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SaBios-Rev. Sade e Biol., v. 2, n. 1 p. 29-31.

PRINCIPAIS TCNICAS MOLECULARES PARA DETECO


DO PAPILOMAVRUS HUMANO
Emily Francini Silva Do Carmo1; Adriana Fiorini1

RESUMO
Existe atualmente grande preocupao com a melhoria no diagnstico da infeco pelo Papilomavrus Humano (HPV), pois
este vrus tem sido responsvel pela principal doena sexualmente transmissvel de etiologia viral e apresenta correlao com
os processos malignos e leses precursoras em crvice uterina. Neste trabalho so apresentadas as principais tcnicas de
deteco molecular para o diagnstico do HPV atualmente disponveis, como a PCR (Reao em Cadeia da Polimerase), a
Captura Hbrida e a Hibridizao In Situ, com maior nfase na PCR. tambm discutida a sensibilidade das tcnicas
moleculares como PCR e PCR em Tempo Real para deteco destes vrus nos tecidos epiteliais antes mesmo do
aparecimento de leses ou sintomas. Com este trabalho foi possvel verificar que a tcnica de PCR, em relao aos demais
testes disponveis, tem uma maior sensibilidade, sendo capaz de detectar uma reduzida quantidade de amostras e tambm
permitir a verificao de infeces por mltiplos subtipos, bem como avaliar o risco oncognico da populao viral infectante.
Palavras-chave: HPV; Neoplasia; PCR; PCR em Tempo Real

PRINCIPAL MOLECULAR THECNIQUES FOR DETECTING HUMAN PAPILLOMAVIRUS

ABSTRACT
Nowadays, there is a great concern with the development of HPV (Human Papillomavirus) virus infection diagnosis. HPV virus
has been responsible for main sexually transmissible diseases of viral etiology and shows correlation with malignant processes
and precursory lesions in uterine cervix. This research shows the main actually available techniques of molecular detection for
HPV diagnosis, as PCR (Polymerase Chain Reaction), Hybrid Capture and In Situ Hibridization, giving emphasis to PCR. It also
discusses about the sensibility of molecular assays as PCR and Real Time PCR for HPV detection in epithelial tissues before
the occurrence of lesions or symptoms. This study has shown that PCR technique, when compared to other available detection
tests, has superior sensibility. This technique is also able to detect a reduced amount of samples and it allows the verification of
infections by multiple virus subtypes, as well as the evaluation of oncogenic risk of viral infecting population.
Key words: HPV; Neoplasm; PCR; Real Time PCR.

freqentemente associada a carcinomas


INTRODUO escamosos genitais de outros locais,
principalmente o cervical (3,4). Estes tumores
O Papilomavrus Humano (HPV), um ocorrem com maior freqncia em mulheres
vrus da famlia Papovaviridae, possui DNA com idade inferior a 65 anos. Existem
circular, infecta o epitlio escamoso do trato evidncias de que dois tipos histolgicos
genital, anal e perianal, mucosa da laringe, distintos de carcinomas escamosos,
entre outros tecidos. Este vrus apresenta denominados verrucides e basalides esto
mais de 100 gentipos (1), dos quais grande presentes preferencialmente neste grupo de
parte est relacionada a processos malignos e carcinomas vulvares (3). Dados obtidos
leses precursoras em crvice uterinas (2). O durante os ltimos 20 anos confirmam a
HPV associado a um subgrupo de hiptese de que o carcinoma escamoso da
carcinoma vulvar e atua por meio do vulva origina-se a partir de pelo menos duas
desenvolvimento de uma leso precursora, a vias patogenticas. Uma consiste em fatores
neoplasia intra-epitelial vulvar (NIV) (3). imunolgicos, idade e consumo de cigarros e
a outra a infeco pelo papilomavrus humano,
Estudos baseados em dados originando uma leso precursora do
epidemiolgicos, clnicos, histopatolgicos e carcinoma escamoso vulvar, a qual, em uma
moleculares indicam a existncia de uma proporo de mulheres, progride para
categoria de carcinoma escamoso vulvar que carcinoma invasivo. Considerando-se dados
est relacionado doena sexualmente morfolgicos e clnicos, aproximadamente
transmissvel, oncognica, causada pelo HPV. 30% de carcinomas vulvares esto associados
Esta classe de tumores vulvares est com HPV e formas clssicas de NIV (3,4).

1- CESUMAR Centro Universitrio de Maring


26 Emily Francini Silva Do Carmo, Adriana Fiorini

Com incidncia mundial de cerca de Papilomavrus associados a cncer,


meio milho de casos por ano como o HPV 16, no progridem de maneira
principalmente em pases em desenvolvimento regular em direo ao processo de maturao
o cncer cervical permanece como um dos viral, acumulando-se no epitlio infectado.
mais importantes e danosos cnceres da Aceita-se que a expresso desregulada de
mulher (2,5). Acredita-se que a infeco viral oncogenes virais, especificamente E6 e E7,
mais frequentemente transmitida por via ocorra na populao celular em replicao
sexual seja aquela provocada pelo HPV (2). (clulas parabasais) e altere irreversivelmente
suas caractersticas de crescimento. As
Estudos demonstram que o HPV pode protenas E6 e E7 do HPV interagem com
ser dividido em 18 tipos, 5 de baixo risco (tipos protenas reguladoras do ciclo celular, como o
6, 11, 42, 43, 44) e 13 de alto risco (tipos 16, p53 e a protena do retinoblastoma (pRb)
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) (3,4).
sendo que mulheres portadoras do tipos 16 e
18 apresentam significativo risco de
desenvolverem processo maligno em crvice O estado fsico do HPV est
uterina quando comparadas a infeco por diretamente relacionado com o tipo de leso
outros agentes virais (1,3,6-10). A International celular. Em leses malignas ocorre a
Agency for Research on Cancer (IARC) e a integrao estvel entre o DNA do HPV com o
Organizao Mundial de Sade (OMS) genoma da clula hospedeira, ao contrrio das
consideram os gentipos 16 e 18 do HPV leses benignas, onde no ocorre esta
como os agentes etiolgicos do carcinoma integrao, pois o vrus encontra-se na forma
escamoso do colo uterino (11). O HPV 16 epissomal. Diferente da integrao do DNA
ocorre em aproximadamente 80% dos tumores viral no genoma do hospedeiro, que
HPV positivos (3). aparentemente ao acaso a integrao do
genoma viral no DNA da clula carcinomatosa
importante salientar que a infeco hospedeira ocorre sempre entre E1 e E2,
pelo HPV pode manifestar-se de trs formas resultando na perda ou alterao de E2,
distintas: clnica (leses verrucosas, sendo o enquanto outras regies do genoma viral
exame clnico capaz de fazer o diagnstico); permanecem intactas. O produto do gene E2
subclnica (suspeitada por alterao na uma protena ligante de DNA que tem um
citologia, colposcopia ou no resultado papel indireto na transformao, por meio da
histopatolgico de uma bipsia) e a forma regulao da transcrio do promotor de
latente que corresponde identificao do E6/E7 dos HPV 16 e 18. Assim, a integrao e
vrus pela biologia molecular na ausncia de a perda da funo de E2 resultam na
alteraes morfolgicas (11). produo excessiva das protenas E6 e E7. A
protena E1 possui atividade helicase, a qual
O ciclo viral est associado ao influencia positivamente a replicao de DNA.
programa de diferenciao da clula epitelial Conseqentemente, a perda funcional de
hospedeira. O papilomavrus humano infecta ambos os genes pode contribuir para a perda
as clulas basais do epitlio por meio de da funo viral normal e para o
leses presentes na mucosa escamosa. Uma desenvolvimento de imortalizao da clula
vez nas clulas, a expresso do vrus hospedeira (3,9).
controlada e a replicao inicia-se em funo
da maturao epitelial. Este processo Atualmente existe grande preocupao
associado com a expresso de genes em torno do aperfeioamento dos mtodos de
estruturais tardios e a produo de capsdeos deteco citopatolgicos do HPV, por isso a
virais e/ou protenas tardias (L1 e L2), na introduo de novos critrios de diagnsticos
superfcie epitelial. O fato das clulas mais sensveis e especficos, tais como os
superficiais sofrerem a diferenciao impede a moleculares, se faz necessrio (6). Devido aos
transformao neoplsica. Alm disso, as resultados rpidos e precisos das tcnicas de
influncias regulatrias de algumas unidades biologia molecular, provvel que os
de traduo do HPV (E1 e E2), no contexto do laboratrios citopatolgicos tendem a utilizar
ciclo viral normal, podem impedir a estas tcnicas como rotina de trabalho e
transformao neoplsica nas clulas em tambm para a confirmao do diagnstico
replicao (1,3,4). por outras tcnicas.

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Deteco Molecular do HPV

O diagnstico da doena cervical, Neste trabalho ser dado maior enfoque


determinada pela presena de clulas na deteco molecular do HPV por PCR, por
epiteliais cervicais anormais, normalmente ter sido atualmente considerada a tcnica de
realizado atravs do exame de Papanicolau. maior sensilbilidade.
Este mtodo considerado muito importante
desde os anos 50, porm pode causar alguns
problemas como deteco limitada dos
precursores do cncer e subjetiva Captura Hbrida
interpretao dos resultados (12). Assim,
durante as duas ltimas dcadas foram O teste por captura hbrida designado
estudados mtodos adicionais que poderiam para detectar 18 tipos de HPV divididos em
melhorar o diagnstico da doena cervical grupos de alto risco (tipos 16, 18, 31, 33, 35,
(13). 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68) e baixo risco
(tipos 6, 11, 42, 43 e 44), (10,15). Este mtodo
A partir do desenvolvimento de tcnicas baseado no uso de microplaca e soluo
de biologia molecular torna-se possvel hibridizadora que contm anticorpos
identificar, com maior sensibilidade, a monoclonais para captura com amplificao
presena do DNA do HPV em grande de sinal, sendo que a presena do vrus
proporo de leses pr-invasivas e cncer detectada pela quimioluminescncia (6,11,16-
cervical. Considerando a participao feminina 18). O material contendo DNA hibridiza-se
em nossa sociedade e economia, plausvel o com o coquetel de sonda especfico de RNA-
estudo que vise poupar essa parcela HPV, assim ocorre a formao de hbridos
significativa da populao de incmodos que RNA/DNA, que so capturados sobre a
podem ser at letais. superfcie da microplaca sensibilizada com
anticorpos especficos para os hbridos
Nesta reviso discutida a RNA/DNA. Os Hbridos imobilizados reagem
sensibilidade das tcnicas moleculares como com a fosfatase alcalina conjugada com
PCR e PCR em Tempo Real, para deteco anticorpos especficos para hbridos RNA/DNA
destes vrus nos tecidos epiteliais antes e so detectados por quimioluminescncia
mesmo do aparecimento de leses ou ultra-sensvel (16). Os valores lidos por um
sintomas, tornando possvel o diagnstico quimioluminmetro so transmitidos a um
precoce. computador, dotado de software especfico,
que analisa os nmeros recebidos e faz os
clculos de validao do ensaio e a
quantificao dos controles positivos,
MTODOS negativos e amostras. Os testes de captura
MOLECULARES PARA A hbrida so ao mesmo tempo qualitativos e
quantitativos (6,11,16-18).
DETECO DO HPV
Desenvolvido para prover estimativas
quantitativas de carga viral, o ensaio de
captura hbrida um mtodo seguro, preciso e
Durante os ltimos 15 anos o reprodutvel para o teste de HPV (12).
diagnstico de agentes infecciosos inclui o uso
de tecnologias que envolvem os cidos
nuclicos. So vrias as tecnologias utilizadas
para a deteco do HPV, as quais incluem os Hibridizao in situ
imunoensaios e os testes moleculares. As
tcnicas moleculares promovem contribuio uma tcnica baseada na deteco de
para o diagnstico de patologias substituindo pequenos segmentos de DNA ou RNA em
os mtodos indiretos de deteco (pesquisa cortes de tecido ou preparados citolgicos,
de anticorpos especficos) ou diretos como o utilizando-se uma seqncia complementar de
cultivo e isolamento de microorganismos, (que cidos nuclicos marcados com sondas. Sob
apresentam baixa sensibilidade e longos condies apropriadas, ocorre a hibridizao
perodos para sua proliferao in vitro) (14). (atravs do estabelecimento de pontes de
Neste tpico sero abordados os mtodos hidrognio) da sonda com a seqncia-alvo do
moleculares mais utilizados para a deteco DNA viral, que pode ser visualizada atravs de
do HPV, como a captura hbrida, a marcadores fluorescentes ou radioativos, que
hibridizao in situ e a PCR. so ligados s sondas permitindo a deteco e

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localizao de seqncias de cidos nuclicos cito-histopatolgicos e colposcpicos (14).


do HPV em material citolgico e histolgico Atualmente existem vrias modificaes da
(19). A hibridizao in situ com sondas tcnica de PCR convencional, sendo as
marcadas com fluorescentes, FISH principais a PCR em Tempo Real ou Q-PCR
(Fluorescence In Situ Hibridization) o mtodo (PCR quantitativa), RT-PCR (PCR por
de hibridizao in situ mais utilizado Transcrio Reversa, para se amplificar
atualmente, por no utilizar marcao amostras de RNA) e a PCR Multiplex, a qual
radioativa. pode ser aplicada para a amplificao de
vrios loci em uma mesma reao.

Para a deteco de HPV, a Q-PCR


Reao em Cadeia da Polimerase promove uma anlise qualitativa e quantitativa,
(PCR) o que permite a estimativa da carga viral de
uma amostra biolgica. Esta tcnica difere da
As tcnicas de biologia molecular e a PCR convencional por utilizar sondas
engenharia gentica progrediram muito nas marcadas com fluorforos que emitem uma
ltimas dcadas, em especial a partir da fluorescncia durante as amplificaes, e o
dcada de 60, quando o DNA teve a sua sinal detectado por um laser do
estrutura descrita (20). Em 1985, Kary Mullis termociclador. O resultado pode ser
(20) desenvolveu a estratgia para se visualizado em uma tela de computador. As
amplificar um alvo genmico mediante a sondas mais utilizadas so TaqMan,
replicao do DNA in vitro. Esta tcnica, Molecular Beacons e o corante intercalante
denominada PCR, executada inteiramente in SYBR Green (20, 23).
vitro sem o uso de clulas, possibilitando a
sntese de fragmentos de DNA, usando a A PCR convencional pode ser
enzima Taq DNA polimerase. Quando um par considerada o mtodo mais sensvel
de oligonucleotdeos (iniciadores) se liga ao disponvel, mas possui algumas limitaes,
DNA alvo, a enzima Taq DNA polimerase assim, como a Captura Hbrida, no possvel
sintetiza uma seqncia complementar de quantificar de maneira significante a carga
DNA, a partir da extremidade 3 OH livre do viral. Devido a alta sensibilidade do mtodo de
primer. Os iniciadores definem a seqncia a PCR podem ocorrer resultados falso-positivos
ser replicada e o resultado obtido a ocasionados por contaminao do ambiente
amplificao de uma determinada seqncia de trabalho por DNA amplificado (24). Esta
de DNA com bilhes de cpias (20). restrio pode ser evitada com o uso da Q-
PCR (23,25). A Q-PCR realiza a quantificao
O ensaio da PCR uma tcnica dos cidos nuclicos de maneira precisa e
utilizada em testes clnicos para deteco de com maior reprodutibilidade. Possibilita maior
alteraes genticas ou infeces por facilidade na quantificao, possui maior
diferentes agentes etiolgicos (21), podendo sensibilidade, preciso, reprodutibilidade, e
ser considerada a mais sensvel na maior velocidade na anlise (20). A liberao
identificao do DNA do HPV nos mais de fluorescncia a cada ciclo de amplificao
diferentes materiais clnicos. A deteco por diretamente proporcional a quantidade de
PCR pode ser qualitativa indicando a presena amplicon gerada, sendo considerado um
do microorganismo em questo ou mtodo preciso de avaliar a carga viral e
quantitativa, a qual pode avaliar a quantidade projetado para manter a contaminao a um
de material gentico em uma amostra mnimo (17).
biolgica. Os mtodos de diagnstico para a
infeco por HPV baseados em PCR tm a A sensibilidade e especificidade do
maior sensibilidade de deteco dos genomas mtodo PCR pode sofrer variaes
virais, quando comparados com outras dependendo dos primers, do tamanho de
metodologias (22). produto da PCR, desempenho da DNA
polimerase utilizada na reao e da
Por intermdio da PCR possvel quantidade de DNA do HPV amplificado (17).
detectar e identificar o material genmico dos
HPVs, o que permite saber se o vrus de alto Os produtos amplificados por PCR
ou baixo risco oncognico. Assim, o podem ser clivados com enzimas de restrio
diagnstico por PCR representa um e os fragmentos obtidos so comparados para
complemento importante aos diagnsticos identificao do subtipo viral, o que permite

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classificar seu grau de risco. Este mtodo A tabela 01 mostra duas seqncias de
apresenta vantagens em relao aos demais iniciadores que podem ser utilizados para se
testes disponveis, pois enquanto nos outros amplificar as seqncias especficas dos tipos
mtodos o poder de deteco de no mximo 16 e 18 do HPV.
uma partcula viral em cada 10 clulas
normais, a PCR capaz de detectar 1
partcula viral em cada 1000 clulas; a tcnica
permite, tambm, verificar infeces por
mltiplos tipos e avaliar o risco oncognico da
populao viral infectante (26).
Tabela 01. Seqncias de iniciadores relacionados aos tipos 16 e 18
Deve-se ressaltar o fato de que todos os do HPV
conjuntos de diagnstico apresentam
caractersticas intrnsecas que podem
conduzir a resultados falsos. A sensibilidade
do teste e outras causas de ordem tcnica so Tipos de HPV Iniciadores Posio de ligao ao
apontadas como fatores que contribuem para
o aparecimento de resultados falso-negativos, DNA
como: a troca da amostra, o uso de reagentes HPV 16 (23) Fwd 5-GGTCGGTGGACCGGTCGATG-3 389 a 408
fora do prazo de validade, a utilizao de
equipamentos desajustados, pipetagem Rev 5GCAATGTAGGTGTATCTCCA-3 465 a 484
incorreta e o transporte ou armazenamento
HPV 16 (7) Fwd 5-CGTAACCGAAATCGGTTGAA-3 31 a 50
inadequado das amostras ou dos kits.
Rev 5-TCCTGTGGGTCCTGAAAC-3 106 a 123
No entanto a anlise do DNA do HPV
por PCR tem um baixo valor falso-negativo HPV 18 (23) Fwd 5-CCTTGGACGTAAATTTTTGG-3 7004 a 7023
para predizer leses cervicais relacionadas Rev 5-CACGCACACGCTTGGCAGGT-3 7100 a 7119
com HPV. Em um estudo realizado por Zazove
et al. (28) pouqussimas mulheres com leses HPV 18 (7) Fwd 5-CGGGACCGAAAACGGTGTA-3 54 a 72
cervicais relacionadas com HPV em uma
Rev 5-CGTGTTGGATCCTCAAAGC-3 112 a 130
populao de baixo risco no foram
diagnosticadas pela tcnica de PCR,
indicando que existe uma razo muito baixa
de resultados falso-negativos.

GENOTIPAGEM DO HPV CONSIDERAES FINAIS


POR PCR
De acordo com vrios estudos,
Para a deteco do DNA do HPV so mulheres com infeco cervical por HPV
utilizados iniciadores consensos, MY09/MY11 podem desenvolver neoplasia, assim torna-se
(27): 5CGTCCMAARGGAWACTGATC3 e importante a precocidade diagnstica.
5GCMCAGAWCATA AYAATGG3
respectivamente, pois so capazes de Pesquisas realizadas em diferentes
identificar vrios tipos de HPV em uma nica condies mostram que todas as tcnicas
reao de PCR (29). Estes iniciadores moleculares citadas neste trabalho so
amplificam especificamente uma parte do importantes e eficientes no diagnstico do
gene L1, que a regio mais conservada do HPV, mas a PCR vem sendo considerada a
genoma dos diferentes tipos de HPV, tcnica com maior sensibilidade,
codificando uma protena do capsdio viral. especificidade e velocidade de anlise,
Estes iniciadores so capazes de amplificar podendo assim ser considerado mtodo
um fragmento de aproximadamente 450 pares molecular de escolha para o eficiente
de bases do gene L1, tornando possvel a diagnstico do HPV.
deteco da maioria dos tipos de HPV
(2,16,17,22,23,25).

SaBios-Rev. Sade e Biol., Campo Mouro, v. 2, n. 1, 2007.


http://www.revista.grupointegrado.br/sabios/
30 Emily Francini Silva Do Carmo, Adriana Fiorini

Recebido em 13/03/07
Revisado em 12/04/07
A ceito em 18/05/07

Adriana Fiorini 1

Endereo para correspondncia1:


Cesumar- Centro Universitrio de Maring- Av. Guedner,
1610; CEP: 870050-390; Maring-PR; Telefone: (44) 3027-
6360 ramal 138;
e-mail: emilyfrancini@hotmail.com
fiorini@cesumar.br

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