Você está na página 1de 190

Universidade de So Paulo

FFCLRP - Departamento de Fsica

MARINA RIBEIRO BATISTUTI

Classificao de fungos atravs da espectroscopia no


infravermelho por transformada de Fourier

Ribeiro Preto - SP
2012
MARINA RIBEIRO BATISTUTI

Classificao de fungos atravs da espectroscopia no


infravermelho por transformada de Fourier

Dissertao apresentada Faculdade de


Filosofia, Cincias e Letras de Ribeiro
Preto da Universidade de So Paulo, como
parte das exigncias para a obteno do
ttulo de Mestre em Cincias.

rea de Concentrao:
Fsica aplicada Medicina e Biologia.
Orientador:
Luciano Bachmann.

Verso corrigida
Verso original disponvel na FFCLRP-

Ribeiro Preto - SP
2012
ii

Autorizo a reproduo e divulgao total ou parcial deste trabalho, por qualquer


meio convencional ou eletrnico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a
fonte.

FICHA CATALOGRFICA

Batistuti, Marina Ribeiro


Classificao de fungos atravs da espectroscopia no
infravermelho por transformada de Fourier / Marina Ribeiro
Batistuti; orientador Luciano Bachmann. Ribeiro Preto - SP,
2012.
174 f.:il.

Dissertao (Mestrado - Programa de Ps-graduao em Fsica


aplicada Medicina e Biologia) - Faculdade de Filosofia, Cincias
e Letras de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo, 2012.

1. FTIR. 2. Espectroscopia. 3. Fungos. 4. Anlise


Multivariada.
Nome: Batistuti, Marina Ribeiro
Ttulo: Classificao de fungos atravs da espectroscopia no infravermelho por
transformada de Fourier

Dissertao apresentada Faculdade de Filosofia,


Cincias e Letras de Ribeiro Preto da
Universidade de So Paulo, como parte das
exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em
Cincias.

Aprovado em: / / .

Banca Examinadora

Prof. Dr. : Instituio:

Julgamento: Assinatura:

Prof. Dr. : Instituio:

Julgamento: Assinatura:

Prof. Dr. : Instituio:

Julgamento: Assinatura:
Agradecimentos

Aos meus pais Paschoal e Cristina pela educao, incentivo, apoio e amor
incondicional. Vocs foram e sempre sero a minha base, os que me ensinaram o
Caminho que devo andar. Obrigada Pai pela inspirao e direcionamento, mesmo
que sem essa inteno, na carreira docente. Obrigada por ser como pai e como
professor um exemplo para mim. Obrigada Me por tudo que voc representa para
mim, todo exemplo, todo consolo, todo carinho, toda pacincia e todo o amor.
Aos meus irmos Guilherme e Ncolas obrigada por todo companherismo,
toda amizade e todas as briguinhas aos finais de semana. Amo vocs!
Ao meu amor David por me acompanhar nessa caminhada, pela apoio,
compreenso e imensa pacincia em todos os momentos. Obrigada por me ouvir,
me entender e me dar nimo para continuar. Obrigada pela ajuda durante a escrita
e formatao deste trabalho, pois sua ajuda foi fundamental. Obrigada por todo
amor e carinho!
Ao Prof. Dr. Luciano Bachmann agradeo imensamente por ter me
aceito tanto como aluna de mestrado como ter me orientado durante todos os anos
de iniciao cientfica. Obrigada por todo conhecimento transmitido, por todas as
oportunidades oferecidas, pela constante pacincia, pelas crticas que me fizeram
crescer, pela confiana depositada que me fez ter responsabilidade pelo trabalho e
pelas decises tomadas. Obrigada pela amizade, pelos cafs e por todas conversas
que me fizeram crescer profissionalmente. voc, sempre serei grata e sei que
sempre poderei contar!
Aos alunos e professores do grupo de Fotobiofsica, muito obrigada! Em
especial, Leila pela sua amizade e parceria. Por toda pacincia e ajuda, por todos
conselhos e desabafos, por todo conhecimento dividido! Ao Fabrcio pela parceria
dia-a-dia, pela correes feitas nesse trabalho, pelas dicas e crticas, pela amizade e

iv
v

por sempre poder contar com sua ajuda! Ao Neto, meu irmo, por estar sempre
presente me alegrando. Obrigada por poder dividir com voc no s o conhecimento
cientfico, mas dia-a-dia todas as risadas, momentos de alegria e aflio.
Ao Prof. Dr. Gilberto bida Leite Braga, colaborador deste trabalho.
Agradeo por abrir as portas do seu laboratrio, por todo conhecimento e toda
ajuda. Agradeo em especial a Ludimila e a Gabi por toda pacincia e toda ajuda
nos experimentos. Agradeo ao Henrique, a Sandrinha e ao Guilherme por toda
amizade construda esses anos, todos os almoos e cafs juntos. Por todas risadas e
momentos de descontrao que dividi com vocs.
Aos funcionrios e tcnicos do Departamento de Fsica que sempre
estiveram presentes para sanar minhas dvidas e me ajudar, em especial secretria
Nilza M. L. Marino por sempre ser to solcita e paciente.
minha amiga-irm Paulinha por dividir comigo no s um apartamento,
mas todas as dvidas e crises da ps-graduao e fora dela tambm, por sempre
me ouvir e me aconselhar. Aos amigos mais chegados que irmos que
imerecidamente so tantos que nem posso citar, mas vocs sabem que so! Obrigada
pela amizade, pelos suporte, por todos os aniversrios e surpresas, todas as caronas,
todos os almoos de domingo juntos. Por tudo que aprendi e sempre aprenderei com
vocs. Por tornar essa caminhada mais leve e alegre!
Capes pela bolsa fornecida.
Louvo Deus pela vida de cada pessoa acima. Louvo Deus pela concluso
deste trabalho e de mais um sonho. Somente Ele toda honra, glria e louvor.
Resumo

BATISTUTI, M. R. Classificao de fungos atravs da espectroscopia no


infravermelho por transformada de Fourier. 2012. 174 f. Dissertao
(Mestrado - Programa de Ps-graduao em Fsica aplicada Medicina e Biologia)
- Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de Ribeiro Preto, Universidade de So
Paulo, Ribeiro Preto - SP, 2012.

A identificao de isolados dentro de algumas espcies de fungos filamentosos


so de interesse mdico, agrcola e industrial. Dentro do gnero Metarhizium, por
exemplo, a identificao de espcies vm sendo constantemente modificada devido
a anlise gentica. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas estratgias para
a identificao rpida e confivel de microrganismos de maneira geral, e de fungos
especificamente, desejvel. A espectroscopia no infravermelho por transformada de
Fourier (FTIR) tornou-se amplamente difundida na medicina e biologia por fornecer
rapidamente informaes capazes de caracterizar bioquimicamente uma amostra.
Assim, o objetivo desta pesquisa foi utilizar a espectroscopia de FTIR para a
caracterizao e classificao de linhagens e de espcies dos gneros Aspergillus e
Metarhizium, alm da comparao entre diferentes metodologias para classificao.
Foram selecionadas duas espcies do gnero Aspergillus: Aspergillus nidulans
(ATCC 10074); Aspergillus flavus (ATCC 1410) com condios verde e branco, obtidas
da ATCC "American Type Culture Collection"(Manassas, VA), e seis espcies do
gnero Metarhizium: Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum
(ARSEF 3391); Metarhizium acridum (ARSEF 7486); Metarhizium anisopliae
(ARSEF 5749); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095) e Metarhizium brunmeum
(ARSEF 5626), obtidas da "USDA-ARSEF collection of Entomopathogenic Fungal

vi
vii

Cultures"(U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory, Ithaca, NY). O cultivo de


todas as espcies foi feito em laboratrio. As espcies A. nidulans ATCC 10074
e M. acridum ARSEF324 foram usadas para avaliar a influncia da luz e do pH
do meio de cultura sobre o crescimento dos fungos. Os valores de pH do meio
estudados variaram ente 5 e 8. Para obter os espectros de absoro, os condios
foram delicadamente retirados e depositados sobre o cristal de ATR do espectrmetro
do FTIR. Os espectros foram normalizados vetorialmente e subdivididos em quatro
intervalos: 910-1178 cm1 , 1178-1490 cm1 , 1490-1790 cm1 e 2810-2990 cm1 .
Parmetros espectroscpicos como o deslocamento do pico de absoro e as razes
entre reas sob as bandas foram calculadas para todos os espectros coletados. O teste
estatstico t-Student foi aplicado a estes parmetros para diferenciar as amostras.
Ambas as anlises foram realizadas pelo programa Origin 8.5. A anlise de
componentes principais e agrupamento foram realizada usando o programa Minitab
16. As tcnicas utilizadas para anlise foram capazes de diferenciar as amostras de
Aspergillus crescidas na presena e na ausncia de luz, mas no foram capazes de
diferenciar as amostras de Metarhizium. Dentre os valores de pH do meio de cultura
foi possvel apenas a diferenciao do pH 8. O A. flavus com condios brancos e
verdes foram diferenciados entre si assim como entre eles e os A. nidulans. Entre as
espcies foi possvel obter a classificao de acordo com a taxonomia atravs da regio
espectral 1178-1490 cm1 . As quatro metodologias foram consideradas adequadas
para anlise dos espectros de absoro, entretanto o deslocamento de pico e a razo
entre as reas so viveis apenas para um nmero pequeno de amostras enquanto o
PCA e o cluster so viveis para um nmero grande de amostras.

Palavras-chave: 1. FTIR. 2. Espectroscopia. 3. Fungos. 4. Anlise


Multivariada.
Abstract

BATISTUTI, M. R. Fourier transform infrared spectroscopy applied to


fungi classification. 2012. 174 f. Dissertation (M.Sc. - Postgraduate program
in Physics applied to Medicine and Biology) - Faculty of Philosophy, Sciences and
Literature, University of So Paulo, Ribeiro Preto - SP, 2012.

The identification of isolates within some species of filamentous fungi has


medical, agricultural and industrial interest. Within the genus Metarhizium, for
example, species identification is being constantly changed due to genetic analysis.
In this context, the development of new strategies for the rapid and reliable
identification of microorganisms in general, and specifically of fungi is desirable.
Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) has become widespread
in medicine and biology by providing information quickly able to biochemically
characterize a sample. The aim of this research was to use FTIR spectroscopy for
characterization and classification of strains and species of the genera Aspergillus
and Metarhizium and compare different methods for classification.
We selected two strains of the genus Aspergillus: Aspergillus nidulans (ATCC
10074), Aspergillus flavus (ATCC 1410) with green and white conidia, obtained
from ATCC "American Type Culture Collection"(Manassas, VA), and six strains of
Metarhizium: Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum (ARSEF
3391); Metarhizium acridum (ARSEF 7486), Metarhizium anisopliae (ARSEF
5749); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095) and Metarhizium brunmeum
(ARSEF 5626), obtained the "USDA-ARSEF collection of Entomopathogenic
Fungal Cultures "(U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory, Ithaca, NY).
The cultivation of all species were made in the laboratory. The species A.

viii
ix

nidulans (ATCC 10074) and M. acridum (ARSEF 324) were used to evaluate the
influence of light and pH of the culture medium on the growth of fungi. The pH
values of the medium studied ranged between 5 and 8. To obtain the absorption
spectra, the conidia were gently removed and deposited on the ATR crystal of FTIR
spectrometer.
The absorption spectra were vector normalized and divided in four ranges:
910-1178 cm1 , 1178-1490cm1 , 1490-1790cm1 and 2810-2990cm1 . Spectroscopic
parameters as the displacement of the absorption peak and the ratios of the areas
under the bands were calculated for all spectra collected. The statistical test
t-Student was applied on these parameters to differentiate the samples. Both
analyzes were performed by the program Origin 8.5. The principal component
analysis and cluster analysis were performed using Minitab 16.
The techniques used for analysis were able to differentiate samples of
Aspergillus grown in the presence and absence of light, but it was not possible
to Metarhizium. Among the pH of the culture medium was only possible to
identify the pH 8. The A. flavus with white and green conidia were differentiated
among themselves and between them and the A. nidulans. Among the strains of
the same specie it was possible to obtain the correct classification according to
the taxonomy through spectral region 1178-1490 cm1 . The four methods were
considered appropriate for the analysis of absorption spectra, however displacement
of the absorption peak and the ratios of the areas are feasible for a small number of
samples and the multivariate analysis are feasible for a large number of samples.

Key-words: 1.FTIR. 2. Spectroscopy. 3. Fungi. 4. Multivariate Analysis.


Lista de Figuras

1.1 O espectro eletromagntico apresentado em funo do comprimento


de onda, da frequncia e do nmero de onda. Cada intervalo
est correlacionado com a regio ou tipo de radiao e o processo
que nela ocorre. UV refere-se ao Ultravioleta, EPR a Ressonncia
paramagntica eletrnica e RMN a Ressonncia magntica nuclear. . 5
1.2 O espectro eletromagntico constitudo por duas componentes
que se propagam atravs de uma onda senoidal. A radiao
eletromagntica est representada pelos campos perpendiculares: E
(eltrico) e B (magntico) e pelo comprimento de onda . . . . . . . . 5
1.3 Modelo clssico da interao da radiao eletromagntica com uma
molcula diatmica. Quando o vetor campo eltrico, E , da radiao
incidente se acoplar com o momento de dipolo, p, a molcula A-B
vibrar e a energia da radiao incidente ser absorvida pela molcula.
Quando a molcula no possui momento de dipolo permanente (A-A)
no haver acoplamento eltrico nem absoro de energia. . . . . . . 7
1.4 O modelo clssico de um rotor linear rgido ilustra as interaes
rotacionais da molcula (A-B) com a radiao eletromagntica. . . . 8
1.5 Representao do perfil de energia de uma molcula diatmica como
um oscilador harmnico, onde a energia pelo deslocamento apresenta
o perfil de uma parbola simtrica ao eixo Ex . . . . . . . . . . . . . 9
1.6 Nveis quantizados de energia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.7 Diagrama representativo os nveis qunticos de energia vibracional
(V) e rotacional (J) de uma molcula diatmica como o CO. . . . . . 11
1.8 Funo energia potencial anarmnica apresenta nveis de energias
definidos ao invs de contnuos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

x
xi

1.9 Ilustrao dos modos vibracionais para uma molculas triatmica


no-linear. Os itens i e ii correspondem a estiramentos simtricos e
assimtricos respectivamente, enquanto o iii corresponde a uma flexo. 14
1.10 Ilustrao do interfermetro de Michelson. A fonte S emite o feixe de
radiao que dividido, metade transmitido para o espelho mvel
e a outra metade para o espelho fixo. Ambos os feixes so refletidos
e ento transmitidos para o detector. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.11 Ilustrao do interferograma uma fonte de radiao monocromtica
(i) e policromtica (ii). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.12 Ilustrao esquemtica do aparelho de FTIR. A fonte S emite o
feixe de radiao, este passa pelo interfermetro de Michelson, pela
amostra e pelo detector. O interferograma obtido transformado no
espectro de absoro atravs da transforamada de Fourier. . . . . . 18
1.13 Ilustrao da tcnica ATR. O feixe de radiao atravessa o cristal at
a interface cristal-amostra, onde ocorre a reflexo interna total. . . . 19
1.14 Exemplo da derivada de segunda ordem do espectro de absoro
no intervalo de 910-1178 cm1 . Na parte inferior do grfico est o
espectro de absoro e na parte superior sua segunda derivada.
possvel observar que cada ponto de mnimo da derivada segunda
ordem corresponde a um pico de absorbncia do espectro. . . . . . . 21
1.15 Interpretao geomtrica da anlise de componentes principais para
p =2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.16 Ilustrao dos procedimentos hierrquicos aglomerativos e divisivos. . 28

3.1 Classificao taxonmica dos fungos usados neste trabalho. O reino


Fungi apresenta diversos filos, entre eles o Ascomycota. Os gneros
Metarhizium e Aspergillus empregados neste trabalho pertencem a
este Filo. Do gnero Metarhizium seis linhagens foram utilizadas,
enquanto duas do gnero Aspergillus foram utilizadas. . . . . . . . . . 38
xii

3.2 Espectro do meio de cultura usado para o crescimento dos


fungos.Destaque na regio de 900-1200 cm1 para melhor visualizao.
O espectro apresenta picos em 3300 cm1 , 1630 cm1 e de 900 a 1200
cm1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.3 Estrutura da dextrose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.4 Imagem microscpica dos condios retirados pelo procedimento usado
neste trabalho. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.5 Espectro de absoro de uma amostra do fungos Aspergillus nidulans
(ATCC 10074) crescido na ausncia de luz. O espectro foi subdividido
em trs regies: regio I (910-1178 cm1 ), regio II (1178-1490 cm1 ),
regio III (1490-1790 cm1 ) e a regio IV (2810-2990 cm1 ). . . . . . 43
3.6 Um exemplo do resultado gerado pelo ajuste de picos atravs do
programa Origin 8.5 para o intervalo I do espectro de absoro do
A. nidulans com 12 bandas determinadas pela derivada de segunda
ordem. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.1 Espectro de absoro no infravermelho do Metarhizium acridum(ARSEF


324) crescido na ausncia de luz. Este espectro tpico para todas as
amostras de fungos deste trabalho e apresenta as principais bandas
de absoro e suprime a regio de 1800-2600 cm1 . . . . . . . . . . . 48
4.2 Quatro comparaes diferentes entre os grupos amostrais.No item
a comparou-se a espcie A. nidulans (ATCC 10074) crescida na
presena e na ausncia de luz. No item b a mesma espcie foi
comparada variando o valor do pH do meio de cultura. No item
c as espcies A. nidulans (ATCC 10074) e a M. acridum (ARSEF
324) foram empregadas para comparao entre dois gneros diferentes
ao qual cada um deles pertence. O item d faz a comparao entre
diferentes espcies dentro do mesmo gnero, no caso Aspergillus. . . . 49
xiii

4.3 Espectro mdio de absoro no infravermelho da espcie de fungo


Aspergillus nidulans (ATCC 10074) crescido na presena e na
ausncia de luz. O espectro apresenta-se subdividido nas quatro
regies de interesse que j foram previamente definidas. A anlise
ser realizada baseando-se nessas quatro regies. . . . . . . . . . . . 52
4.4 Espectros de absoro no infravermelho da espcie A. nidulans
com crescimento na presena e na ausncia de luz. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b)
1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d) 2810-2990 cm1 com
suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destacam-se os
deslocamentos de picos do primeiro e segundo intervalo. . . . . . . . . 53
4.5 Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. nidulans
(ATCC 10074) com crescimento na presena e na ausncia de luz
para os quatro intervalos do espectro de absoro. Nos intervalos I e
II apresentados em (a) e (b) a distribuio dos postos varia em torno
de eixo de PC 1. No intervalo III, em (c), a distribuio dos pontos
varia em torno do eixo de PC 2. No intervalo IV mostrado em (d)
no h distino dos grupos j que os pontos se encontram sobrepostos. 65
4.6 Ilustrao do ciclo sexual e assexual da espcie A. nidulans na
ausncia e na presena de luz respectivamente. A partir da hifa,
o fungo pode ter dois desenvolvimentos diferentes dependendo do
estmulo recebido. Fonte: adaptado de [22]. . . . . . . . . . . . . . 67
4.7 Espectro mdio de absoro no infravermelho da espcie Metarhizium
acridum (ARSEF 324) crescido na presena e na ausncia de luz. O
espectro apresenta-se subdividido em quatro regies de interesse que
sero analisadas separadamente. Observa-se visualmente semelhana
entre os espectros. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
xiv

4.8 Espectros de absoro no infravermelho da espcie M. acridum


com crescimento na presena e na ausncia de luz. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b)
1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d) 2810-2990 cm1 com suas
respectivas derivadas de segunda ordem. Destaca-se os deslocamentos
de picos do primeiro e segundo intervalo. . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.9 Anlise das componentes principais aplicada a espcie M. acridum
(ARSEF 10074) com crescimento na presena e na ausncia de luz
para os quatro intervalos do espectro de absoro. Em todos os quatro
intervalos observam-se a disperso e sobreposio dos pontos onde no
possvel diferenci-los atravs do PCA. . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.10 Espectros de absoro do meio de cultura sem a inoculao dos fungos
preparado com diferentes valores de pH. Observa-se que os espectros
de absoro do meio de cultura no sofrem variaes em funo dos
valores de pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.11 Espectros de absoro no infravermelho da espcie A. nidulans
(ATCC 10074) crescidos em meios de cultura com diferentes valores
de pH. Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos a)
910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d) 2810-2990
cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destacam-se
os deslocamentos de picos do primeiro intervalo em funo do aumento
do pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.12 Destaque para o intervalo I de 910-1178 cm1 do espectro de absoro
do A. nidulans (ATCC 10074) com sua derivada de segunda ordem.
As bandas que apresentaram grande variao ou deslocamento com
o aumento do pH do meio de cultura esto indicadas pelas linhas
verticais em tracejado para melhor visualizao. . . . . . . . . . . . . 92
xv

4.13 Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. nidulans


(ATCC 10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes
valores de pH. Nos intervalos I e II observa-se grande disperso dos
pontos com apenas os pontos referentes ao pH 8 agrupados. Nos
intervalos III e IV todos os valores de pH apresentam-se dispersos e
sobrepostos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.14 Espectros de absoro no infravermelho da espcie M. acridum
(ARSEF 324) crescidos em meios de cultura com diferentes valores
de pH. Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos
a) 910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d)
2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem.
Destaca-se a extrema semelhana entre todos os espectros de absoro
independente do valor de pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.15 Anlise das componentes principais aplicada a espcie M. acridum
(ARDEF 10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes
valores de pH. Observa-se a sobreposio dos pontos nos quatro
intervalos, no sendo possvel a identificao dos grupos. . . . . . . . 106
4.16 Espectros de absoro no infravermelho da espcie A. flavus (ATCC
1410) com condios verdes e brancos crescidos nas mesmas condies.
Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178
cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d) 2810-2990 cm1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. . . . . . . . . . . 109
4.17 Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. flavus
(ATCC 1410) com condios brancos e verdes. Os intervalos I, II
e III destacam-se pela disperso dos pontos amostrais permitindo
a diferenciao dos grupos. O intervalo IV apresenta os pontos
sobrepostos onde no possvel diferenciar os condios brancos e verdes.114
4.18 Espectros de absoro no infravermelho das espcies A. flavus (ATCC
1410) com condios verdes e brancos e A. nidulas (ATCC 10074). Os
espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos I em (a) 910-1178
cm1 , II em (b) 1178-1490 cm1 , III em (c) 1490-1790 cm1 e IV em
(d) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem. 116
xvi

4.19 Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. flavus


(ATCC 1410) com condios brancos e verdes e a espcie A. nidulans
(ATCC 10074). Os intervalos I, II e III destacam-se pela disperso dos
pontos amostrais permitindo a diferenciao dos grupos. O intervalo
IV apresenta os pontos sobrepostos onde no possvel diferenciar os
condios brancos e verdes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
4.20 Dendrogramas dos quatro intervalos dos espectros de absoro das
espcies A. flavus (ATCC 1410) com condios brancos e verdes e A.
nidulans (ATCC 10074) crescidos sob as mesmas condies. . . . . . . 126
4.21 Espectros de absoro no infravermelho das espcies M. acridum,
M. anisopliae e M. brunmeum crescidos nas mesmas condies. Os
espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos I) 910-1178 cm1 ,
II) 1178-1490 cm1 , II) 1490-1790 cm1 e IV) 2810-2990 cm1 com
suas respectivas derivadas de segunda ordem. . . . . . . . . . . . . . . 127
4.22 Anlise das componentes principais do gnero Metarhizium nas
quatro regies de interesse. Destaque para o inetervalo II onde
as variaes da espcie M. brunmeum (pontos pretos e azuis)
apresentam-se deslocadas para o eixo negativo de PC 1, a espcie M.
anisopliae (pontos amarelos) apresentam-se dispersa entre a origem
do mesmo eixo e as variaes da espcie M. acridum apresentam-se
deslocadas para o eixo positivo de PC 1. . . . . . . . . . . . . . . . . 131
4.23 Dendrogramas da anlise hierrquica de todas as amostras do gnero
Metarhizium crescidos sob as mesmas condies. . . . . . . . . . . . . 133
4.24 Espectros de absoro no infravermelho de todas as espcies
anteriormente usadas neste trabalho dos gneros Aspergillus e
Metarhizium crescidos nas mesmas condies. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos I) 910-1178 cm1 , II)
1178-1490 cm1 , II) 1490-1790 cm1 e IV) 2810-2990 cm1 com suas
respectivas derivadas de segunda ordem. . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.25 Anlise de componentes principais para os dois gneros: Metarhizium
e Aspergillus nos quatro intervalos de anlise crescidos sob as mesmas
condies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
xvii

4.26 Dendrogramas da anlise hierarquica das quatro regies do espectro


com nove amostras pertencentes a dois gneros diferentes: Aspergillu
e Metarhizium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

A.1 Anlise da primeira e terceira componentes principais aplicada a


espcies A. nidulans (ATCC 10074) com crescimento na presena
(P) e na ausncia (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de
absoro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
A.2 Anlise da segunda e terceira componentes principais aplicada a
espcies A. nidulans (ATCC 10074) com crescimento na presena
(P) e na ausncia (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de
absoro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
A.3 Anlise da primeira e terceira componentes principais aplicada a
espcies M. acridum (ARSEF 324) com crescimento na presena (P)
e na ausncia (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de
absoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
A.4 Anlise da segunda e terceira componentes principais aplicada a
espcies M. acridum (ARSEF 324) com crescimento na presena (P)
e na ausncia (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de
absoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
Lista de Tabelas

1.1 Graus de liberdade para molculas poliatmicas . . . . . . . . . . . . 13

3.1 Associao bioqumica das bandas encontradas no espectro de


absoro do meio de cultura, PDA [44, 45]. A letra representa
estiramento e flexo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.1 Apresentao dos valores mdios da posio das bandas de absoro


com seus respectivos desvios padro e associao bioqumica
subdivida nas quatro regies em estudo. Destacam-se as bandas que
esto presentes apenas em um ou outro grupo. Nas clulas em branco
a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras ,
e referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes
respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.2 Apresentao do teste estatstico para a posio de cada banda
de absoro e tambm para os valores das razes das reas das
bandas divididas pela rea da amida I, localizada em torno de 1650
cm1 . Destacam-se em cinza as bandas que apresentam diferenas
significativas. Nas clulas em branco no foi possvel realizar o teste
devido a falta da banda correspondente no outro grupo amostral. . . 58
4.3 Tabela com os resultados estatsticos da anlise de componente
principal aplicada ao A. nidulas em duas condies de luminosidade.
Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a varincia
acumulada sempre superior a 86%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

xviii
xix

4.4 Valores mdios da posio das bandas de absoro com seus


respectivos desvios padro e associao bioqumica subdivida nas
quatro regies em estudo. Nas clulas em branco a respectiva
associao no foi encontrada na literatura. As letras ,
e referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes
respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.5 Teste estatstico para a posio de cada banda de absoro e tambm
para os valores das razes das reas das bandas divididas pela rea
da amida I, localizada em torno de 1650 cm1 , para a linhagem M.
acridum. Destacam-se em cinzal as bandas que apresentam diferenas
significativas. Nas clulas em branco no foi possvel realizar o teste
devido falta da banda correspondente no outro grupo amostral.Nas
clulas com o ajuste no convergiu. . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.6 Tabela com os resultados estatsticos da anlise de componente
principal aplicada M. acridum em duas condies de luminosidade.
Observa-se os autovalores, a varincia explicada e a varincia
acumulada, sempre superior a 80%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.7 Valores mdios da posio das bandas de absoro com seus
respectivos desvios padro e associao bioqumica [20] subdivida
nas quatro regies em estudo. Destacam-se as bandas que esto
presentes apenas em um ou outro grupo. Nas clulas em branco a
respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras ,
e referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes
respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.8 Teste estatstico para a posio de cada banda de absoro da
espcie A. nidulans. destacam-se em cinza as bandas que apresentam
diferenas significativas (p<0,05). Nas clulas em branco no foi
possvel realizar o teste devido a falta da banda correspondente no
outro grupo amostral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
xx

4.9 Teste estatstico t-Student para a razo entre as reas de cada banda
de absoro da espcie A. nidulans. A comparao feita entre os dois
valores de pH vizinhos a fim de avaliar a variao das bandas com o
aumento do pH. Destacam-se em cinza as bandas que apresentam
diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi possvel
realizar o teste devido falta da banda correspondente no outro grupo
amostral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.10 Valores obtidos para a anlise e componentes principais da espcie A.
nidulans submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura.
Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a varincia
acumulada sempre superior a 86%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.11 Valores mdios do pico de absoro de cada banda da espcie M.
acridum para diferentes valores de pH do meio de cultura nos
intervalos I e II do espectro com seus respectivos desvios padro.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.12 Teste estatstico t-Student para os valores de pico da espcie M.
acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura.
Os valores de pH foram agrupados dois a dois em ordem crescente
para verificar as alteraes em funo do aumento do pH. Poucas
diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza. . . . . . . . . . . . . 101
4.13 Teste estatstico t-Student para a razo da rea de cada banda de
absoro da linhagem M. acridum submetidos a diferentes valores de
pH do meio de cultura. Os valores de pH foram agrupados dois a
dois em ordem crescente para verificar as alteraes em funo do
aumento do pH. As diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza. 103
4.14 Valores obtidos para a anlise e componentes principais da espcie M.
acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura.
Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a varincia
acumulada sempre superior a 67%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
xxi

4.15 Valores mdios dos picos de absoro de cada banda e a razo


de suas reas pela rea da amida I com os respectivos desvios
padro da linhagem A. flavus (ATCC 1410) com condios verdes e
brancos.O resultado do teste t-student destaca em cinza os dados
significativamente diferentes. As culas com referem-se as bandas
onde o ajuste de pico no convergiu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
4.16 Resultado da anlise das componentes principais da linhagem A.
flavus com condios brancos e verdes. Observam-se os autovalores,
a varincia explicada e a varincia acumulada sempre superior a 69%. 115
4.17 Valores mdios dos picos de absoro de cada banda e a razo de
suas reas pela rea da amida I com os respectivos desvios padro da
linhagem A. flavus (ATCC 1410) com condios verdes e brancos e A.
nidulans (ATCC 10074) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
4.18 Resultado da anlise das componentes principais da linhagem A.
flavus com condios brancos e verdes e A. nidulans. Observam-se
os autovalores, a varincia explicada e a varincia acumulada sempre
superior a 74%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
4.19 Resultado da anlise por agrupamento dos espectros de absoro da
linhagem A. flavus com condios brancos e verdes e A. nidulans. . . . 125
4.20 Valores mdios dos picos de absoro das bandas com os respectivos
desvios padro das linhagens M. acridum (ARSEF 324) e M.
brummeum (ARSEF 5616) com o resultado do teste estatstico para os
valores de pico e razes entre reas. Destacam-se em cinza as bandas
que apresentam diferenas significativas. Nas clulas em branco no
foi possvel realizar o teste devido a falta da banda correspondente no
outro grupo amostral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
4.21 Resultado da anlise das componentes principais das amostras do
gnero Metarhizium crescidas sob as mesmas condies. Observam-se
os autovalores, a varincia explicada e a varincia acumulada sempre
superior a 72%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
4.22 Resultado da anlise por agrupamento dos espectros de absoro da
linhagem A. flavus com condios brancos e verdes e A. nidulans. . . . 134
xxii

4.23 Tabela comparativa entre os picos mdios de absoro do A. nidulnas


e do M. acridum e o resultado do teste estatstico entre os valores de
pico e razes entre reas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.24 Resultado numrico da anlise de componentes principal para todas
as amostras de dois gneros diferentes; Aspergillus e Metarhizium. . . 140
4.25 Resultado da anlise hierrquica dos espectros de absoro dos
fungos pertencentes ao gnero Metarhizium crescidos sob as mesmas
condies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

A.1 Resultado da anlise de componentes principais aplicada a A.


nidulans em duas condies de luminosidade. A tabela apresenta
os valores das varincias das trs primeiras componentes principais e
a varincia acumulada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
A.2 Resultado da anlise de componentes principais aplicada a M.
acridum em duas condies de luminosidade. A tabela apresenta
os valores das varincias das trs primeiras componentes principais e
a varincia acumulada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Lista de Abreviaturas

ARSEF Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures.

ATCC American Type Culture Collection.

ATR Reflexo Total Atenuada (Attenuated Total Reflectance).

A. flavus Aspergillus flavus.

A. fumigatus Aspergillus fumigatus.

A. nidulans Aspergillus nidulans.

DNA cido Desoxrribonuneico (Deoxyribonucleic Acid ).

EPR Ressonncia Paramagntica Eletrnica (Electron paramagnetic


Resonance).

FTIR Transformada de Fourier no infravermelho (Fourier transform infrared ).

HIV Vrus da Imunodeficincia Humana (Human Immunodeficiency Virus).

IV Infravermelho (Infrared ).

M. acridum Metarhizium acridum.

M. anisopliae Metarhizium anisopliae.

M. brummeum Metarhizium brummeum.

PCA Anlise de Componentes Principais (Principal Component Analysis).

PDA gar Batata (Potato Dextrose Agar ).

xxiii
xxiv

RMN Ressonancia Magntica Nuclear.

UV Ultravioleta.
Lista de Smbolos

Comprimento de onda.

Freqncia (Hz).

B Campo Magntico.

Nmero de onda (cm1 ).

E Campo Eltrico.

n ndice de refrao.

c Velocidade da luz.

f Constante de fora.

F Fora restauradora.

re Posio de equilbrio.

p Momento de dipolo.

e Frequencia de euilbrio do oscilador.

Ex Energia Potencial Vibracional.

Energia dada pela equao de Bohr.

h Constante de Planck.

En Nveis de Energia quantizados.

V Nvel quntico de energia vibracional.

xxv
xxvi

J Nvel quntico de energia rotacional.

S Fonte emissora de radiao.

D Detector de radiao.

I Intensidade da radiao que chega ao detector.

B() densidade espectral de potncia.

X Matriz de dados.

X Vetor de mdias amostrais.


X
pxp Matriz de covarincia.

Spxp Matriz de covarincia amostral.

V ar(X) Varincia amostral.

Opxp Matriz ortogonal.

p Autovalores.

ei Autovetor normalizado.

vetor de mdias.

Y Componente principal da matriz de covarincia.

Varincia estimada.

d(Xl , Xk ) Distncia Euclidiana entre dois elementos Xl e Xk .

C Conglomerado.

Estiramento da ligao.

Deformao da ligao.

Flexo da ligao.
Sumrio

Lista de Figuras x

Lista de Tabelas xi

Lista de Abreviaturas xii

Lista de Smbolos xiv

1 Introduo 1
1.1 Espectroscopia no Infravermelho[6] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 Histrico e desenvolvimento da tcnica . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 A Teoria Clssica e Quntica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Instrumentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2.1 Interfermetro de Michelson . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3 Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR . . . . . . . . . . . 16
1.4 Reflexo Total Atenuada - ATR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.5 Processamentos Matemticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.5.1 Deslocamento de pico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.5.2 Razes entre as reas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.5.3 Anlise de Componente Principal [11] . . . . . . . . . . . . . . 22
1.5.4 Anlise por agrupamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.6 Fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2 Motivao & Objetivos 33


2.1 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

xxvii
xxviii

3 Metodologia 36
3.1 Objetos de estudo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.1.1 Linhagens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2 Cultivo dos fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3 Espectroscopia por FTIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.3.1 Testes Preliminares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.3.2 Aquisio dos espectros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4 Anlise de Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.4.1 Normalizaao vetorial [46] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4.2 Deslocamento dos picos de absoro . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4.3 Anlise por Razes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.4 Anlise de Componentes Principais . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.5 Anlise de Agrupamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4 Resultados e Discusso 47
4.1 Influncia da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.1.1 Aspergillus nidulans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.1.2 Metahrizium acridum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.2 Influncia do pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.2.1 Aspergillus nidulans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.2.2 Metarhizium acridum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.3 Classificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
4.3.1 Aspergillus flavus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.3.2 Aspergillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
4.3.3 Metarhizium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
4.3.4 Metarhizium e Aspergillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

5 Concluses e Perspectivas Futuras 145

Referncias 148

A Correes 155
Captulo 1
Introduo

espectroscopia no infravermelho uma tcnica analtica capaz de identificar


A ligaes qumicas em uma molcula destacando-se por obter espectros de uma
gama de compostos [1]. Essa tcnica tornou-se uma ferramenta de destaque ao ser
aplicada em uma variedade de pesquisas biomdicas e biolgicas, incluindo anlise
histopatolgica de cnceres[2], deteco do parasita da malria nas clulas do sangue
infectado [3], doenas sseas [4] e classificao de microrganismos [5]. Dentro das
suas possveis aplicaes, a identificao e classificao de microrganismos, no caso
fungos, o foco deste trabalho.
Esta dissertao apresenta-se organizada em cinco captulos, dentre os quais
este primeiro apresentar uma descrio do incio e da evoluo da espectroscopia no
infravermelho, a teoria, instrumentao, a descrio das espcies de fungos usados na
pesquisa e a forma de anlise dos dados coletados. O captulo 2 detalha os objetivos
deste trabalho, assim como sua motivao.
O captulo 3 descreve cada espcie de fungo estudada, a metodologia
empregada no cultivo dos mesmos, o processo para obteno dos espectros, os
parmetros usados e a descrio das metodologias para anlise dos dados. Os
resultados so apresentados no captulo 4 juntamente com a discusso. Este
captulo encontra-se subdividido em funo dos diferentes experimentos realizados
analisando primeiro alguns fatores ambientais que influenciam a cultura e seguido
da diferenciao entre linhagens, espcies e gneros dos fungos.
O captulo 5 finaliza este trabalho apresentando as concluses obtidas para
cada tipo de anlise e perspectivas para futuros trabalhos.

1
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 2

Aps a defesa foram inseridas no apndice deste trabalho algumas


consideraes feitas pela banca.

1.1 Espectroscopia no Infravermelho[6]


1.1.1 Histrico e desenvolvimento da tcnica
A primeira ideia sobre a existncia de uma regio que se estendia alm do
espectro visvel da luz foi introduzida por Sir Willian Herschel em 1800. Ao
investigar a distribuio do calor no espectro visvel solar obtido pela colocao
de um prisma de vidro na frente de uma fenda da janela e por um termmetro
de mercrio, Herschel descobriu que a temperatura mxima mostrada pelo
termmetro ocorreu alm da extremidade vermelha do espectro. Porm, o prisma de
vidro transmitia apenas o incio da faixa de infravermelho (IV) que agora conhecemos
como IV prximo. Para a deteco das regies de infravermelho mdio e distante
foram necessrios desenvolvimentos de instrumentos de medida mais sensveis do que
o termmetro de mercrio, materiais com melhores propriedades de transmisso do
IV e fontes de radiao mais adequadas do que a luz solar.
As primeiras medidas de bandas de absoro no infravermelho prximo
foram feitas por Sir John Herschel, filho de Sir William, em 1840. J no
comeo da dcada de 1850, John Tyndall foi o pioneiro em tratar as vibraes
moleculares como a origem da absoro da radiao IV. Os seus resultados (incluindo
a transparncia dos elementos gasosos O2 , N2 e H2 ao IV) encontraram mais tarde
explicao completa em termos de bandas de absoro individuais associadas com
os graus de liberdade vibracionais moleculares.
Perto do final do sculo XIX a viso geral era de que as bandas de absoro
ou emisso na regio do visvel estavam relacionadas com ressonncias envolvendo
cargas oscilatrias dentro da molcula. Contudo, isto no poderia explicar os
espectros de emisso de tomos, mesmo estes apresentando espectros de linha mais
simples do que o espectro de bandas moleculares. Logo aps a descoberta do eltron,
H.A. Lorentz e J. Larmor independentemente sugeriram em 1897 que os espectros
visveis surgem a partir das oscilaes de eltrons dentro de uma estrutura atmica
ou molecular. P. Drude em 1904 apontou que desde as intensidades muito reduzidas
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 3

at mesmo as maiores absores no comprimento de onda infravermelho deviam-se a


essas vibraes dos tomos dentro de uma molcula, como intuitivamente antecipado
por Tyndall 40 anos antes. Na primeira Conferncia de Solvay, em 1911, N.
Bjerrum introduziu a ideia de que as molculas esto associadas com trs tipos
de energia de diferentes magnitudes - vibracional, rotacional e translacional.
Nas primeiras dcadas do sculo XX, o advento da teoria quntica forneceu
uma compreenso geral da origem dos espectros moleculares. A teoria quntica
desenvolvida por Schroedinger possibilitou aplicar a equao de onda a uma srie de
modelos que representaram com grande sucesso os espectros no infravermelho mdio
como correspondente a transies vibracionais e nveis mais espaados de energia
rotacional; espectros no infravermelho prximo como originrios de combinaes
vibracionais fundamentais e espectros no infravermelho distante como originrios
de baixa frequncia vibracional. O sucesso esmagador da anlise pela mecnica
quntica dos espectros de vibrao-rotao de pequenas molculas poliatmicas
havia ficado claro no momento em que Gerhard Herzberg publicou seu famoso
relato e abrangente do tema "Molecular Spectra and Molecular Structure: Infrared
and Raman spectra of polyatomic molecules" em 1945.
Na mesma poca, durante a Segunda Guerra Mundial, a evoluo dos
mtodos de amplificao eletrnica, o desenvolvimento de espectrmetros de duplo
feixe, entre outros avanos, possibilitaram o registo do espectro de maneira fcil,
sendo obtido a partir de amostras muito pequenas, independentemente se estes eram
na forma slida, lquida ou gasosa. A partir de ento o mtodo de infravermelho
tornou-se extremamente importante para a anlise da estrutura molecular e como
resultado do amplo uso potencial de espectrmetros de infravermelho levou
sua produo comercial, de modo que a partir de 1945 os espectrmetros foram
construdos individualmente em universidade ou laboratrios industriais.
Um segundo avano importante ocorreu na dcada de 1970 quando
o desenvolvimento e a incorporao de computadores aos espectrmetros
possibilitaram a anlise dos dados coletados atravs da transformada de Fourier,
mtodo matemtico atravs do qual o interferograma transformado em um espectro
de frequncia. Espectrmetros por transformada de Fourier no infravermelho
(FTIR) possuem sensibilidade muito maior e, combinada com muitas outras
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 4

vantagens decorrentes das possibilidades de processamento digital de dados, abriram


caminho para a esta espectroscopia ser aplicada em reas anteriormente consideradas
difceis, como microscopia, espectroscopia de reflexo difusa, espectroscopia
fotoacstica e suas primeiras aplicaes na rea mdica [7].

1.1.2 A Teoria Clssica e Quntica


O espectro de luz que podemos obter do sol possui, entre outras regies,
uma faixa visvel, contnua e policromtica. Outros sistemas de deteco so
capazes de revelar radiaes que vo alm do espectro visvel, como: raios-x,
raios-, ultravioleta, infravermelho, micro-ondas e ondas de rdio. Essas regies
esto ilustradas na Figura 1.1 com suas respectivas interaes com a matria. Ao
espectro que compreende dos raios- s ondas de rdio, d-se o nome de espectro
eletromagntico.
A parte visvel do espectro uma poro relativamente pequena do total,
porm foi atravs dela que se deu incio todo o estudo da interao radiao com a
matria. A radiao infravermelha estende-se aproximadamente de 106 a 103 m ou
como usualmente tratada, de 40 a 4000 cm1 . O espectro eletromagntico e suas
interaes com a matria podem ser considerados em termos das teorias clssica e
quntica, e assim trataremos tambm os modelos clssicos e qunticos vibracionais.
A natureza da radiao apresentada na Figura 1.2 foi descrita por Maxwell



como sendo dois campos, um eltrico ( E ) e outro magntico ( B ), perpendiculares
entre si, de ondas planas, em fase e senoidais. O modelo clssico para a radiao
eletromagntica descreve sua propagao em um meio homogneo com ndice de
refrao n, com velocidade c, dada pelo produto do comprimento de onda
(distncia de dois picos adjacentes) e da frequncia (nmero de ciclos por segundo),
como se segue:

c = n (1.1)

O ndice de refrao n prximo de 1 no ar e 1.6 no vidro para radiaes


policromticas. A velocidade de propagao da luz no vcuo c equivale a 2,99 x
108 m.s1 .
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 5

Figura 1.1: O espectro eletromagntico apresentado em funo do comprimento de onda,


da frequncia e do nmero de onda. Cada intervalo est correlacionado com a regio
ou tipo de radiao e o processo que nela ocorre. UV refere-se ao Ultravioleta, EPR a
Ressonncia paramagntica eletrnica e RMN a Ressonncia magntica nuclear.

Figura 1.2: O espectro eletromagntico constitudo por duas componentes que se


propagam atravs de uma onda senoidal. A radiao eletromagntica est representada
pelos campos perpendiculares: E (eltrico) e B (magntico) e pelo comprimento de onda
.

A unidade mais usual quando tratamos de frequncia na regio do


infravermelho o nmero de onda, dado em cm1 . Essa unidade pode ser
interpretada como o nmero de ondas no comprimento de um centmetro.
As interaes entre o campo eltrico da radiao eletromagntica e os
movimentos do dipolo eltrico nas molculas so a base da teoria clssica. No caso
da espectroscopia vibracional, os movimentos do dipolo so vibraes moleculares
que conduzem a absoro de energia na regio infravermelha. Consideremos aqui
dipolo ou momento de dipolo como a magnitude da carga eltrica multiplicada
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 6

pela distncia que separa as componentes positiva e negativa da carga. No caso


mais simples de uma molcula diatmica composta por dois tomos distintos (A-B)
haver no seu espectro uma banda com forte absoro em um determinado nmero
de onda caracterstico desta molcula.
Em contrapartida, uma molcula diatmica composta por dois tomos iguais
(A-A) no possui dipolo e to pouco absorve radiao no infravermelho. Por
exemplo, o cloreto de hidrognio (HCl) possui uma banda de absoro localizada em
1886 cm1 , j a molcula diatmica do hidrognio H2 completamente transparente
a radiao infravermelha. Para poder modelar matematicamente esse sistema,
considera-se uma molcula diatmica como duas massas m1 e m2 unidas por uma
mola que mantm as duas massas separadas e em equilbrio. A rigidez dessa mola
pode ser caracterizada por uma constante de fora, f . Se assumirmos que este
modelo obedece s leis de Hooke que afirma que se uma mola deslocada por
uma pequena distncia, x, haver uma fora oposta de restaurao, F , que ser
proporcional ao deslocamento, dado por:

F = f x (1.2)

O deslocamento, x, das massas da sua posio de equilbrio, re , para algum valor, r,


dado por:

x = r re (1.3)

Se considerarmos as massas m1 e m2 representado tomos diferentes, eles


deveram atrair os eltrons constituintes da ligao em diferentes intensidades, assim
a molcula ter um momento de dipolo permanente. Se as massas representarem
tomos iguais, a molcula diatmica no ter momento dipolar. A Figura 1.3
representa a descrio clssica para a interao da radiao eletromagntica com
a molcula dipolar, onde o momento de dipolo representado pelo vetor

p.
O mecanismo de deslocamento de uma das massas em relao outra
acontece atravs do acoplamento do vetor campo eltrico da radiao incidente ao
vetor momento dipolar da molcula. Assim, se a frequncia, , da radiao incidente
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 7

Figura 1.3: Modelo clssico da interao da radiao eletromagntica com uma molcula
diatmica. Quando o vetor campo eltrico, E , da radiao incidente se acoplar com o
momento de dipolo, p, a molcula A-B vibrar e a energia da radiao incidente ser
absorvida pela molcula. Quando a molcula no possui momento de dipolo permanente
(A-A) no haver acoplamento eltrico nem absoro de energia.

for igual a frequncia natural de vibrao da molcula ento o vetor campo eltrico,

E , da radiao incidente ir se acoplar com o momento de dipolo, p , e induzir a


molcula A-B a vibrar. A energia da radiao incidente absorvida pela molcula
gerando uma banda de absoro do espectro. Se a molcula no possui momento de
dipolo permanente (A-A) no haver acoplamento eltrico nem absoro de energia.
Sabendo isso, como determinar ento as frequncias naturais de oscilao? Se


considerarmos a fora de restaurao, F , da mola conforme a lei de Hooke, esta
fora tambm dada pela segunda lei de Newton e sua soluo bem conhecida
fornecendo uma frequncia de equilbrio, e , para o oscilador harmnico simples:
s
1 f
e = (1.4)
2
Onde:
1 1 1
= + (1.5)
m1 m2

At o momento, a descrio clssica para o espectro vibracional de uma molcula


diatmica parece convincente. Logo, para molculas poliatmicas a teoria seria uma
simples expanso do que foi apresentado. Como no caso das interaes vibracionais,
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 8

Figura 1.4: O modelo clssico de um rotor linear rgido ilustra as interaes rotacionais
da molcula (A-B) com a radiao eletromagntica.

a interao eltrica tambm possvel entre a radiao eletromagntica e a mudana


dipolar nas molculas decorrentes das rotaes. Uma observao importante a ser
considerada que rotaes livres so possveis normalmente apenas no estado gasoso
enquanto vibraes ocorrem em todos os estados da matria. Tomando novamente
o modelo hipottico diatmico anterior, as observaes agora so que esta molcula
(A-B) no absorve em uma frequncia na regio vibracional, mas em uma srie
de linhas na regio rotacional. Se considerarmos a molcula (A-A) interessante
observar que no haver absoro da regio rotacional. A Figura 1.4 descreve essas
interaes em termos rotacionais.
O modelo nos explica porque o momento de dipolo permanente necessrio
para haver interao, j que o momento de dipolo acopla-se com o vetor campo
eltrico. Se no houver momento de dipolo no haver acoplamento. Este argumento
aplica-se igualmente a qualquer molcula poliatmica. Embora o espectro rotacional
seja bem entendido, suas linhas discretizadas no possuem explicao em termos
clssicos. Esta estrutura discretizada implica que a molcula pode rodar apenas em
certas frequncias discretas o que no explicado pela teoria clssica. Essas linhas
caractersticas so apenas um dos exemplos de inadequaes da teoria clssica. At o
momento consideramos apenas as frequncias de absoro dos processos vibracionais
e rotacionais envolvidos. A energia potencial vibracional, Ex , para uma molcula
diatmica dada pela fora oposta ao deslocamento multiplicada pelo deslocamento,
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 9

Figura 1.5: Representao do perfil de energia de uma molcula diatmica como um


oscilador harmnico, onde a energia pelo deslocamento apresenta o perfil de uma parbola
simtrica ao eixo Ex .

podendo ser escrita pela integral indefinida:


Z
Ex = F dx (1.6)

Se a molcula diatmica pode ser descrita como um oscilador harmnico, a lei


de Hooke pode ser aplicada para todos os valores de deslocamento para resolver
essa integral e seu grfico de energia por deslocamento nos revelar uma parbola
simtrica, como ilustrado na Figura 1.5.
Esta funo sugere que se x aumentar indefinidamente, Ex tambm
aumentar indefinidamente. Porm, com consideraes simples observamos que
quando x alcana valores suficientemente altos, a ligao entre os tomos se rompe.
E quando x tender a zero a funo sugere que Ex varie da mesma forma tanto
para valores positivos como negativos de x. Devemos observar ento que para
valores negativos de x e para x tendendo a zero haver intensa repulso entre os
tomos constituintes da molcula e consequentemente, o valor de Ex ir aumentar
bruscamente com maior inclinao do que a dada pela parbola da energia potencial.
Chegamos a um determinado ponto onde as leis da mecnica clssica so
insuficientes para modelar o sistema. Daremos incio s observaes que levaram
ao desenvolvimento da mecnica quntica e suas explicaes para a espectroscopia.
Entre as observaes experimentais que indicavam que a teoria clssica no era
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 10

Figura 1.6: Nveis quantizados de energia.

consistente, como foi demonstrado anteriormente, durante o sculo XIX muitas delas
afirmavam que a matria no poderia interagir com a energia que forma contnua,
como era suposto at o momento. Trabalhos subsequentes de Einstein, Planck
e Bohr indicaram de formas diferentes que a radiao eletromagntica poderia ser
considerada uma corrente de partculas ou quanta onde cada energia, , dada pela
equao de Bohr:

= h (1.7)

Onde h a constante de Planck dada por 6,6262x1034 Js e equivale frequncia


clssica. O trabalho pioneiro de Balmer ao observar as linhas monocromticas
obtidas no espectro do hidrognio estabeleceu a existncia de nveis de energia neste
tomo. Esta a forma mais simples dos nveis eletrnicos de energia em tomos
e molculas. Nessa nova condio, os processos vibracional e rotacional junto com
outros processos apresentados na Figura 1.1 podem ser representados em termos de
nveis de energia quantizados, E0 , E1 , E2 , ... En como representado na Figura 1.6.
Cada tomo ou molcula em um sistema deve estar em um desses nveis e
em um grande grupo de molculas, haver uma distribuio de todos os tomos e
molculas entre todos esses nveis de energia. Esses nveis de energia so funes
de nmeros inteiros (nmeros qunticos) e parmetros associados com um processo
atmico ou molecular associados a um estado. Sempre que houver uma interao
atmica ou molecular com a radiao, um quantum de energia (ou fton) ser
emitido ou absorvido. Em cada caso, a energia desse quantum de radiao equivaler
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 11

Figura 1.7: Diagrama representativo os nveis qunticos de energia vibracional (V) e


rotacional (J) de uma molcula diatmica como o CO.

exatamente ao gap E1 E0 ou E2 E1 , etc e essa mesma energia est relacionada


com a energia descrita na equao 1.7. Assim, podemos afirmar que a frequncia de
emisso ou absoro da radiao para uma transio entre os nveis de energia E0 e
E1 ser dada por:

E1 E0
= (1.8)
h

Logo, a frequncia de uma banda de absoro no espectro ser a mesma


frequncia da banda de emisso se no houver decomposio ou outros processos
de transferncia de energia. Mecanismo esse que pode ser ilustrado pela Figura
1.6. A espectroscopia no infravermelho consequncia das mudanas de energia
vibracionais e rotacionais como no diagrama da Figura 1.7, que apresenta os estados
qunticos vibracionais e rotacionais de uma molcula diatmica qualquer.
O diagrama simplifica para apenas trs nveis vibracionais caracterizados pela
letra V com os valores 0, 1, 2. Cada estado de energia vibracional est associado
com os estados de energia rotacional, no caso apenas quatro foram ilustrados para
simplificar o diagrama. Os nveis de energia rotacional so caracterizados pela letra
J e assumem valores 0, 1, 2, 3. Considerando, at o momento, a teoria quntica
suficiente para elucidar as questes levantadas anteriormente. Veremos ento, como
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 12

Figura 1.8: Funo energia potencial anarmnica apresenta nveis de energias definidos
ao invs de contnuos.

fica o novo modelo de energia potencial. A funo de energia potencial clssica


descrita anteriormente tratava o sistema como um oscilador harmnico, entretanto
vimos que este modelo no realista. Uma nova expresso matemtica foi proposta
por Morse em 1929 e ilustrada na Figura 1.8.
O oscilador passa a ser tratado como anarmnico com nveis de energia bem
definidos e que podem ser descritos como:

Ev = he (V + 1/2) xhe (V + 1/2)2 , x = he /4D (1.9)

Onde a energia funo do numero inteiro V (numero quntico vibracional),


e a frequncia molecular de vibrao e logo tambm a frequncia da radiao
eletromagntica que interage com a molcula e D a profundidade do mnimo da
curva ou energia de dissociao. importante notar que os nveis de energia no
so igualmente espaados.
As molculas absorvero energia quando esta for igual ao espaamento entre
dois nveis consecutivos. Pela regra de seleo, temos a condio de que a molcula
s pode absorver energia correspondente a h. Este valor corresponde a um pico
simples no espectro. Entretanto, tambm pode ocorrer o chamado overtone, onde
a absoro de energia equivalente a 2h. No espectro, esta absoro representada
por um pico com menor intensidade e localizado em um nmero de onda um pouco
menor do que a metade do valor de h. As teorias clssica e quntica foram at
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 13

aqui aplicadas para o espectro infravermelho do modelo mais simples: uma molcula
diatmica.
As consideraes para molculas poliatmicas so maiores, mas ainda assim
suficientes para descrev-las. As molculas poliatmicas so podem tambm serem
vistas como um sistema de massas ligadas por molas com propriedades elsticas.
As posies de cada tomo podem ser descritas em funo dos eixos X, Y e Z de
um plano cartesiano. Cada tomo tem ento trs graus de liberdade. Isto significa
que ele pode executar movimento relativo a esses trs eixos. E isto conhecido
como movimento translacional. Como as molculas possuem muito mais tomos,
logo tero muitos graus de liberdade. Mas como entender e determinar o nmero de
graus de liberdade?
Se cada tomo possui trs graus de liberdade, cabvel imaginar que uma
molcula diatmica possua o dobro, ou seis graus de liberdade. Sendo assim, quais
so esses graus? Tomando como exemplo a molcula H-Cl, trs deles so os descritos
como graus de liberdade translacional. Os outros trs so provenientes dos graus de
liberdade rotacional e vibracional. No caso de uma molcula linear, como o H-Cl,
dois desses graus so rotacionais e o restante vibracional, em virtude do movimento
oposto dos dois tomos gerando o efeito de estiramento e compresso da ligao.
Ampliando essa anlise para uma molcula poliatmica contendo N tomos,
vamos distinguir dois grupos: linear e no linear. Ambas tm trs graus de liberdade
translacional. As molculas poliatmicas lineares possuem dois graus de liberdade
rotacional e as molculas no lineares possuem trs. Podemos exemplificar para
duas molculas simples como CO2 e H2 O na Tabela 1.1:

Tabela 1.1: Graus de liberdade para molculas poliatmicas

Graus de liberdade CO2 (Linear) H2 O (No Linear)


Translacional 3 3
Rotacional 2 3
Vibracional 3N - 5 3N - 6
Total 3N 3N
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 14

Figura 1.9: Ilustrao dos modos vibracionais para uma molculas triatmica no-linear.
Os itens i e ii correspondem a estiramentos simtricos e assimtricos respectivamente,
enquanto o iii corresponde a uma flexo.

Desta forma, temos duas relaes para calcular os graus de liberdade


vibracionais de molculas lineares e no lineares. Essas vibraes ocorrem apenas
nos chamados modos normais de vibrao, onde cada modo corresponde a um grau
de liberdade e tem uma frequncia caracterstica de uma forma de vibrao.
Esses modos normais de vibrao envolvem os movimentos dos tomos onde
cada tomo se move em fase com a mesma frequncia, mas com diferentes amplitudes
e diferentes direes. Essas amplitudes e direes de cada tomo podem ser
representadas por um vetor deslocamento. E o deslocamento de todos os tomos
em um determinado modo vibracional pode ser representado pela combinao linear
dos deslocamentos.
Uma molcula diatmica possui apenas a conformao linear com um
modo vibracional chamado de estiramento. Esses modos vibracionais podem ser
entendidos pela ilustrao da Figura 1.9, onde a molcula no linear triatmica
possui trs modos vibracionais; dois modos de estiramento e um de flexo.
Uma observao importante a existncia de molculas com dois modos
vibracionais diferentes, porm com a mesma frequncia, sendo ento chamados de
modos degenerados. O espectro de infravermelho pode ser complexo com muitos
modos normais; alguns francos outros com overtone. E como proceder diante dessa
complexidade? A resposta que raramente uma completa interpretao realizada.
1.2 - Instrumentao 15

Em muitos casos apenas uma interpretao parcial necessria, por dois motivos:

1. Certos grupos qumicos possuem massas diferentes dos seus grupos adjacentes,
com frequncias caractersticas ou nmeros de onda vibracionais especficos que
podem ser comparados com tabelas ou espectros de referncia, no intervalo de
1500-4000 cm1 .

2. O intervalo restante, em torno de 50-1500 cm1 , est correlacionado a


impresso digital da amostra. Este intervalo se deve ao acoplamento
vibracional da molcula como um todo, tornando-o nico para cada molcula.

Assim, a complexidade do espectro de infravermelho pode ser teorizado


atravs dos conceitos qunticos. Vamos compreender ento como constituda a
instrumentao para obter tal espectro.

1.2 Instrumentao
Os primeiros espectrmetros eram chamados de dispersivos e possuam
prismas ou grades de difrao da luz. A grade de difrao possua a vantagem de ter
resoluo alta e um grande intervalo de frequncias, porm os prismas permitiam a
passagem de mais energia. Entretanto, qualquer que fosse o mtodo usado, haveria
uma grande limitao do equipamento em termos energticos, obtendo espectros
com pouca resoluo e com um limitado intervalo de nmeros de onda.

1.2.1 Interfermetro de Michelson


No final do sculo XIX, Michelson fez uma das mais importantes descobertas
ticas: o interfermetro que recebeu seu prprio nome. O sistema tico est
apresentado na Figura 1.10:
O feixe de radiao da fonte, S, focalizado em um divisor de feixe que
construdo de tal forma que metade do feixe transmitida para um espelho mvel
e refletido de volta para o divisor, que reflete parte deste feixe para o detector, D,
atravs da amostra. A outra metade do feixe da fonte e refletido do divisor de feixe
para o espelho fixo e refletido para o divisor e finalmente para o detector, D, atravs
da amostra.
1.3 - Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR 16

Figura 1.10: Ilustrao do interfermetro de Michelson. A fonte S emite o feixe de


radiao que dividido, metade transmitido para o espelho mvel e a outra metade para
o espelho fixo. Ambos os feixes so refletidos e ento transmitidos para o detector.

Quando a posio do espelho mvel gerar dois feixes viajando com distncias
iguais at o detector, D, um forte sinal ser obtido. Conforme o espelho mvel se
movimenta em relao a sua posio central, a distncia entre os feixes varia, e um
sinal de interferncia registrado pelo detector. Michelson notou que este padro
de interferncia possua informaes espectrais.
O desenvolvimento da tcnica para registro do padro de interferncia atravs
do movimento do espelho por uma distncia /2 produz uma diferena total de
caminho . O padro de interferncia apresentado na Figura 1.11 para uma fonte
de radiao monocromtica (i) e para uma fonte policromtica (ii) de radiao.
O primeiro uma funo cosseno simples enquanto o segundo possui uma forma
mais complicada por conter toda a informao espectral da radiao que chegou ao
detector.

1.3 Trasformada de Fourier no Infravermelho -


FTIR
A matemtica para converso do padro de interferncia em um espectro
possuiu equaes que relacionam a intensidade que chega ao detector, I() e a
densidade espectral de potncia, B(), para um determinado nmero de onda, ,
1.3 - Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR 17

Figura 1.11: Ilustrao do interferograma uma fonte de radiao monocromtica (i) e


policromtica (ii).

dado por:
Z +
I() = B() cos(2).d (1.10)
0

Essa relao corresponde apenas metade do par cosseno da transformada de


Fourier, sendo a outra:
Z +
B() = I() cos(2).d (1.11)

As equaes 1.10 e 1.11 so intermutveis e conhecidas como par transformada


de Fourier. A primeira demonstra a variao da densidade espectral de potncia
em funo da diferena de caminho que o padro de interferncia. A segunda
demonstra a variao da intensidade em funo da diferena de caminho que
o espectro. Uma podendo ser convertida na outra atravs da transformada de
Fourier.
O experimento para obter um espectro de FTIR consiste em obter dois
interferogramas; um com a amostra e outro sem a amostra no detector e transformar
ambos os interferogramas em espectros. A razo do primeiro pelo segundo
corresponde ao espectro de disperso conhecido at ento.
Outro grande avano para a utilizao da tcnica em larga escala foi o
desenvolvimento de rotinas e algoritmos para realizar do modo rpido a transformada
1.4 - Reflexo Total Atenuada - ATR 18

Figura 1.12: Ilustrao esquemtica do aparelho de FTIR. A fonte S emite o feixe de


radiao, este passa pelo interfermetro de Michelson, pela amostra e pelo detector. O
interferograma obtido transformado no espectro de absoro atravs da transforamada
de Fourier.

de Fourier. Isto combinado com o avano dos computadores ofereceram diversas


outras vantagens e consolidaram a transformada de Fourier como um mtodo
largamente aplicado. A capacidade de medir todos os comprimentos de onda
simultaneamente no interfermetro reduz o tempo de medida, tornando possvel
coletar vrios espectros, diminuindo a relao sinal-rudo.
O mtodo de FTIR ultrapassou as limitaes at ento encontradas,
promovendo medidas rpidas. Sua composio est ilustrada na Figura 1.12:
O feixe de radiao aps passar pelo interfermetro de Michelson atravessa
a amostra. O feixe transmitido incide sobre o detector e o espectro de absoro
obtido a partir da transformada de Fourier do interferograma resultante. Nos
aparelhos modernos de FTIR, um laser He-Ne usado para fornecer uma referncia
interna para a escala de frequncia de cada interferograma, tendo assim um espectro
estvel.

1.4 Reflexo Total Atenuada - ATR


Para o caso de amostras que no possuem um bom espectro de transmisso,
seja porque so polmeros opacos, tecidos, colas, entre outros, mtodos especiais
1.4 - Reflexo Total Atenuada - ATR 19

Figura 1.13: Ilustrao da tcnica ATR. O feixe de radiao atravessa o cristal at a


interface cristal-amostra, onde ocorre a reflexo interna total.

para anlise no infravermelho foram desenvolvidos. Dentre eles, existem tcnicas de


reflexo como: Reflexo Especular e Reflexo Totalmente Atenuada (ATR). Aqui
vamos tratar com mais detalhe do ATR.
Quando a radiao eletromagntica, ou no caso, a radiao infravermelha se
propaga em um meio com alto ndice de refrao at o limite com outro material
com baixo ndice de refrao, existe um ngulo de incidncia onde ocorre a reflexo
interna total, que deve ser maior do que o ngulo crtico dado por:

n1
c = sen1 ( ) (1.12)
n2

onde n1 e n2 representam as ndices de refrao do ATR e da amostra


respectivamente.
A radiao reflete e absorve na interface vrias vezes e em seguida
quantificada por um detector. Nesse ponto o feixe atua como se penetrasse uma
pequena distncia dentro da amostra. A radiao penetrante chamada onda
evanescente.
Se o material por onde o infravermelho se propaga for um prisma ou cristal e
sua superfcie est em contato com a amostra em estudo, como ilustrado na Figura
1.13, ao ocorrer a onda evanescente e se essa amostra absorver nesse comprimento
de onda, haver atenuao do feixe. Assim, a intensidade total da radiao refletida
muda e obtm-se o espectro de absoro.
1.5 - Processamentos Matemticos 20

Essa tcnica tambm pode ser usada para anlise de amostras lquidas ou
emulses, reduzindo o tempo de preparo das amostras [6].
Os espectros de reflectncia total atenuada so semelhantes mas no iguais
aos espectros comuns de absoro. Em geral, os mesmo picos so observados,
porm suas intensidades relativas diferem. As absorbncias dependem do ngulo de
incidncia, mas so independentes da espessura da amostra, uma vez que a radiao
penetra apenas alguns micrmetros na mesma.
Entre as grandes vantagens do ATR est a rapidez com que os espectros so
obtidos e a variedade de amostras possveis.

1.5 Processamentos Matemticos


Diversos processamentos matemticos podem ser aplicados para anlise
do espectro de absoro. O uso de cada processamento depende quase que
exclusivamente da quantidade de espectros e do objetivo da anlise.
Trataremos aqui de quatro processamentos diferentes: o deslocamento de
pico, as razes entre reas, a anlise de componentes principais e a anlise por
agrupamento. Essas duas ltimas fazem parte do grupo de anlise chamado de
multivariada, onde muitas variveis so medidas simultaneamente em cada elemento
amostral.

1.5.1 Deslocamento de pico


O espectro de absoro pode ser descrito como um grfico da absorbncia pelo
nmero de onda da radiao infravermelha. As bandas de absoro representam
sopreposies que no podem ser observadas individualmente [8]. Amostras
biolgicas possuem bandas complexas e sua anlise exige o emprego de mtodos
para aumento da resoluo, em outras palavras, esses mtodos para separao dos
picos que compem cada banda.
A derivao do sinal uma das metodologias empregadas para a separao
dos picos. O sinal de FTIR digital e com resoluo finita sendo a sua derivada de
segunda ordem a mais utilizada com o algoritmo Savitzky-Golay [9]. Na derivada
de segunda ordem, cada ponto de mnimo no grfico corresponde a um pico de
1.5 - Processamentos Matemticos 21

Figura 1.14: Exemplo da derivada de segunda ordem do espectro de absoro no intervalo


de 910-1178 cm1 . Na parte inferior do grfico est o espectro de absoro e na parte
superior sua segunda derivada. possvel observar que cada ponto de mnimo da derivada
segunda ordem corresponde a um pico de absorbncia do espectro.

absorbncia do espectro, como pode ser observado na Figura 1.14.


O exemplo acima ilustra a derivada como mtodo de separao dos picos de
absoro. Da mesma maneira, este mtodo pode ser empregado forma comparativa
entre dois grupos de interesse para verificar o deslocamento do pico de absoro.
Este deslocamento indica alteraes na estrutura ou ligao em questo.

1.5.2 Razes entre as reas


Cada banda do espectro de absoro pode ser analisada individualmente em
funo da sua posio, largura meia altura e rea. Dentre estes parmetros, a rea
pode ser empregada para determinar a concentrao ou composto a que a banda
se refere. Assim, tomados dois grupos, a rea de uma ou mais bandas pode ser o
parmetro de comparao entre elas.
Entretanto, se a rea reflete a absoro de uma determinada ligao, quanto
1.5 - Processamentos Matemticos 22

maior a concentrao de amostra, maior ser a rea de uma determinada banda.


Logo, quando a quantidade de amostra utilizada para a obteno do espectro no
padronizada, h a necessidade de se normalizar este valor.
Uma das possveis normalizaes a razo entre reas, que se baseia na
determinao de uma banda como padro interno do espectro de absoro e as
reas de todas as bandas de interesse tem seu valor numrico de rea dividido pelo
valor da rea desta banda. Na literatura, a banda de amida I, localizada na regio
de 1650 cm1 largamente empregada para este fim [10]. Assim, compara-se o
valor da razo entre reas como indicativo de alterao em determinada ligao ou
estrutura.

1.5.3 Anlise de Componente Principal [11]


A tcnica denominada anlise de componentes principais, ou PCA (da sigla
Principal Component Analysis), tem como objetivo explicar a estrutura de varincia
e covarincia de um vetor aleatrio, composto de p-variveis aleatrias atravs
da construo de combinaes lineares das variveis originais. Estas combinaes
lineares so chamadas de componentes principais.
Em geral, a informao contida em p-variveis originais substituda pela
informao contida em k (k<p) componentes principais, reduzindo o nmero de
variveis a serem analisadas sem perda considervel de informao. A obteno
de tais componentes principais envolve a decomposio da matriz de covarincia
do vetor aleatrio de interesse. Uma vez determinadas as componentes principais,
os seus valores numricos, denominados escores, podem ser calculados para cada
elemento amostral.
Na prtica, as matrizes de covarincia precisam ser estimadas atravs de
dados amostrais. Suponha que dispomos de uma amostra aleatria composta por
n espectros de absoro, onde para cada elemento da amostra, tenha-se observado
os valores de p-nmeros de onda. Dessa forma, podemos guardar os valores dos
elementos amostrais observados em uma matriz chamada de matriz de dados, X.
A informao de cada espectro de absorbncia, ou vetor Xi armazenada em uma
linha dessa matriz e cada coluna representa os dados observados de um nmero de
1.5 - Processamentos Matemticos 23

onda. Assim, temos a matriz nxp denotada por:




X11 Xp1









Xnxp

= .. .. ..
(1.13)



. . .










X1n Xpn

O vetor de mdias ser estimado pelo vetor de mdias amostrais X definido por:


X1






1




X = [X 1 . . . X n ] = ..
(1.14)
.

n











Xp

Onde X i a mdia amostral da i-sima varivel,i = 1, 2, ..., p. A matriz de


X
covarincia pxp ser estimada pela matriz de covarincia amostral Spxp definida

por:


S11 S1p








Spxp

= .. .. ..
(1.15)



. . .








Sp1 Spp

Sendo Sij = Sji , j 6= i,e Sii definidos respectivamente por:


Pn
l=1 (Xil X)2
Sii = (1.16)
n1

que a varincia amostral da i-sima varivel, definida por V ar(Xi ) = ii .


Pn
l=1 (Xil X l )(Xjl X j )
Sij = (1.17)
n1

que a covarincia amostral entre a i-sima e a j-sima variveis ou Cov(Xi , Xj ) =


ij .
1.5 - Processamentos Matemticos 24

Dessa forma, a matriz de covarincia do vetor aleatrio X dada por:




11 1p





X



= .. .. ..
(1.18)
pxp


. . .








p1 pp

A matriz de covarincia uma matriz simtrica, ou seja, ij = ji , i 6= j. Alm


disso, no negativa e seus autovalores 1 , 2 , ..., p , so no negativos tambm.
Para esta matriz de covarincia existe uma matriz ortogonal Opxp , isto, O0 O = OO0 =
Ipxp , tal que:


1 0 0






X


O0

O=

0 2 0


= (1.19)









0 0 p

Onde 1 2 p so os autovalores ordenados em ordem decrescente da


X
matriz pxp , que similar matriz pxp , o que implica em dizer que:

p
X X Y
(i) det( pxp ) =| pxp | = |pxp | = i
i=1
X
(ii) trao( pxp ) = trao (pxp ) = 1 , 2 , . . . , p

A i-sima coluna da matriz Opxp , o autovetor normalizado ei correspondente


ao autovalor i , i = 1, 2, ..., p, que denotado por:


ei1









ei = ..
(1.20)
.











eip

Ento, a matriz O dada por O = [e1 ...ep ] e pelo teorema da decomposio espectral
1.5 - Processamentos Matemticos 25

tem-se que a seguinte igualdade vlida:

p
X X
0
pxp = OO = i ei e0i (1.21)
i=1

Sendo ei um vetor de norma igual a 1, isto :

1
kei k = (e2i1 + e2i2 + + e2ip ) 2 = 1 (1.22)

Assim, temos ento um vetor aleatrio X = (X1 , X2 , . . . , Xp )0 com o vetor de mdias


X
= (1 , 2 , . . . , p )0 e a matriz de covarincia pxp . Sejam 1 2 p os

autovalores desta matriz, com os respectivos autovetores normalizados e1 , e2 , ..., ep ,


isto , os autovetores ei satisfazem as seguintes condies:

(i) e0i ej = 0 para todo i 6= j;

(ii) e0i ej = 1 para todo i = 1, 2, ..., p;


X
(iii) pxp ei = i ei , para todo i = 1, 2, ..., p.

sendo o autovetor ei denotado por ei = (ei1 , ei2 . . . eip )0 . Considere um


vetor aleatrio Y = O0 X, onde Opxp a matriz ortogonal definida anteriormente
e constituda dos autovetores normalizados da matriz de covarincia, ou seja:


e11 ep1








Opxp

= .. .. ..
= [e e ] (1.23)



. . .


1 p






e1p epp

O vetor Y composto por p combinaes lineares das variveis aleatrias do vetor


X, tem vetor mdia igual a O0 e matriz de covarincia pxp , que uma matriz
diagonal como a 1.18. Deste modo surge a ideia de utilizar as combinaes lineares
em Y , como forma alternativa de se representar a estrutura de covarincias do vetor
X, tentando obter uma reduo do espao de variveis, passando da dimenso p para
uma dimenso k menor que p. Assim, ao invs de utilizar o vetor aleatrio original
1.5 - Processamentos Matemticos 26

Figura 1.15: Interpretao geomtrica da anlise de componentes principais para p =2.

na anlise de dados, utiliza-se as k combinaes lineares principais. Os vetores X e


Y tem a mesma varincia total, sendo que a j-sima componente principal da matriz
X
pxp , j = 1, 2, . . . , p definida como:

Yj = e0j X = ej1 X1 + ej2 X2 + + ejp Xp (1.24)

A primeira componente principal ser sempre a mais representativa em termos de


varincia total e a p-sima sempre a de menor representatividade. A Figura 1.15
ilustra as componentes principais no caso de duas variveis. Cada ponto do sistema
de coordenadas X1 e X2 projetado ortogonalmente no novo sistema de coordenadas
Y1 e Y2 .
Na prtica, a matriz de covarincia desconhecida e precisa ser estimada
atravs dos dados amostrais coletados. Em geral, estimada pela matriz de
covarincia amostral. Algumas propriedades das componentes principais so
apresentadas a seguir:

(i) A varincia estimada de Yj igual j , j = 1, 2, ..., p;

(ii) A varincia total explicada pela j-sima componente amostral dada por:
1.5 - Processamentos Matemticos 27


V ar[Yj ] j
=
(1.25)
Varincia Total Estimada de X Pp
1 i=1
Assim, as componentes principais so analisadas em funo das porcentagens de
varincia total explicada. Em termos prticos, necessrio calcular os seus valores
numricos para cada elemento amostral, chamados de escores das componentes. O
grfico de disperso dos escores das primeiras componentes principais usado para
anlise final.

1.5.4 Anlise por agrupamento


A anlise por agrupamento, conglomerados, classificao ou cluster, tem
como objetivo agrupar os elementos amostrais de forma que os elementos
pertencentes a um mesmo grupo so similares entre si em relao s variveis
medidas.
Para entender essa anlise, suponha que se tenha disponvel um conjunto de
dados constitudo de n elementos amostrais, tendo-se medidos p-variveis aleatrias
em cada um deles, ou p nmeros de onda. O objetivo agrupar esses elementos em
g grupos. Para cada elemento amostral j, tem-se o vetor Xj definido:

Xj = [X1j , X2j , . . . , Xpj ]0 , j = 1, 2, . . . , n (1.26)

onde Xij representa o valor observado da varivel i medida no elemento j. Para que
seja possvel o agrupamento, necessrio conhecer a medida de similaridade a ser
utilizada.
A distncia Euclidiana entre dois elementos Xl e Xk , l 6= k, uma medida
de dissimilaridade, ou seja, quanto menor os seus valores, mais similares sero os
elementos que esto sendo comparados. Esta distncia definida por:

p
1 1
X
0
d(Xl , Xk ) = [(Xl Xk ) (Xl Xk )] = [ (Xil Xik )2 ] 2
2 (1.27)
i=1

ou seja, os dois elementos amostrais so comparados em cada varivel pertencente


ao vetor de observaes.
1.5 - Processamentos Matemticos 28

Figura 1.16: Ilustrao dos procedimentos hierrquicos aglomerativos e divisivos.

As tcnicas de agrupamentos podem ser hierrquicas ou no hierrquicas,


sendo as hierrquicas classificadas em aglomerativas ou divisivas, como ilustrado na
Figura 1.16. As tcnicas hierarquicas so usadas, na maioria dos casos, em anlises
exploratrias dos dados com o intuito de identificar possveis agrupamentos. J as
tcnicas no hierrquicas, necessrio que o valor do nmero de grupos j esteja
pr-estabelecido pelo pesquisador.
As tcnicas hierrquicas aglomerativas partem do princpio de que cada
elemento do conjunto de dados, ou cada espectro, considerado um conglomerado
isolado no incio do processo de agrupamento. Em cada passo do algortmo os
elementos amostrais so agrupados, formando novos conglomerados at o momento
em que todos os elementos esto em um nico grupo. Portanto, o estgio inicial
cada elemento amostral considerado um cluster de tamanho 1 e no ltimo estgio
tem-se apenas um nico cluster constitudo de todos os elementos amostrais.
Em cada etapa do agrupamento, os grupos so comparados atravs de
alguma medida de similaridade (ou dissimilaridade) previamente definida. Existem
vrios mtodos de agrupamentos hierrquicos, entre eles est o mtodo de Ward,
proposto em 1963, fundamentado na "mudana de variao"entre os grupos e
dentro dos grupos que esto sendo formados em cada passo do agrupamento. O
procedimento, tambm conhecido como "mnima varincia, fundamentado nos
seguintes princpios:

(i) Inicialmente, cada elemento considerado como um nico conglomerado;

(ii) Em cada passo do algoritmo de agrupamento calcula-se a soma dos quadrados


dentro de cada conglomerado. Essa soma o quadrado da distncia Euclidiana
1.5 - Processamentos Matemticos 29

de cada elemento amostral pertence ao conglomerado em relao ao vetor de


mdias de conglomerado correspondente, isto :

ni
X
SSi = (Xij X i )0 (Xij X i ) (1.28)
j=1

onde ni o nmero de elementos no conglomerado Ci quando se est no passo k do


processo de agrupamento, Xij o vetor de observao do j-simo elemento amostral
que pertence ao i-simo conglomerado, X i o centroide do conglomerado Ci dado
por:

1
vetor de mdias de Ci = X i = [X1 + X2 + + Xn ] (1.29)
ni

e SSi representa a soma de quadrados correspondentes ao conglomerado Ci . No


passo k, a soma de quadrados total dentro dos grupos definida como:

gk
X
SSR = SSi (1.30)
i=1

onde gk o nmero de grupos existentes quando se est no passo k. A distncia


entre os conglomerados Cl e Ci definida como:

nl ni
d(Cl , Ci ) = [ ](X L X i )0 (X l X i ) (1.31)
nl + ni

que a soma de quadrados entre os clusters Cl e Ci . Em cada passo do algoritmo


de agrupamento, os dois conglomerados que minimizam a distncia acima so
combinados.
A medida de distncia dada por pela equao 1.30 nada mais do que a
diferena entre o valor de SSR depois e antes de se combinar os conglomerados Cl e
Ci em um nico conglomerado. Portanto, em cada passo do agrupamento, o mtodo
de Ward combina os dois conglomerados que resultam no menor valor de SSR.
1.6 - Fungos 30

Os resultados do processo de aglomerao so representados por um


dendrograma que mostra a fuso dos grupos em funo da distncia, similaridade
ou dissimilaridade entre eles.

1.6 Fungos
Condios so estruturas especializadas, produzidas assexuadamente por
fungos filamentosos, envolvidos na reproduo, disperso e persistncia ambiental.
No caso de espcies patgenas, os condios tambm podem estar envolvidos no
reconhecimento e na infeco do hospedeiro. Em contraste com o miclio vegetativo,
que apresenta alta atividade metablica, os condios da maioria dos fungos so
estruturas dormentes com baixa atividade metablica [12].
O gnero Aspergillus, por exemplo, compreendem diversas espcies de fungos
que apresentam interesses mdico, agrcola e industrial, como A. fumigatus, A.
flavus e A. niger alm de espcies-modelo como A. nidulans. A maioria das
espcies apresenta ampla distribuio geogrfica. Espcies como A. fumigatus so
importantes patgenos oportunistas e representam um srio problema de sade
pblica. O fungo produz condios esfricos pequenos (2-3,5 m de dimetro)
que permanecem suspensos na atmosfera por longos perodos, facilitando as suas
disperses pelo ar [13].
A aspergilose possui uma mortalidade de 30-90%, sendo causada pela inalao
dos condios. Aps o desenvolvimento do fungo nos pulmes, a infeco pode se
disseminar para os outros rgos do corpo. A principal razo da morte dos pacientes
a baixa eficincia das drogas disponveis para o tratamento. A importncia clnica
crescente aumentou muito o interesse pelo estudo de diversos aspectos da biologia
de A. fumigatus [14].
A. nidulans tem sido um dos principais sistemas-modelo em gentica e
biologia molecular nos ltimos 50 anos e o seu estudo contribuiu muito para a melhor
compreenso de diversos processos celulares importantes, como mitose, expresso
gnica e desenvolvimento. O gnero Aspergillus tambm tem contribudo para o
entendimento do metabolismo secundrio em fungos e para o estudo de metablitos
secundrios economicamente importantes, como as aflatoxinas e penicilinas [15, 16].
1.6 - Fungos 31

A. nidulans normalmente isolado do solo e tambm pode ocorrer como bolor


em alimentos [17]. Algumas espcies do gnero Aspergillus, como A. nidulans,
possuem reproduo assexuada e reproduo sexuada conhecida, mas, na maioria
das espcies, a reproduo sexuada ainda desconhecida [18].
A. fumigatus causa a maioria das aspergiloses em humanos, que a infeco
fngica mais comum em pacientes hospitalizados, depois das micoses causadas por
Candida albicans. O fungo causa micoses como a aspergilose bronco-pulmonar
alrgica e a aspergilose, principalmente em pacientes imunocomprometidos [13, 17].
O gnero Metarhizium compreende diversas espcies que so frequentemente
utilizadas como alternativa aos inseticidas qumicos, para o controle de vetores
de doenas e de pragas agrcolas em diversos pases. A maioria das espcies
cosmopolita. Alm do ciclo patognico, muitas espcies vivem como saprfitas, ou
seja, se alimentam da decomposio de matria orgnica e podem ser facilmente
isoladas de amostras de solos [19]. A taxonomia do gnero Metarhizium sempre foi
problemtica e vem passando por revises peridicas. Apenas recentemente, com a
utilizao de uma abordagem filogentica multigene, foi possvel desdobrar espcies
crpticas como Metarhizium anisopliae [20].
Dentre os fatores ambientais que afetam o crescimento dos fungos, a luz um
dos principais. Sua presena durante o crescimento de fungos altera seu metabolismo
induzindo a biossntese de pigmentos com os carotenoides nos Aspergillus. A
biossntese de carotenoides ocorre desde o azul do espectro visvel at o ultravioleta
e sua eficincia varia com o comprimento de onda, o que sugere o envolvimento de
algum fotorreceptor. O mesmo efeito observa-se por exemplos nos Aureobasidium
pullulans, porm ocorre a produo de pigmentos pretos de melanina estimulada
pela a luz [21].
Os sensores de luz em fungos e consequentemente o controle da luz tem sido
um foco importante das pesquisas nos ltimos anos [22]. Um exemplo desses estudos
a espcie A. nidulans que forma esporos assexuais na presena de luz, mas prefere
a reproduo sexual na ausncia de luz [23, 24].
Outro fator o pH do meio sobre o crescimento de fungos, que embora
estudado, possui valores limitados na literatura. Isso porque embora o pH inicial
do meio possa ser conhecido, o prprio metabolismo do fungo altera tambm o pH
1.6 - Fungos 32

pela produo de cidos orgnicos ou amnia, por exemplo.


Essa diferena na concentrao de ons no meio pode afetar o crescimento
do fungo. Entretanto, se houver nutrientes necessrios, o fungo crescer bem no
intervalo de pH de 4 at 7. O fungo que produz cidos orgnicos capaz de tolerar
condies at mais cidas [21].
A produo de aflatoxina, como a de penicilina em Aspergillus, influenciada
pelo pH do meio de crescimento. No pH 4,0 ou inferior sua produo mxima [25].
No entanto, outros estudos concluram que o pH inicial do meio no um fator
determinante para a produo de micotoxinas. O efeito do pH sobre a biossntese
de aflatoxina dependente da composio do meio de crescimento [26]. Assim,
as complexas interaes entre pH e outros fatores ambientais que influenciam a
diferenciao morfolgica e qumica ainda no so completamente elucidadas [27].
Assim, novas tcnicas para avaliar a estrutura celular e sua composio podem
fornecer informaes valiosas sobre a biologia do fungo e melhorar nossa capacidade
de compreender e controlar o seu metabolismo [28].
A busca por novas tcnicas de anlise, identificao e classificao de fungos
encontra na espectroscopia uma tcnica rpida e possivelmente eficaz para seus
objetivos.
Captulo 2
Motivao & Objetivos

os ltimos anos o nmero de infeces fngicas cresceu coincidente com o


N aumento dos pacientes imunocomprometidos. Estas infeces so devidas
principalmente a deficincias nos mecanismos de defesa do hospedeiro, como
consequncia de infeces virais, especialmente a do vrus da imunodeficincia
humana (HIV) e doenas hematolgicas como diferentes tipos de leucemia. Muitos
procedimentos clnicos e tratamentos, como: cirurgias, cateteres, quimioterapia,
antibiticos e esteroides, tambm so fatores de risco para infeces [29]. No entanto,
estes procedimentos so necessrios tornando o tempo de identificao dos agentes
patgenos fundamental para o tratamento, podendo afetar a efetividade do mesmo
[30].
Os sistemas de identificao disponveis em hospitais baseiam-se nas
caractersticas fisiolgicas e nutricionais desses microrganismos, demorando cerca
de 1-5 dias para as bactrias e 1-2 semanas para fungos [31]. Entre as tcnicas que
oferecem anlise rpida, os mtodos envolvendo biologia molecular so considerados
os mais rpidos e sensveis para identificao de agentes patgenos, sendo a maioria
desses testes direcionados para o sequenciamento do cido desoxirribonucleico
(DNA) para a uma identificao especfica [32, 33]. Entretanto, estas tcnicas
moleculares de diagnstico so caras, e podem fornecer tanto resultados falsos
positivos como falsos negativos [34, 35].
Fungos patgenos pertenciam antes a um grupo bem definido, limitando-se
a regies geogrficas e sendo bem conhecidos. Entretanto, a situao mudou
consideravelmente com novos agentes infecciosos continuamente aparecendo, sendo

33
2.1 - Objetivos 34

em torno de 20 espcies identificadas estando associadas a infeces humanas [29].


Estes novos agentes patognicos oportunistas podem ter causado infeces que
passaram despercebidas devido ao diagnstico inadequado. Esta situao criou um
crescente interesse na sistemtica de fungos. A taxonomia fngica uma disciplina
dinmica e progressiva que, consequentemente, exige mudanas na nomenclatura.
Outra dificuldade que os fungos so na sua maioria classificados segundo sua
aparncia. Assim, diferentes conceitos tm sido aplicados na taxonomia de fungos
[29] e consequentemente, novas tcnicas tem buscado homogeneidade e rapidez na
identificao desses microrganismos.
As tcnicas espectroscpicas destacam-se devido sua sensibilidade, rapidez
e baixo custo. Fornecendo informaes qualitativas e quantitativas sobre uma dada
amostra [33]. O espectro de absoro de qualquer composto conhecido por fornecer
muitas informaes contidas nos picos espectrais [36]. Assim, a tcnica de FTIR para
a deteco e identificao de microrganismos j usada e consolidada tambm para
a deteco e caracterizao de clulas cancerosas [9, 10], clulas infectadas com vrus
[37], para rastrear substncias farmacolgicas injetadas em animais [38].
Entre suas aplicaes biolgicas, o uso especfico em fungos data quase 15
anos, onde foi aplicada com sucesso na deteco de fungos em alimentos [39],
deteco de fungos em madeira em decomposio [40], diferenciao de fungos entre
outros microrganismos [41], avaliao das condies de crescimento dos fungos [28],
identificaes de interesse mdico [42, 43] e na identificao de infeces causadas
por fungos e bactrias [33].

2.1 Objetivos
O objetivo geral deste trabalho a anlise comparativa entre as metodologias
empregadas na espectroscopia vibracional. Metodologias estas que visam diferenciar
e classificar fungos.
Para o xito deste objetivo, outros mais especficos foram estabelecidos.
Primeiramente obter os espectros vibracionais de diversas linhagens de fungos e
identificar fatores que afetem seu crescimento e que possam ser reproduzidos em
laboratrio, como a presena de luz e o pH do meio de cultura.
2.1 - Objetivos 35

A partir dos espectros de absoro, identificar regies ou bandas que


apresentem alteraes capazes de diferenciar as amostras e correlaciona-las
bioquimicamente. Analisar essas regies dos espectros de absoro atravs do
deslocamento dos picos, da razo entre as reas sob as bandas e da anlise de
componentes principais.
Aplicar a anlise por conglomerado para classificar as espcies e gneros
de fungos utilizados, correlacionando o resultado final com a taxonomia hoje
estabelecida.
Captulo 3
Metodologia

tilizando a Espectroscopia por FTIR como tcnica fundamental deste


U estudo, buscou-se identificar e diferenciar algumas linhagens fngicas. A
metodologia deste trabalho apresenta-se subdividida em quatro partes. A primeira
consiste na apresentao do nosso objeto de estudo, no caso, amostras de linhagens
com sua respectiva classificao taxonmica.
A segunda parte apresenta o cultivo dos fungos. Antes da coleta dos
espectros verificou-se microscopicamente se a retirada dos condios era realizada
sem contaminao de outras estruturas e possveis interferncias do meio de cultura
nos espectro. Na terceira parte, a obteno dos espectros de absoro descrita
juntamente com os testes preliminares realizados.
A anlise dos espectros contida na ltima parte baseou-se inicialmente em
verificar a repetitividade dos espectros e identificao bioqumica das bandas. Em
seguida, quatro anlises diferentes foram realizadas: deslocamento dos picos de
absoro; razes entre reas sob bandas; anlise por componente principal e anlise
por agrupamento.

3.1 Objetos de estudo


Foram empregadas oito linhagens pertencentes a dois gneros distintos:
Aspergillus e Metarhizium. A escolha das amostras teve como objetivo avaliar a
capacidade da tcnica e das metodologias empregadas para diferenciar amostras
em funo dos seus diferentes nveis de similaridade, ou seja, amostras de gneros
diferentes, espcies diferentes, linhagens diferentes dentro da mesma espcie e

36
3.2 - Cultivo dos fungos 37

variaes dentro da mesma linhagem. Os dois gneros escolhidos so bem estudados


na literatura, sendo o Aspergillus um modelo de sistema biolgico e o Metarhizium
muito aplicado como bioinseticida.
Sabendo que o ambiente exerce grande influncia sobre o crescimento dos
fungos, escolheu-se dentro de cada gnero uma linhagem para conduzir a avaliao
de alguns destes fatores. Assim, as linhagens Aspergillus nidulans (ATCC 100714)
e Metarhizium acridum (ARSEF 324) foram empregadas para o estudo da presena
de luz e a variao do pH do meio de cultura durante o crescimento desses
microrganismos.

3.1.1 Linhagens
Foram usadas as linhagens Aspergillus nidulans (ATCC 10074) e Aspergillus
flavus (ATCC 1410) com condios brancos e verdes do gnero Aspergillus
e Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum (ARSEF 7486);
Metarhizium anisopliae (ARSEF 2575); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095);
Metarhizium brunmeum (ARSEF 5626) do gnero Metarhizium. As linhagens de
Aspergillus foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas,
VA) e as linhagens de Metarhizium foram obtidas da USDA - ARSEF collection
of Entomopathogenic Fungal Cultures (U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory,
Ithaca, NY).
As espcies fngicas foram agrupadas segundo a taxonomia hoje conhecida e
descrita na Figura 3.1. Note-se os quatro nveis de similaridade entre as linhagens:
h gneros diferentes, espcies diferentes, linhagens diferentes da mesma espcie e
variaes na cor do condio dentro da mesma linhagem. O reino Fungi compreende
muitos outros filos, assim como o filo Ascomycota compreende muitos outros gneros
alm dos que esto apresentados no diagrama abaixo, porm este grupo amostral
foi selecionado para aplicao da metodologia de interesse.

3.2 Cultivo dos fungos


O meio de cultura foi preparado em placas de Petri (90 x 15 mm), contendo
23,0 mL de meio PDA (Potato Dextrose Agar ou gar batata) (Difco, EUA) sem
3.2 - Cultivo dos fungos 38

Figura 3.1: Classificao taxonmica dos fungos usados neste trabalho. O reino Fungi
apresenta diversos filos, entre eles o Ascomycota. Os gneros Metarhizium e Aspergillus
empregados neste trabalho pertencem a este Filo. Do gnero Metarhizium seis linhagens
foram utilizadas, enquanto duas do gnero Aspergillus foram utilizadas.

qualquer outra suplementao. As placas com meio foram preparadas um dia antes
da inoculao dos fungos para garantir que no havia contaminao.
Foram preparados 2,0 mL de suspenso de condios em soluo 0,01% (v/v)
de tween-80 (Sigma - Aldrich, EUA) em tubos de vidro (Schott GL 18, EUA).
A concentrao de condios foi determinada atravs da contagem na cmara de
Neubauer (Boeco, Alemanha) e a concentrao final das suspenses foi ajustada para
1, 0 108 clulas mL1 . Foram inoculados 100, 0 L de suspenso em cada placa e
para cada experimento foram preparadas trs placas de cada linhagem para garantir
a repetitividade do experimento. As placas foram incubadas em uma Incubadora
B.O.D 411D (Nova tica, Brasil) por 12 dias (Metarhizium) e 5 dias (Aspergillus),
no escuro, a 28 C. Aps esse perodo, as placas foram retiradas da incubadora e
levadas imediatamente para a coleta dos espectros de infravermelho.
Para anlise da influncia da luz, o procedimento de preparao das
amostras foi semelhante ao descrito anteriormente. Foram preparadas seis placas
de Aspergillus nidulans (ATCC10074) e seis de Metarhizium acridum (ARSEF
3.3 - Espectroscopia por FTIR 39

324). Trs placas de cada amostra foram crescidas no escuro e trs crescidas na
mesma incubadora com ciclo de 12 horas de claro/escuro usando duas lmpadas
fluorescentes Daylight Plus F30W/155-T8 (Sylvania, Germany).
No momento da preparao do meio de cultura, a variao do pH foi feita
utilizando solues de hidrxido de sdio e cido clordrico. Para cada valor usado,
no caso pH 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0 e 8,0, foram preparadas seis placas, sendo todas
verificadas com um pHmetro. Em trs dessas placas foram cultivados Aspergillus
nidulans (ATCC10074) e nas outras trs Metarhizium acridum (ARSEF 324).
Todo o cultivo e crescimento dos fungos foram supervisionados por um
profissional experiente no manuseio e cultivo dos mesmos, Prof. Dr. Gilberto bida
Leite Braga da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, colaborador
deste trabalho.

3.3 Espectroscopia por FTIR


Foi empregado o espectrmetro Nicolet 380 (Thermo Nicolet, USA) acoplado
ao acessrio denominado de reflexo totalmente atenuada (ATR) Durascope (Smiths
Detection, USA).
Os espectros foram adquiridos com resoluo de 4 cm1 sobre a regio
espectral de 4000-400 cm1 . O acessrio de ATR equipado com um cristal de
diamante que permite obter espectros de absoro entre 4000-700 cm1 , devido
alta absoro na regio espectral referente a 700-400 cm1 . Este aparelho apresenta
uma rea til de 250 m de dimetro, onde a amostra posicionada.

3.3.1 Testes Preliminares


Antes da aquisio dos espectros de absoro, obtiveram-se os espectros de
absoro do meio de cultura. Estes espectros foram obtidos usando os mesmos
parmetros de resoluo e intervalo usados para os demais espectros das linhagens.
O espectro est apresentado na Figura 3.2.
O meio de cultura utilizado, PDA, composto por extrato de batata, dextrose
e gar. A batata composta por carboidratos com ligaes C-O. A dextrose o nome
dado a Glicose-D que, como os outros acares, possui ligaes C-OH, podendo ter
3.3 - Espectroscopia por FTIR 40

Figura 3.2: Espectro do meio de cultura usado para o crescimento dos fungos.Destaque
na regio de 900-1200 cm1 para melhor visualizao. O espectro apresenta picos em 3300
cm1 , 1630 cm1 e de 900 a 1200 cm1 .

C=O na forma aberta e C-O no anel, como ilustrado na Figura 3.3. O gar um
polmero composto por monmeros de acar tendo sua estrutura similar a dextrose,
mas com muitas ligaes C-OH.

Figura 3.3: Estrutura da dextrose.


3.3 - Espectroscopia por FTIR 41

As ligaes citadas acima e os picos encontrados no espectro de infravermelho


da Figura 3.2 esto correlacionados na Tabela 3.1 .

Tabela 3.1: Associao bioqumica das bandas encontradas no espectro de absoro do


meio de cultura, PDA [44, 45]. A letra representa estiramento e flexo.

Pico (cm1 ) Associao bioqumica


931 (C-C)
966 (CH2 OH)
990 (C-O), (COH)
1014 (C-O), (C-C), (COH)
1044 (C-O), (C-C), (COH)
1075 (C-O), (C-C), (COH)
1152 (C-O)
1181 (C-O)
1635 (C=O)
3308 (O-H)

A retirada dos condios das placas de Petri foi feita atravs de leves batidas na
placa para que os condios se desprendessem, e quando necessrio uma ala era usada
para remover apenas os condios. Entretanto, outras estruturas do fungo, como
hifas poderiam se desprender e interferir no espectro. Para verificar as estruturas
do fungo possivelmente presentes na anlise, o material desprendido foi observado
no microscpio. A Figura 3.4 apresenta uma das imagens obtidas sem a necessidade
de usar corantes, apenas a soluo de tween.
Todas as imagens obtidas foram semelhantes a anterior. Por ela observamos
apenas a presena de condios na amostra e garantimos o procedimento proposto
para obteno dos condios.

3.3.2 Aquisio dos espectros


Imediatamente aps o crescimento, as amostras eram transportadas para o
Laboratrio de Espectroscopia Vibracional do Departamento de Fsica, USP, para
3.4 - Anlise de Dados 42

Figura 3.4: Imagem microscpica dos condios retirados pelo procedimento usado neste
trabalho.

realizar a medida experimental. Inicialmente foi feita uma medida de absorbncia


sem nenhuma amostra no cristal do ATR. Esta medida chamada de background.
Em seguida, os condios foram depositados cobrindo todo o cristal do ATR e o
espectro foi coletado. Para obter maior contato entre o cristal de diamante e a
amostra, uma presso aplicada sobre a amostra com o prprio aparelho.
A aquisio dos espectros de absoro foi realizada utilizando passo de 4 cm1
e 32 repeties por espectro. Todas as amostras foram crescidas em triplicada. De
cada placa foram coletados dez espectros totalizando trinta espectros para cada
amostra.

3.4 Anlise de Dados


O pr-processamento dos dados se iniciou com a normalizao vetorial dos
espectros de absoro. Aps a normalizao vetorial dos dados, quatro anlises
diferentes foram aplicadas aos dados: deslocamento do pico de absoro, anlise
por razes entre reas, anlise de componentes principais (PCA) e anlise por
3.4 - Anlise de Dados 43

agrupamento. Os dados sero apresentados subdivididos em funo do objetivo


de estudo: influncia da luz, influncia do pH, classificao entre espcies e gneros.

Figura 3.5: Espectro de absoro de uma amostra do fungos Aspergillus nidulans (ATCC
10074) crescido na ausncia de luz. O espectro foi subdividido em trs regies: regio I
(910-1178 cm1 ), regio II (1178-1490 cm1 ), regio III (1490-1790 cm1 ) e a regio IV
(2810-2990 cm1 ).

A Figura 3.5 ilustra o espectro normalizado do fungo Aspergillus nidulans


crescido na ausncia de luz. O intervalo de 2000-2500 cm1 foi retirado do espectro
para melhor visualizao sem perda significativa de informao. O espectro foi
subdividido em quatro regies para a anlise:

I. 910-1178 cm1

II. 1178-1490 cm1

III. 1490-1790 cm1

IV. 2810-2990 cm1

Esta subdiviso foi feita para poder visualizar cada intervalo do espectro com
maior detalhamento, assim como identific-los bioquimicamente e empregar todas
3.4 - Anlise de Dados 44

as metodologias aqui propostas em cada um deles. Sendo assim, todas as sees e


subsees deste trabalho apresentam-se tambm subdivididas nas mesmas regies.

3.4.1 Normalizaao vetorial [46]


Para a normalizao vetorial dos dados foi utilizado o programa Origin 8.5
que possui a ferramenta "normalizao pela norma". Embora o nome dado seja
diferente, a manipulao matemtica dos dados a mesma demonstrada a seguir.
O espectro dado em uma tabela tendo a coluna x com os valores de nmero
de onda e a y com os respectivos valores de absoro. Esta tabela pode tambm
ser entendida como um vetor, de onde calcularemos a norma. O primeiro passo o
calculo do valor mdio (ym ) do espectro composto por y valores:
P
k yk
ym = (3.1)
N
Onde N o nmero total de pontos e o ndice k varia de um at N. Este valor
mdio ento subtrado do espectro, que tem o efeito de centralizar o espectro em
torno de y = 0:

ybk = yk ym (3.2)

A soma dos quadrados de todos os valores ybk ento calculada e o espectro


dividido pela raiz quadrada da presente soma:

ybk
Yk = p P (3.3)
yk )2
k (b

Isso significa que o vetor da norma do espectro resultante 1. Todos os


espectros apresentados nesta dissertao esto normalizados.

3.4.2 Deslocamento dos picos de absoro


Os deslocamentos dos picos de absoro so determinados pela derivada de
segunda ordem dos espectros de absoro. Este clculo enfatiza as posies das
bandas de absoro j que todas as derivadas reduzem ou eliminam os efeitos da linha
de base e de fundo, sendo por este motivo frequentemente utilizada na espectroscopia
[47].
3.4 - Anlise de Dados 45

Este procedimento foi detalhado no Captulo 1 deste trabalho, porm


vale ressaltar a utilizao dos grficos da segunda derivada para verificar os
deslocamentos dos picos das bandas de absoro.

3.4.3 Anlise por Razes


De acordo com o que foi exposto na introduo e com a literatura corrente
[48], a banda de amida I, localizada em torno de 1650 cm1 , foi empregada como
referncia para este clculo. Esta banda est localizada na regio III do espectro,
juntamente com a banda de amida II posicionada em 1550 cm1 .
Para o clculo individual das bandas optou-se por recortar os quatro
intervalos e aplicar sobre a mdia deles a derivada de segunda ordem para verificar
os valores do pico de cada banda. Estes valores foram empregados na ferramenta
chamada "anlise de pico", disponvel no programa Origin 8.5, que cria uma rotina
para o ajuste das bandas em cada intervalo proposto. Como resultado, programa
fornece o valor individual do pico e da rea sob cada banda, como ilustrado na
Figura 3.6.
O ajuste de picos foi aplicado para determinar os picos e tambm as reas
sob cada banda dos quatro intervalos. Os valores das reas de cada banda foram
divididos pelos valores das reas da amida I do respectivo espectro. O teste
estatstico t-Student com p < 0, 05 foi aplicado para cada razo entre reas para
verificar se havia diferena entre os grupos de interesse, sejam fungos crescidos na
presena e na ausncia de luz, diferentes pH, diferenas entre gneros e espcies.

3.4.4 Anlise de Componentes Principais


A anlise de componentes principais foi realizada pelo programa Minitab
16. Cada uma das quatro regies foi analisada individualmente com a ferramenta
de anlise de discriminante com a matriz de covarincia conforme apresentado na
introduo deste trabalho. Apenas os valores das componentes principais PC1 e PC2
foram calculados visto que j acumulavam a maior parte dos dados, sendo acima de
67% .
A anlise de componentes principais foi aplicada tanto para verificar a
influncia da luz, pH do meio, como para diferenciar as espcies e gneros de fungos.
3.4 - Anlise de Dados 46

Figura 3.6: Um exemplo do resultado gerado pelo ajuste de picos atravs do programa
Origin 8.5 para o intervalo I do espectro de absoro do A. nidulans com 12 bandas
determinadas pela derivada de segunda ordem.

3.4.5 Anlise de Agrupamento


A anlise de agrupamento tambm foi realizada pelo mesmo programa,
Minitab 16. O conjunto de dados tambm subdividido nas quatro regies foi
analisado individualmente. No programa os parmetros distncia Euclidiana e
mtodo hierrquico de Ward foram selecionados, como apresentado na introduo
deste trabalho.
Esta anlise foi aplicada apenas para o item de classificao dos fungos, no
sendo empregada no estudo da influncia da luz ou do pH, j que seu objetivo foi
classificar hierarquicamente as linhagens e comparar com a classificao taxonmica
vigente.
Captulo 4
Resultados e Discusso

om o foco na anlise comparativa entre as tcnicas para anlise do espectro


C de absoro, a apresentao dos resultados pode ser feita de duas formas: em
funo das tcnicas ou em funo dos parmetros analisados (luz, pH e classificao).
Optou-se por dividir a anlise em funo desses trs parmetros e em cada um
comparar as tcnicas de anlise (deslocamento dos picos, razo entre reas, PCA e
anlise por agrupamento).
Ao subdividir os resultados em funo dos parmetros, ou dos trs estudos
realizados, a primeira parte apresenta o estudo da influncia da luz no crescimento
dos fungos e a segunda aborda a variao do pH do meio de cultura. Em ambas as
anlises foram usadas apenas as espcies A. nidulans(ATCC10074) e M. acridum
(ARSEF 324).
A terceira e ltima parte apresenta todos os dados a fim de classific-los
hierarquicamente e compar-los com sua taxonomia. Nesta etapa foram usadas
todas as espcies j anteriormente citadas e representadas na Figura 3.1.
A Figura 4.1 refere-se ao espectro de absoro do M. acridum (ARSEF 324)
crescido na ausncia de luz com destaque para as principais ligaes de cada uma
das quatro regies. Todos os espectros apresentados para cada linhagem neste
trabalho so, na verdade, a mdia dos trinta espectros obtidos e j individualmente
normalizados vetorialmente.
Os espectros de absoro dos fungos so compostos de polissacardeos,
ligaes P=O de fosfodisteres, amidas, sebo, ligaes CH2 e CH3 de lipdios e
gua [46-48].
Na Figura 4.2 observa-se o espectro mdio dos grupos experimentais nos

47
4 - Resultados e Discusso 48

Figura 4.1: Espectro de absoro no infravermelho do Metarhizium acridum(ARSEF


324) crescido na ausncia de luz. Este espectro tpico para todas as amostras de
fungos deste trabalho e apresenta as principais bandas de absoro e suprime a regio
de 1800-2600 cm1 .

quais se verificou alteraes qualitativas. Estes grupos sero avaliados pelas tcnicas
propostas nas prximas sees, mas aqui ser feito breve resumo sobre as alteraes
observadas.
A Figura 4.2a apresenta a espcie A. nidulans crescida na presena e na
ausncia de luz. Os dois espectros apresentam grande semelhana. O intervalo de
910-1740 cm1 apresenta uma absorbncia mais elevada para a cultura crescida na
presena de luz. Apesar dessa diferena ambos os espectros apresentam as mesmas
bandas de absoro.
A segunda figura (4.2b) apresenta a variao do espectro do A. nidulans
(ATCC 10074) com o pH do meio de cultura. Novamente observamos variaes
na amplitude do espectro no intervalo de 910-1740 cm1 , observa-se tambm um
aumento na absorbncia no intervalo entre 2600-4000 cm1 . No intervalo de
4 - Resultados e Discusso 49

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.2: Quatro comparaes diferentes entre os grupos amostrais.No item a


comparou-se a espcie A. nidulans (ATCC 10074) crescida na presena e na ausncia
de luz. No item b a mesma espcie foi comparada variando o valor do pH do meio de
cultura. No item c as espcies A. nidulans (ATCC 10074) e a M. acridum (ARSEF 324)
foram empregadas para comparao entre dois gneros diferentes ao qual cada um deles
pertence. O item d faz a comparao entre diferentes espcies dentro do mesmo gnero,
no caso Aspergillus.

910-2810 cm1 , que cobre quase todo o espectro, a absorbncia parece aumentar
com o aumento do pH do meio de cultura.
Os dois gneros de fungos diferentes foram comparados na Figura 4.2c atravs
das amostras de A. nidulans e de M. acridum. O espectro apresenta grande
variao na intensidade de absorbncia entre os dois gneros. A banda referente
a cidos graxos, ou sebo, localizada em 1700 cm1 , de sebo, est presente apenas
no M. acridum. No intervalo de 2810-2990 cm1 observa-se uma grande variao
na absorbncia das bandas referentes s ligaes de CH2 e CH3 . Estas primeiras
4.1 - Influncia da Luz 50

observaes indicam a possibilidade de diferenciao e classificao de fungos usando


a tcnica de FTIR.
A Figura 4.2d apresenta dois espectros provenientes de duas espcies
diferentes de fungos dentro do mesmo gnero: A. nidulans e A. flavus (com condios
verdes). Os espectros possuem variaes de absorbncia como tambm observado
nos espectros anteriores, tanto nas bandas de polissacardeos, ligaes fosfato e
amidas. Porm, as bandas de absoro so as mesmas em todo o espectro.
Dos espectros anteriormente apresentados na Figura 4.1 observamos que
os intervalos correspondentes a polissacardeos, ligaes fosfato e amidas, que
correspondem aos intervalos I, II e III j definidos, sempre apresentaram algum tipo
de variao. Na maior parte dos espectros essa variao corresponde absorbncia
das bandas, sendo um grupo superior ao outro. As bandas de polissacardeos,
intervalo I, e as bandas referentes a ligaes fosfato, intervalo II, foram as que maiores
variaes apresentaram tendo a posio de algumas bandas deslocadas.
No foram observadas variaes na posio das bandas de amida localizadas
no intervalo III em todos os espectros, tendo apenas diferentes os valores de
absorbncia apenas em funo da amostra. A banda de amida I localizada nessas
amostras em torno de 1650 cm1 refere-se ao estiramento (C=O) acoplado a flexo
(N-H) e ao estiramento (C-N) das ligaes peptdicas [49, 50], a rea desta banda
ser ser o denominador da razo entre as reas das bandas do espectro.
As ligaes CH2 e CH3 de lipdios, localizadas entre 2800-3000 cm1
apresentam poucas alteraes nas comparaes feitas anteriormente na Figura 4.1,
com exceo da comparao entre gneros, podendo indicar diferente quantidade
desses lipdios entre os dois gneros em questo.
Assim, verifica-se que os intervalos anteriormente definidos possuem variaes
espectrais entre os grupos comparados e podem ser empregados na espectroscopia
no infravermelho para anlise de influncias e taxonomia de fungos filamentosos.

4.1 Influncia da Luz


A luz um dos vrios estmulos ambientais que desencadeiam e coordenam
esses diversos processos, principalmente alteraes na produo de metablitos
4.1 - Influncia da Luz 51

secundrios [51]. O tipo de desenvolvimento sexual da espcie A. nidulans depende


da presena ou ausncia de luz, isso torna esta espcie um dos focos de estudo quando
se trata da influncia da luz. A formao de esporos assexuais ocorre quando o fungo
cresce na presena de luz, mas a reproduo sexual ocorre quando seu crescimento
no escuro [22, 23, 24], como ilustrado na Figura 4.5.
J o gnero Metarhizium tem algumas de suas espcies utilizadas como
bioinseticidas no campos. Para isso, suas espcies so estudadas sob diversos fatores
ambientais assim como sua resposta ou tolerncia da radiao solar [52, 53, 54].
Sabendo que a luz exerce influncia sobre essas duas espcies de fungos,
espera-se que os espectros de absoro tambm apontem para essas alteraes e que
essas possam assim ser detectadas pela espectroscopia de FTIR.

4.1.1 Aspergillus nidulans


O espectro mdio de absoro no infravermelho da espcie de A. nidulans
crescido na presena e na ausncia de luz est apresentado na Figura 4.3 e
subdividido em intervalos de interesse para anlise. Esses intervalos so numerados
de I a IV da mesma maneira como foi apresentado no Captulo 3 deste trabalho.
Alm de subdividir os espectros de absoro em quatro intervalos, para
facilitar as interpretaes, as figuras sero apresentadas da mesma forma que a
Figura 4.4, mostrando o espectro e sua respectiva derivada de segunda ordem. Cada
ponto de mnimo da segunda derivada corresponde ao pico ou ponto mximo de uma
banda do espectro. Este processo matemtico visa observao dos deslocamentos
dos picos, onde os pontos de mnimo no coincidem ou variam em funo de algum
parmetro, como o pH.
A Figura 4.4 refere-se aos quatro intervalos do A. nidulas com crescimento
na presena e ausncia de luz, a identificao de cada intervalo feita atravs
da numerao do mesmo. O intervalo I, entre 910-1178 cm1 , apresenta grandes
deslocamentos dos picos, alm da variao de intensidade dos mesmos e como
possvel verificar em 925 cm1 , h uma banda presente apenas no espectro de
absoro referente ao A. nidulans crescido no escuro.
Da mesma forma o intervalo II do espectro, compreendido entre 1178-1490
cm1 , apresenta deslocamentos dos picos em todo o intervalo, com destaque para os
4.1 - Influncia da Luz 52

Figura 4.3: Espectro mdio de absoro no infravermelho da espcie de fungo


Aspergillus nidulans (ATCC 10074) crescido na presena e na ausncia de luz. O
espectro apresenta-se subdividido nas quatro regies de interesse que j foram previamente
definidas. A anlise ser realizada baseando-se nessas quatro regies.

picos localizados em 1200 cm1 e 1375cm1 com maior intensidade no espectro do


A. nidulans crescido no escuro.
Os intervalos III e IV compreendidos entre 1490-1790 cm1 e 2810-2990 cm1
respectivamente apresentam menor razo sinal/rudo do que os espectros anteriores.
A suavizao dos espectros foi realizada, entretanto no se observa deslocamentos
de picos como nos intervalo anteriores.
Com os valores do pico de absoro determinados atravs da segunda
derivada do espectro, a Tabela 4.1 apresenta os valores mdios para cada pico com
seus respectivos desvios padro e associaes bioqumicas[20] para identificao e
caracterizao das bandas.
4.1 - Influncia da Luz 53

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.4: Espectros de absoro no infravermelho da espcie A. nidulans com


crescimento na presena e na ausncia de luz. Os espectros apresentam-se subdivididos
nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d) 2810-2990
cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destacam-se os deslocamentos
de picos do primeiro e segundo intervalo.

Tabela 4.1: Apresentao dos valores mdios da posio das bandas de absoro com
seus respectivos desvios padro e associao bioqumica subdivida nas quatro regies em
estudo. Destacam-se as bandas que esto presentes apenas em um ou outro grupo. Nas
clulas em branco a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras ,
e referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes respectivamente.

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Associao Bioqumica

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

947,9 (2,3)

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 54

Tabela 4.1 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

956,3 (1,3)

959,3 (0,7)

971,7 (1,4) 972,1 (0,7) OCH3 Polissacardeos


e pectina

990,9 (0,7) 991,3 (0,4)

1009,1 (0,6) CO Desoxirribose

1014,9 (0,5)

I 1026,7 (0,9) CO Glicognio

1030,1 (0,3) CO Ribose \


Glicognio

1046,4 (0,9) 1046,1 (0,2) CO Glicognio

1065,2 (2,7) 1062,5 (0,6) CO Ribose \


Fosfodisteres

1076,9 (0,5) PO2 RNA

1080,7 (0,8) PO2

1105,4 (0,8) 1104,42 P-O-C Carboidratos


(0,9)

1124,4 (0,5) CO, CC Polissacardeos

1127,8 (1,9) CO Dissacardeos

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 55

Tabela 4.1 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

1146,5 (0,3) 1148,9 (1,4) CO Oligossacardeos

1201,8 (0,5) PO
2 Fosfato

1203,7 (0,2)

1226, 9 (0,7) 1225,7 (1,2) PO


2 Fosfato

1241,4 (1,3) PO
2 Fosfato

1262,1 (0,2) 1262,7 (1,4) PO


2 Fosfato

1282,4 (7,6) Amina III

1291,9 (0,3) N-H Timina

1310,5 (0,4) 1310,1 (0,8) Amida II

1325,2 (0,9)

1327,4 (1,7) C-N Timina \


Adenina

II 1339,3 (0,5) 1339,4 (0,6) Colgeno

1368,5 (0,2) 1368,0 (0,7) CH2 , CC Polissacardeos

1377,7 (0,2) 1378,8 (1,1) CH3

1399,5 (0,2) 1398,8 (0,4) CH3 Protenas \


Lipdios

1417,7 (0,5) CN e CH

1422,1 (0,3)

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 56

Tabela 4.1 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

1439,9 (0,5)

1450,2 (0,6) Metileno Biomolculas

1452,4 (0,5)

1464,5 (0,4) CH2 Lipdios

1471,9 (5,1) CH2 Lipdios

1514,7 (0,8) 1515,3 (0,3) CC Carotenides

1534,8 (0,8) Guanina\


Amida

1545,9 (0,7) 1546,5 (0,8) NH, CN Amida II

1570,2 (5,3) 1574,1 (0,3) Amida II

1595,3 (1,2) Anel C=C Citosina,


Adeninda

III 1601,3 (1,2) C=N, N-H Citosina,


Adenina

1619,9 (1,5) 1620,7 (1,6) cidos


nucleicos

1638,7 (1,0) 1639,2 (0,1) C=C, N-H Timina,


Adenina e
Guanina

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 57

Tabela 4.1 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

1657,1 (1,8) 1655,3 (2,0) NH, HN, Amida I


C=O

1680,4 (3,0) 1677,7 (1,9) C=O Guanina

1731,5 ster de
(21,2) cido graxo

2851,4 (0,7) 2851,2 (0,6) CH2

2876,5 (2,1) 2876,0 (1,9) CH3

2894,3 (1,4) 2895,5 (1,3) CH3

IV 2924,9 (0,8) CH

2926,8 (0,5) CH2 Lipdios

2957,6 (1,9) 2959,3 (0,9) CH3 Lipdios

Os resultados do teste estatstico aplicado s posies das bandas de absoro


esto apresentados na Tabela 4.2 juntamente com os valores das razes entre as reas
das bandas na presena e ausncia de luz pela banda de amida I (1657 e 1655 cm1
respectivamente) e o resultado do teste estatstico aplicado a essas razes mostrado
na ltima coluna da tabela.
Tabela 4.2: Apresentao do teste estatstico para a posio de cada banda de absoro
e tambm para os valores das razes das reas das bandas divididas pela rea da amida
I, localizada em torno de 1650 cm1 . Destacam-se em cinza as bandas que apresentam
diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi possvel realizar o teste devido a
falta da banda correspondente no outro grupo amostral.

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Razo pela banda da Amida I


4.1 - Influncia da Luz

Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student

947 0,053

956 0,122

959 0,069

971 972 0,1243 0,339 0,106 1, 24.1012

990 991 0,015 1,402 0,545 2, 82.1011

1009 1,902

1014 0,477

I 1026 1,779
58

Continua na prxima pgina. . .


Tabela 4.2 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student

1030 0,320
4.1 - Influncia da Luz

1046 1046 0,135 3,273 0,656 1, 98.1021

1065 1062 1, 64.106 0,596 0,146 7, 39.106

1076 0,575

1080 1,229

1105 1104 4, 26.105 1,170 0,453 9, 47.1021

1124 0,268

1127 0,059

1146 1148 1, 67.105 0,892 0,208 8, 24.1016

1201 0,077

Continua na prxima pgina. . .


59
Tabela 4.2 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student

1203 0,495
4.1 - Influncia da Luz

1226 1225 1, 67.105 0,892 0,208 8, 24.1016

1241 0,219

1262 1262 0,022 1,189 0,288 1, 34.1017

1282 0,007

1291 0,364

1310 1310 0,007 0,534 0,067 1, 15.1021

1325 0,023

1327

II 1339 1339 0,494 1,214 0,123 1, 80.1017

Continua na prxima pgina. . .


60
Tabela 4.2 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student

1368 1368 2, 93.104 1,110 0,132 9, 83.1023


4.1 - Influncia da Luz

1377 1378 5, 93.107 0,309 0,132 7, 55.1012

1399 1398 3, 0.1012 1,018 0,112 2, 97.1019

1417 0,138

1422 0,968

1439 0,372

1450 0,291

1452

1464 0,630

1471 0,014

Continua na prxima pgina. . .


61
Tabela 4.2 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student

1514 1515 0,001 0,548 0,069 3, 57.1017


4.1 - Influncia da Luz

1534 2,335

1545 1546 0,003 0,423 0,178 1, 67.1016

1570 1574 1, 90.104 2,999 0,168 1, 07.1017

1595 0,532

III 1601 1,301

1619 1620 0,048 4,242 0,187 3, 44.1023

1638 1639 0,006 2,316 0,281 5, 15.1020

1657 1655 9, 09.104 1 1

1680 1677 8, 53.105 0,186 0,177 0,758

Continua na prxima pgina. . .


62
Tabela 4.2 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student

1731 0,226
4.1 - Influncia da Luz

2851 2851 0,451 0,261 0,107 0,008

2876 2876 0,309 1,971 1,485 0,012

2894 2895 9, 29.104 0,208 0,089 2, 06.104

IV 2924

2926

2957 2959 2, 72.105 1,013 0,603 3, 48.106


63
4.1 - Influncia da Luz 64

Destacados em cinza esto apresentadas as bandas que so significativamente


diferentes. interessante notar a grande alterao encontrada, onde apenas
as bandas localizadas em 971, 1046, 1339, 2851 e 2876 cm1 so iguais pelo
deslocamento dos picos, enquanto apenas a banda localizada em 1677 cm1 igual
em relao a sua rea. Todas essas ligaes referem-se a ligaes C-O, C-H ou
colgeno.
Praticamente todas as ligaes dos quatro intervalos apresentaram-se
diferentes sob as duas condies de luminosidade, indicando grande influncia deste
fator ambiental. As bandas citadas anteriormente onde no houve deslocamento do
pico referem-se a cidos nuclicos, glicognio, colgeno, lipdios e guanina. Apenas
sabendo a identificao bioqumica no possvel correlacionar tais bandas com
alteraes estruturais.
Ao aplicar a anlise de componentes principais, PCA, aos dados de cada
intervalo, os grficos de disperso dos escores das componentes principais foram
obtidos, como apresentados pela Figura 4.5. Cada grfico apresenta os sessenta
pontos amostrais divididos nos dois grupos de interesse. O intervalo ao qual cada
grfico pertence est indicado na prpria legenda.
Os intervalos I e II apresentam a mesma distribuio com os pontos
pertencentes ao A. nidulans com crescimento na presena de luz localizados no
eixo positivo de primeira componente principal (PC 1) e os pontos pertencentes ao
A. nidulans com crescimento na ausncia de luz localizados no eixo negativos da PC
1.
O intervalo III apresenta os pontos amostrais distribudos em funo do eixo
da segunda componente principal, estando relativamente separados. Entretanto, o
intervalo IV apresenta a mesma disperso dos pontos, no havendo distino entre
as duas condies de crescimento.
Ao observar estes resultados, verificamos que as alteraes limitam-se as
regies referentes polissacardeos, ligaes fosfato e amidas que tentaremos
correlacionar com os processo bioqumicos envolvidos. A quantificao dos mesmos
pode ser feita, porm no ser pois no apresentar, neste caso, informaes
relevantes para concluso.
A Tabela 4.3 apresenta para a anlise de componentes principais os
4.1 - Influncia da Luz 65

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.5: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. nidulans (ATCC
10074) com crescimento na presena e na ausncia de luz para os quatro intervalos do
espectro de absoro. Nos intervalos I e II apresentados em (a) e (b) a distribuio dos
postos varia em torno de eixo de PC 1. No intervalo III, em (c), a distribuio dos pontos
varia em torno do eixo de PC 2. No intervalo IV mostrado em (d) no h distino dos
grupos j que os pontos se encontram sobrepostos.

respectivos autovalores, varincia explicada(%) e varincia acumulada (%) para a


Figura 4.5.
A tabela 4.3 nos apresenta a alta acumulao da varincia nas duas primeiras
componentes, sendo sempre superior a 86%. Estes resultados justificam a utilizao
de apenas PC1 e PC2 para anlise. Os autovalores representam a varincia das
componentes principais, sendo sempre a primeira componente com o maior valor e
as seguintes com valores decrescentes. Observa-se que a maior varincia acumulada
encontra-se no intervalo IV, entretanto o mesmo no distinguiu os grupos.
Atravs dos espectros de absoro da espcie A. nidulans com crescimento
4.1 - Influncia da Luz 66

Tabela 4.3: Tabela com os resultados estatsticos da anlise de componente principal


aplicada ao A. nidulas em duas condies de luminosidade. Observam-se os autovalores,
a varincia explicada e a varincia acumulada sempre superior a 86%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00363 88,0 88,0
I
PC2 0,00040 9,7 97,7
PC1 0,00084 80,9 80,9
II
PC2 0,00009 9,3 90,1
PC1 0,00136 58,3 58,3
III
PC2 0,00065 27,8 86,1
PC1 0,00375 87,5 87,5
IV
PC2 0,00048 11,2 98,7

em diferentes condies foi possvel observar variaes como deslocamento de picos,


diferentes valores para as razes entre as reas e a separao desses grupos em trs
dos quatro intervalos atravs do PCA.
Os fungos desenvolvem esporos assexuados, chamados condios, e estes
constituem a maior fonte de disseminao deste organismo. No caso da espcie A.
nidulans tambm possvel o desenvolvimento sexual travs da formao de corpos
de frutificao esfricos chamados de cleistothecia [55]. A esporulao assexual ou
sexual regulada pela expresso do gene velvet, ou veA [56]. A caracterizao do
veA tem mais de 50 anos, entretanto sua protena no apresenta homologia com
nenhuma outra protena com funo conhecida e este fato tem sido um obstculo
para entende-la [56]. Estudos adicionais deste gene em outros fungos forneceram
evidncias da sua relao com a ativao do desenvolvimento sexual e inibio do
desenvolvimento assexual [55].
O desenvolvimento regulado pela veA dependente da luz. Na espcie A.
nidulans a luz reduz e atrasa a formao de cleistothecia e o fungo se desenvolve
assexuadamente, enquanto no escuro o mesmo fungo se desenvolve sexualmente.
Este ciclo est representado pela Figura 4.6 com cada estrutura.
A espcie A. nidulas produz vrios metablitos secundrios, entre eles
4.1 - Influncia da Luz 67

Figura 4.6: Ilustrao do ciclo sexual e assexual da espcie A. nidulans na ausncia e na


presena de luz respectivamente. A partir da hifa, o fungo pode ter dois desenvolvimentos
diferentes dependendo do estmulo recebido. Fonte: adaptado de [22].

micotoxinas e o antibitico penicilina [57]. O veA est diretamente ligado com


o controle do metabolismo secundrio j que a produo de penicilina afetada por
ele, embora seu mecanismo ainda no seja conhecido [22].
A protena expressa por este gene contm ligaes comuns as protenas,
como N-H, C-H, C=O e C-OH. Observando a identificao bioqumica dessas
bandas verifica-se que elas so localizadas nos inervalos I e III. Desta forma, as
alteraes encontradas por todas as metodologias para esses dois intervalos podem
ser compreendidas.
Entretanto, o intervalo II tambm apresentam alteraes no espectro. Estas
alteraes podem ser correlacionadas com a produo de metablitos secundrios,
que so estruturas complexas com diversas ligaes ao longo do espectro de
infravermelho. Assim, embora possamos cmpreender algumas das alteraes do
espectro, torna-se difcil a indentificao individual de cada banda ou alterao
devido a complexidade das estruturas envolvidas.
4.1 - Influncia da Luz 68

4.1.2 Metahrizium acridum


O espectro mdio de absoro no infravermelho da espcie de M. acridum
crescido na presena e na ausncia de luz est mostrado na Figura 4.7 e tambm
subdividido da mesma forma em quatro regies. A primeira grande diferena que
observa-se a semelhana entre os espectros seja pelo perfil ou posio dos picos
assim como pela intensidade dos mesmos, diferentemente do que foi observado na
espcie anteriormente analisada.

Figura 4.7: Espectro mdio de absoro no infravermelho da espcie Metarhizium


acridum (ARSEF 324) crescido na presena e na ausncia de luz. O espectro apresenta-se
subdividido em quatro regies de interesse que sero analisadas separadamente. Observa-se
visualmente semelhana entre os espectros.

Os quatro intervalos apresentados abaixo na Figura 4.8 com suas respectivas


segundas derivadas no apresentam deslocamentos dos picos de absoro ou
mudana de perfil do espectro.
4.1 - Influncia da Luz 69

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.8: Espectros de absoro no infravermelho da espcie M. acridum com


crescimento na presena e na ausncia de luz. Os espectros apresentam-se subdivididos
nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c) 1490-1790 cm1 e d) 2810-2990
cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destaca-se os deslocamentos de
picos do primeiro e segundo intervalo.

Tabela 4.4: Valores mdios da posio das bandas de absoro com seus respectivos
desvios padro e associao bioqumica subdivida nas quatro regies em estudo. Nas clulas
em branco a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras , e
referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes respectivamente.

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Associao Bioqumica

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

933,2 (2,1) 932,1 (3,5)

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 70

Tabela 4.4 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

954,0 (1,3) 953,7 (0,9)

972,7 (1,0) 972,4 (0,7) PO4

990,8 (0,7) 990,8 (1,2)

1010,4 (0,7) 1010,0 (0,6) CO Desoxirribose

I 1022,4 (0,4) 1022,6 (0,5) Glicognio

1041,0 (0,6) 1040,9 (0,5) CO Ribose

1062,3 (1,1) 1062,1 (0,8) CO Ribose

1078,3 (0,7) 1078,1 (0,5) PO2 Fosfato

1107,7 (1,6) 1107,4 (1,3) CO, CC Polissacardeos

1155,5 (0,5) 1155,3 (0,7) CC Carotenides

1200,3 (1,3) 1200,6 (0,4) Colgeno \


Fosfato

1228,2 (0,5) 1228,1 (0,8) PO


2 Fosfato

1262,4 (3,7) 1261,6 (3,7) PO


2 Fosfato

1279,6 (3,8) 1280,2 (0,9) Colgeno \


Amida III

1314,3 (0,8) 1314,0 (0,8)

1341,8 (2,2) 1341,5 (3,3) Colgeno

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 71

Tabela 4.4 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

II 1358,4 (0,9) 1358,4 (1,4) CO, CH e


NH

1376,8 (0,7) 1376,9 (0,4) CH3

1399,3 (1,7) 1399,9 (0,7) CH3 Protenas

1416,7 (0,3) 1416,7 (0,3) CN, CH e


NH

1454,7 (0,3) 1454,6 (0,3) metil

1467,3 (3,6) 1467,8 (4,1) CH2

1479,3 (3,0) 1481,4 Amida II


(11,2)

1515,3 (0,5) 1515,4 (0,6) CC Carotenides

1545,9 (0,7) 1546,0 (0,5) NH, CN Amida II

1574,1 (4,2) 1574,6 (5,7) C=N Adenina

1595,3 (1,2) 1595,3 (1,2) Anel C-C

III 1620,2 (0,7) 1620,2 (0,7) cidos


nucleicos

1638,5 (0,7) 1638,5 (0,6) C=C, N-H Timina,


Adenina e
Guanina

Continua na prxima pgina. . .


4.1 - Influncia da Luz 72

Tabela 4.4 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz Qumica Biolgica

1657,9 (1,6) 1657,6 (1,8) NH, HN, Amida I


C=O

1686,6 1685,3 (9,5) Amida I


(11,4)

1742,7 (1,2) 1742,1 (1,6) C=O Lipdios

2852,2 (0,5) 2852,6 (0,9) CH2

2872,9 (3,1) 2873,7 (2,5) CH2

IV 2897,6 (1,7) 2895,1 (3,3) CH3

2924,4 (0,8) 2924,4 (0,8) CH2 Lipdios

2955,3 (1,7) 2956,41 CH3 Lipdios


(2,1)

Os picos de absoro determinados pela segunda derivada esto apresentados


na Tabela 4.4 com seus respectivos desvios padro e associaes bioqumica.
O teste estatstico t-Student foi aplicado aos valores do pico de absoro
com p < 0, 05 para verificar os deslocamentos de banda e as razes das reas pela
rea da banda de amida I. O resultado est apresentado na Tabela 4.5.
Tabela 4.5: Teste estatstico para a posio de cada banda de absoro e tambm para
os valores das razes das reas das bandas divididas pela rea da amida I, localizada em
torno de 1650 cm1 , para a linhagem M. acridum. Destacam-se em cinzal as bandas que
apresentam diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi possvel realizar o
teste devido falta da banda correspondente no outro grupo amostral.Nas clulas com o
ajuste no convergiu.
4.1 - Influncia da Luz

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Razo pela banda da Amida I

Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student

933 947 0,209 0,321

954 953 1, 59.106 0,684 0,081 0,304

972 972 0,012 0,101 0,165 1, 34.104

990 990 0,854 0,276 0,176 0,002

1010 1010 0,749 0,351 0,463 0,002

1022 1022 7, 85.104 0,128 0,394 4, 67.1015

1041 1040 6, 82.1010 0,914 0,518 2, 62.107

Continua na prxima pgina. . .


73
Tabela 4.5 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student

I 1062 1062 2, 18.107 0,108 0,368 1, 12.1012


4.1 - Influncia da Luz

1078 1078 0,096 0,324 0,452 4, 04.107

1107 1107 2, 71.106 0,591 0,239 9, 66.108

1155 1155 0,355 0,044 0,046 0,805

1200 1200 0,163 0,141 0,148 0,544

1228 1228 0,636 0,669 0,782 0,045

1262 1261 0,429 0,239 0,154 0,174

1279 1280 0,383 0,680 3,727 0,387

1314 1314 0,233 0,154 0,219 1, 30.104

1341 1341 0,647 0,159 0,192 0,087

Continua na prxima pgina. . .


74
Tabela 4.5 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student

II 1358 1358 0,875 0,232 0,217 0,533


4.1 - Influncia da Luz

1376 1376 0,392 0,486 0,609 1, 46.104

1399 1399 0,075 0,191 0,271 0,0052

1416 1416 0,843 0,674 0,635 0,414

1454 1454 0,353 0,537 0,719 4, 85.107

1467 1467 0,663 0,020 2, 26.105

1479 1481 0,334 0,013 0,313

1514 1515 0,722 0,096 0,102 0,446

1545 1546 0,454 1,256 1,418 0,016

1574 1574 0,678 0,392 0,247 6, 43.104

Continua na prxima pgina. . .


75
Tabela 4.5 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student

1595 1595 0,884 1,038 1,038 1


4.1 - Influncia da Luz

III 1620 1620 0,948 0,642 0,631 0,747

1638 1638 0,927 2,114 2,330 0,029

1657 1657 0,350 1 1

1686 1685 0,620 0,340 0,360 0,410

1742 1742 0,124 0,225 0,195 0,156

2855 2852 0,016 0,304 0,472 0,004

2872 2873 0,305 1,691 0,969 9, 16.104

IV 2897 2895 3, 49.104 0,286 0,394 0,026

2924 2924 0,994 2,088 2,007 0,517

Continua na prxima pgina. . .


76
Tabela 4.5 Continuao

Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student

2955 2956 0,033 0,899 0,657 0,003


4.1 - Influncia da Luz
77
4.1 - Influncia da Luz 78

A clula referente ao teste estatstico da banda localizada em 1657 cm1 est


em branco em todas as tabelas desse trabalho pois esta banda o denominador da
razo entre reas, logo todas as razes referentes est banda sempre tero valor
unitrio.
Embora os espectros de M. acridum no apresentem diferenas visuais, ao
observar o resultado apresentado na Tabela 4.5, verificamos que as regies I e III no
apresentam diferenas significativas quanto aos deslocamentos dos picos enquanto
as regies I e IV concentram todas as diferenas.
As razes entre as reas apontam para diferenas significativas em todo o
espectro, sendo essas mais concentradas nas regies I e IV. Levando em considerao
tanto o deslocamento de picos como as razes entre reas, observa-se que as bandas
com diferenas significativas referem-se na regio I a cidos nucleicos, glicognio,
ribose e polissacardeos e na regio IV a estiramentos CH, CH2 e CH3 de lipdios.
Este resultado diferente do encontrado para a linhagem A. nidulans onde a regio
IV no apresentou alteraes.
Ao analisar esses mesmos dados atravs das componentes principais,
geraram-se os diagramas da Figura 4.9.
Apesar da diferente disperso dos dados em torno do eixo PC 1 e PC 2
em cada intervalo, em nenhum deles possvel diferenciar a amostra segundo as
condies de crescimento pela anlise de componentes principais, j que em todos
intervalos os pontos encontram-se sobrepostos. O PCA, neste caso, evidencia a
estabilidade ou tolerncia do M. acridum na presena de luz e tambm sua limitao
para diferenciar essas duas amostras.
A Tabela 4.6 apresenta o resultado da anlise. A varincia acumulada neste
caso apresentou valores inferiores aos apresentados para a anlise do A. nidulans,
sendo no caso da regio II 65,5% e nas outras regies acima de 80%.
A varincia acumulada das duas primeiras componentes em todos os
intervalos alta, com valor mnimo do 80,7% para o segundo intervalo. Verifica-se
que o valor desta varincia no est relacionado com a distino entre os grupos
amostrais.
A presena de luz visvel durante o crescimento micelial influencia o
metabolismo secundrio [58], a produo de pigmentos em muitas espcies de fungos
4.1 - Influncia da Luz 79

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.9: Anlise das componentes principais aplicada a espcie M. acridum (ARSEF
10074) com crescimento na presena e na ausncia de luz para os quatro intervalos do
espectro de absoro. Em todos os quatro intervalos observam-se a disperso e sobreposio
dos pontos onde no possvel diferenci-los atravs do PCA.

[59], alm dos mecanismos que sofrem alteraes serem importantes para a proteo
dos condios contra a radiao UVB ou para neutralizar radicais livres e oxidantes
[54].
Muitos estudos vm sendo realizados com o intuito de verificar os efeitos
de diversas condies de crescimentos na tolerncia ao estresse e a radiao UVB
nos Metarhizium [52, 53, 54]. Alguns resultados apresentam uma alta tolerncia
e estabilidade do M. acridum (ARSEF 324) a radiao UVB [58]. Tambm foi
demonstrado que a produo de pigmentos como melanina e carotenoides, muito
comuns em fungos expostos a luz, no ocorre em amostras de M. robertsii crescidos
na presena e ausncia de luz e em dois meios de cultura diferentes [54].
Ao tentar avaliar o comportamento do M. acridum na presena e ausncia de
4.1 - Influncia da Luz 80

Tabela 4.6: Tabela com os resultados estatsticos da anlise de componente principal


aplicada M. acridum em duas condies de luminosidade. Observa-se os autovalores, a
varincia explicada e a varincia acumulada, sempre superior a 80%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00128 83,7 83,7
I
PC2 0,00010 7,0 97,7
PC1 0,00013 56,2 56,2
II
PC2 0,00005 24,5 80,7
PC1 0,00163 67,6 67,6
III
PC2 0,00057 23,7 91,3
PC1 0,00332 66,0 66,0
IV
PC2 0,00136 27,1 93,1

luz atravs do espectro de absoro temos como resultado dois espectros semelhantes.
A estabilidade ou tolerncia do fungo luz evidenciada atravs desta semelhana.
Ou seja, devido tolerncia desta espcie exposio luminosa durante seu
crescimento nenhuma alterao visvel encontrada no espectro de absoro.
Para avaliar a produo de pigmentos, a banda localizada em 1155 cm1
referente aos carotenoides pode ser observada. Entretanto, esta banda no apresenta
alterao pela anlise pelo deslocamento de seu pico ou pela razo da sua rea,
logo entende-se que assim como o M. robertsii, o M. acridum tambm no produz
carotenoides na presena de luz.
Esta ltima anlise s possvel de ser realizada atravs da identificao de
cada banda de absoro seguida do deslocamento de pico e razo entre as reas. A
anlise por componentes principais no foi capaz de identificar alteraes em bandas
individuais.
As amostras analisadas nesta seo so linhagens pertencentes a dois gneros
diferentes. Quando submedidas ao crescimento na presena e ausncia de luz o
resultado obtido para cada uma foi diferente. Ao observar visualmente o espectro
da linhagem A. nidulans verificam-se variaes, porm o mesmo no ocorrer com
os espectros da linhagem M. acridum quando submetidos as mesmas condies
4.2 - Influncia do pH 81

de crescimento, seus espectros so semelhantes e sem alteraes visuais. Este


comportamento diferente reflete no caso doA. nidulans a expresso de um gene
e no M. acridum sua tolerncia a radiao visvel.
As diferenas entre as linhagens puderam ser verificadas para o A. nidulans
por todas as tcnicas empregadas, entretanto, para linhagem M. acridum apenas o
deslocamento do pico de absoro e as razes entre reas das bandas foram efetivas.

4.2 Influncia do pH
Assim como a luz, o pH do meio de cultura tambm influencia o
desenvolvimento do microrganismo [22, 61]. O estudo desta influncia foi realizado
com as espcies A. nidulans (ATCC 10074) e M. acridum (ARSEF 324).
A espcie A. nidulans mostrou em estudos que o pH do meio altera sua
produo de aflatoxinas, com a penicilina [62], sendo menor quanto maior for o valor
do pH. J a espcie M. anisopliae, tambm do gnero Metarhizium, muito usada
como controle biolgico de pragas por produzir enzimas extracelulares responsveis
pela degradao da cutcula dos insetos, destaca-se pela capacidade de crescer em
meio com pH variando de 2,5 a 10,5.
Assim, sabendo da interao desses gneros com o meio e sua direta relao
com a produo de metablitos, espera-se que as alteraes decorrentes da variao
do pH do meio de cultura sejam identificadas atravs do espectro de absoro.
Os espectros do meio de cultura, sem a inoculao do fungo, foram obtidos
para os diferentes valores de pH utilizados (Figura 4.10). Observa-se que o espectro
de absoro do meio de cultura, ou PDA, semelhante independente do valor de
pH.
As bandas presentes nos espectros de absoro do meio de cultura j foram
identificadas e apresentadas na Tabela 3.1 do Captulo 3 deste trabalho.
Dentre os seis valores de pH preparados, o meio de cultura com pH 4 no
solidificou, logo no foi possvel realizar o cultivo dos fungos neste pH.
4.2 - Influncia do pH 82

Figura 4.10: Espectros de absoro do meio de cultura sem a inoculao dos fungos
preparado com diferentes valores de pH. Observa-se que os espectros de absoro do meio
de cultura no sofrem variaes em funo dos valores de pH.

4.2.1 Aspergillus nidulans


A mdia dos trinta espectros de absoro da espcie A. nidulans (ATCC
10074) para cada valor de pH j subdividida em seus quatro intervalos esto
apresentados na Figura 4.11 com suas respectivas segundas derivadas. Entre os
valores de pH estudados, o pH 5,5 o valor do meio de cultura comumente utilizado
em laboratrio e tambm utilizado em todos os outros experimentos deste trabalho.
O primeiro intervalo, 910-1178 cm1 , apresenta grandes diferenas no
espectro de absoro. Observa-se que o espectro do pH 5 semelhante ao do pH 5,5
com menor absorbncia apenas. J a partir do pH 6 as bandas comeam a sofrer
maiores alteraes e quanto maior o valor de pH, maior a alterao. Este intervalo
refere-se a polissacardeos presentes nos condios principalmente na parede celular.
Atravs da segunda derivada observa-se que o aumento do pH leva ao
4.2 - Influncia do pH 83

deslocamento de alguns picos, como por exemplo o pico localizado em 1103 cm1 ,
referente polissacardeos. Tambm possvel observar o desaparecimento de
bandas, como o caso da banda localizada em 925 cm1 , no caracterizada, que no
est presente no espectro do pH 8. Entretanto, a banda em 950 cm1 apresenta um
aumento em sua absorbncia no pH 8.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.11: Espectros de absoro no infravermelho da espcie A. nidulans (ATCC


10074) crescidos em meios de cultura com diferentes valores de pH. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c)
1490-1790 cm1 e d) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem.
Destacam-se os deslocamentos de picos do primeiro intervalo em funo do aumento do
pH.

Nos intervalos II, III e IV observam-se poucas alteraes nos espectros de


absoro, entre elas o aumento da absorbncia com o aumento do pH. Ao analisarmos
os mesmos intervalos atravs da segunda derivada verificamos as maiores variaes
4.2 - Influncia do pH 84

no intervalo II nas bandas localizadas em 1200 e 1230 cm1 , as quais apresentam


um aumento na absorbncia maior do que as outras bandas.
Nos intervalos III e IV, a segunda derivada evidencia uma relao sinal/rudo
maior comparado aos outros intervalos. O terceiro intervalo apresenta apenas o
aumento da absorbncia no espectro referente ao pH 8. O quarto intervalo apresenta
variaes na segunda derivada do espectro entre os valores de pH.
Este aumento da absorbncia poderia estar correlacionado com a variao da
quantidade de amostra colocada na janela do detector. Entretanto, espera-se que
atravs da normalizao empregada e das repeties realizadas, este aumento esteja
diretamente relacionado com as alteraes devido ao pH.
Observando os espectros de absoro nos quatro intervalos propostos,
obtou-se por dessa seo em diante limitar a anlise nos intervalos I e II. A Tabela
4.7, apresenta para estes intervalos, a mdia dos picos mximos de absoro de cada
banda para cada valor de pH do meio de cultura, seus respectivos desvios padro e
tambm suas respectivas associaes qumica e biolgica [20].

Tabela 4.7: Valores mdios da posio das bandas de absoro com seus respectivos
desvios padro e associao bioqumica [20] subdivida nas quatro regies em estudo.
Destacam-se as bandas que esto presentes apenas em um ou outro grupo. Nas clulas
em branco a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras , e
referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes respectivamente.

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Associao Bioqumica

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8 Qumica Biolgica

927,7 947,6 927,8 922,4 DNA


(0,8) (0,5) (0,9) (29,6)

935,4
(3,0)

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 85

Tabela 4.7 Continuao

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8 Qumica Biolgica

961,7 964,7 961,9 963,5 960,1 C-C, Desoxirribose


(5,1) (5,4) (9,3) (3,7) (3,5) C-O

990,3 990,6 990,7 990,6 991,1 C-C,


(0,7) (0,8) (2,2) (0,7) (0,6) C-O

1012,5 1012,3 1012,6 1012,3 1012,5 C-O Desoxirribose


(0,6) (0,5) (1,5) (0,6) (1,0)

1025,8 C-O Glicognio


(1,4)

1027,7 1028,1 1028,4 1028,5 CO Glicognio


(0,9) (0,8) (1,3) (0,8)

I 1044,5 1044,5 1044,4 1044,6 1042,9 CO Glicognio


(0,7) (0,4) (0,9) (0,6) (1,1)

1059,3 1059,5 1058,9 1059,4 C-OH


(1,0) (2,2) (1,1) (3,2)

1076,3 PO
2 Fosfato
(0,6)

1079,3 1079,3 1079,1 1079,1 PO


2
(0,7) (0,5) (0,5) (0,5)

1104,5 1104,5 1104,2 1104,2 1103,2 P-O-C Polissacardeos


(0,9) (0,5) (0,9) (0,5) (1,1)

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 86

Tabela 4.7 Continuao

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8 Qumica Biolgica

1123,6 1122,8 1123,2 1122,6 CO Carboidratos


(1,3) (0,8) (1,4) (0,9)

1128,9
(9,2)

1146,7 1146,8 1146,6 1146,2 C-O Oligossacardeos


(1,0) (0,4) (0,9) (0,4)

1151,4 C-O Glicognio


(0,5)

1203,6 1203,9 1203,4 1203,6 1201,2 Colgeno


(0,6) (0,5) (0,8) (0,5) (0,3) \
Fosfato

1224,8 Colgeno
(2,0) \
Fosfato

1232,9 1233,7 1232,6 1232,2 PO


2 Fosfato
(1,8) (1,3) (2,6) (1,9)

1245,2 PO
2 Fosfato
(3,1)

1263,3 1263,2 1263, 1 1262,3 PO


2 Fosfato
(4,5) (5,1) (4,1) (3,6)

1271,2
(1,6)

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 87

Tabela 4.7 Continuao

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8 Qumica Biolgica

1275,7 1277,0 1276,0 1275,8 N-H Timina


(2,7) (3,0) (4,3) (2,3)

1293,2 1292,7 1291,3 1292,4 N-H Timina


(5,5) (5,1) (4,7) (4,2)

1302,5
(2,2)

II 1308,4 1308,7 1308,8 1308,6 1310,9 Amida


(1,5) (1,3) (2,3) (1,9) (4,8) III

1324,7 1326,2 1323,1 1322,5


(7,4) (8,7) (5,1) (7,6)

1338,6 Colgeno
(3,2)

1343,4 1343,3 1343,5 1343,5


(1,1) (1,1) (1,3) (0,8)

1377,6 1377,6 1377,6 1377,8 1379,3 CH3


(0,9) (1,1) (1,2) (0,7) (0,8)

1398,7 1399,2 1398,9 1398,9 1397,4 CH3


(0,9) (0,7) (0,5) (0,7) (1,4)

1415,2 1415,3 1414,9 1414,9 1415,7 CH,


(0,7) (0,5) (0,7) (0,8) (0,6) NH e
CN

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 88

Tabela 4.7 Continuao

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8 Qumica Biolgica

1452,3 1452,4 1452,0 1451,9 1452,3 CH3 Protenas


(0,7) (0,7) (1,0) (0,9) (0,8)

1477,3 1474,8 1470,9 1481,7 1472,9 CH2 Lipdios


(24,4) (19,5) (2,2) (41,4) (1,6)

A Tabela 4.7 nos permite observar e semelhana entre os picos dos espectros
dos valores de pH entre 5 e 7, assim como o diferentes valores de pico encontrado
para o pH 8.
Para a anlise estatstica desse grupo de amostras o teste t-Student foi
realizado pareando os valores de pH em sequncia crescente e sem comtemplar
todas as possibilidades de combinao, j que o intuito verificar os picos
significativamente diferentes em funo do aumento do pH. Assim, a Tabela 4.8
apresenta os valores dos picos e o resultado do teste t-Student com destaque para
os valores que so significativamente diferentes. As clulas em branco correspondem
a comparaes que no foram possveis de realizar.
4.2 - Influncia do pH 89

Tabela 4.8: Teste estatstico para a posio de cada banda de absoro da espcie
A. nidulans. destacam-se em cinza as bandas que apresentam diferenas significativas
(p<0,05). Nas clulas em branco no foi possvel realizar o teste devido a falta da banda
correspondente no outro grupo amostral.

Intervalo Picos de absoro t - Student

(cm1 ) pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

927 0,572 0,372 0,319

935

961 0,027 0,016 0,084 6, 68.104

990 0,272 0,739 0,807 0,006

1012 0,180 0,362 0,359 0,225

1025

I 1027 0,089 0,323 0,659

1044 0,853 0,586 0,311 1, 55.109

1059 0,569 0,223 0,453

1076

1079 0,866 0,135 0,938

1104 0,727 0,224 0,916 3, 13.105

1123 0,005 0,134 0,041

1128

1146 0,011 0,028 0,029

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 90

Tabela 4.8 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

1151

1203 0,051 0,009 0,298 2, 90.1030

1224

1232 0,039 0,043 0,444

1245

1263 0,951 0,883 0,470

1271

1275 0,082 0,299 0,788

1293 0,691 0,263 0,340

1302

II 1308 0,401 0,796 0,671 0,018

1324 0,480 0,114 0,722

1338

1343 0,795 0,498 0,780

1377 0,825 0,927 0,513 3, 89.1010

1398 0,022 0,031 0,420 1, 38.106

1415 0,486 0,082 0,893 5, 33.105

1452 0,406 0,111 0,711 0,136

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 91

Tabela 4.8 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

1477 0,663 0,273 0,156 0,248

A Tabela 4.8 pode ser analisada de duas formas. A primeira observando


apenas os resultados do pH 5 ao 7. Neste caso todos os valores dos picos so
constantes para todas as amostras, entretanto quatro valores se destacam: 1028,
1059, 1123 e 1146 cm1 . Nos dois primeiros picos a diferena foi apenas na
comparao entre dois valores de pH, enquanto os dois ltimos picos apresentaram
diferenas significativas em todas as comparaes feitas, ou seja, para incremento
no pH houve uma diferena significativa no pico de absoro dessas bandas, como
possvel observar na Figura 4.12 neste intervalo com destaque para os valores aqui
discutidos.
A banda localizada em 1146 cm1 refere-se a oligossacardeos possivelmente
da membrana da parede celular. Ela, em especfico, podemos observar alteraes ao
compararmos todos os pH de 5 a 7, e se encontra muito deslocada no pH 8.
A segunda forma comparar os espectros de absoro dos valores de pH de
5 a 7 com o espectros de absoro do pH 8. Algumas bandas no esto presentes
neste espectro, como a banda localizada em 927 cm1 , tambm indicada na Figura
4.12.
Para a anlise por razes, as reas das bandas j apresentadas foram dividas
pela rea da banda de amida. O teste t-Student foi realizado com a mesma
combinao entre os valores de pH feita anteriormente, pareando os valores na
sequencia crescente e apresentado na Tabela 4.9.
4.2 - Influncia do pH 92

Figura 4.12: Destaque para o intervalo I de 910-1178 cm1 do espectro de absoro do A.


nidulans (ATCC 10074) com sua derivada de segunda ordem. As bandas que apresentaram
grande variao ou deslocamento com o aumento do pH do meio de cultura esto indicadas
pelas linhas verticais em tracejado para melhor visualizao.

Tabela 4.9: Teste estatstico t-Student para a razo entre as reas de cada banda de
absoro da espcie A. nidulans. A comparao feita entre os dois valores de pH vizinhos
a fim de avaliar a variao das bandas com o aumento do pH. Destacam-se em cinza as
bandas que apresentam diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi possvel
realizar o teste devido falta da banda correspondente no outro grupo amostral.

Intervalo Picos de absoro t - Student

(cm1 ) pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

927 0,002 0,086 0,393

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 93

Tabela 4.9 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

935

961 0,075 0,916 0,556 0,009

990 0,074 0,137 0,402 0,055

1012 0,053 0,002 0,830 7, 23.1024

1025

I 1027 0,843 0,191 0,464

1044 0,007 0,174 0,020 5, 30.1011

1059 0,147 0,124 0,025

1076

1079 0,002 0,387 0,068

1104 0,444 0,620 0,323 0,334

1123 0,086 0,337 0,107

1128

1146 1, 18.104 5, 97.104 0,049

1151

1203 0,442 0,329 0,024 5, 99.1010

1224

1232 0,460 0,036 0,449

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 94

Tabela 4.9 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

1245

1263 0,197 0,581 0,898

1271

1275 0,321 0,321 0,797

1293 0,330 0,907 0,488

1302

II 1308 0,951 0,104 0,304 0,313

1324 0,059 0,210 0,841

1338

1343 2, 27.105 0,003 0,005

1377 0,687 0,042 0,582 3, 408.104

1398 0,322 0,322 0,663 4, 07.106

1415 0,073 0,071 0,043 5, 33.105

1452 0,629 0,053 0,996 0,416

1477 0,336 0,173 0,340 0,715

A Tabela 4.9 apresenta em destaque os valores de razo de rea com diferenas


significativas. Observa-se que as diferenas encontram-se dispersas pela tabela
porm concentrando-se na coluna comparativa entre o pH 7 e 8. Podemos entender
4.2 - Influncia do pH 95

essas diferenas apresentadas no espectro de absoro do pH 8 como consequncia


da estabilidade ou tolerncia do fungo a variao de pH, com exceo do pH 8.
Sabemos que o pH do meio de cultura influencia, no caso dos Aspergillus, a
produo de aflatoxinas como a penicilina, porm essa influncia tambm depende
da composio do meio de cultura [27]. Estudos apresentaram a diminuio da
produo de micotoxinas da espcie A. nidulans com o aumento do pH do meio de
cultura. Entretanto, a interao entre o pH e outros fatores ambientais complexa
e ainda no esclarecida [60].
As alteraes observadas limitam-se a serem identificadas como variaes das
ligaes referentes a polissacardeos, oligossacardeos e ligaes fosfato, entretanto
no possvel correlacion-las diretamente com a produo de aflatoxinas.
A anlise de componentes principais foi utilizada tambm para os intervalos
III e IV, diferentemente das anlises anteriores.
Nos quatro intervalos determinados observamos a distribuio dos pontos
para os valores de pH 5, 5,5, 6 e 7 sobreposta, no havendo distino entre esses
grupos. Entretanto, como esperado, devido as diferenas encontradas nas bandas do
espectro de absoro e deslocamentos de picos, o pH 8 apresenta uma distribuio
isolada de seus pontos em relao aos outros grupos amostrais. Este fato poder ser
visualizado nos intervalos I e II com seus pontos localizados no eixo positivo de PC1.
J nos intervalos III e IV, essa distino no clara.
A Tabela 4.10 apresenta o resultado numrico do PCA para as duas primeiras
componentes principais das amostras submetidas aos cinco valores de pH do meio
de cultura.
Observa-se que a varincia acumulada para as duas primeiras componentes
chega a 99,2% e 97% para os intervalos IV e I respectivamente e chega tem mnimo
de 86,6% para o intervalo II.
Embora o intervalo IV agregue quase 100% da varincia acumulada, ele no
foi capaz de diferenciar os valores de pH. Entretanto, o intervalo II com menos de
90% dos dados diferenciou-os. Novamente, temos que a diferenciao os grupos
em cada intervalo no depende da varincia acumulada. No estudo anterior, da
influncia da luz, os mesmo intervalos I e II tiveram destaque devido a diferenciao
dos grupos amostras para a espcie A. nidulans.
4.2 - Influncia do pH 96

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.13: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. nidulans (ATCC
10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes valores de pH. Nos intervalos
I e II observa-se grande disperso dos pontos com apenas os pontos referentes ao pH 8
agrupados. Nos intervalos III e IV todos os valores de pH apresentam-se dispersos e
sobrepostos.

4.2.2 Metarhizium acridum


O mesmo procedimento para anlise do comportamento do A. nidulans em
diferentes valores de pH do meio foi realizado para outra espcie, M. acridum
(ARSEF 324). As regies do espectro de absoro esto apresentadas na Figura
4.13 com suas respectivas derivadas de segunda ordem.
O resultado observado visualmente na Figura 4.13 semelhante ao observado
na anlise da influncia da luz. Isso por que em ambos os casos os espectros da
linhagem A. nidulans apresentaram variaes significativas enquanto os espectros
da espcie M. acridum apresentaram-se extrema semelhana nas suas bandas de
absoro.
4.2 - Influncia do pH 97

Tabela 4.10: Valores obtidos para a anlise e componentes principais da espcie A.


nidulans submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Observam-se os
autovalores, a varincia explicada e a varincia acumulada sempre superior a 86%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00285 79,1 79,1
I
PC2 0,00064 18,0 97,0
PC1 0,00053 73,7 73,7
II
PC2 0,00009 13,0 86,6
PC1 0,00132 57,8 57,8
III
PC2 0,00072 31,5 89,3
PC1 0,00523 76,8 76,8
IV
PC2 0,00152 22,3 99,2

A Tabela 4.11 apresenta os valores mdios dos picos de absorbncia para cada
banda em cada valor de pH. A associao bioqumica no foi apresentada sabendo
que a mesma j foi mostrada para a espcie M. acridum no estudo da influncia da
luz sob essa espcie (Tabela 4.4).

Tabela 4.11: Valores mdios do pico de absoro de cada banda da espcie M. acridum
para diferentes valores de pH do meio de cultura nos intervalos I e II do espectro com seus
respectivos desvios padro.

Intervalo Picos de absoro (cm1 )

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8

926,8 (2,6) 926,5 (1,9) 926,9 (2,1) 924,3 (14,9) 917,6 (51,3)

942,5 (3,7) 943,8 (3,7) 943,6 (2,7) 943,8 (3,9) 943,2 (3,6)

954,3 (0,5) 954,5 (0,8) 953,9 (0,8) 954,2 (0,5) 954,3 (0,5)

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 98

Tabela 4.11 Continuao

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8

971,7 (0,4) 971,8 (0,5) 971,8 (0,8) 971,9 (0,7) 971,9 (0,6)

993,5 (0,5) 993,4 (0,5) 993,5 (0,7) 993,6 (0,4) 993,6 (0,4)

1012,9 (0,6) 1012,7 (0,5) 1012,9 (1,0) 1012,9 (0,9) 1012,9 (0,6)

I 1031,1 (0,4) 1031,1 (0,3) 1030,9 (0,5) 1031,1 (0,3) 1031,1 (0,3)

1046,5 (1,2) 1046,7 (0,9) 1046,5 (1,3) 1046,7 (1,2) 1046,6 (0,9)

1062,5 (1,7) 1062,2 (1,6) 1062,4 (1,5) 1062,3 (1,4) 1062,4 (1,6)

1077,5 (1,1) 1077,7 (1,0) 1077,6 (0,8) 1077,6 (0,9) 1077,6 (0,9)

1108,4 (0,6) 1108,2 (0,8) 1108,6 (0,7) 1108,5 (0,3) 1108,7 (0,8)

1125,7 (3,7) 1124,7 (2,9) 1127,5 (2,8) 1125,8 (4,2) 1127,5 (4,2)

1139,9 (1,1) 1139,2 (1,9) 1139,7 (1,2) 1139,6 (1,4) 1139,6 (1,5)

1155,6 (0,4) 1155,5 (0,5) 1155,5 (0,4) 1155,5 (0,4) 1155,5 (0,5)

1196,6 1168,1 1188,7 1090,3 (4,4) 1200,7 (5,3)


(26,6) (12,3) (28,2)

1228,7 (0,8) 1228,2 (1,0) 1228,2 (1,8) 1228,7 (1,8) 1228,7 (0,9)

1263,6 (0,9) 1263,9 (0,1) 1263,6 (2,8) 1261,6 (5,9) 1262,9 (3,3)

1264,5 (1,8) 1263,9 (0,2) 1265,1 (3,3) 1264,2 (1,2) 1264,0 (0,5)

1278,4 (3,9) 1276,9 (3,3) 1278,1 (2,3) 1276,2 (3,7) 1277,1 (3,5)

1295,3 (2,8) 1295,3 (2,3) 1295,4 (3,3) 1293,1 (2,9) 1295,3 (3,3)

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 99

Tabela 4.11 Continuao

pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8

1311,1 (1,1) 1311,4 (2,0) 1311,6 (1,2) 1310,4 (4,5) 1311,8 (1,5)

1320,9 (1,0) 1321,8 (3,1) 1321,2 (1,7) 1321,6 (4,1) 1321,7 (2,9)

II 1339,8 (1,9) 1339,2 (3,2) 1339,4 (3,0) 1339,5 (4,2) 1338,5 (5,2)

1361,2 (3,4) 1361,4 (3,1) 1362,1 (2,2) 1360,5 (3,4) 1361,9 (2,8)

1377,6 (0,3) 1377,7 (0,3) 1377,8 (0,3) 1377,5 (0,5) 1377,6 (0,5)

1400,1 (1,1) 1400,2 (1,3) 1400,1 (1,3) 1399,7 (1,4) 1400,2 (1,9)

1416,1 (0,6) 1416,2 (0,7) 1416,1 (0,9) 1416,2 (0,9) 1416,0 (0,8)

1416,5 (0,3) 1416,6 (0,5) 1416,5 (0,1) 1416,9 (1,0) 1416,7 (0,8)

1416,8 (0,9) 1417,3 (2,3) 1416,8 (0,9) 1418,3 (3,1) 1417,8 (2,9)

1456,2 (0,4) 1456,3 (0,3) 1456,1 (0,9) 1456,3 (1,1) 1456,0 (0,5)

1470,8 1470,0 (5,1) 1469,2 (8,2) 1473,8 (9,7) 1481,6


(10,4) (37,2)

interessante notar que com o aumento do pH do meio as bandas no


apresentam deslocamentos dos picos de absoro. Em algumas clulas observamos
grandes valores de desvios padro. Estes valores so provenientes do ajuste de picos
realizado pelo programa. O que em alguns casos ocorreu foi um ajuste ruim, onde
a somatria das bandas no estava corretamente sobreposta ao espectro ou no
ocorreu ajuste, quando uma ou mais bandas tendiam a infinito e seus valores foram
descartados.
Usando os valores da Tabela 4.11 elaborou-se a Tabela 4.12 com o resultado
4.2 - Influncia do pH 100

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.14: Espectros de absoro no infravermelho da espcie M. acridum (ARSEF


324) crescidos em meios de cultura com diferentes valores de pH. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c)
1490-1790 cm1 e d) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem.
Destaca-se a extrema semelhana entre todos os espectros de absoro independente do
valor de pH.

do teste estatstico t-Student para os valores de pH agrupados dois a dois na


sequncia. Em destaque observam-se os valores significativamente diferentes.
4.2 - Influncia do pH 101

Tabela 4.12: Teste estatstico t-Student para os valores de pico da espcie M. acridum
submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Os valores de pH foram
agrupados dois a dois em ordem crescente para verificar as alteraes em funo do
aumento do pH. Poucas diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza.

Intervalo Picos (cm1 ) t - Student

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

926 0,513 0,422 0,356 0,493

942 0,191 0,794 0,805 0,571

954 0,213 0,006 0,097 0,625

971 0,444 0,966 0,551 0,871

993 0,232 0,226 0,979 0,922

1012 0,267 0,253 0,895 0,782

1031 0,608 0,093 0,346 0,299

I 1046 0,526 0,548 0,499 0,856

1062 0,387 0,633 0,818 0,801

1077 0,423 0,537 0,892 0,999

1108 0,240 0,094 0,472 0,181

1125 0,225 3, 07.104 0,057 0,113

1139 0,111 0,274 0,892 0,954

1155 0,763 0,993 0,819 0,958

1200 0,220 0,375 0,224 0,172

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 102

Tabela 4.12 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

1228 0,071 0,953 0,333 0,861

1262 0,125 0,529 0,107 0,291

1264 0,154 0,073 0,147 0,637

1277 0,113 0,100 0,017 0,310

1295 0,979 0,873 0,005 0,009

1311 0,425 0,699 0,175 0,111

1321 0,144 0,331 0,598 0,922

1338 0,439 0,801 0,950 0,444

II 1361 0,854 0,318 0,040 0,095

1377 0,710 0,136 0,015 0,739

1400 0,751 0,669 0,288 0,207

1416 0,634 0,613 0,627 0,374

1416 0,335 0,177 0,028 0,432

1417 0,280 0,316 0,020 0,559

1456 0,386 0,251 0,407 0,276

1470 0,704 0,625 0,049 0,272

O teste estatstico confirma o que foi observado pela segunda derivada do


4.2 - Influncia do pH 103

espectro de absoro, na Figura 4.13. A regio I apresenta apenas um valor


significativamente diferente enquanto a regio II apresenta seis valores. No primeiro
caso, assim como em algumas clulas do segundo caso, os valores destacados em
cinza apontam para variao entre os valores de pico devido ao ajuste de picos e no
necessariamente as variaes reais do espectro. Entretanto, essas mesmas variaes
concentram-se na regio II e na mudana do pH 6 para o pH 7, sendo talvez o M.
acridum mais sensvel a este intervalo de pH.
A Tabela 4.13 refere-se ao mesmo teste estatstico, porm agora aplicado aos
valores das razes entre as reas das bandas pela banda de amida I, destacando os
valores significativamente diferentes.

Tabela 4.13: Teste estatstico t-Student para a razo da rea de cada banda de absoro
da linhagem M. acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Os
valores de pH foram agrupados dois a dois em ordem crescente para verificar as alteraes
em funo do aumento do pH. As diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza.

Intervalo Picos (cm1 ) t - Student

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

926 0,253 0,588 0,216 0,308

942 0,321 0,321 0,377 0,321

954 0,336 0,677 0,100 0,003

971 0,014 0,760 0,959 0,838

993 0,780 0,596 0,147 0,404

1012 0,518 0,047 0,361 0,430

1031 0,546 0,504 0,464 0,977

I 1046 0,708 0,221 0,564 0,929

1062 0,625 0,758 0,763 0,575

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 104

Tabela 4.13 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

1077 0,947 0,204 0,209 0,889

1108 0,824 0,754 0,725 0,421

1125 0,441 0,312 0,308 0,158

1139 0,254 0,167 0,458 0,191

1155 0,073 0,254 0,148 0,909

1200 0,362 0,117 0,262 0,153

1228 0,458 0,217 0,024 0,908

1262 0,322 0,175 0,322 0,321

1264 0,322 0,175 0,321 0,321

1277 0,321 0,915 0,320 0,321

1295 0,269 0,321 0,321 0,277

1311 0,694 0,299 0,183 0,275

1321 0,322 0,321 0,321 0,349

1338 0,869 0,243 0,084 0,520

II 1361 0,392 0,785 0,909 0,853

1377 0,003 0,273 0,005 0,810

1400 0,053 0,321 0,321 0,718

1416 0,211 0,272 0,363 0,311

Continua na prxima pgina. . .


4.2 - Influncia do pH 105

Tabela 4.13 Continuao

pH5/5,5 pH5,5/6 pH6/7 pH7/8

1416 0,221 0,283 0,413 0,282

1417 0,279 0,333 0,484 0,277

1456 0,509 0,030 0,725 0,179

1470 0,065 0,769 0,992 0,321

Diferentemente do resultado apresentado pela anlise estatstica do


deslocamento dos picos de absoro, a Tabela 4.13 apresenta valores significantemente
diferentes distribudos por toda a tabela. H tanto diferenas nos dois intervalos de
anlise quanto nos diferentes valores de pH.
Essas diferenas encontradas parecem no ter um padro de distribuio que
permita diferenciar o pH. Os poucos valores em destaque referem-se aos ajustes
de picos comentado anteriormente, onde o somatria do ajuste individual de cada
banda no coincidiu com o espectro. interessante tambm notar que na linhagem
M. acridum, ocorrem deslocamentos de picos de absoro, entretanto no ocorrem
alteraes nas reas dos mesmos.
As poucas variaes encontradas nesta linhagem submetida diferentes
valores de pH, assim como no estudo anterior, quando submedida diferentes
condies de luminosidade indicam sua estabilidade em relao a esses fatores
ambientais.
O estudo das componentes principais apresentado na Figura 4.15.
A Figura 4.15 apresenta as quatro regies do espectro com as distribuies dos
pontos amostrais variando em funo do eixo da primeira e da segunda componente
principal, estando, entretanto em todos eles sobrepostos. Assim, embora nos
intervalos I, II, III e IV os pontos tenham diferentes distribuies, em nenhum
4.2 - Influncia do pH 106

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.15: Anlise das componentes principais aplicada a espcie M. acridum (ARDEF
10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes valores de pH. Observa-se
a sobreposio dos pontos nos quatro intervalos, no sendo possvel a identificao dos
grupos.

deles possvel distinguir os valores de pH. A Tabela 4.14 apresenta o resultado


desta anlise de componentes principais, PC 1 e PC 2, com os autovalores de cada
componente, os valores de varincia explicada e acumulada.
Na Tabela 4.14 podemos observar que as varincias acumuladas das
componentes PC 1 e PC 2 para os dois primeiros intervalos tem valor inferior aos
anteriormente encontrados para o estudo da influncia do pH na espcie A. nidulans,
entretanto foram capazes de diferenciar pelo menos um grupo amostral.
O pH timo de crescimento de algumas espcie de Metarhizium como a
M. anisopliae est entre 5 e 8 [61]. O mesmo intervalo de pH foi avaliado nesta
seo e verificou-se que atravs dos espectros de absoro da linhagem M. acridum
que esta tambm possui um pH timo de crescimento dentro desse intervalo.
4.3 - Classificao 107

Tabela 4.14: Valores obtidos para a anlise e componentes principais da espcie M.


acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Observam-se os
autovalores, a varincia explicada e a varincia acumulada sempre superior a 67%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00014 57,6 57,6
I
PC2 0,00004 19,0 76,7
PC1 0,00004 48,2 48,2
II
PC2 0,00001 19,0 67,2
PC1 0,00047 71,6 71,6
III
PC2 0,00009 14,3 85,9
PC1 0,00221 92,5 92,5
IV
PC2 0,00152 4,4 96,9

Visualmente os espectros no apresentaram nenhuma alterao e esta observao


pode ser confirmada por todas as metodologias propostas neste estudo, e sendo
assim, nenhuma delas foi capaz de identidicar os valores de pH.
Nesta seo observamos o diferente comportamento das duas linhagens
quando submetidas agora a diferentes valores de pH do meio de cultura, assim
como ocorreu quando avaliadas em funo do crescimento na presena ou ausncia
de luz. Suas respostas foram semelhantes as encontradas na seo anterior j que
para ambos os fatores a linhagem A. nidulans apresentou alteraes no espectro de
absoro, enquanto a linhagem M. acridum no apresentou alteraes significativas.
Atravs das sees 4.1 e 4.2 foi possvel observar a influncia de dois dos
fatores ambientais em duas linhagens diferentes representantes de dois gneros. A
influncia desses fatores varia de acordo com a linhagem e devem ser considerados
quando deseja-se avaliar este sistema biolgico atravs da espectroscopia vibracional.

4.3 Classificao
Aps os estudos de alguns fatores ambientais que podem alterar o crescimento
dos fungos e sabendo que essas alteraes podem ser detectadas pela espectroscopia
4.3 - Classificao 108

no infravermelho, desejamos utilizar a mesma tcnica para classificao de algumas


linhagens dos mesmos.
A classificao das amostras apresentadas na Figura 3.1 foi subdividida da
seguinte maneira: Aspergillus flavus, que diferem devido mudana de colorao
dos condios. Aspergillus, onde comparamos as trs amostras desta espcie com o
objetivo de diferenci-las e classific-las de acordo com a taxonomia. Metarhizium,
onde so comparadas duas espcies atravs das linhagens: M. acridum e M.
brunmeum. Por fim, juntamos todas as amostras dos dois gneros a fim de
classific-las.
Todas as anlises de deslocamento de pico e razes entre reas foram
realizadas para o intervalo I e II, j que estes dois at o momento apresentaram
maiores alteraes . As anlises de componentes principais e agrupamentos foram
realizadas para todos os intervalos.

4.3.1 Aspergillus flavus


Os A. flavus so dois fungos da mesma linhagem que foram selecionados
devido a sua alterao estar apenas nos condios, os quais so brancos em um grupo
e verdes no outro. Seus respectivos espectros mdios de absoro com as derivadas
de segunda ordem so mostrados na Figura 4.16.
Nos trs primeiros intervalos possvel identificar visualmente alteraes nos
espectros de absoro. A derivada de segunda ordem dos mesmos indica tanto
variaes na intensidade desses picos como deslocamento, como o caso dos picos
localizados em 931, 1014 e 1078 cm1 do intervalo I por exemplo.
No intervalo IV apresenta poucas alteraes entre os espectros de absoro,
destacando apenas o pico localizado em 2950 cm1 . Para verificar os valores dos
picos de absoro dos intervalos I e II, as razes entre as reas e o resultado do teste
estatstico t-Student foi elabora a Tabela 4.15.
A primeira observao a ser feita a diferena encontrada entre os picos de
absoro. Os deslocamentos dos picos so evidenciados pelas lacunas em branco na
tabela j que no h coincidncia entre os valores. Aplicando o teste t-Student
apenas nos valores de pico correspondentes algumas diferenas foram encontradas.
O mesmo ocorreu quando o teste foi aplicado aos valores de reas.
4.3 - Classificao 109

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.16: Espectros de absoro no infravermelho da espcie A. flavus (ATCC


1410) com condios verdes e brancos crescidos nas mesmas condies. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm1 , b) 1178-1490 cm1 , c)
1490-1790 cm1 e d) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem.
Tabela 4.15: Valores mdios dos picos de absoro de cada banda e a razo de suas reas
pela rea da amida I com os respectivos desvios padro da linhagem A. flavus (ATCC 1410)
com condios verdes e brancos.O resultado do teste t-student destaca em cinza os dados
significativamente diferentes. As culas com referem-se as bandas onde o ajuste de pico
no convergiu.
4.3 - Classificao

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Razo pela banda da Amida I

Brancos Verdes t-Student Brancos Verdes t-Student

931,2 (2,8)

941,3 (5,2) 938,6 (11,8) 2, 05.106 0,12 (0,10) 0,08 (0,05) 5, 49.106

954,6 (3,5) 959,9 (4,4) 1, 09.108 0,23 (0,16) 0,16 (0,04) 0,034

972,1 (1,9) 975,1 (1,5) 7, 91.1010 0,08 (0,07) 0,23 (0,02) 2, 24.105

992,1 (1,2) 990,3 (0,7) 0,58 0,47 (0,24) 0,35 (0,10) 0,015

1014,9 (0,8) 1,33 (0,25)

I 1019,8 (0,8) 1,28 (0,45)

1043,6 (1,3) 1043,8 (1,0) 0,56 0,61 (0,19) 1,43 (0,25) 2, 06.1020
110

Continua na prxima pgina. . .


Tabela 4.15 Continuao

Brancos Verdes t-Student Brancos Verdes t-Student


4.3 - Classificao

1060,9 (1,3) 1061,2 (1,5) 5, 28.1014 0,38 (0,14) 0,04 (0,03) 8, 02.1019

1078,5 (0,6) 1077,1 (0,5) 1, 48.106 0,81 (0,28) 0,93 (0,14) 0,03

1105,7 (1,7) 1103,8 (0,9) 1, 26.104 0,18 (0,07) 0,22 (0,53) 0,024

1123,8 (2,2) 1121,7 (1,6) 0,93 0,41 (0,15) 0,56 (0,10) 2, 59.105

1153,8 (0,6) 1153,8 (0,3) 0,001 0,13 (0,05) 0,14 (0,02) 0,435

1202,1 (0,6) 1201,7 (0,3) 0,065 0,08 (0,03) 0,08 (0,01) 0,74

1228,5 (0,8) 1227,9 (1,1) 0,236 0,56 (0,15) 0,69 (0,13) 4, 72.104

1247,8 (0,8) 1248,7 (3,8) 0,001 0,09 (0,02) 0,03 (0,03) 9, 83.1014

1261,6 (0,9) 0,09 (0,03)

1272,2 (1,9) 0,57 (0,15)

Continua na prxima pgina. . .


111
Tabela 4.15 Continuao

Brancos Verdes t-Student Brancos Verdes t-Student


4.3 - Classificao

1280,4 (0,9) 0,24 (0,15)

1313,2 (1,1) 1312,4 (0,7) 0,60 0,40 (0,06) 0,28 (0,10) 3, 12.107

1335,7 (4,4) 0,04 (0,05)

1346,4 (1,5) 1346,2 (1,4) 1, 10.107 0,19 (0,08) 0,40 (0,13) 1, 41.109

II 1356,9 (1,4) 0,11 (0,09)

1370,4 (0,7) 0,20 (0,09)

1377,7 (0,7) 0,56 (0,23)

1383,1 (0,6) 0,33 (0,14)

1399,9 (1,5) 1401,5 (0,3) 0,215 0,10 (0,03) 0,31 (0,12) 9, 74.1014

1414,7 (1,4) 1414,3 (0,8) 2, 07.1011 0,31 (0,01) 0,15 (0,07) 2, 53.109

Continua na prxima pgina. . .


112
Tabela 4.15 Continuao

Brancos Verdes t-Student Brancos Verdes t-Student


4.3 - Classificao

1425,1 (0,7) 0,26 (0,07)

1441,8 (1,5) 1444,2 (0,7) 2, 06.1011 0,39 (0,12) 0,33 (0,15) 0,082

1454,5 (3,0) 1452,9 (1,8) 0,012 0,07 (0,10)

1470,9 (26,5) 1464,3 (1,4) 0,180 0,047 (0,02) 0,15 (0,05) 2, 75.1015
113
4.3 - Classificao 114

Embora visualmente os espectros de absoro da espcie A. flavus tenham


apresentado poucas alteraes, observamos diversas alteraes ao longo dos dois
primeiros intervalos atravs do deslocamento de pico e das razes entre as reas.
Pelos resultados obtidos at o momento espera-se que a anlise de componentes
principais tambm seja capaz de apontar tais diferenas separando os grupos
amostrais. Seu resultado mostrado na Figura 4.17.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.17: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. flavus (ATCC
1410) com condios brancos e verdes. Os intervalos I, II e III destacam-se pela disperso
dos pontos amostrais permitindo a diferenciao dos grupos. O intervalo IV apresenta os
pontos sobrepostos onde no possvel diferenciar os condios brancos e verdes.

Ao observar visualmente os espectros de absoro e a derivada de segunda


ordem dessa linhagem verificam-se algumas bandas que apresentam alteraes. A
anlise das componentes principais apresenta um resultado compatvel com essa
observao e tambm com o resultado apresentado pelo deslocamento dos picos e
razes entre reas, onde possvel identificar os grupos amostrais em trs dos quatro
4.3 - Classificao 115

intervalos.
O primeiro intervalo capaz de diferenciar as amostras apresentando apenas a
sobreposio de alguns pontos. O intervalo II apresenta uma distribuio dos grupos
em torno do eixo de PC1, com os A. flavus verdes do lado negativo enquanto os A.
flavus brancos esto do lado positivo. O intervalo III apresenta o perfil do espectro
e segunda derivada muito semelhantes, entranto o PCA foi capaz de distinguir os
grupos com sucesso.
O resultado desta anlise (Tabela 4.16) confirma a grande quantidade de
dados agregados nas duas primeiras componentes, com menor porcentagem do
intervalo II, 69,9%. As componentes do intervalo IV apresentam as maiores
varincias acumuladas, 98,4%, porm no foram capazes de distinguir os grupos.
Tabela 4.16: Resultado da anlise das componentes principais da linhagem A. flavus
com condios brancos e verdes. Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a
varincia acumulada sempre superior a 69%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00098 77,9 77,9
I
PC2 0,00019 15,7 93,6
PC1 0,00022 48,2 48,2
II
PC2 0,00010 21,7 69,9
PC1 0,00187 50,6 50,6
III
PC2 0,00108 29,2 79,8
PC1 0,00684 78,8 78,8
IV
PC2 0,00170 19,6 98,4

A identificao das amostras de mesma linhagem, no caso A. flavus com


alterao na colorao dos condios foi possvel atravs da espectroscopia vibracional
aplicando todas as metodologias propostas.

4.3.2 Aspergillus
Para analisar espcies diferentes dentro de um mesmo gnero selecionamos
quatro linhagens distintas, duas pertencentes ao gnero Aspergillus e duas
4.3 - Classificao 116

pertencentes ao gnero Metarhizium.


Da mesma forma como feito anteriormente, a mdia dos trinta espectros
de cada amostra apresentada na Figura 4.18 com suas respectivas derivadas de
segunda ordem. As quatro regies apresentam alteraes, entretanto novamente
observamos alteraes mais expressivas nas regies I e II tanto no espectro de
absoro como na derivada de segunda ordem.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.18: Espectros de absoro no infravermelho das espcies A. flavus (ATCC 1410)
com condios verdes e brancos e A. nidulas (ATCC 10074). Os espectros apresentam-se
subdivididos nos intervalos I em (a) 910-1178 cm1 , II em (b) 1178-1490 cm1 , III em (c)
1490-1790 cm1 e IV em (d) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda
ordem.

A posio dos picos de absoro esto apresentadas na Tabela 4.17 com o


resultado do teste estatstico. Os valores dos desvios padro foram omitidos pois j
foram apresentados nas Tabelas 4.1 e 4.15. possvel observar bandas com variaes
4.3 - Classificao 117

na posio, porm com as mesmas associaes bioqumicas apresentadas nas sees


anteriores, assim as associaes tambm foram omitidas.
Tabela 4.17: Valores mdios dos picos de absoro de cada banda e a razo de suas reas
pela rea da amida I com os respectivos desvios padro da linhagem A. flavus (ATCC 1410)
com condios verdes e brancos e A. nidulans (ATCC 10074) .

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) Pico t-Student rea t-Student


4.3 - Classificao

Brancos Verdes A. nidulans Brancos/ Verdes/ Brancos/ Verdes/


A. nidulans A. nidulans A. nidulans A. nidulans

931

941 938

954 959 956 0,010 6, 31.105 2, 28.106 0,162

972 975 971 0,373 7, 80.1013 2, 69.108 0,005

992 990 990 1, 18.105 0,002 1, 47.1017 2, 03.1014

1009

1014

1019

Continua na prxima pgina. . .


118
Tabela 4.17 Continuao

Brancos Verdes A. nidulans Brancos/ Verdes/ Brancos/ Verdes/


A. nidulans A. nidulans A. nidulans A. nidulans
4.3 - Classificao

I 1026

1043 1043

1046

1060 1061

1065

1078 1077 1080 1, 01.1017 9, 46.1029 3, 22.1013 1, 03.1014

1105 1103 1105 0,479 4, 64.1010 6, 54.1013 3, 32.104

1123 1121 1124 0,103 1, 79.1012 0,001 0,006

1146

1153 1153
119

Continua na prxima pgina. . .


Tabela 4.17 Continuao

Brancos Verdes A. nidulans Brancos/ Verdes/ Brancos/ Verdes/


A. nidulans A. nidulans A. nidulans A. nidulans
4.3 - Classificao

1202 1201 1203 3, 09.1021 1, 09.1037 1, 86.106 1, 88.1015

1228 1227 1226 1, 05.1010 3, 17.105 9, 01.104 3, 64.1016

1241

1247 1248

1261 1262

1272

1280 1291

1310 1, 44.1018 4, 34.1019 0,005 0,405

1313 1312

1325
120

Continua na prxima pgina. . .


Tabela 4.17 Continuao

Brancos Verdes A. nidulans Brancos/ Verdes/ Brancos/ Verdes/


A. nidulans A. nidulans A. nidulans A. nidulans
4.3 - Classificao

1327

II 1335 1339

1346 1346

1356

1370 1368

1377 1377

1383

1399 1401 1399 0,248 1, 73.1036 9, 82.1019 3, 02.109

1414 1414

1425 1422
121

Continua na prxima pgina. . .


Tabela 4.17 Continuao

Brancos Verdes A. nidulans Brancos/ Verdes/ Brancos/ Verdes/


A. nidulans A. nidulans A. nidulans A. nidulans
4.3 - Classificao

1454 1452 1452 3, 36.104 0,154 2, 16.1016 5, 11.105

1464 1464

1470
122
4.3 - Classificao 123

A Tabela 4.17 aponta diferenas em toda a regio I e II do espectro de


absoro. Ao comparar a posio dos picos de absoro verificam-se varias clulas
em branco onde no existe bandas correspondentes. Da mesma forma, verificam-se
as diferenas encontradas atravs do resultado do teste estatstico para os valores de
picos de bandas correspondentes e para os valores das razes entre as reas.
Ao compararmos essas trs linhagens entre si no h como afirmar se a A.
nidulans mais prxima da A. flavus com condios brancos ou verdes observando
visualmente o espectro ou sua segunda derivada, pelo deslocamento de pico ou
atravs das razes entre reas. Entretanto, podemos verificar que h diferenas
entre ambas as comparaes.
O resultado da anlise de componentes principais para essas trs amostras
nos quatro intervalos est apresentado na Figura 4.19 e na Tabela 4.18.
A regio I apresenta os pontos distribudos com pequena sobreposio,
principalmente entre as amostras de A. flavus. interessante notar esta distribuio
pois a sobreposio entre os pontos referentes aos condios brancos e verdes indica
maior similaridade entre essas amostras do que entre elas e a linhagem A. nidulans.
Os intervalos II e III apresentam os trs grupos amostrais separados,
com destaque para o intervalo III onde os pontos apresentam-se distribudos ao
longo do eixo da segunda componente principal e com maior distncia entre os
agrupamentos. A regio IV, entretanto, apresenta os pontos com maior disperso,
menor agrupamento e sobreposio entre os pontos, no permitindo a distino entre
os grupos amostrais.
A Tabela 4.18 apresenta os resultados do PCA com os autovalores e
varincias. Os valores mnimos de varincia acumulada de 74,2% para regio II
e mximo de 97,5% para a regio IV. Ao comparar esse valores com o diagrama
da Figura 4.18 verificamos novamente que a varincia acumulada no determina a
distino dos grupos amostrais.
A distncia euclidiana e o mtodo de Ward foram aplicados mdia dos
espectros para todas as anlises por agrupamentos aqui realizados. Observamos na
Figura 4.20 os dendrogramas gerados para cada intervalo do espectro.
Os dendrogramas apresentam os grupos amostrais agrupados em funo da
distncia entre eles. Quanto maior a similaridade entre as amostras, menor ser a
4.3 - Classificao 124

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.19: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. flavus (ATCC
1410) com condios brancos e verdes e a espcie A. nidulans (ATCC 10074). Os intervalos
I, II e III destacam-se pela disperso dos pontos amostrais permitindo a diferenciao dos
grupos. O intervalo IV apresenta os pontos sobrepostos onde no possvel diferenciar os
condios brancos e verdes.

distncia em que elas sero conectadas no dendrograma. A Tabela 4. 19 apresenta


o resultado numrico dessas distncias.
Dos quatro intervalos avaliados apenas os trs primeiros agruparam
corretamente as amostras unindo primeiro a espcie A. flavus com diferente
colorao dos condios e em seguida esta espcie com a A. nidulans. O intervalo
IV agrupou o A. flavus com condios brancos com o A. nidulans erroneamente.

Entre os agrupamentos realizados duas distncias tm que ser consideradas;


os valores de distncia de cada cluster em cada intervalo, apresentado na
tabela anterior, e para cada cluster a distncia deles nos quatro intervalos
4.3 - Classificao 125

Tabela 4.18: Resultado da anlise das componentes principais da linhagem A. flavus


com condios brancos e verdes e A. nidulans. Observam-se os autovalores, a varincia
explicada e a varincia acumulada sempre superior a 74%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00218 62,5 62,5
I
PC2 0,00077 22,1 84,6
PC1 0,00056 53,9 53,9
II
PC2 0,00021 20,3 74,2
PC1 0,00626 67,4 67,4
III
PC2 0,00160 17,3 84,7
PC1 0,00580 73,5 73,5
IV
PC2 0,00189 24,0 97,5

Tabela 4.19: Resultado da anlise por agrupamento dos espectros de absoro da


linhagem A. flavus com condios brancos e verdes e A. nidulans.

Intervalo Nmero de Clusters Distncia


2 21,93
I
1 43,10
2 31,15
II
1 40,59
2 34,39
III
1 36,21
2 26,90
IV
1 27,86

comparativamente. Os intervalos I, II e III classificaram corretamente as amostras,


entretanto, essas distncias entre eles variam. Desconsiderando o intervalo IV, a
menor distncia do primeiro agrupamento ocorre no intervalo I seguido pelo II e III,
entretanto a distncia do segundo agrupamento ocorre no sentido inverso III, II e I.
Observando o dendrograma final, o intervalo capaz de agrupar todas as
4.3 - Classificao 126

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.20: Dendrogramas dos quatro intervalos dos espectros de absoro das espcies
A. flavus (ATCC 1410) com condios brancos e verdes e A. nidulans (ATCC 10074)
crescidos sob as mesmas condies.

amostras primeiro o III. Este intervalo tambm se destacou atravs anlise por
componentes principais. Assim, entre as linhagens representantes das espcies A.
flavus e A. nidulans a espectroscopia vibracional foi capaz de identificar cada uma
quando empregada com as metodologias de anlise multivariada.

4.3.3 Metarhizium
Trs espcies do gneros Metarhizium foram analisadas atravs das linhagens:
M. acridum (ARSEF324), M. anisopliae(ARSEF 5749) e M. brunmeum (ARSEF
5616). A Figura 4.21 apresenta os espectros com as respectivas derivadas de segunda
ordem de todas as seis linhagens de Metarhizium.
Como era esperado aps observar o comportamento deste gnero sob os
4.3 - Classificao 127

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.21: Espectros de absoro no infravermelho das espcies M. acridum, M.


anisopliae e M. brunmeum crescidos nas mesmas condies. Os espectros apresentam-se
subdivididos nos intervalos I) 910-1178 cm1 , II) 1178-1490 cm1 , II) 1490-1790 cm1 e
IV) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda ordem.

fatores de influncia antes analisados, tanto os espectros de absoro como suas


derivadas de segunda ordem so parecidas, com destaque para poucas e sutis
variaes como a regio em torno de 1030 cm1 no intervalo I, 1230 cm1 no intervalo
II e em torno de 1650 cm1 no intervalo III.
A anlise estatstica dos picos de absoro e das razes entre as reas
realizada atravs do pareamento das amostras. As linhagens M. acridum (ARSEF
324) e M. brunmeum (ARSEF 5616) foram selecionadas como representantes deste
gnero. O resultado est apresentado na Tabela 4.20.
4.3 - Classificao 128

Tabela 4.20: Valores mdios dos picos de absoro das bandas com os respectivos desvios
padro das linhagens M. acridum (ARSEF 324) e M. brummeum (ARSEF 5616) com o
resultado do teste estatstico para os valores de pico e razes entre reas. Destacam-se em
cinza as bandas que apresentam diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi
possvel realizar o teste devido a falta da banda correspondente no outro grupo amostral.

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) t-Student

M. acridum M. brummeum Pico reas

933,2 (2,1) 930,8 (0,5) 0,719 0,398

954,0 (1,3) 955,2 (0,3) 0,782 2, 98.105

972,7 (1,0) 973,1 (1,2) 8, 50.105 0,414

990,8 (0,7)

993,3 (0,8)

1010,4 (0,7) 1012,2 (1,1) 4, 31.1013 1, 32.1022

1022,4 (0,4)

I 1031,1 (0,7)

1041,0 (0,6)

1045,7 (0,7)

1062,3 (1,1) 1063,5 (0,7) 0,310 1, 87.1012

1078,3 (0,7) 1079,9 (0,5) 4, 26.1020 1, 31.1035

1107,7 (1,6) 1107,9 (1,9) 0,0231 2, 15.1021

1126,7 (8,8)

1139,8 (2,9)

Continua na prxima pgina. . .


4.3 - Classificao 129

Tabela 4.20 Continuao

M. acridum M. brummeum Pico reas

1155,5 (0,5) 1155,0 (0,6) 0,328 0,029

1200,3 (1,3) 1203,3 (0,5) 2, 35.1016 7, 44.104

1228,2 (0,5)

1235,1 (0,9)

1252,7 (3,7)

1262,4 (3,7)

1279,6 (3,8) 1278,7 (3,7) 0,386 0,099

1314,3 (0,8) 1316,2 (1,1) 1, 93.1010 1, 31.105

1341,8 (2,2) 1342,6 (4,5) 0,410 0,332

II 1358,4 (0,9)

1361,9 (0,7)

1376,8 (0,8) 1377,6 (0,3) 3, 74.106 3, 42.1024

1399,3 (1,7) 1399,5 (0,2) 0,570 4, 46.1018

1416,7 (0,3) 1417,7 (0,3) 9, 09.1018 2, 17.1023

1438,1 (0,9)

1454,7 (0,3) 1449,9 (4,2) 8, 53.108 0,329

1460,6 (0,7)

1467,3 (3,6)

Continua na prxima pgina. . .


4.3 - Classificao 130

Tabela 4.20 Continuao

M. acridum M. brummeum Pico reas

1479,3 (3,0)

Dentro de um mesmo gnero que apresenta poucas variaes espectrais


visveis, as duas espcies utilizadas na tabela anterior apresentaram deslocamentos
de picos significativamente diferentes entre elas assim como entre suas razes
das reas. As nicas bandas que no apresentaram resultados significativamente
diferentes para os dois testes foram as bandas localizadas em 1280 cm1 e 1340
cm1 , associadas a amida II e colgeno respectivamente.
O PCA forneceu os diagramas apresentados na Figura 4.22 com suas
distribuies para cada amostra.O intervalo IV no foi capaz, novamente, de
distinguir os grupos apresentando maior sobreposio entre os dados. O intervalo
III tambm apresenta sobreposio entre grande parte dos pontos amostrais.
Os intervalos I e II agruparam as amostras e distinguiram os grupos. Entre
eles, destaca-se o intervalo II no qual observam-se os pontos pretos e azuis agrupados
e prximos se referem as variaes da espcie M. brunmeum. Os pontos amarelos
a espcie M. anisopliae e os pontos verde, rosa e vermelho deslocado para o eixo
positivo de PC 1 se referem as variaes da espcie M. acridum. Da mesma forma
esperasse que ente intervalo seja capaz de agrupar corretamente essas amostras.
Aps a realizao do PCA, seus resultados numricos foram agrupados na
Tabela 4.21, onde as varincias acumuladas so maiores nos intervalos I e IV, sendo
acima de 90%. O intervalo II que possui o melhor resultado visual na Figura 4.21
apresenta a menor varincia acumulada, 72,7%.

A anlise por conglomerado foi realizada visando correta classificao


dentro do mesmo gnero, onde primeiramente as amostras com numerao M. 324,
4.3 - Classificao 131

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.22: Anlise das componentes principais do gnero Metarhizium nas quatro
regies de interesse. Destaque para o inetervalo II onde as variaes da espcie M.
brunmeum (pontos pretos e azuis) apresentam-se deslocadas para o eixo negativo de PC
1, a espcie M. anisopliae (pontos amarelos) apresentam-se dispersa entre a origem do
mesmo eixo e as variaes da espcie M. acridum apresentam-se deslocadas para o eixo
positivo de PC 1.

M. 3391 e M. 7486 e as amostras M. 1095 e M. 5626 deveriam de aglomerar, j que


so variaes da mesma espcie. Os dendrogramas para cada regio so apresentados
na Figura 4.22.
Os intervalos I, III e IV no foram capazes de agrupar corretamente as
amostras, aglomerando primeiro as espcies diferentes ao invs de agrupas variaes
dentro da mesma espcie. J o intervalo II classificou os grupos amostrais como
esperado, ou seja, coerente com a taxonomia j apresentada na Figura 3.1.
Como apenas um dos intervalos foi capaz de classificar os grupos
corretamente, no temos como comparar os valores de distncia da Tabela 4.22.
4.3 - Classificao 132

Tabela 4.21: Resultado da anlise das componentes principais das amostras do gnero
Metarhizium crescidas sob as mesmas condies. Observam-se os autovalores, a varincia
explicada e a varincia acumulada sempre superior a 72%.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00136 72,9 72,9
I
PC2 0,00036 19,6 92,6
PC1 0,00023 45,9 45,9
II
PC2 0,00014 26,9 72,7
PC1 0,00251 68,8 68,8
III
PC2 0,00055 15,1 83,9
PC1 0,01751 83,9 83,9
IV
PC2 0,00238 11,4 95,3

Assim, at o presente momento, ao intervalo II destacou-se para a diferenciao e


classificao correta dos fungos dentro de um mesmo gnero, assim como j havia
se destacado anteriormente para as anlises da influncia da luz e pH.
4.3 - Classificao 133

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.23: Dendrogramas da anlise hierrquica de todas as amostras do gnero


Metarhizium crescidos sob as mesmas condies.

4.3.4 Metarhizium e Aspergillus


Dentro da seo classificao partimos de um caso especfico de colorao
do condio dentro de uma mesma linhagem e chegamos ao caso mais geral onde
compararemos dois gneros distintos que at aqui foram avaliados separadamente.
Os espectros de absoro apresentados na Figura 4.23 evidenciam
particularidades de cada espcie como a banda localizada em 925 cm1 , presente
apenas no A. nidulans no intervalo I ou mesmo a banda 1740 cm1 presente apenas
no gnero Metarhizium no intervalo III.
Para realizar a comparao entre as metodologias optou-se por avaliar uma
espcie de cada gnero atravs do deslocamento de pico e razes entre rea, deixando
todo o grupo amostral para ser avaliado pelas tcnicas multivariadas. Assim, a
Tabela 4.23 foi elaborada com os valores de pico j associados bioquimicamente
4.3 - Classificao 134

Tabela 4.22: Resultado da anlise por agrupamento dos espectros de absoro da


linhagem A. flavus com condios brancos e verdes e A. nidulans.

Intervalo Nmero de Clusters Distncia


5 14,35
4 20,65
I 3 26,23
2 36,84
1 57,54
5 14,25
4 17,52
II 3 25,57
2 41,58
1 72,70
5 15,76
4 16,50
III 3 22,63
2 45,41
1 66,93
5 9,53
4 10,2
IV 3 20,38
2 33,46
1 50,44

no nicio deste trabalho e o resultado do teste estatstico. Nesta tabela os


valores das razes entre reas tambm so omitidos por j terem sido apresentados
anteriormente nas sees 4.3.2 e 4.3.3.
4.3 - Classificao 135

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.24: Espectros de absoro no infravermelho de todas as espcies anteriormente


usadas neste trabalho dos gneros Aspergillus e Metarhizium crescidos nas mesmas
condies. Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos I) 910-1178 cm1 ,
II) 1178-1490 cm1 , II) 1490-1790 cm1 e IV) 2810-2990 cm1 com suas respectivas
derivadas de segunda ordem.

Tabela 4.23: Tabela comparativa entre os picos mdios de absoro do A. nidulnas e do


M. acridum e o resultado do teste estatstico entre os valores de pico e razes entre reas.

Intervalo Picos de absoro (cm1 ) t-Student

M. acridum A. nidulans Pico Razo das reas

933,2 (2,1)

Continua na prxima pgina. . .


4.3 - Classificao 136

Tabela 4.23 Continuao

M. acridum A. nidulans Pico Razo das reas

954,0 (1,3) 956,3 (1,3) 4, 17.104 9, 84.107

972,7 (1,0) 971,7 (1,4) 0,522 0,572

990,8 (0,7) 990,9 (0,7) 0,462 1, 19.1018

1010,4 (0,7) 1009,1 (0,7) 1, 33.105 2, 24.1019

1022,4 (0,4)

1026,7 (0,9)

I 1041,0 (0,6)

1046,4 (0,9)

1062,3 (1,1) 1065,2 (2,7) 5, 19.104 0,089

1078,3 (0,7) 1080,7 (0,8) 6, 63.1022 1, 05.1017

1107,7 (1,6) 1105,4 (0,8) 8, 33.1025 8, 74.1025

1124,4 (0,5)

1155,5 (0,5)

1146,5 (0,3)

1200,3 (1,3)

1203,73 (0,2)

1228,2 (0,5) 1226,9 (0,7) 1, 02.1011 0,004

1241,4 (1,3)

Continua na prxima pgina. . .


4.3 - Classificao 137

Tabela 4.23 Continuao

M. acridum A. nidulans Pico Razo das reas

1262,4 (3,7) 1262,1 (0,2) 0,726 4, 65.1014

1279,6 (3,8)

1291,9 (0,3)

1310,5 (0,4)

1314,3 (0,8)

1325,2 (0,9)

1327,43 (1,7)

II 1341,8 (2,2) 1339,3 (0,5) 6, 51.108 2, 65.1016

1358,4 (0,9)

1368,5 (0,2)

1376,8 (0,7) 1377,7 (0,2) 1, 41.107 1, 68.107

1399,3 (1,7) 1399,54 (0,2) 0,539 1, 32.1016

1416,7 (0,3)

1422,1 (0,3)

1439,9 (0,5)

1452,4 (0,5)

1454,7 (0,3)

1467,3 (3,6) 1464,5 (0,4) 3, 45.1020 9, 07.1022

Continua na prxima pgina. . .


4.3 - Classificao 138

Tabela 4.23 Continuao

M. acridum A. nidulans Pico Razo das reas

1479,3 (3,0)

A diferena entre os espectros dessas duas amostras pode ser verificado devido
quantidade de clulas em brancos, ao deslocamento dos picos e a razo entre as
reas.
Dos resultados apresentados pelo PCA (Figura 4.25) com todas as amostras
apenas o intervalo II fornece um resultado coerente com o esperado. Nele observamos
a distribuio dos pontos em funo do gnero ao redor do eixo de PC1, onde o
Metarhizium apresenta-se deslocado para os valores negativos do eixo enquanto o
Aspergillus apresenta-se deslocado para o eixo positivo.
No gnero Aspergillus podemos observar que os pontos vermelho e preto esto
mais prximo entre s do que dos pontos verdes. Este fato o coerente j que os
primeiro referem-se espcie A. flavus com condios verdes e brancos, enquanto o
ltimo refere-se a A. nidulans.
No intervalo I podemos observar a distribuio dos pontos referentes ao
Aspergillus deslocados para o eixo negativo de PC 1. Os pontos referentes do
Metarhizium apresentam-se deslocados para o eixo positivo de PC1, com exceo
do M. acridum.
Os outros intervalos apresentaram disperses com maiores sobreposies
entre os pontos, o que dificulta sua distino.
O resultado numrico fornecido pelo PCA est discriminado na Tabela 4.24
com as varincias acumuladas novamente altas para o primeiro e o ltimo intervalo
(acima de 88,0%) e inferiores para o segundo e terceiro intervalo (mximo de 80,6%).
A anlise por agrupamento foi coerente com o resultado da anlise de
componentes principais. Na Figura 4.26 observa-se que dos quatro intervalos
4.3 - Classificao 139

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.25: Anlise de componentes principais para os dois gneros: Metarhizium e


Aspergillus nos quatro intervalos de anlise crescidos sob as mesmas condies.

analisados, apenas o segundo classificou todas as amostras corretamente. Nele, duas


das linhagens da espcies de M. acridum se uniram primeiro assim como duas das
linhagens de M. brunmeum. Em seguida as duas primeiras linhagens de M. acridum
se uniram terceira e as de M. brunmeum se uniram M. anisopliae, dando origem
a um s ramo proveniente do gnero Metarhizium.
Da mesma maneira, o gnero Aspergillus uniu-se entre os A. flavus primeiro
e na sequncia ao A. nidulans. Por fim, os ramos provenientes dos dois gneros
diferentes se uniram finalizando o dendrograma.
Os outros trs intervalos correlacionaram as amostras erroneamente
agrupando primeiro linhagens de Aspergillus com Metahrizium ou correlacionando
linhagens de espcies diferentes antes de correlacion-las com outras linhagens da
mesma espcie.
4.3 - Classificao 140

Tabela 4.24: Resultado numrico da anlise de componentes principal para todas as


amostras de dois gneros diferentes; Aspergillus e Metarhizium.

Intervalo Componente Autovalor Varincia (%) Acumulada (%)


PC1 0,00321 71,0 71,0
I
PC2 0,00078 17,3 88,2
PC1 0,00118 67,4 67,4
II
PC2 0,00023 13,2 80,6
PC1 0,00318 58,3 58,3
III
PC2 0,00080 14,7 73,0
PC1 0,02068 75,8 75,8
IV
PC2 0,00467 17,1 93,0

A Tabela 4.25 apresenta os valores das distncias no dendrograma em


funo do nmero de clusters formados para cada intervalo. Caso houvesse
mais de um intervalo onde o agrupamento apresentado pela Figura 4.26 estivesse
correto, poderamos comparar os valores das distncias de cada cluster dessa tabela.
Entretanto, como apenas um intervalo foi agrupado corretamente no h como
comparar esses valores de distncias obtidos.

Tabela 4.25: Resultado da anlise hierrquica dos espectros de absoro dos fungos
pertencentes ao gnero Metarhizium crescidos sob as mesmas condies.

Intervalo Nmero de Clusters Distncia

8 8,41

7 13,40

6 13,44

5 16,68
I
Continua na prxima pgina. . .
4.3 - Classificao 141

Tabela 4.25 Continuao

Intervalo Nmero de Clusters Distncia

4 23,82

3 36,25

2 50,20

1 86,00

8 9,05

7 9,31

6 14,85

5 25,01
II
4 26,03

3 35,67

2 45,78

1 103,39

8 10,33

7 10,87

6 17,66

5 31,22
III
4 36,90

Continua na prxima pgina. . .


4.3 - Classificao 142

Tabela 4.25 Continuao

Intervalo Nmero de Clusters Distncia

3 45,67

2 46,85

1 69,01

8 6,71

7 10,42

6 11,13

5 12,45
IV
4 12,48

3 21,26

2 43,71

1 86,32

Desta forma, verifica-se que a observao visual do espectro de absoro


e de sua derivada de segunda ordem foram vlidos para indicar as regies que
apresentavam alteraes e tambm, no caso da espcie Metarhizium, a invariao
do espectro em funo dos fatores avaliados. O deslocamento dos picos e a razo
entre as reas so capazes de avaliar bandas especficas do espectro. Atravs dessas
duas metodologias possvel verificar se as bandas apresentam deslocamentos dos
picos e variaes em sua rea ou apenas um deles, sendo portanto complementares.
4.3 - Classificao 143

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.26: Dendrogramas da anlise hierarquica das quatro regies do espectro com
nove amostras pertencentes a dois gneros diferentes: Aspergillu e Metarhizium.

Outra caracterstica dessas duas tcnicas sua adequao a quantidade de dados


envolvidos, sendo limitada para grandes quantidades.
J as anlises multivariadas, PCA e agrupamento, foram vlidas para anlise
em todas as sees deste trabalho. Diferente das metodologias anteriormente citadas,
estas no permitem, em um determinado intervalo, identificar bandas especficas que
apresentam alteraes. Porm, sua principal vantagem consiste na anlise de grande
quantidade de dados.
Ao agrupar essas quatro metodologias nas diferentes sees deste trabalho,
verificou-se que a regio localizada entre 1178-1490 cm1 , referente ao intervalo
II, adequada para diferenciar e classificar corretamente as espcies de fungos
aqui empregadas, assim como avaliar outros fatores de influncia. Este intervalo
apresentou alteraes visuais em seus espectros de absoro, deslocamentos de
4.3 - Classificao 144

picos, variaes nas razes entre as reas e separao entre os grupos no diagrama
da anlise de componentes principais. Entretanto, a afirmao de que este foi
considerado o melhor grupo provm da anlise por agrupamento, onde este foi
o nico intervalo com agrupamento correto de acordo com a taxonomia vigente.
Assim, as informaes necessrias para se chegar a uma concluso, no baseiam-se
em apenas uma metodologia, mas na correlao das informaes fornecidas.
Captulo 5
Concluses e Perspectivas
Futuras

tualmente diversas metodologias so aplicadas a anlise do espectro


A infravermelho, porm muitas vezes sem o devido critrio. Com o objetivo de
comparar quatro dessas metodologias (deslocamento de pico, razes entre as reas
das bandas, anlise de componentes principais e anlise por agrupamento), oito
linhagens fngicas foram crescidas em laboratrio e analisada sob diferentes fatores
ambientais (luz, pH) e classificadas comparativamente com a taxonomia vigente.
Atravs desse trabalho foi possvel verificar o potencial da espectroscopia
por FTIR em uma amostra biolgica para caracterizao bioqumica, identificao
de fatores que afetam seu desenvolvimento e identificao de regies do espectro
responsveis pela correta classificao em espcies e gneros.
O deslocamento dos picos de absoro e as razes entre as reas desses picos
pela rea da banda de amida I evidenciaram as bandas e consequentemente as regies
do espectro com maiores diferenas espectrais entre as bandas. interessante notar
que nem todas as bandas na quais ocorreram os deslocamentos do pico apresentaram
diferenas nas reas e o inverso tambm verdadeiro. Esta observao indica
possveis falhas na anlise devido ajuste realizado pelo software que ser discutido
adiante.
A influncia da luz apresentou grandes diferenas espectrais, especialmente
na espcie A. nidulans. Entretanto, observam-se deslocamentos de pico e variaes
de rea em ambas as espcies. A influncia do pH apresenta variaes espectrais no
pH8 para a espcie A. nidulans enquanto a espcie M. acridum parece no sofrer

145
5 - Concluses e Perspectivas Futuras 146

alteraes. Este mesmo comportamento verificado no deslocamento de picos e


variaes de reas.
Ao observarmos classificao das linhagens fngicas a anlise anterior
torna-se inconclusiva. Para os todos os nveis de similaridade propostos, partindo
da diferena de colorao dos condios de uma mesma linhagem at dois gneros
distintos, muitas alteraes so encontradas ao longo das duas regies de anlise.
Cada metodologia aqui proposta possui objetivos distintos que devem ser
levados em conta para a anlise. Uma grande quantidade de dados torna invivel a
anlise por deslocamento de pico e razes entre as reas, devido a grande quantidade
de clculos envolvidos. As tcnicas multivariadas como PCA e Cluster possuem como
vantagem a rapidez para analisar quantos dados forem necessrios.
A anlise multivariada apresentou bons resultados para a influncia em trs
dos quatro intervalos da espcie A. nidulans, porm no foi capaz de diferenciar
os grupos da espcie M. acridum. Para influncia do pH, o PCA apresentou bom
resultado para dois dos quatro intervalos da espcie A. nidulans, entretanto apenas
diferenciando o pH 8 e novamente no foi capaz de diferenciar nenhum valor de pH
da espcie M. acridum em estudo.
Para a classificao das linhagens a anlise multivariada nos permite tambm
usar a anlise por agrupamento hierrquico. Essa anlise somada anlise por
componentes principais permitiu-nos definir o melhor intervalo do espectro. A
correta classificao de todas as linhagens ocorreu apenas para o intervalo II
correspondente a 1178 - 1490 cm1 do espectro.
Porm as anlises multivariadas no permitem que a identificao de bandas
especficas que sofreram alteraes. Ao caracterizar bioquimicamente as bandas e
avaliar o deslocamento de pico e alteraes entre reas possvel identificar as bandas
e ligaes especficas e at quantifica-las em funo da rea.
Assim, cada metodologia deve ser avaliada em funo do objetivo do estudo.
Porm uma anlise completa deve compreender mais de uma.
As limitaes encontradas baseiam-se principalmente nos programas
empregados para as anlises. O ajuste de picos feito pelo Oringi 8.5 apresentou
dificuldades em convergir as bandas para o espectros em algumas amostras.
Deixando claro uma falha desde trabalho ao utiliz-lo. O programa Minitab
5 - Concluses e Perspectivas Futuras 147

16 tambm possui limitaes com relao a quantidade de dados aceitos para


anlise, sua tabela de dados no comporta o espectros infravermelhos inteiro, sendo
necessrio subdividi-lo em intervalos menores.
Os objetivos propostos de classificao hierrquica das amostras relacionando-os
com a taxonomia hoje vigente foram alcanados com sucesso em pelo menos
um dos intervalos do espectro, verificando tambm a potencialidade da tcnica
espectroscpica para este estudo e diferenciaes entre amostras em geral.
Como perspectivas futuras, podemos apontar a expanso desta classificao
para outros gneros e espcies. Outra perspectiva em destaque a tentativa de
identificar amostras de fungos desconhecidos a partir de um banco de espectros e
das metodologias aqui empregadas.
Referncias1

[1] SANTOS, C. et al. Fourier transform infrared as a powerful technique for the
identification and characterization of filamentous fungi and yeasts. Res Microbiol,
v. 161, p. 16875, 2010.

[2] BHARGAVA, R. Towards a practical fourier transform infrared chemical imaging


protocol for cancer histopathology. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 389,
p. 11551169, 2007.

[3] WEBSTER, G. et al. Discriminating the intraerythrocytic lifecycle stages of the


malaria parasite using synchrotron ft-ir microspectroscopy and an artificial neural
network. Analytical Chemistry, v. 81, p. 25162524, 2009.

[4] FUCHS, R. et al. In situ examination of the time-course for secondary


mineralization of haversian bone using synchrotron fourier transform infrared
micro spectroscopy. Matrix Biology, v. 27, p. 3441, 2008.

[5] BEEKES, M.; LASCH, P.; NAUMANN, D. Analytical applications of fourier


transform-infrared (ft-ir) spectroscopy in microbiology and prion research.
Veterinary Microbiology, v. 123, p. 305319, 2007.

[6] GEORGE, B.; MCINTYRE, P. Infrared Spectroscopy. [S.l.]: Analytical


Chemistry by Open Learning, 1987.

[7] CHALMERS, J. M.; GRIFFITHS, P. R. Handbook of vibrational spectroscopy


- The Historical Development of Experimental Techniques in Vibrational
Spectroscopy. [S.l.]: John Wiley Sons, 2002.
1
De acordo com a Associao Brasileira de Normas Tcnicas. NBR 6023.

148
REFERNCIAS 149

[8] HARIS, P. I.; CHAPMAN, D. Does fourier-transform infrared-spectroscopy


provide useful information on protein structures. Trends in Biochemical Sciences,
v. 17, p. 328333, 1992.

[9] FORATO, L. A.; BERNARDES, R.; COLNAGO, L. A. Study of resolution


enhancement methods for analysis of secondary structure of proteins by ftir.
Quimica Nova, v. 21, p. 146150, 1998.

[10] SUREWICZ, W.; MANTSCH, H. H.; CHAPMAN, D. Determination of


protein secondary structure by fourier transform infrared spectroscopy: a critical
assessment. Biochemistry, v. 32, p. 38994, 1993.

[11] MINGOTI, S. ANLISE DE DADOS ATRAVS DE MTODOS DE


ESTATSTICA MULTIVARIADA. [S.l.]: UFMG, 2005.

[12] BRAGA, G. U. L.; DESTEFANO, R. H. R.; MESSIAS, C. L. Oxygen


consumption by metarhizium anisopliae during germination and growth on
different carbon sources. Journal of Invertebrate Pathology, v. 74, p. 112119,
1999.

[13] MOWAT, E. et al. The characteristics of aspergillus fumigatus mycetoma


development: is this a biofilm? Medical Mycology, v. 47, p. 120126, 2009.

[14] LI, H. et al. Glycosylphosphatidylinositol (gpi) anchor is required in aspergillus


fumigatus for morphogenesis and virulence. Mol Microbiol, v. 64, p. 10141027,
2007.

[15] YU, J.; KELLER, N. Regulation of secondary metabolism in filamentous fungi.


annual review of phytopathology. Annual Review of Phytopathology, v. 43, p.
437458, 2005.

[16] BENNETT, J. Aspergillus: a primer for the novice. Medical Mycology, v. 47,
p. 512, 2009.

[17] LATGE, J. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology


Reviews, v. 12, p. 310, 1999.
REFERNCIAS 150

[18] ADAMS, T. H.; WIESE, J. K.; YU, J. H. Asexual sporulation in aspergillus


nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 62, p. 35, 1998.

[19] BRAGA, G. U. et al. Effects of uvb irradiance on conidia and germinants of the
entomopathogenic hyphomycete metarhizium anisopliae: a study of reciprocity
and recovery. Photochem Photobio, v. 73, p. 1406, 2001.

[20] BISCHOFF, J. F.; REHNER, S. A.; HUMBER, R. A. A multilocus phylogeny


of the metarhizium anisopliae lineage. Mycologia, v. 101, p. 512530, 2009.

[21] CARLILE, M. J.; WATKINSON, S. The Fungi. Fourth. [S.l.]: Academic Press.,
1997.

[22] BAYRAM, O. et al. Spotlight on aspergillus nidulans photosensory systems.


Fungal Genet Bio, v. 47, p. 9008, 2010.

[23] ADAMS, T.; WIESER, J. K.; YU, J. H. Asexual sporulation in aspergillus


nidulans. Microbiol Mol Biol Rev, v. 62, p. 3554, 1998.

[24] MOONEY, J.; YAGER, L. N. Light is required for conidiation in aspergillus


nidulans. Genes Dev, v. 4, p. 147382, 1990.

[25] COTTY, P. J. Aflatoxin and sclerotial production by aspergillus-flavus -


influence of ph. Phytopathology, v. 78, p. 125053, 1998.

[26] JR., R. L. B.; AYRES, J. C. Effect of initial ph on aflatoxin production. Appl


Microbiol, v. 30, p. 10501, 1975.

[27] CALVO, A. M. et al. Relationship between secondary metabolism and fungal


development. Microbiol Mol Biol Rev, v. 66, p. 44759, 2002.

[28] SZEGHALMI, A.; KAMINSKYJ, S.; GOUGH, K. A synchrotron ftir


microspectroscopy investigation of fungal hyphae grown under optimal and
stressed conditions. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 387, p. 17791789,
2007.

[29] GUARRO, J.; GENE, J.; STCHIGEL, A. M. Developments in fungal taxonomy.


Clinical Microbiology Reviews, v. 12, p. 454+, 1999.
REFERNCIAS 151

[30] DOERN, G. et al. Clinical impact of rapid in-vitro susceptibility testing and
bacterial identification. Journal of Clinical Microbiology, v. 32, p. 17571762,
1994.

[31] THOMPSON, R. L.; WRIGHT, A. J. General principles of antimicrobial


therapy. Mayo Clinic Proceedings, v. 73, p. 9951006, 1998.

[32] TENOVER, F. et al. Development of pcr assays to detect ampicillin resistance


genes in cerebrospinal-fluid samples containing haemophilus-influenzae. Journal
of Clinical Microbiology, v. 32, p. 27292737, 1994.

[33] ERUKHIMOVITCH, V. et al. Ftir microscopy as a method for identification


of bacterial and fungal infections. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, v. 37, p. 11051108, 2005.

[34] VANEECHOUTTE, M.; VANELDERE, J. The possibilities and limitations of


nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology. J Med Microbiol,
v. 46, p. 188194, 1997.

[35] FREDRICKS, D. N.; RELMAN, D. A. The possibilities and limitations of


nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology. J Med Microbiol,
v. 46, p. 188194, 1997.

[36] NAUMANN, D.; HELM, D.; LABISCHINSKI, H. Microbiological


characterizations by ft-ir spectroscopy. Nature, v. 351, p. 8182, 1991.

[37] HULEIHEL, M. et al. Spectroscopic characterization of normal primary and


malignant cells transformed by retroviruses. Applied Spectroscopy, v. 56, p.
64045, 2002.

[38] ERUKHIMOVITCH, V. et al. Spectroscopic characterization of human


and mouse primary cells, cell lines and malignant cells. Photochemistry and
Photobiology, v. 76, p. 446451, 2002.

[39] GORDON, S. et al. Identification of fourier transform infrared photoacoustic


spectral features for detection of aspergillus flavus infection in corn. International
Journal of Food Microbiology, v. 35, p. 179186, 1997.
REFERNCIAS 152

[40] NAUMANN, A. et al. Fourier transform infrared microscopy and imaging:


Detection of fungi in wood. Fungal Genetics and Biology, v. 42, p. 829835, 2005.

[41] IRUDAYARAJ, J.; YANG, H.; SAKHAMUR, S. Differentiation and detection


of microorganisms using fourier transform infrared photoacoustic spectroscopy.
Journal of Molecular Structure, v. 606, p. 181188, 2002.

[42] MAQUELIN, K. et al. Identification of medically relevant microorganisms by


vibrational spectroscopy. Journal of Microbiological Methods, v. 51, p. 255271,
2002.

[43] SOCKALINGUM, G. D. et al. Ftir spectroscopy in medical mycology:


applications to the differentiation and typing of candida. Analytical and
Bioanalytical Chemistry, v. 387, p. 17291737, 2007.

[44] COSTA, P.; POPPI, R. J. Aplication of genetic algorithms in the variable


selection in mid infrared spectroscopy. simultaneous determination of glucose,
maltose and fructose. Quimica Nova, v. 25, p. 4652, 2002.

[45] KACURAKOVA, M.; MATHLOUTHI, M. Ftir and laser-raman spectra of


oligosaccharides in water: Characterization of the glycosidic bond. Carbohydrate
Research, v. 284, p. 145157, 1996.

[46] WARTEWIG, S. IR and Raman Spectroscopy - Fundamental Processing. [S.l.]:


WILEY-VCH, 2003.

[47] CHALMERS, J.; GRIFFITHS, P. R. Handbook of vibrational spectroscopy -


Sample characterization and spectral data processing. [S.l.]: John Wiley & Sons,
2002.

[48] SUREWICZ, W.; MANTSCH, H. H.; CHAPMAN, D. Determination of


protein secondary structure by fourier transform infrared spectroscopy: a critical
assessment. Biochemistry, v. 32, p. 38994, 1993.

[49] MOVASAGHI, Z.; REHMAN, S.; REHMAN, I. Fourier transform infrared (ftir)
spectroscopy of biological tissues. Applied Spectroscopy Reviews, v. 43, p. 134179,
2008.
REFERNCIAS 153

[50] FORATO, L. A.; BERNARDES, R.; COLNAGO, L. A. Study of resolution


enhancement methods for analysis of secondary structure of proteins by ftir.
Quimica Nova, v. 21, p. 146150, 1999.

[51] BUSCH, S.; BRAUS, G. H. How to build a fungal fruit body: from uniform
cells to specialized tissue. Mol Microbiol, v. 64, p. 87376, 2007.

[52] RANGEL, D. E.; ANDERSON, A. J.; ROBERTS, D. W. Growth of


metarhizium anisopliae on non-preferred carbon sources yields conidia with
increased uv-b tolerance. J Invertebr Pathol, v. 93, p. 12734, 2006.

[53] RANGEL, D. et al. Variations in uv-b tolerance and germination speed of


metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. J
Invertebr Pathol, v. 87, p. 7783, 2004.

[54] RANGEL, D. et al. Visible light during mycelial growth and conidiation of
metarhizium robertsii produces conidia with increased stress tolerance. FEMS
Microbiol Lett, v. 315, p. 816, 2011.

[55] YAGER, L. Early developmental events during asexual and sexual sporulation
in aspergillus nidulans. Biotechnology, v. 23, p. 1941, 1992.

[56] CALVO, A. The vea regulatory system and its role in morphological and
chemical development in fungi. Fungal Genetics and Biology, v. 45, p. 10531061,
2008.

[57] BRAKHAGE, A. et al. Regulation of penicillin biosynthesis in filamentous


fungi. Molecular Biotechnology of Fungal Beta-Lactam Antibiotics and Related
Peptide Synthetases, v. 88, p. 4590, 2004.

[58] LI, Z. et al. Biological control of insects in brazil and china: history, current
programs and reasons for their successes using entomopathogenic fungi. Biocontrol
Science and Technology, v. 20, p. 117136, 2010.

[59] LUZ, C. et al. Selection of beauveria bassiana and metarhizium anisopliae


isolates to control triatoma infestans. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 93, p. 839846,
1998.
REFERNCIAS 154

[60] KELLER, N. et al. ph regulation of sterigmatocystin and aflatoxin biosynthesis


in aspergillus spp. Phytopathology, v. 87, p. 6438, 1997.

[61] HALLSWORTH, J.; MAGAN, N. Culture age, temperature, and ph affect the
polyol and trehalose contents of fungal propagules. Applied and Environmental
Microbiology, v. 62, p. 24352442, 1996.
Apndice A
Correes

ste captulo contm algumas correes feitas aps a defesa. Outras correes
E menores j foram introduzidas ao logo do trabalho, porm optou-se por
destacar aqui a anlise de componentes principais (PCA).
O PCA foi aplicado atravs do programa Minitab 16 para a anlise da
influncia da luz, do pH e diferenciao de espcies e generos fngicos. Entretanto,
este programa analisa apenas a primeira e a segunda componente principal
automaticamente. Para analise da terceira componente principal, como foi sugerido
pela banca, optou-se por aplicar o programa Statistica 10 anlise da influncia da
luz e observar os resultados obtidos.
Assim, a primeira espcie apresentada a Aspergillus nidulans (ATCC
10074). Para esta linhagem a distribuio PC 1 x PC 2 diferencia os pontos
referentes amostra crescida na presena e na ausencia de luz nos intervalos I, II e III.
Entratento, no intervalo IV no possvel diferenciar as condies de crescimento. A
mesma anlise foi refeita e na Figura A.1 esto apresentados os diagramas de PC 1
x PC 3. Os pontos em preto com a letra P referem-se ao grupo crescido na presena
de luz, enquanto os em vermelho com a letra A referem-se ao grupos crescido na
ausncia de luz.
Os intervalos I e II novamente puderam ter os grupos diferenciados. Os
intervalos III e IV tiverem resultados opostos aos anteriores, sendo que agora o
intervalo III apresentou os pontos sobrepostos enquanto no IV pela primeira fez foi
possvel diferenciar os grupos em funo da presena ou ausncia de luz durante o
crescimento.

155
A - Correes 156

(a) (b)

(c) (d)

Figura A.1: Anlise da primeira e terceira componentes principais aplicada a espcies


A. nidulans (ATCC 10074) com crescimento na presena (P) e na ausncia (A) de luz
para os quatro intervalos do espectro de absoro.

Novamente os mesmos intervalos foram avaliados em funo agora de PC 2


x PC 3 e esto apresentados na Figura A.2.
Nessa anlise um resultado interessante foi obtido, onde os intervalos I e II
apresentaram os pontos sobrepostos enquanto nos intervalos III e IV foi possvel
diferenciar os grupos em estudo. A Tabela A.1 apresenta a varincia de cada uma
das trs componente assim como a varincia acumulada.
O primeiro e o segundo intervalo apresentam distribuio das varincias de
cada componente semelhantes, onde PC 1 corresponde 80-87%, PC 2 9% e PC 3
1-5%. Como resultado observamos para ambos intervalos a distribuio de pontos
capaz de diferenciar os grupos em PC 1 x PC 2 e PC 1 x PC 3. A distribuio PC
A - Correes 157

(a) (b)

(c) (d)

Figura A.2: Anlise da segunda e terceira componentes principais aplicada a espcies A.


nidulans (ATCC 10074) com crescimento na presena (P) e na ausncia (A) de luz para
os quatro intervalos do espectro de absoro.

2 x PC 3 em ambos no capaz de no foi capaz de identificar os pontos referentes


a cada grupo. Este resultado indica principalmente a qualtidade de informao
contida em cada componente, onde ao avaliar uma componente com alta e outra
com baixa varincia podemos diferenciar as amostras. Mas isso no possvel ao
avaliar umas componentes com baixa varincia, como PC 2 e PC 3.
O terceiro intervalo apresenta uma distribuio diferente com PC 1 de 58%,
PC 2 27% e PC 3 10%. Como resultado temos PC 1 x PC 2 e PC2 x PC 3
diferenciando os grupos enquanto PC 1 x PC 3 no. J o quarto e ltimo intervalo
apresenta as varincias das componentes da seguinte forma: PC 1 87%, PC 2 11%
e PC 3 0,58%. O interessante que mesmo a terceira componente possuindo um
A - Correes 158

Tabela A.1: Resultado da anlise de componentes principais aplicada a A. nidulans em


duas condies de luminosidade. A tabela apresenta os valores das varincias das trs
primeiras componentes principais e a varincia acumulada.

Intervalo Componente Varincia (%) Acumulada (%)


PC 1 87,98 87,98
I
PC 2 9,74 97,72
PC 3 1,30 99,02
PC 1 80,89 80,89
II
PC 2 9,25 9,14
PC 3 5,97 96,11
PC 1 58,34 58,34
III
PC 2 27,76 86,10
PC 3 10,63 96,73
PC 1 87,51 87,51
IV
PC 2 11,19 98,70
PC 3 0,58 99,28

falor inferior apresenta um bom resultado em ambos os diagramas. Isso pode ser
consequncia dos grupos CH2 e CH3 , presentes no intervalo IV, estarem prximos
a banda de gua, sofrendo grande influncia. Assim, sua informao "til"ou que
sofre menos influncia est em uma pequena parcela do total.
O mesmo procedimento foi repetido para a linhagem Metarhizium acridum
(ARSEF 324). Anteriormente, a anlise atravs de PC 1 x PC 2, no foi capaz de
diferenciar as amostras em nenhum dos intervalos estudados. E este resultado se
repetiu na Figura A.3 onde so apresentados os diagramas de PC 1 x PC 3 para
nos quatro intervalos e na Figura A.4 onde so apresentados os diagramas de PC
2 x PC 3 no mesmo intervalos. Em nenhuma das anlises foi possvel identificar os
grupos amostrais.
A Tabela A.2 apresenta a varincia de cada componente assim como a
varincia acumulada das trs primeiras componentes. A variao desses valores
A - Correes 159

(a) (b)

(c) (d)

Figura A.3: Anlise da primeira e terceira componentes principais aplicada a espcies


M. acridum (ARSEF 324) com crescimento na presena (P) e na ausncia (A) de luz
para os quatro intervalos do espectro de absoro

menor quando comparada a linhagem anteior, o que era esperado devido aos
espectros serem extremamente prximos.
Embora a linhagem M. acridum no tenha tido acrescimo de informao com
a anlise da terceira componente, a linhagem A. nidulans teve. Os intervalos I, II e
III foram capazes de diferenciar as amostras apenas atravs das duas primeiras
componentes principais. Entretanto, o intervalo IV s foi capaz de diferenciar
as amostras crescidas no claro e no escuro com a anlise da terceira componente
principal. Sendo assim, esta sugesto feita pela banca acrescenta mais informao
aos resultados j apresentados neste trabalho.
A - Correes 160

(a) (b)

(c) (d)

Figura A.4: Anlise da segunda e terceira componentes principais aplicada a espcies M.


acridum (ARSEF 324) com crescimento na presena (P) e na ausncia (A) de luz para
os quatro intervalos do espectro de absoro
A - Correes 161

Tabela A.2: Resultado da anlise de componentes principais aplicada a M. acridum em


duas condies de luminosidade. A tabela apresenta os valores das varincias das trs
primeiras componentes principais e a varincia acumulada.

Intervalo Componente Varincia (%) Acumulada (%)


PC 1 83,66 83,66
I
PC 2 7,00 90,66
PC 3 4,64 95,3
PC 1 56,20 56,20
II
PC 2 24,53 80,73
PC 3 5,78 86,51
PC 1 67,62 67,62
III
PC 2 23,68 91,3
PC 3 4,14 95,44
PC 1 65,97 65,97
IV
PC 2 27,07 93,04
PC 3 5,61 98,65