, triglicridos) y que estn disponibles en el laboratorio en cantidad
suficiente. Los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las indicaciones del fabricante, siguiendo el manual
de uso del reactivo (inserto), donde tambin se pueden consultar los fundamentos de la determinacin y el
significado clnico del analito en cuestin. Ver las recomendaciones del Anexo B.
Tcnica
- Determinar al analito elegido, en el control preparado por el laboratorio o en el control comercial,
segn sea la muestra con la que se cuente, siguiendo las indicaciones del manual de uso de
reactivo correspondiente.
- Anotar los resultados en el pizarrn. Los profesores elegirn al menos 20 de estos datos para
realizar los clculos que se requieren para la elaboracin de la carta control. Los dems resultados
se graficarn en la carta obtenida.
- Calcular el promedio de los resultados elegidos, posteriormente la desviacin estndar y el
coeficiente de variacin de acuerdo a las siguientes frmulas:
1+2+3+4
=
CV= /
Estos datos tambin pueden obtenerse utilizando una calculadora que cuente con aplicaciones de
estadstica o en el programa de Excel de Microsoft, segn convenga. La forma de ingresar los datos y
calcularlos depender de la herramienta en cuestin.
NOTA: el CV puede expresarse en dcimas (tal cual se obtiene con la frmula indicada) o en
porcentaje, para lo cual el resultado obtenido debe multiplicarse por 100.
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1.5.3.2.4 Calcular los rangos de la carta control, con el promedio y las desviaciones estndar obtenidas, de
acuerdo a lo siguiente:
1S = ( - ) ( + )
2S = ( - 2) ( + 2)
3S = ( - 3) ( + 3)
Donde ( - ) es el lmite inferior del rango y ( + ) es el lmite superior del rango. Por ejemplo si
queremos calcular el 1S y se tiene un = 89 y una = 12
1S = (89 12) (89 + 12) = 77 101
De esta misma manera se calculan los rangos 2S y 3S.
Nota. El smbolo () no indica resta, sino el rango que se obtiene.
- Graficar los lmites obtenidos como se ilustra en la figura 1.1 (ver pgina 5). Al momento de graficar
es necesario resaltar en color verde el 1S pues este rango nos indica el lmite aceptable, el 2S se
delimita de color amarillo porque es el lmite de alerta y por ltimo el 3S de color rojo pues nos
indica que es el lmite de accin.
- Graficar en la carta control los resultados que no se utilizaron en los clculos o en su defecto, los
que sean indicados por los profesores (ver numeral 1.5.3.2.2).
Elaboracin de la carta control terica

NOTA: esta carta nicamente se elaborar si se cuenta con el suero control comercial
- Identificar en el manual de uso del suero control comercial utilizado, el rango aceptable del analito
que se determin, ste es el lmite 2S. Algunos insertos indican el promedio y la desviacin
estndar.
- Calcular el promedio, a partir del lmite 2S; ejemplo: si el lmite es 240 280, el promedio es 260,
es decir el valor medio de este lmite.
- Calcular la desviacin estndar, a partir del lmite 2S; de acuerdo con el ejemplo anterior, se
obtiene la diferencia entre el lmite superior y el inferior (280 240 = 40), este valor se divide entre
cuatro (40/4 = 10). El resultado es la desviacin estndar (10).
Carta control de ___analito___ Mes _______________ nivel del control __________
16
Da del mes
Figura 1.1 Muestra de una carta control (Tomada del archivo del autor)
- Calcular, utilizando el promedio y la desviacin estndar tericos, los lmites 1S y 3S, adems
del coeficiente de variacin. Es recomendable tambin calcular el lmite 4S.
- Elaborar la carta control terica con los lmites tericos calculados, para compararla con la carta
control experimental e identificar el efecto del coeficiente de variacin en cada una de ellas.
- Analizar las diferencias observadas entre las cartas graficadas.
Evaluacin de la carta control mediante las Multirreglas Westgard

- Evaluar las cartas control terica y experimental mediante el diagrama lgico de aplicacin de las
multirreglas Westgard (figura 1.2).
- Cuando una corrida est fuera de control, investigar el proceso y corregir el problema, en el
siguiente orden.
- Determinar el tipo de error que ocurre con base a la regla violada. Un error aleatorio es detectado
usualmente por las reglas 1-3S o R-4S, mientras que un error sistemtico es fcilmente indicado
por las reglas 2-2S, 4-1S o 10X.
- Consultar los manuales de procedimientos para identificar las variables que afectan al proceso para
el tipo de error indicado por la regla de control que ha sido violada.
- Inspeccionar el proceso de anlisis e identificar las causas del problema.
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Figura 1.2 Diagrama lgico para la aplicacin de la tcnica de control multirreglas Westgard (Adaptado de
Westgard, Barry, Hunt, 1981)
Parmetros de la evaluacin externa de la calidad

NOTA: para calcular estos parmetros, deben tomarse al menos tres datos de cada grupo de la
asignatura, eligiendo entre los graficados aquellos que se encuentren dentro del rango +/- 2S y
preferentemente que sean de equipos diferentes, de modo que a cada dato se le considere como
resultado de un laboratorio distinto. Asignar a cada dato un nmero o nombre ficticio de laboratorio,
de manera que se tenga bien identificado.
- Calcular el promedio de los valores elegido. A este promedio se le denomina valor consenso, o,
en trminos comunes valor real.
- Calcular el porcentaje de error para cada laboratorio, lo que reflejar la exactitud en su trabajo,
para lo cual debe utilizarse la siguiente frmula

% = 100

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El valor del laboratorio es cada uno de los resultados elegidos, por lo tanto esta frmula debe aplicarse
con cada uno de estos datos, uno a la vez.
- Calcular el porcentaje de puntuacin del ndice de varianza utilizando la siguiente frmula
%
= 100

Donde el porcentaje de error corresponde a un porcentaje aceptable que es caracterstica del analito que
ser evaluado, los cuales dependen del mtodo empleado en el anlisis.
- Analizar el resultado de cada laboratorio ficticio con base en lo indicado en la tabla 1.1
Tabla 1.1 Intervalos de las puntuaciones de los ndices de varianza
PIV Color Calidad

0 - 100 Verde Calidad satisfactoria
101 Amarillo Calidad regular, susceptible a
200 mejora
201 Anaranjad Calidad insatisfactoria
300 o
301 Rojo Mala calidad
400
1.6 Disposicin de residuos

- Las agujas deben depositarse en el contenedor rgido de residuos peligrosos biolgico-infecciosos
(RPBI); su empaque se desecha a la basura municipal.
- Las torundas, guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del rea
de trabajo deben desecharse en la basura municipal.
- En caso de que algn material est empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI.
- Los tubos que contengan mezclas reactivas sangre y muestra biolgica se depositarn en los
contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin.
- Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura
municipal del laboratorio. Estas debern depositarse en los botes ubicados fuera del laboratorio.
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1.7 Orientaciones para la elaboracin del reporte

En el cuaderno de prcticas debe elaborarse la carta control experimental y terica; en cada una de estas
se graficarn algunos de los resultados (al finalizar la sesin experimental el profesor responsable de la
prctica indicar los datos a graficar).
Para analizar las cartas control debe calcularse el coeficiente de variacin, para conocer el efecto de la de
la variabilidad de los datos; posteriormente, los puntos graficados deben evaluarse de acuerdo a las reglas
Westgard; en caso de que se presente violaciones, indicar si se trat de un error personal o instrumental,
aleatorio o sistemtico; adems de seguir el procedimiento para conocer las variables que ocasionaron el
error. Es importante que se plantee una posible accin correctiva y una preventiva para evitar que vuelva a
suceder la violacin.
Debe resaltarse la importancia de esta herramienta para el control de calidad interno del laboratorio clnico.
1.8 Referencias
- NOM-007-SSA3-2011, Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos.
- Prada, E., Blazquez, R., Gutirrez-Bassini, G., Morancho, J., Jou, J.M., Ramn, F., Rics, C.,
Salas, A. (2016) Control interno de la calidad vs control externo de la calidad. Laboratorio clnico,
9:54-9 doi 10.1016/j.labcli.2016.04.00 mi03
- Westgard, J, Barry, P, Hunt, M (1981) A multi-rule Shewart chart for quality control in clinical
chemistry. Clin Chem 27(3):493-501
- Westgard, J. (2013) Prcticas bsicas de control de la calidad. Westgard QC Inc, USA
20
PRCTICA No. 2
OBTENCIN DE VALORES DE REFERENCIA
Beatriz L. Gonzlez M.
Luis A. Gordillo R.
2.1 Introduccin
Los valores de referencia son una herramienta esencial para la interpretacin de los resultados de
laboratorio; la NOM-007-SSA3-2011, en su numeral 4.8, indica que deben estar impresos en los informes
de resultados, conforme a los mtodos utilizados, el gnero y el grupo de edad al que corresponden.
Actualmente, se define a los valores de referencia como el resultado analtico obtenido en un
individuo de referencia, es decir, aquel rango que se obtiene por una observacin o medicin de un tipo
particular de magnitud o de un individuo perteneciente a un grupo muestra de referencia; estos valores son
dependientes de la gentica, la raza, los estilos de vida y ambientales, y en ocasiones, hasta la edad;
adems, el mtodo analtico utilizado y el equipo tambin pueden afectar (Boyd, 2010).
Los valores de referencia son una gua de los que se podran considerar pacientes normales, pero
el hecho de encontrarse fuera de ellos no indica una enfermedad, simplemente que el valor obtenido no
est dentro del 95% de la poblacin con la que se calcularon. Debido a lo anterior, se dice que no es vlido
utilizar los valores de referencia reportados en los insertos de las casas comerciales, ya que fueron
obtenidos, la mayora de las veces, de poblaciones muy diferentes a las usuarias del laboratorio (Ozarda,
2016)).
El panel de expertos de la Federacin Internacional de Qumica Clnica (IFCC, por sus siglas en
ingls) desarroll en 1986, la llamada teora de los valores de referencia, que describe los lineamientos
para establecerlos, pero hasta la fecha el concepto no es bien comprendido, pues se manejan en forma
indistinta los conceptos valores de referencia, lmites de referencia y lmites de decisin clnica (Boyd,
2010).
Para la obtencin de estos valores es necesario buscar una poblacin lo ms homognea posible,
respecto a las variables que los afectan, y clnicamente sana, establecer los criterios de inclusin y
21
exclusin de los individuos, el procedimiento de recoleccin idneo de la muestra, el sitio de puncin ms

recomendable, las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras y el mtodo de anlisis
ptimo de acuerdo a los parmetros del control de calidad (Sikaris, 2014).
La determinacin de valores de referencia implica: obtener datos, ordenarlos, procesarlos
estadsticamente y obtener conclusiones. Cuando la distribucin es simtrica (el 95% de los pacientes es
aparentemente sana), se emplea estadstica paramtrica; si se trata de distribucin asimtrica se usa la
descriptiva, abarcando el percentil 2.5 al 97.5 (Boyd, 2010; Theodorsson, 2015).
La importancia de la obtencin de los valores de referencia no solo radica en hacer una
comparacin adecuada de los resultados del paciente con respecto a la poblacin en la que se ubica, sino
que adems se cumple con la normatividad oficial en Mxico (NOM-007-SSA3-2011) que indica que el
informe de resultados debe incluir los valores de referencia de cada analito que se determine en el
laboratorio.

- Definir los siguientes conceptos: lmites de referencia, lmites de decisin clnica, lmites de corte;
mtodos estadsticos paramtricos y no paramtricos; normalidad estadstica.
- Explicar cmo afectan las diversas variables (relacionadas con el paciente, el equipo y mtodo a utilizar)
en la obtencin de valores de referencia.
2.3 Objetivos
- Conocer el procedimiento correspondiente para realizar la obtencin de valores de referencia en una
poblacin homognea.
- Obtener los valores de referencia en una poblacin de estudiantes (grupo de Anlisis Bioqumicos
Clnicos Especiales) de algn analito de Qumica Clnica, segn convenga, mediante el mtodo 2S
y el mtodo de percentiles, para comparar los resultados obtenidos y determinar cul es el ms
adecuado de acuerdo a la poblacin estudiada.
Material por equipo

- 5 tubos de ensaye - torundas con alcohol (como mnimo una por alumno)
- 1 ligadura - 1 sistema al vaco (tubo tapn rojo de 4 ml, aguja) por alumno
22
Material por grupo

- espectrofotmetro - puntas para micropipeta
- celdas para el espectrofotmetro - agitador vrtex
- micropipeta (capacidad mnima 10 L) - bao mara a 37 C
Reactivos
Podr utilizarse cualquier reactivo de Qumica Clnica que est disponible y en cantidad suficiente, se
prefieren las determinaciones de glucosa, cido rico, colesterol y triglicridos.

2.5.1 Obtencin del material biolgico
Para la obtencin de la muestra y separacin del suero ver Anexo A.
Nota. Cada alumno procesar la muestra que obtuvo.
2.5.2 Indicaciones previas. Para calcular los valores de referencia en la poblacin estudiada y para fines
de enseanza experimental, se prefieren determinar aquellos analitos cuya tcnica sea colorimtrica de
punto final (glucosa, cido rico, colesterol, triglicridos) y que estn disponibles en el laboratorio en
cantidad suficiente. Por lo tanto, deben verificarse las condiciones de ayuno e interferencia con frmacos,
de modo que los pacientes cumplan con estas condiciones, as como identificar si es conveniente
considerar criterios de particin. Los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las indicaciones del
fabricante, siguiendo el manual de uso del reactivo (inserto), donde tambin se pueden consultar los
fundamentos de la determinacin y el significado clnico del analito en cuestin. Ver las recomendaciones
del Anexo B.
Los datos que se obtengan deben compartirse con todos los integrantes del grupo; en ocasiones es
conveniente considerar los resultados de los dems grupos con la finalidad de que la n sea ms grande.
2.5.3 Seleccin de la poblacin de referencia

- La poblacin de referencia se define como el conjunto de individuos seleccionados con la finalidad
de obtener valores de referencia, para seleccionarlos es necesario definir adecuadamente los
criterios de inclusin y exclusin con la finalidad de que se reduzca la variabilidad biolgica.
23
Asimismo es importante definir la necesidad de establecer los criterios de participacin, en caso de

que sea necesario establecer subgrupos (ver tabla 1).
Criterios de inclusin Criterios de exclusin Criterios de
particin
Ser clnicamente sanos Condiciones patolgicas o intervencin mdica Edad
Vivir en una zona geogrfica reciente Gnero
delimitada Uso de drogas o frmacos Estado fisiolgico
Pertenecer a la misma raza o etnia Factores de riesgo
Seguir las indicaciones de ayuno
- Adems de lo anterior, deben considerarse las caractersticas de la muestra; es necesario darle a

la poblacin de referencia las indicaciones previas de ayuno o dieta, restriccin de frmacos, entre
otras. Una vez obtenida la muestra debe manipularse de manera que no se hemolise. Lo anterior
con la finalidad de obtener una muestra de calidad analtica.
- Por otro lado, el procedimiento a realizar debe ser ejecutarse correctamente, de modo que cumpla
con el control de calidad previamente establecido.
2.5.4 Tratamiento de valores aberrantes
Con el fin de eliminar valores que no pertenezcan a la serie de datos obtenidos es conveniente evaluar a
los valores de los extremos, para lo cual se utiliza la prueba de Dixon-Reed.
Procedimiento
- Ordenar los resultados del analito determinado en forma ascendente.
- Evaluar el primero y el ltimo valor por la frmula de Dixon-Reed, para determinar estadsticamente
que pertenecen a la serie de datos:
D R/3,
donde D es la diferencia del valor evaluado menos el valor inmediato (considerndose el valor absoluto) y
R es la diferencia entre el ltimo y el primer valor.
- Eliminar el valor evaluado en caso de que no se cumpla la frmula de Dixon.
2.5.5 Descripcin de la muestra de referencia

La muestra de referencia es un subconjunto de la poblacin de referencia. Es importante verificar que la
distribucin de los datos obtenidos en esta poblacin sea gaussiana, pues el clculo de valores de
referencia paramtricos exige este tipo de distribucin, en caso contrario deber optarse por transformar
24
los datos para obligarlos a cumplir con la distribucin de Gauss o proceder a calcular intervalos de
referencia no paramtricos.
Procedimiento
- Una forma sencilla de identificar si la muestra de referencia tiene una distribucin gaussiana es
demostrar que el promedio, la mediana y la moda corresponden al mismo dato.
- Tambin es posible graficar los datos mediante un histograma, para lo cual se recomienda utilizar
la siguiente frmula, con la finalidad de definir el tamao del intervalo

=
1 + (3.321 )
Donde x mximo es el lmite superior de los datos, x mnimo es el lmite inferior y n es el nmero de datos.
Considerando este dato es posible graficar el histograma de frecuencias y determinar grficamente si los
datos tienen una distribucin gaussiana.
- Existen pruebas estadsticas que permiten definir la gaussianidad de los datos, la IFCC recomienda
determinar los coeficientes de sesgo y de curtosis (test de coeficientes).
Coeficiente de sesgo basado en el coeficiente de Person
donde X es el promedio, Md es la mediana y S es la desviacin estndar. El coeficiente de Pearson vara

entre -3 y 3, de modo que:
o Si As < 0 la distribucin ser simtrica negativa
o Si As = 0 la distribucin ser simtrica (gaussiana)
o Si As > 0 la distribucin ser simtrica positiva
Coeficiente de curtosis basado en la medida de Fischer
25
Donde Xi es cada uno de los valores, X es la media aritmtica, n es el nmero de datos y 4 es el

cadruplo de la desviacin estndar poblacional. Como en el caso de coeficiente de Pearson, la medida de
Fischer vara entre -3 y 3, por lo que:
o Si < 3 la distribucin es platicrtica
o Si = 3 la distribucin es normal o mesocrtica
o Si > 3 la distribucin es leptocrtica
NOTA: ambos coeficientes pueden ser calculados en Excel o SPSS.
2.5.6 Clculo de valores de referencia: mtodo 2S

El mtodo 2S est basado en estadstica paramtrica, de modo que la poblacin debe cumplir la condicin
de que tenga una distribucin gaussiana.
Procedimiento
- Una vez que se ha demostrado que los datos cumplen con una distribucin gaussiana, obtener el
promedio y la desviacin estndar.
- Calcular el rango 2S, como se obtiene para las cartas control. Este intervalo es el valor de
referencia.
- Es conveniente calcular el coeficiente de variacin, que junto con las pruebas de gaussianidad
permitirn fundamentar si el mtodo es adecuado o no para calcular los valores de referencia en la
poblacin.
2.5.7 Clculo de valores de referencia: mtodo de percentiles 2.5 y 97.5

El mtodo de percentiles 2.5 y 97.5 est basado en estadstica no paramtrica, de modo que es el mtodo
de eleccin cuando la distribucin no es gaussiana.
Procedimiento
- Calcular ((n+1) x 0.025), donde n es el nmero total de datos. Expresar el resultado sin dcimas.
- Eliminar, al principio y final de la serie, el nmero obtenido de datos.
- Los resultados de los extremos son los valores de referencia para esa poblacin.
26
NOTA: con fines de enseanza experimental, los valores de referencia deben calcular por ambos mtodos,
sin embargo deben considerarse los resultados de los test de coeficientes en el anlisis de los resultados.

- Las torundas, los guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del
rea de trabajo deben desecharse en la basura municipal.
- En caso de que algn material est empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI.
- Los tubos que contengan mezclas reactivas, sangre y muestra biolgica se depositarn en los

En el cuaderno de prcticas se realizarn los clculos pertinentes para obtener los valores de
referencia con los mtodos 2S y percentiles.
Considerar cul de los dos mtodos es el ms apropiado para obtener los valores de referencia en la
poblacin utilizada, explicando si se presentaron variables preanalticas, analticas y postanalticas que
pudieran afectar el proceso.
Comparar los valores obtenidos con algunos tericos, indicando la referencia consultada, verificando
si existe alguna diferencia significativa entre ellos, apoyndose en alguna prueba estadstica.
2.8 Referencias
- NOM-007-SSA3-2011, Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos.
- Boyd, J. (2010) Defining laboratory reference values and decision limits: populations, intervals, and
interpretations. Asian J Androl 12:83 90
27
- Ozarda, Y. (2016) Reference intervals: current status, recent developments and future
considerations. Biochemia Medica 26(1):5 -16 doi: 10.11613/BM.2016.001
- Sikaris, K. (2014) Physiology and its importance for reference intervals. Clin Biochem Rev 35(1):3
14
- Thedorsson, E. (2015) Resampling methods in Microsoft Excel for estimating reference intervals.
Biochemia Medica 25(3):311 319 doi: 10.11613/BM.2015.031
28
PRCTICA No 3.
ESPERMATOBIOSCOPA DIRECTA
Beatriz L. Gonzlez M.
3.1 Introduccin
El semen es una combinacin de espermatozoides suspendidos en las secreciones del testculo y

epiddimo, y las secreciones de la prstata, vesculas seminales y las glndulas bulbouretrales que se
mezclan con aquella en el momento de la eyaculacin. El producto final es un lquido viscoso denominado
eyaculado (WHO, 2010).
El estudio del lquido seminal, conocido como espermatobioscopa, espermiograma o
espermatograma, es el examen diagnstico ms importante y sencillo para iniciar el estudio de la fertilidad
masculina, es de bajo costo y permite realizar una primera impresin diagnstica y evaluar los logros de
los tratamientos mdicos y quirrgicos que se llevan a cabo durante el tratamiento. La espermatobioscopa
tambin tiene aplicaciones en problemas legales, como en los casos de violacin, y para verificar la
eficacia de la vasectoma (Omu, 2013; Wang, et al, 2014).
Existen dos tipos de espermatobioscopa: la directa para la cual se obtiene la muestra por
masturbacin evitando el uso de condn o lubricantes, y la indirecta, tambin llamada prueba de Sims-
Huhner, cuya muestra es el fluido que se obtiene despus de que la pareja mantuvo coito a trmino. Esta
ltima prueba permite evaluar la compatibilidad del lquido seminal con el moco cervical, debido a que
solamente se evala la capacidad del espermatozoide para moverse en la secrecin vaginal (WHO, 2010).
La espermatobioscopa directa se realiza dividindola en dos tipos de examen: macroscpico, en el
que se evalan el volumen, el pH, licuefaccin, viscosidad, olor, color y el examen microscpico, donde se
determina el nmero de espermatozoides, motilidad, morfologa y vitalidad (WHO, 2010; Omu, 2013;
Auger, et al 2015; Agarwal, et al, 2016).
Debe considerarse que las muestras fluctan en un rango que vara en funcin de diferencias
individuales, del tiempo de abstinencia y de detalles finos en la recoleccin, as como del intervalo
transcurrido entre la obtencin y el procesamiento de la muestra; por lo tanto, estos factores pueden hacer
variar los resultados. En consecuencia, nunca se deber establecer un diagnstico con la evaluacin de
una sola muestra, por lo que se recomienda analizar dos muestras de semen en un lapso no menor y no
mayor a tres meses para establecer un diagnstico certero, (WHO, 2010).
Para que una espermatobioscopia sea interpretada correctamente por el mdico es necesario
indicarle al paciente una informacin clara y completa acerca de la recoleccin y manipulacin de la
29
muestra hasta su entrega al laboratorio; tambin es fundamental que la muestra sea analizada
garantizando un procesamiento correcto, por lo cual se recomienda realizar estos exmenes en un
laboratorio de androloga (WHO, 2010; Esteves, 2016).

- Definir los siguientes conceptos: astenozoospermia, poliespermia, oligospermia, teratozoospermia,
hiperespermia, aneyaculacin, eyaculacin retrgrada, hematospermia.
- Explicar cmo se obtiene el factor para calcular el nmero de espermatozoides/mL
- Investigar los fundamentos del anlisis apoyado por computadora para la evaluacin de la
motilidad, la estimacin de la concentracin y de la morfometra del semen.
- Indicar en un cuadro comparativo las diferencias entre la cmara Makler y la de Neubauer.
- Investigar el fundamento de las tinciones de Shorr y Diff-Quick.
- Investigar en que consiste la tcnica de evaluacin de la morfologa de los organelos de los
espermatozoides mtiles (MSOME).
3.3 Objetivos
- Conocer la importancia que tienen las indicaciones que se le dan al paciente para realizar la
recoleccin y el manejo de la muestra para observar el efecto que tienen en los resultados de
espermatobioscopa.
- Conocer las pruebas que se realizan al semen mediante la realizacin de una espermatobioscopa
directa para poder apoyar a un diagnstico adecuado.

Material por equipo
-1 gradilla -1 tiras de papel pH
-1 aplicador de madera -2 tubos de ensaye 12x75
-1 hemocitmetro con pipeta de leucocitos -1 pipeta graduada
-1 microscopio
Reactivos
- Tren de tincin de Papanicolau-Reactivo de Dacie (formol 1%, citrato de sodio 3%)
- Colorante de Wright y buffer de fosfatos (en caso de que no se cuente con el tren de tincin de Papanicolau
30

Instrucciones para la recoleccin de la muestra de semen
- Abstenerse de tener relaciones sexuales y masturbacin por un periodo de entre 2 a 7 das.
- Obtener la muestra va masturbacin sin usar lubricante ni condones de ltex ya que pueden
contener espermicidas.
- Recolectar la muestra en un contenedor de plstico limpio, estril y de boca ancha. Es importante
que se recoja la totalidad del eyaculado. En caso contrario, la muestra debe marcarse recoleccin
incompleta e indicar cul fue la fraccin no recolectada.
- A la brevedad o dentro de la primera media hora de recoleccin de la muestra, llevar el recipiente al
laboratorio mantenindolo en un bolsillo que est cerca del cuerpo, para mantener la temperatura
de la muestra.
- Etiquetar el espcimen con: nombre, fecha y hora de recoleccin.
3.5.2 Aspecto y color

Significado clnico. El aspecto del lquido seminal es opalescente, el color es grisceo. La muestra de
semen debe ser examinada inmediatamente despus de su licuefaccin o dentro de los 60 minutos, por
simple observacin a temperatura ambiente. Un aumento o disminucin de la turbidez en el aspecto del
semen carecen de importancia clnica excepto cuando es causado por una leucocitosis en procesos
inflamatorios. Puede parecer menos opaca cuando la concentracin de espermatozoides es muy baja,
marrn cuando contiene eritrocitos, o amarillenta en el caso de un paciente con ictericia o que consume
algunas vitaminas.
Tcnica
- Observar la muestra despus de la licuefaccin, mezclndola suavemente.
3.5.3 Licuefaccin
Significado clnico. La licuefaccin total de la muestra a temperatura ambiente se realiza de 15-60 minutos.
El semen se eyacula lquido, pero al poco tiempo se forma un cogulo, que se rompe entre 10 y 20
minutos debido a la accin de enzimas proteolticas, como la fibrinolisina, posteriormente vuelve a
transformarse en un lquido viscoso. En algunos casos, la licuefaccin no es completa a los 60 minutos, lo
que puede provocar una inmovilizacin completa o parcial de los espermatozoides, inhibiendo su
movimiento a travs del crvix del tero. El retraso de la licuefaccin por ms de 2 horas sugiere una
inflamacin de glndulas sexuales accesorias o defectos de enzimas de los productos de secrecin de las
31
glndulas. El semen con licuefaccin normal puede contener pequeos grnulos que no lican, lo que
parece no tener significancia clnica. La presencia de cadenas de moco puede interferir con el anlisis.
Tcnica
- Mezclar cuidadosamente la muestra en el recipiente original, evitando agitarla vigorosamente.
- Observar que la muestra se lice dentro del periodo de tiempo mencionado. Es posible que se
observen grumos e hilos. No debe mezclarse continuamente pues se puede acelerar la
licuefaccin.
3.5.4 Volumen
Significado clnico. El volumen normal del eyaculado es de 1.2 a 7.6 mL; el cual se genera principalmente
por las vesculas seminales y la glndula prosttica, con una pequea cantidad de las glndulas
bulbouretrales y el epiddimo. Los aumentos de volumen se relacionan a procesos infecciosos-
inflamatorios de los rganos accesorios; la disminucin es caracterstica de obstruccin del conducto
eyaculatorio o ausencia congnita del conducto deferente. Asimismo, debe considerarse la prdida de
eyaculado durante la recoleccin, la eyaculacin parcial retrgrada o la deficiencia de andrgenos. Los
volmenes reducidos pueden ocasionar una escasa penetracin en el moco cervical por parte de los
espermatozoides.
Tcnica
- Medir el volumen del eyaculado usando una pipeta de vidrio despus de que la muestra est
totalmente licuada.
3.5.5 Viscosidad
Significado clnico. Se dice que una muestra tiene una buena viscosidad cuando la licuefaccin es
adecuada. La viscosidad (a menudo denominada consistencia) puede interferir con la determinacin de
la motilidad y la concentracin de espermatozoides y con las pruebas para la deteccin de anticuerpos
unidos a la superficie de los espermatozoides. Tambin una viscosidad elevada ha demostrado una
invasin excesiva del moco cervical en estudios realizados despus del coito.
Tcnica.
- Aspirar la muestra en una pipeta de 5 mL y permitir la libre cada de las gotas. Observar la longitud del
filamento formado. En una muestra normal se observan gotas pequeas y bien definidas.
32
- Como mtodo alternativo, la muestra puede ser evaluada introduciendo una varilla de vidrio o un
aplicador de madera. La longitud del filamento que se forma no debe exceder los 2 cm de
longitud.
3.5.6 pH
Significado clnico. El pH del lquido seminal es de 7.2 - 8.0. El pH es un reflejo del balance entre el pH de
las diferentes glndulas accesorias, principalmente de la secrecin de vesculas seminales (alcalinas) y
prosttica (cida). Debe determinarse entre 30 minutos y 1 hora despus de la eyaculacin, pues la
prdida de CO2 puede afectar el pH. Cuando el pH de una muestra es <7.0 y adems presenta
azoospermia e hipospermia, se debe sospechar de una obstruccin de las vas eyaculatorias o ausencia
bilateral congnita de los vasos deferentes. A valores de pH cido se produce mortalidad de los
espermatozoides (el pH de la vagina acta como espermaticida biolgico). Cuando existe un pH cido y un
volumen menor a 2 mL se debe sospechar de una agenesia de vesculas seminales y esta se debe
comprobar con una titulacin de fructuosa de semen. Los valores de pH en ciertas regiones geogrficas
son generalmente iguales o superiores a 8.0 comparados con valores de 7.2 a 8.0 de otras regiones.
Procesos inflamatorios e infecciones crnicas pueden estar relacionados con alteraciones en el pH.
Tcnica
- El pH debe medirse dentro de la primera hora posterior a la eyaculacin.
- Distribuir una gota de semen sobre la tira de papel pH.
- Al cabo de 30 segundos el color de la zona impregnada debe ser uniforme; comparar con la escala
de colores de la caja para determinar el pH de la muestra.
3.5.7 Agregacin y aglutinacin

NOTA: Esta prueba y la de motilidad son subjetivas, por lo que deben realizarse por duplicado por dos
analistas diferentes y comparar sus resultados. En caso de discordancia es necesaria la participacin de
un tercer analista.
Lo
Fundamento. La observacin en fresco, bajo el microscopio ptico, de una muestra de semen permite
evaluar la agregacin o aglutinacin, la presencia de clulas redondas (diferentes a los espermatozoides,
tales como clulas epiteliales, leucocitos, clulas germinales inmaduras), la evaluacin de la motilidad;
33
asimismo permitir determinar la dilucin requerida para el recuento. Es recomendable realizar la

observacin en dos preparaciones diferentes.
Significado clnico. La adherencia de espermatozoides inmviles a otros o de espermatozoides mviles a

cadenas de moco, clulas no espermticas o detritos celulares es considerada como agregacin
inespecfica y debe ser reportada. La aglutinacin especfica se refiere a espermatozoides con movilidad
limitada pegados a otros, cabeza a cabeza, cola a cola o cabeza a cola. No obstante la aglutinacin es
evidencia insuficiente para deducir causas inmunolgicas de la infertilidad, aunque sugiere determinar la
presencia de anticuerpos anti-espermatozoides. La aglutinacin severa puede afectar la evaluacin de la
motilidad y de la concentracin.
Tcnica
- Colocar una gota de semen licuado sobre un portaobjetos limpio y seco.
- Cubrir con un cubreobjetos y montar en el microscopio.
- Enfocar la preparacin a 10X y observarla a 40X por lo menos 10 campos.
- Evaluar el grado de aglutinacin con base en los grados indicados a continuacin
Grado 1, aislado: < 10 espermatozoides por aglutinado, la mayora estn libres
Grado 2, moderado: 10 a 50 espermatozoides por aglutinado, se observan espermatozoides libres
Grado 3, grande: aglutinados de ms de 50 espermatozoides, pocos permanecen libres
Grado 4, grueso: todos los espermatozoides estn aglutinados, y estos estn interconectados.
Grados
1 2 3 4
Cabeza
cabeza
Flagelo
flagelo
34
Mezclado
Cabeza -
flagelo
Figura 3.1 Grados de aglutinacin
3.5.8 Motilidad
Significado clnico. La motilidad progresiva debe ser mayor al 32% de los espermatozoides con motilidad;
la motilidad progresiva y no progresiva (anteriormente conocida como movilidad) debe ser mayor al 40%.
Si no se cumplen estos criterios la muestra seminal se califica con diagnstico de astenozoospermia. El
espermatozoide tiene una estructura flagelar que permite su desplazamiento en el lquido seminal, en la
cavidad vaginal, tero y trompas uterinas. En la evaluacin de la capacidad reproductiva o frtil del
espermatozoide, la motilidad es un criterio determinante para su normalidad. La motilidad est disminuida
por infecciones de transmisin sexual, por el varicocele testicular, el fro, muchos das de abstinencia,
afectaciones mitocondriales de origen congnito o adquirido, sustancias adictivas como el cigarrillo y el
alcohol. Es una alteracin frecuente en varones con infertilidad. Su tratamiento depende de la causa. En
caso de infecciones (especialmente por Chlamydia) se utilizan antibiticos, cuando hay aumento de la
viscosidad del semen se utilizan los mucolticos, y si hay sospechas de la deficiencia en la cadena
respiratoria mitocondrial se utilizan vitaminas, aminocidos, antioxidantes.
Tcnica
- Utilizar la preparacin en fresco indicada en el procedimiento de aglutinacin y agregacin.
- Evaluar el porcentaje aproximado de la motilidad de acuerdo a las categoras de la OMS:
Motilidad progresiva (PR, progressive motility): los espermatozoides se mueven
activamente, sea en forma lineal o en crculos
Motilidad no progresiva (NP, non-progressive motility): cualquier patrn de movimientos con
ausencia de progresin
35
Inmvil (IM, immotility): ningn tipo de movimiento
3.5.9 Vitalidad
Fundamento. El porcentaje de espermatozoides vivos se puede evaluar identificando aquellas clulas con
la membrana intacta, mediante exclusin de colorante o por choque hipoosmtico, este ltimo se basa en
el hecho de que solamente las membranas intactas se hincharn en soluciones hipotnicas. La vitalidad
debe evaluarse lo ms pronto posible, preferiblemente a los 30 minutos despus de la emisin, de manera
que se eviten cambios en la vitalidad por efecto de la disminucin de la temperatura.
Significado clnico. El porcentaje de clulas viables normalmente debe exceder el nmero de clulas
mtiles, siendo el valor de referencia mayor a 58%. La vitalidad se estima para evaluar la integridad de la
membrana celular, su evaluacin es muy importante cuando los espermatozoides presentan una motilidad
progresiva menor al 40%.
Tcnica del choque hipoosmtico

- Colocar 1 ml de solucin hipoosmtica (citrato de sodio + fructosa) a 37 C durante 5 minutos.
- Agregar 100 l de la muestra de semen a la solucin y mezclar por pipeteo suave.
- Incubar a 37 C durante 30 minutos. Entonces transferir una alcuota a un portaobjetos y cubrirla
con un cubreobjetos.
- Contar 200 espermatozoides, indicando el nmero de clulas hinchadas (vivas) y el nmero de
clulas no hinchadas (muertas). Las clulas hinchadas se identifican por cambios en la forma de
las clulas (ver figura 3.2).
- Calcular el porcentaje de clulas vivas.
36
Figura 3.2 Representacin esquemtica de cambios morfolgicos en espermatozoides sujetos a estrs hipo-
osmtico. (a) representa a un espermatozoide muerto, (b-g) indica cualquier tipo de hinchazn que puedan
observarse en los espermatozoides.
Tcnica de la exclusin del colorante eosina-nigrosina

- Colocar en un portaobjetos 15 l de colorante eosina-nigrosina.
- Agregar al colorante 15 l de la muestra de semen y mezclar por pipeteo suave.
- Esperar 30 segundos e inmediatamente extender con ayuda de un portaobjetos.
- Realizar un conteo de 200 espermatozoides, sealando el nmero de clulas teidas (muertas) y
de clulas no teidas (vivas) (ver figura 3.3).
- Calcular el porcentaje de clulas vivas.
37
Figura 3.3 Tincin de nigrosina-eosina. Los espermatozoides vivos no estn teidos, los
espermatozoides muertos se ven de color rojo
3.5.10 Recuento de espermatozoides: mtodo de la cmara de Neubauer

Fundamento. El lquido de Dacie est compuesto por formol al 1%, que es un espermicida y citrato de
sodio al 3%, que funciona como anticoagulante, este lquido se utiliza para mantener inmviles a los
espermatozoides y evitar la coagulacin de la muestra dentro de la cmara de Neubauer, lo que facilita su
conteo.
Significado clnico. El valor de referencia es > 15 millones/mL o > 39 millones como nmero total de
espermatozoides en la muestra. Cuando la cantidad de espermatozoides es inferior a estos valores se
denomina oligozoospermia; cuando no hay ningn espermatozoide se denomina azoospermia. En estos
casos, el problema puede ser secretor, es decir, no hay o hay pocos espermatozoides por dao en el
testculo causado por inflamaciones, infecciones, varicocele y otras causas, o excretor, es decir, se
producen espermatozoides pero existe una obstruccin de la va de transporte de espermatozoides desde
los testculos a la uretra prosttica.
Las oligozoospermias o azoospermias pueden ser de origen congnito o adquirido. Es importante
determinar en suero el valor de FSH, la cual est relacionada con el nmero de espermatogonias. Cuando
FSH est alta, el dao de la espermatognesis es importante y su pronstico es reservado; cuando FSH
es baja es posible estimular la espermatognesis y se espera un resultado favorable. Si FSH est en
valores normales y hay azoospermia, hay que sospechar de un proceso obstructivo.
38
Tcnica
NOTA: En la evaluacin de la muestra en fresco debe observarse la densidad espermtica; en caso de
que se observe una gran cantidad de espermatozoides por campo, es recomendable aumentar la
dilucin recomendada en esta tcnica o contar una quinta parte de la cuadrcula central.
- Despus de la licuefaccin del semen, se realiza una dilucin 1:20 con lquido de Dacie, sea con
ayuda de micropipetas o con la pipeta de Thoma para leucocitos.
- Homogenizar la dilucin y proceder al llenado de la cmara de Neubauer.
- Se cuentan 2 cuadros primarios opuestos (aquellos que se utilizan para el conteo de leucocitos, ver
en la figura 3.4 los cuadros marcados con la letra L). El conteo se hace por duplicado y se obtiene
el promedio de los conteos.
- Reportar el nmero de espermatozoides/mL y el nmero total de espermatozoides en el eyaculado
de acuedo a las siguientes frmulas:
Nmero (no) de espermatozoides (esp)/mL = no de esp X 100000
no total de esp en el eyaculado = no de esp/mL X volumen total de la muestra
Figura 3.4 Posicin de los cuadros primarios para el conteo de

espermatozoides en la cmara de Neubauer (Adaptado de
OMS, 2001)
3.5.11 Morfologa
La morfologa de los espermatozoides puede observarse en una extensin (frotis) sobre un portaobjetos si
se tien con alguna tcnica apropiada. En los laboratorios de androloga se utiliza la tincin de
Papanicolau para realizar esta observacin, adems de que es la tcnica que la OMS recomienda. Existen
39
otros mtodos de tincin, tales como la tincin de Shorr, la de Diff-Quick y otros derivados de la tincin de
Romanowsky, sin embargo pueden presentar una tincin de fondo y no tener la misma calidad que la
tincin de Papanicolau.
3.5.11.1 Fundamentos
Fundamento de la tincin de Papanicolau. La tincin de Papanicolau es un mtodo de tincin policrmico;
est compuesto por hematoxilina de Harris (que tiene afinidad por la cromatina, tiendo el ncleo), EA-50
(colorante integrado por eosina Y, caf Bismarck, verde luz; tie el citoplasma de clulas metablicamente
activas y al flagelo) y el naranja G (OG-6, el 6 indica la concentracin de cido fosfotngstico utilizado para
acidificar durante su disolucin; tiene afinidad por la queratina, penetra rpidamente al citoplasma). Los
pasos de tincin estn entremezclados con soluciones que hidratan, deshidratan y enjuagan las clulas
con la finalidad de asegurar la tincin; finalizando con un paso de aclaramiento con xilol que produce
transparencia celular. El paso final de montaje permite proteger la muestra contra el secado y la oxidacin
(puede omitirse si la muestra no se guardar para observaciones posteriores).
Significado clnico. El porcentaje de formas normales va de 3 a 48%. Las infecciones de transmisin

sexual, el estrs, las altas temperaturas, el varicocele, los txicos ambientales, las drogas de adiccin
(marihuana, cidos, cocana etc.), el alcohol, el cigarrillo, antibiticos, agropesticidas, radiaciones han sido
asociadas con la teratozoospermia. Tambin existen factores genticos, como los casos de la agenesia
del acrosoma y la ausencia de brazos de dinena en el flagelo (sndrome del cilio inmvil), donde hay
inmovilidad de los espermatozoides.
Tcnica de la tincin de Papanicolau

- Colocar hacia la orilla un portaobjetos limpio y seco una gota pequea de la muestra del lquido
seminal.
- Extender la gota hacia el centro del portaobjetos con un aplicador de madera y secar al aire libre.
- Fijar el frotis sumergindolo durante cinco minutos en etanol al 95%.
- Las extensiones fijadas se deben teir de acuerdo al siguiente procedimiento, en cada paso se
retira el excedente de solucin
Etanol al 80% 30 segundos
40

Agua destilada 30 segundos
Hematoxilina de 4 minutos exactos
Harris
Agua destilada 30 segundos
Etanol acidulado 6 inmersiones
Agua corriente fra 5 minutos
Etanol al 95% Al menos 15
minutos
Naranja G6 1 minuto
EA-50 1 minutos
Etanol al 99.5% 15 segundos
Etanol al 99.5% 15 segundos
NOTA: en caso de que se desee conservar la tincin, es necesario colocarla en una solucin de
xilol:etanol 95% durante un minuto y posteriormente en xilol 100% un minuto. Posteriormente montar en
resina sinttica, cubriendo la preparacin con un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo de inmersin.
- Realizar dos conteos de 200 espermatozoides, clasificndolos en espermatozoides normales,
anormales de cabeza, anormales de pieza intermedia y anormalidad de flagelo; es importante
considerar que un mismo espermatozoide puede tener una, dos o tres anormalidades. Los
resultados se reportan en porcentaje. La figura 3.5 muestra algunas formas anormales de
espermatozoides humanos.
41
Figura 3.5 Formas anormales del espermatozoide; a, normal, b, cabeza puntiaguda, c, remanente
citoplasmtico, d, cabeza de alfiler, e, macroceflico, f, microceflico, g, cabeza estrellada, h, biceflico, j,
doble flagelo, k, defecto de pieza intermedia (Tomado de Cannon y Henry, 1991).
Con la tincin de Papanicolau, la cabeza aparece teida de azul claro en la regin acrosomal y azul oscuro
en la zona postacrosomal. La pieza media puede mostrarse rojiza, mientras que el flagelo puede ser azul o
rojizo. Las gotas citoplasmticas, usualmente ubicadas detrs de la cabeza en la pieza media, se tien de
verde.
3.5.12 ndices de defectos mltiples

Fundamento de la determinacin. Morfolgicamente, los espermatozoides anormales pueden tener
mltiples defectos (de cabeza, de pieza intermedia, del flagelo o una combinacin de estos). Una detallada
observacin de la incidencia del porcentaje de anormalidades morfolgicas puede ser de gran utilidad en
la evaluacin del grado de dao de la espermatognesis. Los ndices de defectos mltiples son: ndice de
anomalas mltiples (MAI), ndice de teratozoospermia (TZI) e ndice de deformidad del esperma (SDI) se
derivan de los porcentajes de las anormalidades de cabeza, pieza intermedia y flagelo.
Significado clnico. Estos ndices han sido correlacionados con fertilidad in vivo (MAI y TZI) e in vitro (SDI)
y pueden ser de utilidad en la evaluacin de ciertas condiciones patolgicas. Algunos informes sugieren
que un TZI mayor a 1.6 est asociado con menores tasas de embarazo en parejas infrtiles sin tratamiento
y que un SDI de 1.6 predice el fracaso de la fertilizacin in vitro.
Tcnica.
- Cada anormalidad del espermatozoide se registra, incluyendo la presencia de citoplasma residual.
Para calcularlos considere que
A = nmero de espermatozoides con anormalidades de cabeza
42
B = nmero de espermatozoides con anormalidades de pieza intermedia

C = nmero de espermatozoides con anormalidades de flagelo
D = nmero de espermatozoides con residuos citoplasmticos
E = nmero total de espermatozoides contados (siempre ser 200, pues son los
espermatozoides que se cuentan en cada recuento)
F = nmero de espermatozoides con defectos (este nmero ser igual a la resta de formas
normales respecto a 200)
- MAI es el promedio de anomalas por espermatozoide anormal. Se incluyen todas las anomalas
observadas.
MAI = (A+B+C) / F
- TZI es parecido a MAI, pero un mximo de cuatro defectos por espermatozoides anormal son
considerados.
TZI = (A+B+C+D) / F
- SDI es el nmero de defectos dividido por el nmero total de espermatozoides (normales mas
anormales)
SDI = (A+B+C+D) / E

- El material utilizado que contenga muestra biolgica (pipeta de leucocitos, portaobjetos y
cubreobjetos) se depositar en los contenedores con cloro dispuestos para cada fin.
- El sobrante de la muestra biolgica contenida en el recipiente recoleccin, se depositar en la taza
del bao y se accionar la palanca; el recipiente se puede tirar en el bote de la basura del bao.
- Los guantes, torundas, papel y dems material desechable contaminados con muestra se
depositarn en el bote de la basura municipal.
municipal del laboratorio. Estas debern depositarse fuera del laboratorio.
43

En el cuaderno de prcticas se indicarn los clculos pertinentes y los resultados de cada determinacin
realizada; la discusin debe centrarse en la importancia que tiene la realizacin de la espematobioscopa
en el diagnstico de infertilidad, en la donacin de esperma en bancos especializados y como seguimiento
a la realizacin de una vasectoma. Adems de considerar la importancia de cada una de las fases del
control de calidad interno en la emisin de resultados confiables.
Los resultados obtenidos deben analizarse integralmente; en caso de que orienten a problemas de
fertilidad dar recomendaciones tales como la pertinencia de una nueva evaluacin, el uso de otras pruebas
para corroborar los resultados, entre otras.
Para las conclusiones haga referencia si los objetivos planteados fueron alcanzados o no, as como sus
consideraciones sobre el aprendizaje adquirido en su formacin profesional.
3.8 Referencias
- Agarwal, A., Gupta, S., Du Plessis, S., Sharma, R., Esteves, S., Cirenza, C., Eliwa, J., Al-Najjar, W.,
Kumaresan, D., Haroun, N., Philby, S., Sabanegh, E. (2016) Abstinence time and its impacto n
basic and advanced semen parameters. Urology 94: 102 110
- Auger, J., Jouannet, P., Eustache, F. (2015) Another look at human sperm morphology. Hum
Reprod 31(1):10 - 23 doi: 10.1093/humrep/dev251
- Esteves, S. (2016) Novel concepts in male factor infertility: clinical and laboratory perspectives J.
Assist Reprod Genet 33:1319 1335 doi: 10.1007/s10815-016-0763-8
- Omu, A. (2013) Sperm parameters: paradigmatic index of good health and longevity. Med Princ
Pract 22(suppl 1): 30 42 doi: 10.1159/000354208
- WHO (2010) WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed.
WHO Press. Switzerland.
- Wang, Y., Yang, J., Jia, Y., Xiong, C., Meng, T., Guan, H., Xia, W., Ding, M., Yuchi, M. (2014)
Variability in the morphologic assessment of human sperm: use of the strict criteria recommended
by the World Health Organization in 2010. Fertility and Sterility 101 (4) doi j.fertnstert.2013.12.047
44
PRCTICA No 4.
EVALUACIN DEL LQUIDO CEFALORRAQUDEO
Heidi J. Amezcua Hempel

4.1 Introduccin
El lquido cefalorraqudeo (LCR) se forma principalmente en los plexos coroideos ventriculares
mediante una combinacin de transporte activo y ultrafiltracin del plasma. Una vez formado circula en
sentido ascendente sobre los hemisferios cerebrales, as como en sentido descendente por encima de la
columna vertebral y las races nerviosas (Tortora, Derrickson, 2007).
Una caracterstica importante de este lquido es el incremento de sodio, cloruro, magnesio y
glutamina en comparacin con el plasma, as mismo se encuentran en menor proporcin la glucosa,
potasio, calcio, colesterol, cido rico, hierro, tiroxina y zinc (Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, 2003).
El volumen de LCR en un adulto sano es 90 a 150 ml y de 10 a 60 ml en neonatos, este se forma a
un ritmo aproximado de 500 ml al da, lo que equivale de cinco a seis veces el volumen total del lquido de
todo este sistema (Cabrera, 2003).
Las funciones vitales del LCR son:
Amortiguar el encfalo dentro de la bveda craneal. Por lo tanto, un golpe en la cabeza
moviliza en forma simultnea todo el encfalo, lo que hace que ninguna porcin de ste sea
contorsionada momentneamente por el golpe.
Sirve de transporte para los nutrientes que llegan al cerebro y eliminar los desechos.
Fluir entre el crneo y la mdula espinal para compensar los cambios en el volumen de
sangre intracraneal (la cantidad de sangre dentro del cerebro), manteniendo una presin
constante (Tortora, Derrickson, 2007).
La muestra biolgica puede obtenerse por medio de punciones realizadas en tres sitios diferentes:
lumbar, cisternal o ventricular (Smith, Kjeldsverg, 2010). Cabe aclarar que su composicin vara
dependiendo el sitio de puncin, en la zona ventricular hay una mayor cantidad de protenas respecto a la
45
zona lumbar (Cabrera, 2003). La puncin lumbar es la primera eleccin en adultos, debe ser realizada por
personal capacitado debido a los riesgos que corre el paciente, los pasos para realizar esta puncin son:
Se coloca al paciente acostado lateralmente con la cabeza y las rodillas flexionadas hacia el
abdomen, con lo que se obtiene una mayor separacin de las apfisis espinosas vertebrales
(son prominencias seas o proyecciones que surgen de la parte posterior de las lminas de
las vrtebras).
Se traza una lnea entre ambas crestas ilacas que pasa, generalmente, entre la tercera y
cuarta apfisis Se elige el espacio ms favorable palpando las apfisis espinosas ya sea por
encima o por debajo de la lnea trazada. Algunos autores refieren que la puncin se puede
llevar a cabo entre la 2 y 3 vrtebra lumbar sin que existan complicaciones, aunque se
prefiere entre la 3 y 4 debido a que esta zona tiene una mayor zona de trabajo. Se
desinfecta la piel de la regin lumbosacra con una solucin antisptica (yodo o alcohol).
Inyectar 1-2 ml anestsico local (lidocana 2 %) en el espacio seleccionado.
La aguja se introduce entre ambas apfisis espinosas atravesando el ligamento
nterespinoso perpendicularmente a la piel de la lnea media. El bisel del trocar se debe
disponer en el sentido de las fibras musculares. En ese momento se desva la aguja hacia la
cabeza y se introduce hasta 5- 6 cm alcanzndose el espacio subaracnoideo. Se nota una
ligera resistencia cuando se perforan los ligamentos y el saco dural. Se retira el mandril
fluyendo espontneamente la muestra. Cuando el ligamento nterespinoso est fibrosado o
es muy resistente es necesario practicar la puncin a 1 cm de la lnea media moviendo a la
aguja en sentido ceflico y hacia la lnea media.
La puncin lumbar se indica ante la sospecha de meningitis, aunque tambin puede aportar
informacin relevante en enfermedades malignas, hemorragias cerebrales, convulsiones, enfermedades
metablicas (Smith, Kjeldsverg, 2010). Este tipo de puncin est contraindicada en aquellos pacientes que
presentan sntomas o signos de incremento de la presin intracraneal. En estos casos, existe el riesgo de
herniacin cerebral, al realizar la extraccin. Tambin est contraindicada en los nios con inestabilidad
hemodinmica, coagulopata o que presenten infeccin de los tejidos del lugar donde se va a realizar la
extraccin (Cabrera, 2003).
El estudio del LCR se divide en el examen fsico, evalundose aspecto, color densidad y pH, el
examen microscpico, donde se determina el nmero de leucocitos y su cuenta diferencial y el examen
qumico, realizndose la determinacin de glucosa, cloro y protenas de forma cuantitativa y cualitativa
(Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, 2003).
46

- Cundo se utilizan las diferentes zonas de puncin para la obtencin de LCR?
- En una tabla indique la composicin bioqumica del LCR, comparndola con la del plasma.
- Cmo se distingue una puncin traumtica de un derrame cerebral cuando el aspecto de la muestra
es sanguinolento?
- Qu es la xantocroma? En qu casos se presenta?
- Porque es importante el cuidado de la presin durante la obtencin del LCR?
- Explicar la utilidad de los ndices los ndices de IgG, de albmina y de Tourtelotte.
- Investigar cmo se utiliza la tcnica multiplex PCR el estudio del LCR.
4.3 Objetivos
- Conocer los mtodos de obtencin del LCR y los cuidados al paciente antes, durante y despus de
la obtencin del mismo.
- Analizar una muestra de LCR, a travs de las diferentes pruebas que se realizan para su estudio
(fsicas, qumicas, conteo celular y diferencial), y establecer una posible alteracin en su
composicin que apoye al diagnstico mdico.

Material por equipo
- 15 Tubos de ensaye 12x75 mm - 2 Portaobjetos
- 1Propipeta - 1 Aplicador de madera
- 1 Gradilla - 1 Cuadro de papel seda
- 1 Microscopio - 1 Hemocitmetro
- 1 pipeta graduada de 1 ml (1/100)
Material por grupo

- 3 Gradilla - 1 Pipetas graduadas de 1 ml (1/100)
- 1 Centrfuga con balanza - 3 Pipetas graduadas de 5 ml
- 1 Agitador vortex - 1 Pipetas graduadas de 2 ml (1/100)
- 1 Bao de incubacin a 37 C - 2 Vaso de precipitado de 500 ml
- 2 Espectrofotmetro con gradilla - 1 Micropipeta (5 50 ul)
- 10 celdas para espectrofotmetro - 1 Micropipeta (40 200 ul)
- 2 piseta con agua destilada - 1 Micropipeta (200 100 ul)
47
- 1 bolsa roja para RPBI - Refractmetro
Reactivos
- Reactivo para la determinacin Glucosa - Reactivo de Pandy
- Reactivo para la determinacin Protenas rojo de pirogalol - Reactivo para la - Reactivo de None-Apelt
determinacin cloruros - Colorante de Wright
- Hipoclorito de sodio - Buffer de fosfatos

4.5.1. Obtencin de la muestra biolgica
La muestra de LCR ser proporcionada por los profesores del laboratorio.
NOTA. La evaluacin de los resultados de las pruebas del examen fsico (aspecto, color, densidad y pH)
puede ser subjetiva, por lo que se requerir de atencin de parte de los integrantes del equipo. En caso de
alguna duda se podr solicitar apoyo a los profesores.

Significado clnico.
El LCR es transparente e incoloro en condiciones normales.
Su estudio es importante y es til en el estudio de enfermedades desmielinizantes tanto del sistema
nervioso central (SNC) como perifrico. Si tiene apariencia turbia o lechosa, indica un aumento de la
concentracin de lpidos y protenas o infeccin bacteriana. Una apariencia brumosa nos indica la
presencia de leucocitos. Un aspecto sanguinolento nos habla de una posible hemorragia. Cabe mencionar
que la hemorragia subaracnoidea, no siempre da un color rojo; se confirma por medio de una
centrifugacin, que mostrar un sobrenadante amarillento y en el sedimento se hallarn glbulos rojos. La
apariencia coagulada nos indica la elevacin de protenas o factores de coagulacin. La presencia de una
pelcula en la superficie es un indicio de meningitis bacteriana. La presencia de color en la muestra se
denomina xantocroma. Un color rojizo puede ser causado por la propia puncin y no debe confundirse con
la hemorragia, generalmente va disminuyendo conforme sale el lquido y la centrifugacin lo elimina por
completo al decantarse los eritrocitos. Un color amarillo procede de la hemoglobina de procesos
hemorrgicos. Aparece excepcionalmente en las ictericias (bilirrubinorraquia).y en el sndrome de Froin, se
observa ms tpicamente por el bloqueo espinal (compresin medular tumoral), por otro lado, un color rosa
indica una cantidad de oxihemoglobina y un color anaranjado es indicativo de hemlisis intensa.
48
Tcnica
- Homogenizar la muestra por inversin suave.
- Observar la muestra para determinar su aspecto y color
4.5.3 Densidad
Significado clnico.
La densidad del LCR oscila entre 1.005 y 1.009, debido a que su componente principal es el agua.
La densidad se ve alterada por la presencia de sangre (debido a una puncin incorrecta o hemorragia),
elevacin de protenas, lpidos, o por alguna infeccin microbiana.
Tcnica
- Calibrar el refractmetro a 1.000 agregando una gota de agua a la cmara y moviendo la perilla que se
encuentra en la parte superior, (si se tienen problemas para visualizar la escala puede calibrarse con el
ocular).
- Limpiar con papel absorbente y agregar gotas de la muestra homogenizada a la cmara y observar por el
ocular.
- Leer la densidad en la escala respectiva, de acuerdo a la lnea de separacin entre el campo claro y el
oscuro.
4.5.4 pH
Significado clnico.
49
El pH del LCR es de 7.3 a 7.4, es ligeramente ms alcalino cuando permanece en reposo, como resultado
del desprendimiento de dixido de carbono.
Tcnica
- Introducir una tira de papel pH a la muestra homogenizada.
- Al cabo de 30 segundos comparar con la escala de colores de la caja para determinar el pH de la
muestra.
4.5.5 Conteo celular de leucocitos

Significado clnico.
En adultos el nmero debe ser inferior a 5/mm3 con predominio linfocitario (linfocitos: 93-97%;
polimorfonucleares: 1-3%; monocitos 0.5-1%).
El significado de un recuento entre 5 y 10 clulas es dudoso, pero por encima de 10 clulas es
inequvocamente patolgico. En nios la cifra de leucocito aumenta hasta 20-30/mm3, sobre todo en los
menores de un ao.
Tcnica
- Homogenizar la muestra por inversin suave.
- 4.5.5.2.2 Llenar la cmara de Neubauer con una pipeta de Thoma o tubo capilar y permitir reposar
durante 2 minutos.
- 4.5.5.2.3 Montar en el microscopio, enfocar con el objetivo de 10X y contar los cuadrantes de
leucocitos en 40X.
- 4.5.5.2.4 En caso de que se dificulte el conteo por el nmero de clulas, hacer una dilucin con la
pipeta de Thoma y lquido de Turck. El factor por el que se multiplica el nmero de clulas se calcula
considerando la dilucin, el volumen de la cmara y los cuadrantes contados.
4.5.6 Cuenta diferencial de leucocitos

Fundamento.
Se utiliza la tincin de Wright, su fundamento est descrito en el numeral 3.5.9. de la prctica no. 3.
Significado clnico.
50
En condiciones normales encontramos en el LCR menos de 5 linfocitos/l, cuando existe una meningitis
purulenta los valores de neutrfilos van de 10-10.000/l, en el caso de meningitis viral y tuberculosa los
valores son mayores a 100/l, con un predominio mononuclear.
Tcnica
- Centrifugar el LCR a 2000 rpm por 5 min, recolectar el sobrenadante en otro tubo y guardarlo para
realizar las pruebas qumicas.
- Colocar una gota del sedimento en un portaobjetos y secar a temperatura ambiente.
- Realizar la tincin de Wright.
- Montar la preparacin en el microscopio, enfocarla a 10X y observarla a 100X.
- Contar 100 leucocitos diferenciando cada poblacin presente.
4.5.7 Determinacin de glucosa por el mtodo de glucosa oxidasa-POD (enzimtico colorimtrico)

Fundamento.
La glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando cido glucnico y H2O2, este reacciona con un
cromgeno (4-aminoantipirina) por la reaccin de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y
550 nm. La intensidad de color producida es directamente proporcional a la concentracin de glucosa.
Significado clnico.
Los valores normales corresponden a 2/3 partes del valor de glucosa en el paciente por lo que se
recomienda que se determine la glucemia dos horas antes de realizar la extraccin del LCR. Al realizar
este examen se debe tomar en cuenta si el paciente cursa una hiperglucemia, de ser as pueden
registrarse valores mayores a 60 mg/dL y el valor mximo que se puede observar es de 300 mg/dL por
esta causa. Se puede observar un aumento de glucosa en encefalitis epidmica (aumento discreto),
poliomielitis, meningitis serosas y urmicas e hipertensin endocraneana. Se observa una disminucin de
glucosa en estados de hipoglucemia, meningitis purulentas (acompaando la pleocitosis y la turbidez),
meningitis tuberculosa (el descenso es lento), en casos graves de sfilis meningovascular, carcinomatosis
menngea, sndrome de Reye (hepatoencefalopata aguda metavrica), cisticercosis con
meningoencefalitis, meningitis reumatoide, granulomatosa por sarcoidosis y hemorragia aracnoidea.
51
Tcnica
- Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda es
505 nm.
4.5.8 Determinacin cualitativa de protenas por los mtodos de Nonne-Apelt y Ross Jones
Fundamento.
La prueba de Nonne Apelt es especfica de las globulinas, puesto que precipitan por el sulfato de amonio a
media saturacin; no sucede lo mismo con la de Ross Jones pues en el punto de contacto la
concentracin del sulfato de amonio es del 85 %, o sea una solucin saturada, que precipita no slo las
globulinas sino tambin la albmina.
Significado clnico.
La presencia de un color claro indica cantidad normal de globulinas. La presencia de precipitado turbio es
indicativo del exceso de globulinas. La formacin de un anillo turbio entre los 2 lquidos se observa en
casos patolgicos.
Tcnica para la realizacin de la prueba de Nonne Apelt.

- Colocar en un tubo de ensaye 0.5 ml de la solucin de sulfato de amonio saturado y 0.5 ml de LCR,
agitar suavemente.
- Reposar 3 min y leer los resultados de acuerdo a lo siguiente:
La mezcla no cambia de aspecto, reaccin negativa (-).
Opalinidad, reaccin positiva (+).
Enturbiamiento, reaccin positiva (++).
Enturbiamiento fuerte, reaccin positiva (+++).
Enturbiamiento lechoso, reaccin positiva (++++).
Tcnica para la realizacin de la prueba de Ross Jones.

- Colocar en un tubo de ensaye 1.0 ml de solucin saturada de sulfato de amonio y 0.5 ml de LCR
ste ltimo deslizndolo por las paredes del tubo, evitando romper la interfase que se forma.
52
- Observa sobre fondo oscuro el anillo blanquecino que aparece en el punto de contacto. Si l anillo
no aparece a los 2 minutos la reaccin se considera negativa.
- Reportar la intensidad del anillo con cruces (+ a ++++)
4.5.9 Determinacin cualitativa de protenas por el mtodo de Pandy

Fundamento.
La albmina y las globulinas precipitan en una solucin de fenol.
Significado clnico.
Se considera normal si no se observa turbidez alguna. Al igual que las otras pruebas permite reconocer
una inflamacin crnica o incipiente. La presencia de una ligera turbidez indica una presencia anormal de
globulina. La reaccin es un ndice de la fraccin globulnica del LCR. Sin embargo Pandy dice que es una
prueba para albmina y globulinas. En la inmensa mayora de los casos un Pandy negativo corresponde a
albuminorraquias normales.
Tcnica
- Agregar una gota de LCR a 0.5 ml de la solucin saturada de fenol, agitar y leer despus de haber
pasado 3 minutos.
- Observar sobre fondo oscuro para apreciar la opalescencia o la turbidez producidas. Es
aconsejado por algunos autores, la comparacin con un LCR normal, lo que facilita la apreciacin
de las pequeas opalescencias.
- La forma de reportar los resultado es igual que en las pruebas anteriores.
4.5.10 Determinacin cuantitativa de protenas por el mtodo de rojo de pirogalol (colorimtrico)

Fundamento.
Las protenas presentes en la muestra reaccionan en medio cido con el rojo de pirogalol y el molibdato,
formando un complejo colorido. La absorbancia a 600 nm debido a la formacin del complejo colorido es
directamente proporcional a la concentracin de protena en la reaccin.
Complejo protena -
Complejo Rojo
+ de pirogalol Rojo de pirogalol-
Protena
molibdeno molibdeno
Significado clnico.
53
Se consideran normales resultados de 15-40 mg/dl por puncin lumbar, para el caso de puncin cisternal
es de 10-25 mg/dl, y ventricularmente es de 5-15 mg/dl. Debe considerarse que la presencia de sangre en
LCR da lugar a un incremento la concentracin. Las protenas pueden observarse elevadas cuando existe
variacin en la permeabilidad de la barrera hematoenceflica: en procesos inflamatorios y degenerativos
del neuroeje y meninges, daos vasculares del sistema nervioso, meningitis supuradas, hemorragia
cerebral, procesos obstructivos del espacio subaracnoideo y sndrome de Guillain-Barr.
Tcnica
- Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda
en que se lee es 600 nm.
4.5.11 Determinacin de cloro por el mtodo de tiocianato de mercurio (colorimtrico)

Fundamento.
Los iones cloruro de la muestra reaccionan con tiocianato de mercurio desplazando el ion tiocianato. El
tiocianato libre en presencia de iones frricos forma un complejo colorido medible
espectrofotomtricamente. La intensidad del color, leda entre 440 y 500 nm, es proporcional a la
concentracin de iones cloruro presente en la muestra ensayada.
2 Cl- + Hg (SCN)2 HgCl2 + 2 SCN-
SCN- + Fe3+ FeSCN2+
Significado clnico.
La cifra normal es de 700 a 750 mg/dl. (120-130 mEq/L) expresados en NaCl.
Se observa un aumento en los procesos en que existe una retencin de cloruros en sangre, en las nefritis
con insuficiencia renal, deshidrataciones puras sin prdida de electrolitos. Se observa una disminucin en
hipocloremias (ocasionado en la neumona por neumococos), meningitis tuberculosas y purulentas y en la
enfermedad de Heine-Medin y sfilis nerviosa.
Tcnica.
es 540 nm.
54
- Los tubos con muestra biolgica y los portaobjetos se depositarn en los contenedores con cloro
dispuestos para este fin.
- Los guantes, papel y dems materiales desechables empapados con la muestra se depositarn en
la bolsa roja de residuos peligrosos biolgicos infecciosos.

En el cuaderno de prcticas realizar los clculos necesarios para obtener los resultados de cada prueba
realizada y compararlos con los valores de referencia correspondiente.
Dado que la muestra es proporcionada por los profesores, debe considerarse si la toma de muestra puede
afectar a las determinaciones realizadas explicando cmo sucedera.
Integrar los resultados para verificar si orientan hacia algn diagnstico; indicar si existen otras pruebas
que puedan complementarlos.
Realizar las recomendaciones necesarias al paciente y al mdico, de acuerdo al probable diagnstico.
Resaltar la importancia del estudio de esta muestra en patologas especficas relacionadas con el sistema
nervioso central.
4.8 Referencias
- Anatoma para estudiantes, Gray, 2 edicin, 2010.
- Strasinger SK, Schaub Di Lorenzo M. Anlisis de orina y de los lquidos
corporales. 5 ed. Madrid : Editorial Mdica Panamericana; 2010.
- Guilln Campuzano E, Buo Soto A, Daz Garca R, Galn Ortega A,Guevara Ramrez P,
Malumbres S, et. al. Recomendaciones para el estudiodel lquido cefalorraqudeo. Sociedad
Espaola de Bioqumica Clnica yPatologa Molecular (SEQC). Comit Cientfico. Comisin
MagnitudesBiolgicas relacionadas con la Urgencia Mdica. Documento K. Fase 3.Versin 2.
2010.
- Cisternografa con radionuclidos [Internet]. Biblioteca Nacional de Medicina de los EE.UU.; [citado 10
oct 2016]. [1 pantalla]. Disponible en: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003823.htm
- Definicin, Indicaciones, Contra-indicaciones, Tcnicas, Equipos, Preparacin y Fotos de Puncin
lumbar. [Internet] Disponible en: http://apuntes-medicina.blogspot.com/2016/10/definicion-indicaciones-
contra.html
55
- Smith, G., Kjeldsverg, C. (2010). Lquido cefalorraqudeo, sinovial y lquidos serosos del
organismo. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnstico clnico. Marbn: Madrid.
- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). El encfalo y los nervios craneales. En autor Principios de
anatoma y fisiologa. Mdica Panamericana: Mxico, D.F
- https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2011/09/analisis-de-liquidos-biolc3b3gicos.pdf
- Cabrera, C. (2003) Lquido cefalorraqudeo y la puncin lumbar en el siglo XXI. Rev Posg VIa
Cted Medicina 128. Recuperado de http://med.unne.edu.ar/revista/indice.html#128
- Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, D. (2003) Cerebrospinal fluid analysis. American Family
Physician. 68 (6): 1103 1108
PRCTICA No 5.
DIFERENCIACIN DE EXUDADOS Y TRASUDADOS
Vernica Ruiz Solorio.

5.1 Introduccin
Los lquidos serosos corporales se derivan del plasma y se encuentran en la cavidad pleural,
pericrdica, peritoneal y articular, en estas cavidades corporales estn delimitadas por una membrana
serosa parietal y una visceral que estn constituidas por una capa de tejido conjuntivo con abundantes
capilares y vasos linfticos y una capa superficial de clulas mesoteliales (Tortora y Derrickson, 2007).
Estos lquidos son un ultrafiltrado del plasma que se derivan de una abundante red capilar de la
membrana serosa. Su formacin es similar a la del lquido extravascular y aqu intervienen la presin
hidrosttica, la presin coloidosmtica y la permeabilidad capilar (Tortora y Derrickson, 2007).
En condiciones fisiolgicas hay una pequea cantidad de lquido en cada una de estas cavidades
que permite el movimiento de las vsceras en cada uno de estos espacios. Un sistema complejo regula el
volumen de estos lquidos. Cuando se alteran estos mecanismos responsables de la formacin o
absorcin del lquido se produce un aumento excesivo de estos lquidos, de este modo el lquido se
acumula cuando se aumenta la permeabilidad capilar y la presin hidrosttica o cuando disminuye la
56
presin coloidosmotica o se obstruye el drenaje linftico. La presin hidrosttica impulsa la salida del
lquido de los capilares hacia el interior de las cavidades (Strasinger y DiLorenzo, 2008).
Las protenas plasmticas son las que producen la presin osmtica y contrarrestan la presin
hidrosttica manteniendo el lquido en los capilares, la diferencia de presin osmtica entre el plasma y el
lquido intersticial es proporcional a la concentracin de protenas, principalmente la albumina. Los vasos
linfticos tambin desempean un papel importante en la absorcin de agua, protenas y otros solutos
desde el espacio extravascular (Strasinger y DiLorenzo, 2008).
Los exudados son lquidos inflamatorios cuya formacin depende de un aumento de la
permeabilidad capilar debido a alteraciones que implican directamente a estructuras de la superficie de
determinadas cavidades (mesotelio, vasos linfticos, capilares y articulaciones). Por ejemplo: tuberculosis,
infecciones bacterianas, tumores, entre otras (Smith, Kjeldsverg, 2010).
Los trasudados son derrames provocados por factores mecnicos que influyen en la formacin o
resorcin de lquido plasmtico, por ejemplo, a causa de la reduccin de la albmina del plasma o
incremento de la presin venosa (presin hidrosttica o coloidosmtica). La diferencia entre un trasudado y
exudado se basa en niveles arbitrarios de decisin clnica que han sido determinados empricamente
(Smith, Kjeldsverg, 2010).
El estudio habitual del derrame pleural y sinovial de etiologa desconocida incluye en general la
determinacin de su aspecto general, nivel total de protenas, recuento de eritrocitos recuento de
leucocitos, recuento diferencial y estudio microscpico con Wright y Gram, cultivo y estudio citolgico
(Smith, Kjeldsverg, 2010; Strasinger y DiLorenzo, 2008).
Otros estudios que resultan de gran utilidad son: la determinacin de glucosa, LDH, pH, fosfatasa
alcalina y biopsia (Smith, Kjeldsverg, 2010). Tambin es importante sealar que existen tcnicas de
imagen, que son importantes para el diagnstico de las diversas patologas relacionadas. La radiografa de
trax permite detectar derrames muy pequeos de hasta 100 ml adoptando diferentes posiciones como el
decbito lateral. En ocasiones es necesario recurrir a la ecografa para localizar un derrame (Strasinger y
DiLorenzo, 2008).
El estudio de estos lquidos serosos proporcionan informacin importante sobre la fisiopatologa de
los rganos y tejidos donde se generan y es funcin del laboratorio la seleccin de magnitud diagnostica
apropiada y con buena capacidad discriminatoria, para que este estudio aporte informacin decisiva en la
prctica clnica.

- Describa en un cuadro las caractersticas distintivas de los exudados y trasudados.
57
- Qu otras pruebas complementaran la prctica y en qu situaciones se usaran?

- Qu enzimas son cuantificadas en el estudio de los exudados y trasudados?
- Definir los siguientes conceptos: paracentesis, toracocentesis, artrocentesis, pericardiocentesis.
- En un cuadro, indique la composicin, la cantidad, las situaciones en las que aumenta y sus hallazgos
de laboratorio de los lquidos peritoneal, sinovial, pericrdico y pleural.
5.3 Objetivos
- Determinar si el lquido seroso proporcionado en la prctica es un exudado o un trasudado mediante la
realizacin de pruebas fsicas, qumicas y microscpicas para conocer la importancia de su diferenciacin.

Material biolgico
Muestra de lquido seroso proporcionada por los profesores del laboratorio
Material por equipo

- 3 Cubreobjetos - 1 Pipeta graduada de 1ml
- 1 Cuadros de papel seda - 6 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm
- 1 Propipeta - 1 Gradilla
- 3 Portaobjetos - 1 Microscopio
Material por grupo

- 1 Bao de incubacin a 37 C - 1 Centrifuga con balanza
- 1 Micropipeta (5 50 ul) - 1 Micropipeta (40 200 ul)
- 1 Micropipeta (200 1000 ml) - 1 Espectrofotmetro con gradilla
- 5 Frasco gotero con aceite de inmersin - 10 celdas para espectrofotmetro
- Recipientes para desechos (RPBI) - 1 Pinzas para portaobjetos
- 3 pipetas graduadas de 5 ml - 3 gradillas
- 2 Vaso de precipitado de 500 ml - 1 Dispensador de puntas azules
- 1 Dispensador de puntas amarillas
Reactivos
- Reactivo para la determinacin Glucosa - Hipoclorito de sodio
- Reactivo para la determinacin Protenas totales (Biuret) - Benzal
58
- cido actico glacial - Buffer de fosfatos

- Reactivos para la tincin Wright - Aceite de inmersin

5.5.1 Obtencin de la muestra
La muestra ser proporcionada por los profesores.

Significado clnico.
Los lquidos amarillentos claros, parecidos al suero o a la orina normal, pueden corresponder a trasudados
de congestin. El lquido puede ser de color amarillento transparente, turbio por su contenido elevado de
clulas, hemtico por la presencia de hemates o quiloso por aumento de grasas en forma de triglicridos.
Una apariencia lechosa o fibrinosa puede ser debida a un aumento de la concentracin celular o lipdica.
El examen del sobrenadante tras la centrifugacin permite su diferenciacin.
Tcnica
- Homogenizar la muestra por inversin suave y observarla
- En caso de que la muestra presente turbidez se observa despus de la centrifugacin a 2000 rpm por 5
minutos.
5.5.3 Densidad
Significado clnico.
El exudado generalmente tiene una densidad superior 1.018 y un trasudado con una densidad menor a
1.018
Tcnica
- Seguir la tcnica descrita en 4.5.3.2.
5.5.4 pH
Significado clnico.
59
En los exudados el pH es inferior a 7.30 en trasudados el pH es mayor a 7.30. El pH es inferior a 7.2 en

muchos derrames exudativos de diversa etiologa especialmente en empiema pleural y derrames
neoplsicos. Sin embargo en los derrames quilosos y los secundarios a embolismo pulmonar no desciende
por debajo de este lmite.
Tcnica
- Seguir la tcnica descrita en 4.5.4.2.
5.5.5 Prueba de Rivalta

Fundamento.
Se usa para distinguir exudados de trasudados. Los exudados contienen una protena que es la
seromusina esta precipita con cido actico, la presencia de dicha protena en una muestra de lquido
filtrado, se revela por una muestra de precipitado o floculacin cuando se le adiciona cido actico.
Tcnica
- Colocar en un tubo de ensaye 2 ml de cido actico diluido.
- Agregar una o dos gotas del lquido de puncin analizado.
- Si las gotas se hunden dejando un rastro claramente visible de precipitado blanco se puede afirmar que
es un exudado. Si se disuelven inmediatamente se trata de un trasudado.
5.5.6 Determinacin de protenas por el mtodo de Biuret (colorimtrico)

Fundamento.
En medio alcalino, los grupos amino terminales de los enlaces peptdicos de las protenas se unen al
cobre, formando un tetracomplejo (4 amino terminales y un cobre) generando un intenso color violeta
azulado. La intensidad del color formado, leda entre 540 y 560 nm es proporcional a la concentracin de
protena total en la muestra ensayada.
Significado clnico.
Una cifra mayor a 3 g/dl es significativa de un exudado, por debajo de 3 g/dl es indicativo de un trasudado.
Una ascitis rpida muy rica en protenas es sospechosa de trombosis supraheptica. La fibronectina
aumenta en la ascitis maligna por carcinomatosis peritoneal. Tambin en derrames pleurales tuberculosos
o en conectivopatas (son un grupo de enfermedades que se caracterizan por ser generalmente procesos
multisistmicos. Los rganos diana varan en cada proceso lo que les da una entidad propia a cada una de
60
ellas. En todas ellas se presume una etiopatogenia comn, la aparicin de autoanticuerpos especficos).
La beta-2 microglobulina est presente en los derrames debidos a procesos hematolgicos.
Tcnica
es 540 nm.
5.5.7 Determinacin de glucosa en la muestra control por el mtodo de glucosa oxidasa-POD

(enzimtico colorimtrico).
Fundamento.
El fundamento est descrito en el numeral 4.5.7.
Significado clnico.
La determinacin de la glucosa sirve para el diagnstico diferencial de los exudados. Cuando la glucosa es
menor de 60 mg/dl sugiere derrame pleural paraneumnico, tuberculosis, neoplasia o artritis reumatoide.
Los valores bajos de glucosa se deben al consumo excesivo por parte del metabolismo celular o
bacteriano. En los derrames paraneumnicos complicados valores de glucopleura inferiores a 40 mg/dl
son indicacin de drenaje. En neoplasias, la glucosa baja indica gran nmero de clulas neoplsicas y
mayor probabilidad de obtener citologa positiva. En la artritis reumatoide la glucopleura baja se debe a un
bloqueo del paso de la misma desde la sangre al espacio pleural.
5.5.8 Examen microscpico

Fundamento.
Se realiza una observacin del sedimento sin realizar tincin, bajo el microscopio a 40X, buscando la
presencia de clulas mesoteliales y de la inflamacin, adems de cristales. En aquellos casos en que se
identifique una cantidad considerable de leucocitos, el sedimento se observar tindolo con Wright (para
el fundamento ver 3.4.9.2 y la tcnica ver 3.4.9.4).
Significado clnico.
El sedimento de los derrames trasudados puede presentar algunas clulas mesoteliales de descamacin,
cuyo nico inters estriba en la posible confusin con clulas atpicas, por su alteracin y degeneracin en
los derrames crnicos. El conteo celular aumenta en las infecciones bacterianas. La presencia de cristales
de urato en fagocitosis se observa con gota artrtica. En lupus eritematoso sistemtico se observan clulas
61
LE. Los linfocitos predominan en derrames tuberculosos pero tambin los podemos encontrar en
neoplsicos. Polinucleares en exudados de origen bacteriano no tuberculosos por cocos generalmente.
Eosinfilos son elevados en enfermedades como periartritis nodosa; Churg Straus, etc. que tambin se le
llama enfermedad del colgeno, pero tambin abundan en derrames parasitarios o alrgicos, incluso en la
tuberculosis o cncer.
Tcnica
- Centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 5 min.
- Decantar el sobrenadante en otro tubo.
- Resuspender la pastilla, colectar una gota del lquido con una pipeta Pasteur y colocarla sobre un
portaobjetos, cubrir con cubreobjetos.
- Montar la preparacin en el microscopio, enfocar en 10X y observar a 40X.
- Buscar y registrar la presencia de clulas mesoteliales, leucocitos, bacterias y cristales.
- Reportar la presencia de estas clulas como negativo, escasos, moderados, abundantes e incontables.
- En caso que los leucocitos se encuentren de moderados a incontables, realizar un frotis colocando una
gota del sedimento homogenizado, extendiendo suavemente sobre un portaobjetos. Secar al aire y teir
con Wright (ver 3.5.9.4).

- Los tubos y portaobjetos con muestra biolgica se depositarn en los contenedores con cloro dispuestos
para este fin.
- Los guantes, papel y dems material desechable contaminado con muestra se depositarn en la bolsa
roja de RPBI.
- Los guantes y su envoltura se desecharn en el bote de la basura si no estn contaminados.

En el cuaderno de prcticas que entregarn despus de haber terminado la parte experimental y con base
a los resultados de las pruebas realizadas al lquido en estudio, se analizar si se trata de un exudado o
trasudado; tambin es pertinente sugerir pruebas complementarias para la clasificacin y para conocer el
origen de la posible patologa del lquido seroso. Debe resaltarse la importancia de diferenciar el origen del
62
lquido, para iniciar un tratamiento, dar un seguimiento y valorar posibles patologas relacionadas con el
derrame.
5.8 Referencias
- Smith, G., Kjeldsverg, C. (2010). Lquido cefalorraqudeo, sinovial y lquidos serosos del
organismo. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnstico clnico. Marbn: Madrid.
- Strasinger, S. DiLorenzo, M. (2008). Lquidos serosos. En autor Anlisis de orina y de los lquidos
corporales. Mdica Panamericana: Buenos Aires
- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). Principios de anatoma y fisiologa. Mdica Panamericana:
Mxico, D.F
- Diferenciacin entre nuevos marcadores L. Hernndez Blasco. Revista de Patologa
Respiratoria Vol. 11 Nov. 2008.
http://www.revistadepatologiarespiratoria.org/descargas/pr_11-2s_104-108.pdf.
63
PRCTICA NO. 6
EXMEN COPROLGICO
Ma. de Lourdes Galvn Ruiz
6.1 Introduccin
Aunque la digestin de las protenas, los hidratos de carbono y las grasas ingeridas tienen lugar a lo largo
del tubo digestivo, el intestino delgado es el sitio principal para la degradacin final y reabsorcin de estos
compuestos. Las enzimas digestivas secretadas en el intestino delgado por el pncreas son la tripsina,
quimiotripsina, aminopeptidasa y lipasa. Las sales biliares proporcionadas por el hgado ayudan a la
digestin de las grasas. Una deficiencia en cualquiera de estas sustancias causa incapacidad de digerir y,
por lo tanto reabsorber ciertos alimentos. El exceso de material sin digerir o sin reabsorber aparece
despus en las heces y el paciente presenta sntomas de dispepsia y malabsorcin (Strasinger y Di
Lorenzo, 2010).
La muestra normal de heces contiene bacterias, celulosa y otros alimentos sin digerir, secreciones
gastrointestinales, pigmentos biliares, clulas de las paredes intestinales, electrlitos y agua. Muchas
especies de bacterias componen la flora intestinal normal. El metabolismo bacteriano produce el olor fuerte
asociado con las heces y el gas intestinal (flato). Los hidratos de carbono, en especial los oligosacridos,
que son resistentes al paso de la digestin, atraviesan la porcin superior del intestino sin cambios, pero
son metabolizados por las bacterias en la porcin inferior del intestino y producen cantidades grandes de
flatos. La produccin excesiva de gas tambin aparece en los individuos con intolerancia a la lactosa
cuando las bacterias intestinales metabolizan la lactosa de la leche o de las sustancias que la contienen
(Strasinger y Di Lorenzo, 2010).
Un adulto excreta entre 100 a 300 gr de materia fecal por da, la excrecin depende de una serie compleja
de procesos de absorcin, secrecin y fermentacin. El examen de estas se realiza con frecuencia en la
evaluacin de trastornos gastrointestinales y sus resultados ayudan a descubrir un sinfn de enfermedades
como pueden ser, sangrado y obstruccin gastrointestinal, ictericia obstructiva, enfermedades parasitarias,
disentera, colitis ulcerosa y en los sndromes de mala absorcin y mala asimilacin.
El contenido del intestino delgado (quimo) principia su paso hacia el recto en tan solo 2 a 3 horas despus
de haber comido, pero el proceso no es completo sino hasta 6 a 9 h despus de la comida (Tortora y
Derrickson, 2007).
El intestino grueso es capaz de absorber alrededor de 3 000 ml de agua. Cuando la cantidad de agua que
alcanza el intestino grueso excede esta cantidad, se excreta con la materia fecal slida y produce diarrea.
64
Por otra parte, el estreimiento provee el tiempo necesario para que ms agua se reabsorba de la materia
fecal y produce heces pequeas y duras (Strasinger y Di Lorenzo, 2010)..
El colon proximal o recto absorbe la mayor parte del agua restante. La absorcin colnica del agua y
electrolitos es un proceso pasivo. Despus de comer hay movimientos de mayor actividad propulsiva
(peristaltismo). Estas ondas peristlticas tienen su origen en reflejos gastroclicos y duodenoclicos, los
cuales se inician despus de la comida, se producen al llenarse el duodeno con el alimento proveniente
del estmago. Los msculos del colon estn inervados por el sistema nervioso autnomo. El sistema
nervioso parasimptico estimula el movimiento, y el simptico inhibe este movimiento. Varias veces al da
se presenta peristaltismo masivo, lo cual hay distencin del recto y se inicia la urgencia de la defecacin.
En personas con motilidad normal y con ingestin de una dieta mixta, el tiempo de trnsito o de paso
(desde la ingesta del alimento hasta de defecacin) es de 24 a 48 h. De esta forma, la funcin normal del
colon encierra 3 procesos fisiolgicos: 1) absorcin de lquidos y electrolitos; 2) contraccin que mezclan el
contenido, lo exponen a la mucosa y lo transportan al recto, y 3) defecacin (Tortora y Derrickson, 2007;
Garca y Lpez, 2007).
El examen coprolgico es un examen habitual de las heces, incluye los anlisis macroscpico,
microscpicos y qumicos para la deteccin temprana de hemorragia gastrointestinal, trastornos hepticos
y de los conductos biliares, sndromes de dispepsia y malabsorcin, inflamacin y causas de diarrea y
esteatorrea (Strasinger y Di Lorenzo, 2010).
Tambin existen otros exmenes como son el coproparasitoscpico y el coprocultivo, el primero se realiza
para la observacin de parsitos en sus diferentes fases del ciclo de vida en una muestra fresca; en el
segundo, la muestra se siembra en medios de cultivos selectivos para el desarrollo e identificacin de las
bacterias entricas patgenas (Heising, Threatte, Henry, 2010)
Las muestras al azar convienen para la comprobacin cualitativa de sangre y el examen microscpico de
leucocitos, fibras musculares y grasas en heces suelen recolectarse en envases de plstico o vidrio con
tapa de rosca. Para la comprobacin cuantitativa, por ejemplo para las grasas en heces, se requieren
muestras en tiempo establecido, debido a la variabilidad de los hbitos intestinales y el tiempo de trnsito
requerido para que el alimento atraviese el tubo digestivo, la muestra ms representativa es una
recoleccin de 3 das. Estas muestras se recolectan en envases grandes para albergar la cantidad y
facilitar la emulsificacin antes de la prueba (Strasinger y Di Lorenzo, 2010).
Cuando se recolecte la muestra debe evitarse mezclarla con orina, sangre menstrual o agua de colonia;
debe llevarse lo ms pronto posible al laboratorio, registrarla y realizar el examen.
6.2 Actividades previas a la prctica:
65
- Instrucciones que se deben dar a los pacientes para una correcta recoleccin de heces en la
deteccin de sangre oculta.
- Definir creatorrea, esteatorrea, melena, espre, acolia, aquilia, amilorrea y meconio.
- Cmo se recolecta una muestra para la determinacin cuantitativa de grasa? Cmo se realiza
esta determinacin? Cul es su utilidad diagnstica?
- Cmo se determinan el urobilingeno y pigmentos biliares en las heces?
- Cul es su utilidad diagnstica?
- Indicar el fundamento de la determinacin de azcares reductores. Investigar la utilidad de las
tabletas Clinitest en esta determinacin. Cul es la utilidad diagnstica de los azcares reductores?
- Buscar imgenes para consultar durante la prctica, describiendo con las diferentes tinciones a
emplear; as como los artefactos y de restos de alimentos que se observan en el examen
microscpico de heces.
6.3 Objetivos
- Conocer la importancia de recolectar correctamente de una muestra de heces al azar y para estudios
cuantitativos, as como las interferencias que se deben evitar para la obtencin de resultados reales.
- Conoce el fundamento y establecer
importancia de la realizacin correcta de cada una de las pruebas del examen coprolgico, que permita
identificar en forma precisa las alteraciones que presenta la muestra para analizar en conjunto los
resultados.
- Realizar una interpretacin correcta de los resultados obtenidos que precisen las alteraciones
especficas de los procesos digestivos y los rganos involucrados,
Reactivos por grupo

Azul de metileno al 0.1%
cido actico al 3%
Sudn III
Lugol
SSF
Tarjetas Hema screen
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Tabletas reactivas Clinitest

Benzal
Hipoclorito de sodio
Material por equipo
3 Tubos de ensaye 13x100
1 Gradilla
2 Pipetas Pasteur con bulbo
1 Abatelenguas
1 Microscopio
1 Tubo de ensaye 15x150 mm
5 Portaobjetos
5 Cubreobjetos
1 Cuadro de papel seda
1 Aplicador de madera
1 Tira indicadora de pH
Material por grupo

1 Gradilla
5 Tubos de ensaye 15X100 mm
5 Bulbos para Pipeta Pasteur
5 Pipetas Pasteur con punta corta
6.5.1 Obtencin y procesamiento de la muestra biolgica

- Como se mencion anteriormente debe seguirse el rgimen de prueba indicado, evitando el consumo
excesivo de carne pues puede afectarse el resultado de la deteccin de sangre oculta.
- El paciente debe orinar en la taza del bao.
- La defecacin se realiza en un cmodo recipiente escrupulosamente limpios, evitando la
contaminacin con sangre (proveniente de fisuras anales o menstruacin) u orina.
- Existen tubos de plstico con tapas que tienen adaptadas unas cucharillas con las que se pueden
recolectar aproximadamente de 5 a 10 g de heces. En caso de no contar con estos tubos, puede
utilizarse un abatelenguas estril para realizar la recoleccin. En caso de que el paciente sea un beb,
la muestra se recoge del paal, pero debe evitarse el uso de talco o pomadas en la piel del beb.
- Las muestras pueden ser examinadas una hora despus de la evacuacin, aunque puede ser posible
refrigerarlas el tiempo que sea indispensable hasta su evaluacin.
67
6.5.2 Examen macroscpico

Principio
El color marrn de las heces es el resultado de la oxidacin intestinal del estercobilingeno a
estercobilina, que debido a la degradacin de la hemoglobina se forma la bilirrubina conjugada que pasa a
travs del conducto biliar al intestino delgado donde las bacterias intestinales la convierten en
urobilingeno y estercobilingeno.
Normalmente el aspecto las heces presenta forma cilndrica y consistencia slida, que debe mantenerse
despus de excretada. El rgimen de prueba sin celulosa puede dar lugar a unas heces algo ms blandas,
pero normales.
El olor fecal caracterstico (reportado como sui gneris), vara de acuerdo a la ingesta de alimentos y el
tiempo que permanece dentro del intestino.
Tcnica
Destapar con cuidado el recipiente que contiene la muestra. realizar las observaciones inmediatamente.
Reportando color, forma, consistencia y olor.
Significado Clnico
Es frecuente que los trastornos gastrointestinales originen cambios en el color marrn y consistencia forme
de las heces, se debe tomar en cuenta que pueden existir alteraciones debidas a la dieta o consumo de
medicamentos; por lo que es importante realizar la diferenciacin entre esto y una posible patologa.
Segn el rea del tracto intestinal en el que se produzca la hemorragia el color puede ser de rojo brillante a
rojo oscuro o inclusive negro.
La sangre que se origina en esfago, estmago o duodeno tarda aproximadamente 3 das para aparecer
en las heces, observndose negras alquitranadas; mientras que la sangre que proviene de la porcin
inferior del tubo digestivo requiere menos tiempo para aparecer y conserva el color rojo. En caso de
encontrar heces rojas o negras es necesario realizar pruebas qumicas para determinar la presencia de
sangre; ya que la ingesta de sangre, moras, mosto de uva, vino tinto, carbn vegetal, hierro, bismuto, sales
de plata, hierro, carbn vegetal o bismuto producen heces negras; mientras que el betabel produce heces
rojas, por lo tanto deben evitarse 3 a 5 das antes de la recoleccin de la muestra. Las heces verdes las
producen los antibiticos orales por oxidacin de bilirrubina fecal a biliverdina o tambin por la ingestin de
grandes cantidades de verduras de hojas o alimentos ricos en colorantes verdes. La insuficiencia
pancretica provocan heces amarillentas, con diferentes matices; la dieta lctea y en los lactantes es
68
amarillo canario. Con dieta crnica se hace marrn oscuro, mientras que si son abundantes las papas y el
pan, las heces se aclaran hacia un marrn amarillento. El ruibarbo, sen, santonina y otras plantas tien de
amarillo las deposiciones. En la acolia de las ictericias obstructivas y en la fase aguda de las hepticas son
blanco-grisceas. La sangre en forma de estras en la superficie indica hemorroides o anormalidades
anales.
La consistencia acuosa sugiere diarrea. Cuando las heces son pequeas y duras indican estreimiento,
mientras que las heces delgadas como cintas sugieren una obstruccin intestinal.
Las falsas diarreas de los constipados se caracterizan por la deposicin mixta, compacta la primera parte y
pastosa al final. En el clera se han comparado con la "sopa de arroz", y en la tifoidea con el "pur de
guisantes", pero esta ltima es inconstante en su presentacin. La deposicin de los enfermos con
insuficiencia gstrica descompensada parece una "papilla". En las esteatorreas de origen biliar,
pancretico o entrico (espre y diarreas esprueiformes, celiaqua) es cremosa y pegajosa, como
"mantequilla", tambin se observan voluminosas y espumosas, con apariencia grasosa y flotan. En la
dispepsia de fermentacin son generalmente pastosas, esponjadas y espumosas.
Las heces revestidas de moco indican inflamacin o irritacin intestinal, se observan en colitis patolgica o
presin excesiva durante la evacuacin.
El moco con filamento de sangre sugiere dao en las paredes intestinales, causada tal vez por disentera
bacteriana o amebiana o por procesos maligno. La presencia de moco debe informarse.
Aunque el olor se hace ftido en todos los procesos que cursan con putrefaccin de las protenas ingeridas
o endgenas (lo cual puede ocurrir en pacientes con insuficiencia gstrica, biliar o pancretica, colitis,
cncer, etc.), y sobre todo en las melenas, en el cncer de colon y en el absceso abierto en el intestino
grueso. En las "diarreas de fermentacin" con trnsito rpido a partir del ciego son de olor rancio, agrio.
Durante el tratamiento con antibiticos no emiten olor. Las diarreas urmicas y en las fstulas
rectovesicales provocan un olor amoniacal.
6.5.3 pH
Principio
La tira indicadora de pH contiene como indicadores: azul de bromotimol, rojo de metileno y fenolftalena,
produciendo un cambio de coloracin de acuerdo a la concentracin de iones H+.
Tcnica
- Humedecer una tira de papel pH, con agua destilada.
69
- Poner el papel en contacto con las heces en varios puntos de la superficie y tambin el interior, usando
solo un lado de la tira de papel.
- Comparar el vire que presenta tira de papel pH con la escala de colores de la caja.
NOTA: Tener precaucin de que al comparra la tira reactiva ya impregnada con heces no tenga contacto
directo con la carta de colores, para evitar contaminacin de la misma.
Significado clnico
Los valores normales van de 7.0 8.0 . El pH de las heces depende de mltiples factores, dietticos y
endgenos, pero nos orienta para identificar que si es <7.0 puede tratarse de una dispepsia fermentativa,
mientras que en procesos diarreicos e insuficiencia gstrica es >8.0
6.5.4 Sangre oculta por el mtodo del guayaco (HemaScreen)
Fundamento
La reaccin utiliza la actividad de la seudoperoxidasa de la hemoglobina que reacciona con el perxido de
hidrgeno para oxidar los compuestos fenlicos presentes en el guayaco (inicialmente incoloro) con la
produccin de quinonas de color azul.
pseudoperoxida
Hemoglobina + H2O2 sa
2H2O + O2 + Guayaco Guayaco oxidado
incoloro azul
Tcnica
- Escribir la informacin requerida en la parte frontal de la tapa de la tarjeta Hema-Screen y abrir la
tapa.
- Con un aplicador de madera tomar con un extremo un poco de muestra superficial y con el otro de
la parte interna.
- Distribuir las muestras en cada una de las ventanas y cerrar la tapa con ayuda de la pestaa. Secar
a temperatura ambiente.
- Abrir la parte trasera de la ventana perforada y agregar 2 gotas de revelador en la parte trasera de
las ventanas. La presencia de sangre provoca la formacin de un halo verde-azulado en torno a las
heces.
Significado clnico
En condiciones normales este parmetro es negativo. La prueba positiva es indicativa de sangre oculta y
sangrado masivo del tracto gastrointestinal. Como todo sangrado mayor a 2.5 mL/150g de heces se
considera importante desde el punto de vista patolgico y pueden estar ausentes los signos visibles de
sangrado. En la actualidad su uso est muy difundido como procedimiento eleccin para identificacin de
70
sangre oculta, la prueba anual tiene un alto valor predictivo positivo para la deteccin temprana de cncer
colorrectal y es recomendada por la American Cancer Society, en particular para las personas mayores de
50 aos.
6.5.5 Determinacin de azcares reductores en heces

Fundamento
Esta determinacin debe utilizarse en caso de que la muestra sea de paciente peditrico y lo ms pronto
posible despus de emitida, pues la glucosa y otros azcares son consumidos por bacterias. Se utilizan las
tabletas reactivas Clinitest para la determinacin cuantitativa de azcar en orina de Bayer, con algunos
cambios en la tcnica. El sulfato de cobre de las tabletas Clinitest reacciona con los azcares reductores
(glucosa, fructosa, galactosa y pentosa) presentes en la muestra, reducindolo a xido cuproso. El color
resultante va desde azul verdoso a naranja, dependiendo de la cantidad de azcar presente. El hidrxido
de sodio proporciona el medio alcalino necesario para que se lleve a cabo la reaccin. El calor requerido
es proporcionado por la reaccin del hidrxido de sodio con el agua y con el cido ctrico. El carbonato de
sodio y el cido ctrico ayudan a disolver la tableta.
Tcnica
- Realizar en un tubo de ensaye 13 x 100mm una emulsin, colocando una parte de las heces en
dos partes de agua.
- Transferir 15 gotas de la emulsin a un tubo 15x150 y adicionar una tableta de Clinitest sin agitar.
- Esperar 15 segundos y agitar suavemente para mezclar el contenido. PRECAUCIN: evitar el
contacto con la piel, los ojos, las membranas mucosas y la ropa pues la reaccin es exotrmica.
- La lectura se realiza comparando el color del lquido contenido en el tubo con la carta de colores
del manual de uso de las tabletas.
NOTA: La emulsin preparada se utilizar ms adelante en las tinciones que se observarn en el

microscopio.
Significado clnico
En condiciones normales no deben existir azcares reductores en la muestra, pues son digeridos y
absorbidos en su totalidad en el intestino. Pueden presentarse en intolerancia a la lactosa, mala digestin
por falta de actividad enzimtica, mala absorcin o distrofia de la mucosa intestinal.
71
6.5.6 Examen microscpico directo

Principio
La evaluacin microscpica de las preparaciones de heces se realiza para detectar presencia de
leucocitos asociados con diarrea microbiana, almidones, fibras musculares sin digerir que se asocian con
creatorrea y grasas asociadas con esteatorrea.
Tcnica
- En un portaobjetos, colocar una gota de emulsin y cubrirla con un cubreobjetos, para despus
montar la preparacin en el microscopio.
- Enfocar a 10X y realizar la observacin a 40X revisando 15 campos evitando la lectura en las orilla
del cubreobjetos.
- Identificar leucocitos, fibras musculares estriadas y parsitos reportando: cantidad /campo.
Evaluar la cantidad de bacterias como escasas, moderadas o abundantes.
Significado clnico
Si la muestra es observada dentro de la primera hora de la deposicin, puede evidenciarse la presencia
leucocitos, fibras musculares estradas, parsitos vivos o bacterias. Los primeros deben ser negativos,
mientras que las bacterias son escasas.
6.5.7 Fibras musculares en heces

Fundamento.
La eosina en alcohol al 10% durante 3 minutos de contacto con las fibras musculares, realza las
estriaciones para poder identificar el grado de digestin de las mismas
Tcnica
- Colocar en un portaobjetos una pequea cantidad de heces y adicionar 2 gotas de eosina en
alcohol al 10% y emulsionar empleando un aplicador de plstico.
- Colocar un cubreobjetos y dejar reposar durante 3 minutos
- Enfocar la preparacin a 10X y observar a 40X, se revisa la totalidad del cubreobjetos durante
exactamente 5 minutos.
72
- Se cuenta nmero de fibras teidas de rojo con estriaciones tanto en sentido horizontal como
vertical bien conservadas, stas son las caractersticas de la fibras sin digerir.
- Reportar la cantidad total observada.
Significado clnico
La prueba debe ser negativa o escasa.
Las fibras parcialmente digeridas muestran estriacin en una sola direccin y las totalmente digeridas no
tienen estriaciones.
Slo deben contarse y reportar la presencia de fibras musculares estriadas sin digerir, siendo til para el
diagnstico y monitorizacin de pacientes con insuficiencia pancretica, debida a pancreatitis crnica,
fibrosis qustica o neoplasias; tambin pueden observarse en caso de obstruccin biliar y fstulas
gastroclicas. Existe creatorrea en la insuficiencia gstrica con aquilia.
6.5.8 Leucocitos fecales

Fundamento
Las muestras se pueden examinar como preparaciones en fresco o en frotis teidos con azul de metileno
que presenta afinidad por los ncleos leucocitarios y har evidente la presencia de neutrfilos. Esta tincin
tambin identificar a los jabones. Todas las preparaciones deben realizarse con muestras recin emitidas.
Tcnica
- Colocar una 3 gotas de emulsin de heces 1 gota de heces lquidas o con moco y agregar 2
gotas de azul de metileno
- Mezclar con un palillo de madera
- Dejar reposar 2-3 minutos
- Enfocar a 10X y realizar la observacin a 40X revisando 20 campos evitando la lectura en las orilla
del cubreobjetos.
- Identificar los neutrfilos reportando: cantidad /campo
Significado clnico
Los neutrfilos se observan en las heces en enfermedades que afectan la mucosa intestinal, como colitis
ulcerosa y disentera bacteriana.
La presencia de 3 o ms neutrfilos por campo (visto a 40x) puede ser indicativo de una enfermedad
bacteriana invasiva.
73
Nota: el hallazgo de algn neutrfilo observado en frotis de heces a 100x tiene una sensibilidad de
alrededor del 70% para detectar la presencia de bacterias invasiva.
6.5.9. Determinacin cualitativa de grasas neutras y grasas fraccionadas en heces

Fundamento
Los lpidos incluidos en el examen microscpico de las heces son grasas neutras (triglicridos), sales de
cidos grasos (jabones), cidos grasos y colesterol; su presencia puede ser observada al emplear la
tincin con Sudn III. El procedimiento de tincin consta de 2 partes: la tincin de grasas neutras y la
tincin de grasas fraccionadas.
Las grasas neutras se tien con facilidad utilizando como colorante Sudn III y aparecen como gotitas
grandes anaranjadas o rojas, situadas a menudo cerca del borde del cubreobjetos.
Como los jabones y los cidos grasos no se tien directamente con Sudn III se debe examinar un
segundo portaobjetos despus de realizar una hidrlisis de stos, mezclando la muestra de heces con
cido actico al 36% y aplicando calor.
Para saber la cantidad de grasa en heces debe de hacerse una cuantificacin en una muestra de 72 h. La
grasa puede reconocerse macroscpicamente siempre y cuando la excrecin de grasa sea considerable.
Tcnica de tincin de grasas neutras

- Mezclar 3 gotas de heces emulsificadas con una gota de alcohol etlico al 95% sobre un
portaobjetos
- Mezclar con aplicador de plstico
- Adicionar 2 gotas de Sudn III saturado en etanol al 95%
- Mezclar con aplicador y colocar cubreobjetos
- Revisar con objetivo 40x toda la preparacin incluyendo las orillas del cubreobjetos.
- Contar las gotas anaranjadas presentes / campo, e indicar el tamao de las gotas.
NOTA: Los jabones y los cidos grasos no se tien directamente con Sudn III, por lo tanto debe
examinarse un segundo portaobjetos como se describe a continuacin:
Tcnica de tincin de grasas fraccionadas

- Mezclar 3 gotas de heces emulsificadas con una gota de cido actico al 36% sobre un
portaobjetos
74
- Mezclar con aplicador de plstico

- Adicionar 2 gotas de Sudn III saturado en etanol al 95%
- Mezclar con aplicador y colocar cubreobjetos
- Calentar suavemente hasta el punto de ebullicin
- Revisar con objetivo 40x toda la preparacin incluyendo las orillas del cubreobjetos
- Contar las gotas anaranjadas presentes / campo, e indicar el tamao de las gotas.
Este examen revela gotitas teidas que representan a los cidos grasos libres y los cidos grasos
producidos por la hidrlisis de jabones y grasas neutras.
Interpretacin de resultados
Nmero de gotitas/campo Reporte

100 gotas menores de 4 m Normal
100 gotas de 1 a 8 m Aumento leve
100 gotas de 6 a 75 m Aumento
Significado clnico.
La grasa en las heces debe ser negativa o escasa. La esteatorrea en las deposiciones puede deberse a
uno o varios mecanismos como lo son: trnsito acelerado, dficit enzimtico de su digestin, dficit de
absorcin o hipersecrecin endgena. Unas veces predomina la grasa neutra, sin desdoblar, y en otros
casos los cidos grasos y jabones.
6.5.11 Presencia de quistes parasitarios y almidn

Fundamento.
El yodo tie de amarillo los ncleos de quistes, de caf las vacuolas que contienen glucgeno y de azul los
grumos de almidn en presencia de lugol, debido a una adsorcin o fijacin del yoduro sobre las unidades
de glucosa de la amilasa.
Tcnica
75
En un portaobjetos colocar una gota de emulsin de realizada en cada uno (ver 7.4.7.3.1 Agregarle una
gota de lugol mezclndolas con un aplicador de madera.
Enfocar la preparacin a 10X y observar a 40X, buscando quistes, vacuolas con glucgeno y almidn.
Criterio de evaluacin del frotis:

1 - 4 = escasos
Promedio de 20 campos observados con objetivo 40x: 5 9 = moderados
Ms de 10 = abundantes
Significado clnico
La bsqueda de amilorrea tiene menos inters clnico que el de los dems pero sirve principalmente para
evidenciar un trnsito acelerado a travs del colon. Aparece cuando hay una ingestin excesiva de fculas
con o sin defectos de insalivacin y masticacin. Cuando existe una Insuficiencia pancretica la
coexistencia de esteatorrea y creatorrea en este sndrome global confirma el diagnstico. La amilorrea
puede faltar en pancreopatas evidentes.

- La suspensin debe regresarse al contenedor original de la muestra, que junto con el resto de la
muestra biolgica depositar en la taza del bao y se accionar la palanca, el contenedor puede
tirarse en el bote de la basura del bao.
- Los guantes, papel y dems material desechable contaminado se depositarn en la bolsa de la
basura municipal.
- Las cajas petri y portaobjetos con muestra biolgica se depositarn en los contenedores con cloro
dispuestos para este fin.
6.7 Referencias
- Garca, P.,Lpez, G. (2007). Evaluacin de la absorcin y metabolismo intestinal. Nutricin

Hospitalaria 22(Suppl 2): 5-13
- Heisig, D., Threatte, G., Henry, J.B. (2010). Diagnstico de laboratorio de las alteraciones
gastrointestinales y pancreticas. En Henry , J.B. Laboratorio en el diagnstico clnico. Marban:
Madrid, Espala
76
- Strasinger, S. , Di Lorenzo, M. (2008). Anlisis de heces. En autor Anlisis de orina y de los

lquidos corporales. Mdica Panamericana: Buenos Aires, Argentina
- Trtora, G., Derrickson, B. (2007). El aparato digestivo. En autor Principios de anatoma y
fisiologa. Mdica Panamericana: Mxico, D.F.
PRCTICA No 7.
EQUILIBRIO HIDROELECTROLTICO Y CIDO BASE
Ren Damin Santos.
7.1 Introduccin
Los electrolitos son iones que existen en los lquidos corporales; el metabolismo resulta afectado
por las concentraciones absolutas y relativas de estos electrolitos constituyendo importantes factores de la
77
osmolalidad, los potenciales de membrana el estado de hidratacin y del pH de los lquidos intracelular
(LIC) y extracelular (LEC) (Singer y Brenner, 2008).
Los electrolitos de importancia clnica son: sodio (principal catin extracelular), potasio (principal
catin intracelular), cloro (principal anin extracelular), fsforo, magnesio y calcio (iones inorgnicos
relacionados con el metabolismo mineral).
Los anlisis para la evaluacin del equilibrio hidroelectroltico y cido-base son los procedimientos
ms comnmente realizados en los laboratorios de qumica clnica; en conjunto, estos anlisis se agrupan
frecuentemente en un perfil metablico bsico.
De manera que es importante conocer la fisiologa de los rganos relacionados con el equilibrio
hidroelectroltico y cido-base, rin y pulmn, para poder interpretar adecuadamente los resultados de los
electrolitos sricos, trmino bajo el cual se han conjuntado al sodio, cloro y potasio. Estos se relacionan
con el equilibrio hidroelectroltico, debido a que mantienen la distribucin del agua entre los lquidos
extracelulares e intracelulares.
Los desrdenes de electrolitos son comunes en pacientes adultos hospitalizados en terapia
intensiva, con frecuencia, secundarios al tratamiento de diferentes alteraciones comunes, pues los
medicamentos utilizados en estos pacientes pueden alterar su absorcin, han sido asociados con
incremento de la morbilidad y mortalidad, la alteracin ms comn es la mielosis pontina, que degenera en
edema cerebral. Estas alteraciones pueden prevenirse si se usa una adecuada administracin intravenosa
de fluidos y nutrientes, por ejemplo, si se observa hiponatremia se contraindica el uso de fluidos
intravenosos hipotnicos, mientras que si hay hipernatremia se administra agua (Singer y Brenner, 2008).
Las alteraciones crnicas de los electrolitos, sumadas a la presencia de otras patologas pueden
ocasionar arritmias atriales. Adems, los electrolitos cumplen una funcin primordial en la hidratacin, de
tal manera que tambin deben monitorearse en aquellos pacientes que se someten a ejercicio extenuante,
dado que debido a su prdida a travs del sudor pueden generar alteraciones.
La determinacin de sodio, cloro y bicarbonato como electrolitos, adems de la evaluacin del CO 2
y del pH, permiten evaluar al equilibrio cido-base, con la finalidad de definir el origen, metablico o
respiratorio, de las alteraciones relacionadas (Heitz y Horne, 2005).
El mtodo ms utilizado para determinar al sodio, potasio y cloro es el de ion selectivo
(automatizado), que se fundamenta en un mtodo potenciomtrico que emplea electrodos "ion-selectivo".
Estos electrodos consisten en membranas permeables a una determinada especie inica. La diferencia de
potencial que se establece en la interfase de la membrana y la muestra en solucin, es directamente
proporcional al logaritmo de la actividad o concentracin inica segn lo establecido por la ecuacin de
78
Nernst. Adems de este mtodo, se ha utilizado la flamometra, aunque la necesidad de gas propano ha
disminuido su uso (Heitz y Horne, 2005).
La gasometra es el mtodo de eleccin para evaluar al equilibrio cido-base, a travs de la medicin de
bicarbonato, CO2 y del pH. No obstante, su ejecucin no forma parte de las pruebas de rutina, como lo
puede ser la determinacin de electrolitos sricos; sin embargo, se reconoce su importancia clnica como
apoyo al diagnstico (Heitz y Horne, 2005).

- Explicar qu muestras se utilizan para la determinacin de sodio, cloro y potasio.
- Investigar el fundamento de la determinacin de sodio, cloro y potasio por flamometra.
- Investigar qu es la gasometra? para qu se utiliza? cul es la muestra idnea para realizarla?
7.3 Objetivo
Estudiar el papel de la determinacin de electrolitos en las patologas relacionadas con el equilibrio
hidroelectroltico y cido-base a travs del estudio de los fundamentos de su determinacin y de casos
clnicos que permitan valorar la importancia.

Cuaderno de prcticas
Casos clnicos relacionados con alteraciones cido-base y del equilibrio hidroelectroltico.

- Asignar a los equipos uno de los siguientes temas:
Mtodos de cuantificacin de electrolitos
- Ion selectivo
- Flamometra
- Gasometra
Casos clnicos
- Deshidratacin
- Acidosis tubular renal
- Hiper e hiponatremia
- Hipovolemia
- Cetoacidosis (alcholica y diabtica)
79
Puede considerarse la opcin de asignar un tema por mesa en caso de que el nmero de equipos y de
sesiones calendarizadas as lo requieran.
- Los puntos que deber contener la presentacin son los que se indican en la siguiente tabla:
Mtodo de cuantificacin Caso clnico
- Titulo - Titulo
- Fundamento: anotar reacciones qumicas - Introduccin
necesarias. - Caractersticas del (los) paciente(s)
- Ejemplo de metodologa: describir pasos, - Metodologa: describir pasos, hacer
hacer diagrama de flujo utilizar los esquemas diagrama de flujo, utilizar los
necesarios. esquemas necesarios
- Muestra(s) biolgica(s) que se puede(n) - Resultados
emplear. - Discusin (considerando la
- Sensibilidad y especificidad. importancia de la evaluacin de los
- Unidades de reporte electrolitos para estos casos)
- Ejemplos de electrolitos que se cuantifiquen - Conclusiones
por ese mtodo
- Costos
- Al trmino de cada exposicin, los alumnos deben responder las dudas que se hayan generado de parte
de los alumnos y de los profesores del grupo, a fin de complementar y resaltar los puntos importantes de la
exposicin.

Debido a que se trata de una prctica terica no habr generacin de residuos.

Este punto no aplica debido a que la prctica se cumple con presentaciones orales que los alumnos
preparan con antelacin.
80
7.8 Referencias
- Buckley, MS, Leblanc, JM, Cawley, MJ. (2010) Electrolyte disturbances associated with commonly
prescribed medications in the intensive care unit. Crit Care Med 38(6 Suppl):S253-64
- Heitz, U., Horne, M. (2005). Fluidos, electrolitos y equilibrio cido-base. Elsevier Mosby: Madrid
- Sedlacek, M, Schoolwertj, AC, Remillard, BD. (2006) Electrolyte disturbances in the intensive care
unit. 19(6):496-501
- Singer, G., Brenner, B. (2008) Alteraciones de lquidos y electrolitos. En Fauci, A., Braunwald, E.,
Kasper, D., Hauser, S., Longo, D., Jameson, L., Loscalzo, J. Principios de Medicina Interna. Mc
Graw Hill: Mxico.
81
PRCTICA NO. 8
ELECTROLITOS DEL METABOLISMO MINERAL
Ren Damin Santos.

8.1 Introduccin
Como la piel, el hueso se forma antes del nacimiento, pero despus se renueva en forma continua
(Tortora, 2007), lo que provoca que el esqueleto sea un rgano metablicamente activo que sufre
remodelacin a lo largo de la vida (Hristova, 2010). Para que se produzca el crecimiento del hueso son
necesarias grandes cantidades de calcio (Ca) y fosforo (P) y pequeas cantidades de flor (F), magnesio
(Mg), hierro (Fe) y manganeso (Mn) (Tortora, 2007). La remodelacin esqueltica puede ser estimulada
por la respuesta hormonal a los cambios de Ca y P.
El Ca es el catin de mayor concentracin en el cuerpo humano, tiene gran importancia en la
mineralizacin del hueso, adems de ser un componente importante en diversos procesos fisiolgicos
como la coagulacin sangunea, la transmisin neuronal, la excitabilidad muscular, por lo cual la
concentracin srica de calcio debe mantenerse entre los 8 mg/dL y los 11 mg/dL. Entre las metodologas
que se emplean para su cuantificacin se encuentra el anlisis colorimtrico con indicadores
metalocrmicos, el marcado fluorescente en unin con EDTA o EGTA y la espectrometra de absorcin
atmica (Hristova, 2010).
El P es el mayor anin intracelular, es esencial en diferentes funciones celulares y fisiolgicas,
adems de participar en vas metablicas de carbohidratos, lpidos y protenas, tambin es responsable de
la produccin y almacenamiento de energa mediante los compuesto fosforilados de alta energa y no
82
olvidemos que es importante en la estructura sea, la sntesis de colagena y la homeostasis del Ca (Viana,
2012), cerca del 85% de fosfato en adultos se encuentra como sales de fosfato de calcio, el 15% restante
se encuentra ionizado (Tortora, 2007). Los mtodos ms empleados en la determinacin de fosfato
inorgnico son reacciones de est con molibdato de amonio para dar un complejo de fosfomolibadato
(Hristova, 2010).
El catin intracelular ms abundante, pero el segundo en importancia es el Mg, est involucrado en
aproximadamente 300 reacciones enzimticas como cofactor metlico (Viana, 2012). Casi el 54% del Mg
forma parte de la matriz sea como sales de magnesio y el 46% restante se encuentra en forma de iones
Mg2+ en el LEC y el LIC. Es esencial para la actividad neuromuscular, la transmisin sinptica y la funcin
del miocardio, adems de participar en la secrecin de PTH (Tortora, 2007). El mtodo de referencia para
la determinacin de Mg es la espectrometra de absorcin atmica, sin embargo se han utilizado varias
tcnicas analticas (Hristova, 2010).
Los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral (fsforo, magnesio y calcio total) pueden
determinarse mediante mtodos espectrofotomtricos usando el rango UV-visible del espectro
electromagntico.

- Explique la diferencia entre el calcio total y el calcio ionizado.
- Investigar las interferencias relacionadas con las determinaciones de calcio, fsforo y magnesio.
8.3 Objetivos
- Realizar la determinacin de los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral mediante mtodos
espectrofotomtricos para conocer los cuidados en el procedimiento, as como su importancia en el apoyo
al diagnstico.

- Material biolgico
*1 ml de suero obtenido por sistema al vaco, uno por equipo.
- Material por equipo

- 6 tubos de ensaye - torundas con alcohol (como mnimo, una por alumno)
- 1 ligadura - 1 sistema al vaco (tubo tapn rojo, aguja, adaptador)
83
- Material por grupo

- 2 espectrofotmetro - 1 dispensador de puntas azules para
- 10 celdas para el espectrofotmetro micropipeta
- 1 micropipeta (capacidad mnima 10 L) - 1 dispensador de puntas amarillas para
- 1 agitador vrtex micropipeta
- 1 bao mara a 37 C
- Reactivos
Equipo para la determinacin de:
- Fsforo inorgnico - Magnesio - Calcio total
NOTA: El mtodo a utilizar depender de los reactivos disponibles en el laboratorio.

- Obtencin del material biolgico
Para la obtencin de la muestra y separacin del suero ver Anexo A.
NOTA: Para conocer la tcnica, el valor de referencia y las precauciones durante la determinacin de cada
electrolito que se realizar, es necesario consultar el manual de uso de los reactivos disponibles en el
laboratorio en el momento de la prctica.
- Determinacin de fsforo inorgnico

- Fundamento. Existen dos mtodos para la determinacin de fsforo inorgnico:
- Mtodo colorimtrico: determina fsforo inorgnico. El fosfato inorgnico reacciona en medio cido con
el molibdato para dar fosfomolibdato, que es reducido por el cido ascrbico a azul de molibdeno,
desarrollndose el color en medio arsenito/citrato. El arsenito/citrato se combina con el exceso de
molibdato impidiendo su reaccin posterior con el fosfato liberado de los steres lbiles. El color obtenido
se mide entre 620 y 650 nm.
- Mtodo UV: El fsforo inorgnico (Pi) reacciona en medio cido con el molibdato para dar un complejo
fosfomolbdico que se mide espectrofotomtricamente a 340 nm.
84
- Significado clnico. El fsforo se encuentra en el organismo formando parte de compuestos orgnicos

(protenas, lpidos, carbohidratos, cidos nucleicos) o como fosfatos inorgnicos, cumpliendo diversas
funciones (transporte de energa, estructura de los tejidos, mantenimiento del pH de los lquidos
corporales). Los tejidos seo y muscular lo contienen como constituyente esencial y es notable su
participacin en la composicin del tejido nervioso. Su concentracin en circulacin est regulada entre
otros factores por los niveles de vitamina D y las glndulas endocrinas, observndose variaciones
fisiolgicas de acuerdo a la edad, ingesta, actividad fsica, embarazo, etc. Existen situaciones patolgicas
en las que se altera este equilibrio, producindose anormalidades en la concentracin de fsforo
circulante. Niveles elevados de fsforo srico son atribuidos a la dieta, metstasis de huesos, alteraciones
en el hgado, alcoholismo, diarreas y vmitos, en el hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo
conduce a la situacin contraria. Tambin puede encontrarse hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y
diversos trastornos renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con deficiencias de vitamina D y
defectos en la reabsorcin de fsforo a nivel renal.
- Determinacin de magnesio (Mg): mtodo colorimtrico

- Fundamento. El Mg, en medio alcalino, reacciona con un cromgeno (xylidyl blue o calmagita) formando
un complejo de color prpura cuya intensidad es proporcional a la concentracin de Mg presente en la
muestra. La incorporacin del complejante EGTA al reactivo elimina la interferencia de los iones calcio.
- Significado clnico. El Mg es el segundo catin intracelular ms abundante en el organismo humano
despus del potasio, siendo esencial en gran nmero de procesos enzimticos y metablicos. El 60% del
Mg del organismo se encuentra en los huesos y el resto est repartido entre msculos y otros tejidos
blandos. El Mg cumple un rol muy importante en la fisiologa humana. Participa en el metabolismo
energtico a travs de la activacin del ATP, en la transferencia de fosfatos de alta energa y es el ion
activador de muchas enzimas involucradas en el metabolismo de lpidos, carbohidratos y protenas. El Mg
es un mediador en mecanismos de conduccin y transporte a travs de membranas. Es esencial en la
preservacin de estructuras macromoleculares de DNA, RNA y ribosomas y en la formacin del hueso y el
mantenimiento de la presin osmtica. La hipomagnesemia est muy asociada a la deficiencia de otros
iones como el P, K y Ca. Las causas de hipomagnesemia son mltiples: diarreas crnicas y agudas,
sndromes de mala absorcin, succin nasogstrica prolongada y vmitos, fstulas intestinales y biliares,
deterioro de la conservacin renal, diabetes mellitus (acidosis diabtica), hipertiroidismo,
hiperaldosteronismo primario, alcoholismo crnico, administracin de diurticos o aminoglucsidos,
hiperparatiroidismo. El exceso de Mg puede darse por incorporacin o administracin excesiva de sales de
Mg y en general se asocia a falla renal. Otras patologas asociadas a hipermagnesemia son: hipercalcemia
85
hipocalcirica, hipotiroidismo, deficiencia de mineralocorticoides, enfermedad de Addison o terapia

intensiva con anticidos. El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos
y de laboratorio.
- Determinacin de calcio total

- Fundamento. Existen dos mtodos colorimtricos para la determinacin de calcio:
- Mtodo del arsenazo III: El calcio reacciona con arsenazo III (cido 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-
naftalenen-bis(azo)-dibenzenarsnico) dando un complejo de color azul que se mide
fotocolorimtricamente a 650 nm.
- Mtodo de o-cresolftalena. El calcio reacciona con la cresolftalen complexona (o-CPC) a pH 11, dando
un complejo de adicin color magenta que se mide fotocolorimtricamente a 570 nm.
- Significado clnico. El calcio es el mineral ms abundante e importante del cuerpo humano, el 99 % se

halla en los huesos. Es esencial en la mayora de las reacciones de la coagulacin sangunea y en la
regulacin de la excitabilidad de las fibras musculares. Su concentracin en suero y orina est regulada
por la accin de factores tales como niveles de parathormona, vitamina D y fsforo, observndose
fluctuaciones fisiolgicas debidas a edad, sexo, embarazo, actividad fsica, cambios estacionales (por
accin de la luz solar). La hipercalcemia est relacionada con distintas patologas: hiperparatiroidismo,
neoplasias seas, intoxicaciones con vitamina D, aumento de la retencin renal, osteoporosis, sarcoidosis,
tirotoxicosis. La hipocalcemia se asocia con desrdenes tales como hipoparatiroidismo, deficiencia de
vitamina D, malnutricin o malabsorcin. Una disminucin de los niveles de albmina causa una
disminucin del calcio en suero.

- Las torundas, los guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del rea
de trabajo deben desecharse en la basura municipal. En caso de que estos materiales estn empapados
de sangre, depositarlos en la bolsa roja de RPBI.
- Los tubos que contengan mezclas reactivas, sangre y muestra biolgica se depositarn en los
86


En el cuaderno de prcticas se harn los clculos necesarios para obtener el resultado de cada analito
determinado; la discusin se basar en el anlisis de la influencia que tienen los electrolitos determinados
en el impacto del estudio del tejido seo principalmente, sin dejar de considerar que cada uno de ellos
tambin tienen otras funciones que pueden verse alteradas en caso de su aumento o disminucin.
Analizar las ventajas y desventajas de los mtodos de determinacin empleados, haciendo comentarios de
cmo afectaran la calidad en los resultados as como sugerencias para corregir los posibles errores en lo
que se incurri.
En las conclusiones debe considerarse si los objetivos planteados fueron alcanzados, si la prctica otorg
aprendizaje significativo y valor agregado a la formacin del estudiante.
8.8 Referencias
- Hristova, L.N, Henry, J.B. (2010).Intermediarios metablicos, iones inorgnicos y marcadores
bioqumicos del metabolismo del hueso. En Henry, J.B, Davey, F. Herman, C. McPherson, R.
Pincus, M. Threatte, G. Woods, G. Laboratorio en el diagnostico clnico. Marbn: Madrid
- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). Homeostasis hidroelectroltica y acido-base. En Tortora, G.
Derrickson, B. Principios de anatoma y fisiologa. Mdica Panamericana: Mxico, D.F
- Viana, L. Burgos, M.G.P, Silva, R. (2012). Refeeding sndrome: clinical and nutritional relevance.
ABCD. Arquivos Brasileiros de Cirugia Digestiva. 25(1), 56 59.
- Gattineni, J. Baum, M. (2012). Genetic disorders of phosphate regulation. Pediatric Nephrology.
27(9): 1477 1487. DOI: 10.1007/s00467-012-2103-2
PRCTICA No 9
DETERMINACION DE HORMONAS
87
G. Leticia Arellano M.
9.1 Introduccin
El sistema endocrino comprende parte del sistema de comunicacin intra y extracelular encargado
de controlar la reproduccin, diferenciacin sexual, crecimiento, desarrollo, regulacin del metabolismo y
aporte de nutrimentos en un individuo. Este sistema funciona a base de una serie de glndulas
encargadas de elaborar un grupo de mensajeros qumicos llamados hormonas, que interactan con
receptores especficos en sus clulas blanco. Aunque no existe relacin anatmica entre las diversas
glndulas endocrinas, existen ciertas relaciones hormonales de interdependencia, por lo que se habla de
ejes hormonales (Kaplan, 2003).
En general la secrecin de una hormona depende de su concentracin o de la concentracin de
algn producto de su accin, en plasma o en el lquido extracelular, es decir, son reguladas por
retroalimentacin. La secrecin hormonal no tiene lugar de forma continua y uniforme, sino pulstil, con
perodos de secrecin (pulsos) y otros de reposo. Las caractersticas de los pulsos pueden variar a lo largo
del da o en diversas circunstancias fisiolgicas o patolgicas. Cuando la secrecin vara ostensiblemente
a lo largo del da se habla del ritmo circadiano (Henry, 2001).
Las anormalidades en la secrecin hormonal son generalmente definidas en trminos de los niveles
sricos de las mismas (aumento o disminucin), o en la demostracin de alteracin directamente en la
glndula en la que se producen. Excesiva cantidad de hormona pude ser secretada por tumores, que la
retroalimentacin no funcione, ingestin deliberada o por indicacin teraputica. En tanto que la
disminucin puede resultar de la carencia en su sntesis o dao en la glndula que la produce (Kaplan,
2003).
Una complicacin en el estudio de la secrecin hormonal es que no se debe exclusivamente al
dao de la glndula productora, sino que como existen ejes de regulacin, el dao en alguna parte del eje
tendr como consecuencia que se daen los de otra. Es por ello generalmente se evalan en perfiles o
conjunto de hormonas que regulan una determinada funcin (Henry, 2001).
El progreso de la endocrinologa ha ido ligado al desarrollo de ensayos que permiten medir las
hormonas. La endocrinologa clnica est limitada a la medicin de la concentracin de las hormonas en
suero u otros fluidos tales como la orina o saliva. En los laboratorios clnicos se tiene acceso a una amplia
variedad de ensayos con diferentes grados de sensibilidad y especificidad que ayudan a interpretar la
severidad del dao, la mayora de estos son inmunoensayos, entre los que se encuentran: el
radioinmunoanlisis (RIA), el anlisis inmunorradiomtrico (IRMA), el inmunoensayo ligado a enzimas
(ELISA), la quimioluminiscencia (QLM) y el fluoroinmunoanlisis incrementado por la disociacin de
lantnidos (DELFIA) (Kaplan, 2003).
88
Para la interpretacin de los ensayos deben ser considerados los siguientes factores: el estado
clnico del paciente, la concentracin de la variable regulada por la hormona, la concentracin de otras
hormonas que participen en el mecanismo de retroalimentacin, la naturaleza pulstil de la secrecin
hormonal (anotar la hora del da a la cual se toma la muestra), el estado de estrs del paciente, as como
la naturaleza qumica de la hormona y su vida media, ya que todos estos factores pueden afectar los
niveles de hormonas (Henry, 2001).
9.2 Actividades complementarias a la prctica

Esquematizar las glndulas que forman parte del sistema endocrino, indicando las hormonas
producidas por cada una de ellas.
Investigar cul es la naturaleza qumica de las hormonas, mencionando un ejemplo de cada una.
Describir un ejemplo de la respuesta que una hormona puede desencadenar cuando se une a su
receptor en la clula blanco.
9.3 Objetivos
Conocer la importancia clnica de la determinacin de hormonas a travs de la exposicin de los
mtodos empleados en la cuantificacin de las mismas, as como describir sus fundamentos para
poder aplicarlos en el diagnstico de patologas que involucren alteraciones en la secrecin hormonal.
Comprender la importancia de la determinacin de hormonas, por medio de la exposicin y discusin
de algunos casos clnicos, en los que se apliquen las metodologas expuestas, para resaltar su
importancia en el diagnstico, seguimiento y tratamiento de alteraciones hormonales.

Video proyector
9.5 Metodologa
9.5.1 Exposiciones por parte de los alumnos
Asignar a cada equipo de trabajo, un tema para exposicin. Este puede ser un mtodo para
cuantificacin de hormonas o un caso clnico.
El equipo realizar una bsqueda en medios impresos o electrnicos.
En base a la informacin obtenida y con la asesora del profesor, realizara una presentacin, para
exponerla ante el grupo.
Los puntos que deber contener la presentacin se indican en la siguiente tabla:
89
Mtodo de cuantificacin Caso clnico

Nombre de la Tcnica. Titulo del caso.
Fundamento: indicar reacciones qumicas Introduccin.
necesarias. Cuadro clnico del (los)
Muestra(s) biolgica(s) que se puede(n) paciente(s).
emplear. Metodologa: describir pasos,
Indicaciones al paciente. hacer diagrama de flujo, utilizar los
Ejemplo de metodologa: describir pasos, esquemas necesarios. Resaltar
hacer diagrama de flujo, utilizar los tcnicas de cuantificacin.
esquemas necesarios. Resultados.
Sensibilidad y especificidad. Discusin.
Unidades de reporte. Conclusiones.
Ejemplos de hormonas que se cuantifiquen Referecias.
por ese mtodo.
Costos.
Referencias.
Al trmino de cada exposicin, los alumnos deben responder las dudas que se hayan generado de
parte de los alumnos y de los profesores del grupo, a fin de complementar y resaltar los puntos
importantes de la exposicin.
90
Por tratarse de exposiciones orales, no se generan residuos peligrosos. Los residuos que se pudieran
generar, se depositaran en la basura municipal.

No se entregar reporte para esta prctica.
9.8 Referencias
- Henry, J. B. (2001) Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 20th. W.B.
Saunders Co: U.S.A.
- Kaplan, Lawrence A., Pesce, Amadeo J., Kazmierczak, Steven C. (2003). Clinical Chemistry. 4th
Mosby: USA.
PRCTICA No 10.
CUANTIFICACIN DE GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA
Gloria L. Arellano M.
10.1 Introduccin
La gonadotrofina corinica humana (hCG), es sintetizada principalmente por el trofoblasto placentario, por
ello ha sido considerada la hormona del embarazo, sin embargo es tambin producida por la hipfisis de
hombres y mujeres sanos, as como por algunos tumores (carcinoma testicular u ovrico). Su funcin en el
embarazo normal es mantener la esteroideogensis del cuerpo lteo hasta el momento en que la placenta
alcance el desarrollo adecuado para realizar esta funcin. (Saavedra, MS. et al. 2004)
La hGC es una glicoprotena con un peso molecular de 36.7 kDa y est formada por dos subunidades,
una cadena y una cadena , unidas por un puente disulfuro. La cadena es codificada por un solo gen y
es similar a la cadena de otras hormonas como la hormona luteinizante (LH), la hormona estimulante del
91
folculo (FSH) y la tirotrofina hipofisaria (TSH); en tanto que, la cadena , es codificada por sies genes y
es diferente a la cadena de las otras hormonas, lo que le confiere la especificidad.
Una vez sintetizada la hormnoa, esta sufre una serie de transformaciones, entre las que se encuentran,
reareglos moleculares, cortes y diferentes grados de glicosilacin, que dan lugar a variantes de la misma,
por lo que se puede localizar a la molcula completa, o bien fragmentos de ella. Tambin se puede
encontrar variacin en el porcentaje de glicosilalcin, lo que modifica su actividad biolgica, vida media y
aclaramiento. (Saavedra, MS. et al. 2004)
Es importante considerar esta variabilidad en la hormona, cuando se desea cuantificar con fines
diagnsticos. La cuantificacin de hGC se emplea para el diagnstico de embarazos intra y extrauterinos,
prediccin de aborto espontneo, diagnstico y seguimiento de tumores y bsqueda de algunas
alteraciones cromosmicas como el sndrome de Down.
La medicin de hGC se realiza cualitativa o cuantitativamente por mtodos inmunolgicos. Entre las
tcnicas que se emplean en su determinacin se encuentran inhibicin de la hemaglutinacin, RIA,
inmunoenzayo cromatogrfico, quimioluminiscente o fluorimtrico. La especificidad de estos ensayos, es
dada por el tipo de anticuerpos que se empleen en su determinacin. Debido a la variabilidad en las
formas de hGC, se recomienda el uso de anticuerpos monoclonales.

- Describir las diferentes molculas de hCG que se pueden encontrar en sangre y orina.
- Realizar una tabla indicando los niveles de hCG durante las diferentes etapas del embarazo.
10.3 Objetivos
- Realizar la cuantificacin de hCG empleando un reactivo comercial, con el fin de aplicar una de las
tcnicas para cuantificacin de hormonas y comprender la importancia de la toma de muestra, los
cuidados en la determinacin e interpretacin de resultados.
10.4.1 Material biolgico.

Orina de 24 horas.
Nota: Las muestras de orina debern enfriarse y centrifugarse para eliminar material insoluble.
92
10.4.2 Material por equipo

- 1 gradilla para tubos de ensaye 12x75 mm
- 20 tubos de ensaye 12x75 mm
- 1 pipeta Pasteur con bulbo
10.4.3 Material por grupo

- 1 Micropipeta (10 - 200 L) - Puntas amarillas para micropipeta
- 1 Micropipeta (200 - 1000 L)
- Puntas azules para micropipeta.
10.4.4 Reactivos
- Kit para cuantificacin de hCG
- 250 mL de NaCl al 0.85% (SSF)
10.5.1 Fundamento
Cuando los eritrocitos sensibilizados con hCG (hCG adsorbida en la membrana del eritrocito) se ponen en
contacto con anticuerpos monoclonales anti-fraccin beta de hCG, reaccionan formando un patrn de
aglutinacin, que se manifiesta como un botn en el fondo del tubo (reaccin negativa). La presencia
simultnea de hCG libre, en la muestra de suero u orina, boquea la unin de los anticuerpos anti-hCG con
los eritrocitos sensibilizados (inhibe la hemaglutinacin), permitiendo la sedimentacin de los eritrocitos en
forma anular (reaccin positiva).
10.5.2 Preparacin de la muestra biolgica

- En el caso de la muestra de orina, enfriar la muestra (4-8C) durante 2 horas, para precipitar material
insoluble y centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos. Trabajar con el sobrenadante.
10.5.2 Tcnica
Numerar del 1- 8, 16 tubos de ensaye 12x75mm (por duplicado).
- Preparar 8 diluciones dobles de la muestra de orina, como se indica en la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Dilucin 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
SSF
93
- Mezclar perfectamente cada uno de los tubos.

- Colocar en la otra serie de tubos numerados, 0.1 mL de la dilucin correspondiente.
- Adicionar a cada uno de los tubos, 0.1 mL de la solucin de anticuerpos anti-hCG y mezclar
perfectamente.
- Agregar 0.05 mL de eritrocitos sensibilizados con hCG (eritrocitos-hCG).
- Mezclar perfectamente para homogenizar.
- Colocar la gradilla en un lugar exento de vibraciones calor excesivo.
- Esperar 6 minutos y registrar los resultados positivos.
- Los resultados negativos debern verificarse al cabo de 90-120 minutos.
10.5.3 Interpretacin de resultados
Considerar como dilucin final aquella que se encuentra entre la que inhibe la aglutinacin formando un
anillo y la que no inhibe, dando un patrn homogneo en el fondo del tubo. Dilucin final 1:48.
94
En este caso, considerar como dilucin final al tubo en el que se form el anillo con mayor dimetro, ya
que se encuentra entre la que inhibe totalmente la aglutinacin y la que no inhibe, dando un patrn
homogneo en el fondo del tubo. Dilucin final 1:64.
10.5.4 Clculos
hCG = Inverso de la dilucin final x sensibilidad del reactivo (U/mL) x volumen orina/ 24 hrs.
= UI/24 horas.
10.6 Disposicin de residuos.

- Las muestras de orina deben depositarse en el sanitario.
- Las torundas, guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del rea de
trabajo deben desecharse en la basura municipal.
- Los tubos que contengan mezclas reactivas: muestra biolgica + reactivos, as como las puntas de la
micropipeta, se depositarn en los contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin.

En el cuaderno de prcticas debern anotarse los datos para calcular la concentracin de hCG en la
muestra.
Analizar: cuidados en la determinacin, dificultades en la lectura y especificidad en relacin a otras
tcnicas de cuantificacin.
10.8 Referencias
Saavedra, M.S.; Filguerira, E.E.; Pessacq, M.T. et al. (2004). Formas moleculares de gonadotrofina
corinica humana (hCG). Impacto en su medicin. RAEM. 41(1):27-45.
Instructivo para cuantificacin de hCG por inhibicin de la hemoaglutinacin. Lafon.
95
Anexo A
Mtodo para la obtencin de sangre venosa por sistema de tubo al vaco
A.1 Lavarse correctamente las manos con jabn lquido (preferentemente) y agua.
A.2 Seleccionar e identificar la vena para realizar la puncin:
A.2.1 Vena media baslica
A.2.2 Vena ceflica
A.3 Enroscar la aguja al adaptador del sistema al vaco.
A.4 Preparar el tubo indicado para cada caso:
A.4.1 Tubo con tapn rojo o tapn dorado: Sangre coagulada para obtencin de suero
A.4.2 Tubo con tapn lila: Sangre entera anticoagulada con EDTA
A.5 Ligar el brazo a 5 cm aproximadamente del lugar de puncin.
A.6 Realizar asepsia con una torunda impregnada con alcohol.
A.7 Introducir la aguja de puncin en la vena con una inclinacin de 30 C aproximadamente.
A.8 Colocar el tubo, verificar que la sangre comienza a salir y retirar la ligadura.
A.9 Dejar llenar el tubo y retirarlo, sosteniendo con firmeza el adaptador.
A.10 Retirar la aguja y presionar con una torunda impregnada con alcohol el sitio de la puncin.
A.11 En caso de que el tubo sea para la obtencin de sangre anticoagulada (tapn lila), invertirlo
suavemente 15 veces, para homogenizarla con el anticoagulante.
A.12 Si se trata del tubo de tapn rojo o dorado, debe colocarse durante 10 minutos en bao de agua a 37
C para coagular la muestra; posteriormente se le quita el tapn cubrindose con papel parafilm y se
centrifuga a 2500 rpm/10 min para separar el suero.
A.13 Disponer los residuos generados de la siguiente forma
A.13.1 Depositar la aguja de puncin en el contenedor rojo rgido
A.13.2 Depositar las torundas con alcohol y los tapones de la aguja en el bote de basura municipal.
96
Anexo B
Indicaciones bsicas para realizar las determinaciones colorimtricas
B.1 Rotular tres tubos de ensayo, cada uno como blanco, estndar y muestra con un marcador de tinta
indeleble, no se recomienda utilizar cinta adhesiva tipo masking tape ya que en el momento de la
incubacin puede desprenderse del tubo y ocasionar confusin.
B.2 El tubo marcado como blanco lo realizar el primer equipo que lea en el espectrofotmetro y el tubo
marcado como estndar ser preparado por tres personas del grupo.
B.3 Los tubos se preparan e incuban de acuerdo a la tabla que viene en el manual de uso (inserto) del
reactivo con que se cuente en el momento de la prctica, siguiendo el orden y las cantidades que se
indiquen. Esto se debe a que la forma de preparar los tubos puede cambiar de acuerdo a la marca del
reactivo.
B.4 Ajustar el espectrofotmetro a la longitud de onda indicada en el fundamento y llevar a cero de
absorbancia con el tubo blanco.
B.5 Leer la absorbancia de los 2 tubos restantes (estndar y problema) y realizar el clculo
correspondiente, de acuerdo a la siguiente frmula.
(. )( )
=
.
La concentracin del estndar se proporcionar en el momento de la realizacin de la prctica pues

depende de la determinacin a realizar y la marca del reactivo que se vaya a utilizar.
97

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Manual de Prcticas de Laboratorio de

VINCULACIN DE LAS PRCTICAS DE LABORATORIO CON EL CONTENIDO DEL

Unidad (nmero y Prctica con la que se Contenido que permite la vinculacin

4. Estudio de los 5. Diferenciacin de En la teora se explica la funcin de los lquidos

OBJETIVO DEL MANUAL

INTRODUCCIN DEL MANUAL

El Laboratorio Clnico es el establecimiento pblico, social y privado, legalmente establecido,

1.2 Actividades previas a la prctica

1.4 Materiales, equipos y reactivos

Material por grupo

1.5 Procedimiento experimental

1.5.2 Preparacin del suero control en el laboratorio

1.5.3 Elaboracin de la carta control experimental (grfico de Levey-Jennings)

Elaboracin de la carta control terica

Carta control de ___analito___ Mes _______________ nivel del control __________

Evaluacin de la carta control mediante las Multirreglas Westgard

Parmetros de la evaluacin externa de la calidad

- Calcular el porcentaje de puntuacin del ndice de varianza utilizando la siguiente frmula

Tabla 1.1 Intervalos de las puntuaciones de los ndices de varianza

PIV Color Calidad

1.6 Disposicin de residuos

1.7 Orientaciones para la elaboracin del reporte

OBTENCIN DE VALORES DE REFERENCIA

exclusin de los individuos, el procedimiento de recoleccin idneo de la muestra, el sitio de puncin ms

2.2 Actividades previas a la prctica

2.4 Materiales, equipos y reactivos

Material por equipo

Material por grupo

2.5 Procedimiento experimental

2.5.3 Seleccin de la poblacin de referencia

Asimismo es importante definir la necesidad de establecer los criterios de participacin, en caso de

- Adems de lo anterior, deben considerarse las caractersticas de la muestra; es necesario darle a

2.5.5 Descripcin de la muestra de referencia

Coeficiente de sesgo basado en el coeficiente de Person

donde X es el promedio, Md es la mediana y S es la desviacin estndar. El coeficiente de Pearson vara

Coeficiente de curtosis basado en la medida de Fischer

Donde Xi es cada uno de los valores, X es la media aritmtica, n es el nmero de datos y 4 es el

2.5.6 Clculo de valores de referencia: mtodo 2S

2.5.7 Clculo de valores de referencia: mtodo de percentiles 2.5 y 97.5

2.6 Disposicin de residuos

2.7 Orientaciones para la elaboracin del reporte

El semen es una combinacin de espermatozoides suspendidos en las secreciones del testculo y

3.2 Actividades previas a la prctica

3.4 Materiales, equipos y reactivos

3.5 Procedimiento experimental

3.5.2 Aspecto y color

3.5.7 Agregacin y aglutinacin

asimismo permitir determinar la dilucin requerida para el recuento. Es recomendable realizar la

Significado clnico. La adherencia de espermatozoides inmviles a otros o de espermatozoides mviles a

Figura 3.1 Grados de aglutinacin

Inmvil (IM, immotility): ningn tipo de movimiento

Tcnica del choque hipoosmtico

Tcnica de la exclusin del colorante eosina-nigrosina

3.5.10 Recuento de espermatozoides: mtodo de la cmara de Neubauer

Figura 3.4 Posicin de los cuadros primarios para el conteo de

Significado clnico. El porcentaje de formas normales va de 3 a 48%. Las infecciones de transmisin

Tcnica de la tincin de Papanicolau

Etanol al 50% 30 segundos

3.5.12 ndices de defectos mltiples

B = nmero de espermatozoides con anormalidades de pieza intermedia

3.6 Disposicin de residuos

Carta control de _analito_ Mes _____ nivel del control