Ao del Buen Servicio al Ciudadano

LABORATORIO DE ENZIMOLOGA
PRCTICA N1
ACTIVIDAD DE FOSFATASA CIDA EN HGADO
MESA 5

Nombres codigo Introduccin Procedimiento Clculos Discusiones

Resultados

Barbagelata Chalco 20141011 50% 75% 25% 50%

Norma Eliana

Cordero Flores Jos 2014101 0% 0% 75 % 0%

7

Garavito Mena Jhon 20130090 50% 0% 0% 25 %

Jhosef

Bustamante Loreo, 20141014 0% 25% 0% 50%

Junior

2017- I
1.Introduccin:

Las fosfatasas cidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo,
siendo particularmente altas las cantidades de estas enzimas en prstata, estmago,
hgado, msculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Las distintas isoenzimas se diferencian entre
s por su pH ptimo, peso molecular, y requerimientos de activadores e inhibidores. La
fosfatasa cida prosttica (PAP) constituye un valioso auxiliar en el diagnstico precoz de
cncer prosttico, una de las formas neoplsicas de mayor morbilidad. La determinacin de
la actividad enzimtica de PAP usando -naftil fosfato como sustrato ha mostrado
sensibilidad y especificidad adecuadas para su utilizacin en el diagnstico de esta
enfermedad. Se encuentran actividades elevadas de Fosfatasa cida total (ACP) en algunas
enfermedades hematolgicas (leucemia mieloctica, trombocitmopenia idioptica) y seas
(enfermedad de Paget, carcinoma seo), as como en algunos tipos de cncer,
enfermedades hepticas (hepatitis, ictericia obstructiva), etc. (E.Ctola. 2000).

2.Materiales y mtodos:

Materiales
Manual de prcticas de Enzimologa.Mg.Sc. Pilar Aliaga Rota VIII edicin, Marzo 2017 , pg
2-4.

Preparacin de la muestra para la cuantificacin de la actividad de la enzima

Para iniciar la preparacin de la muestra, se rotulan tres tubos de ensayo: blanco, M y RM.
Luego se adiciona a cada tubo 2.5ml de buffer acetato y 0.2 ml de P-nitrofenil fosfato.
Despus se llevan los tres tubos a bao mara a 37C por 5 minutos. Finalizado este tiempo
se agrega 0.1ml de extracto crudo de hgado a los tubos M y RM, dejando un lapso de 30
segundos entre tubo y tubo, para continuar la incubacin de los tres tubos a 37C por
2minutos. Pasados los 2 minutos se retiran los tres tubos e inmediatamente despus se
agrega 1.0 ml de una solucin NaOH 1M a los tubos M y R M, dejando un lapso de 30
segundos entre cada tubo en el mismo orden de la adicin del extracto crudo de hgado .
Para finalizar con la preparacin de los tubos, aadir 1ml de NaOH 1 M y 0.1ml de ext al
tracto crudo de hgado al tubo blanco .Para la lectura de las absorbancias, calibrar el
espectrofotmetro con agua a 402 nm y finalizar leyendo las absorbancias del
contenido de cada tubo..

3.Resultados:

En la siguiente tabla podemos observar las absorbancias obtenidas por las distintas mesas,
en este caso, omitimos los datos extremos y solo tomamos en cuenta los ms cercanos
para obtener un promedio ms confiable y poder realizar los respectivos clculos y
comparaciones. Recordar que las medidas obtenidas en el espectrofotmetro deben estar
dentro de un rango de ( 0.2 - 0.8 )
4.Clculos:

Hallamos U/L ,partiendo de esta relacion que se conoce como Ley de Lambert-Beer y se
representa matemticamente con la siguiente ecuacin:(Bermejo,1990)

A = .l.c
donde:
: representa la absorbancia especfica o absortividad de la especie que absorbe
l :es el paso ptico: longitud atravesada por la radiacin electromagntica a travs del
medio absorbente
c :es la concentracin de la especie absorbente.(Bermejo,1990)

A = C x1840

Primero se debe de restar la absorbancia de la muestra de la mesa 1,2 y3 con su respectivo

tubo blanco( 2.4626, 1.661,1.644),despus se procede a sacar el promedio de las 3 mesas,
luego se calcula la concentracin total de la muestra.

18400 1M
1,9225 xM = 1. 04480 U M

Luego se suman todos los volmenes de los reactantes para calcular la concentracin en

dicho volumen . 1.04480 U moles...1000 ml

3.97024= x U moles..3,8ml

Despus se calcula en relacin al tiempo que en este caso es 1 min, para calcular la
concentracin en dicho tiempo.
3.97024 moles 2min
1.98512=x moles1min

Por ltimo se toma en cuenta el extracto crudo de hgado tomado en un 1 ml y se

procede a calcular dicha concentracin.

1.98512 U moles. 0,1ml

19.8512=x U moles.1 ml

Se tiene que para una absorbancia de 1.9925 de fosfatasa acida se tiene una
actividad enzimatica de 19.8512 U/mL

5.Discusiones:

La presencia de una enzima se demuestra generalmente siguiendo la

desaparicin del sustrato la aparicin del producto de la reaccin. La
enzima se incuba con el sustrato bajo condiciones cuidadosamente
controladas (pH, temperatura, etc.) y se sacan alcuotas a intervalos de
tiempo apropiados para ser analizadas.La actividad enzimtica de una
solucin de enzima se expresa en unidades (U) por mL y es una medida de la
concentracin de enzima en solucin:
En este trabajo prctico se trabajar con la enzima fosfatasa cida proveniente de
un extracto crudo de la hgado . Este extracto crudo ser utilizado para determinar la
actividad enzimtica y estudiar las propiedades cinticas de la enzima fosfatasa
cida. Para evaluar la actividad de la fosfatasa , se utiliza un sustrato orgnico
(p-nitrofenilfosfato), la concentracin del producto de la hidrlisis ( p- nitrofenol ) es
proporcional a la actividad de la fosfatasa . El principio de la tcnica se basa en el
uso de una fraccin artificial de un sustrato orgnico ( p - nitrofenilfosfato ) el cual

es hidrolizado por fosfatasas del tipo fosfomonoesterasas para obtener HP 04

( Otrola 2003 ).

El sustrato ms habitual es el p-nitrofenilfosfato , que es un fosfato monoester

mineralizado por fosfatas cidas y alcalinas en el suelo. Para probar la actividad
de cualquiera de estas fosfatasas , basta ajustar el pH del medio de incubacin ,
estableciendo condiciones cidas o alcalinas (Stevenson y Cole , 1999 ) y en casi
todos los ensayos se emplea p-nitrofenilfosfato como sustrato, ya que es incoloro y
por accin de fosfatasa se transforma en p-nitrofenol a partir de la cual se genera
p-nitrofenolato que produce el color amarillo en condiciones alcalinas . Por esta
razn , el aumento de coloracin amarillo con el tiempo de incubacin , medido a
402nm con un espectrofotmetro , es un indicador de que el nivel en el que el
sustrato p-nitrofenilfosfato es hidrolizado por la fosfatasa una vez que la reaccin se
detiene y la solucin se alcaliniza ( Coney , 2000 )

La velocidad de una reaccin enzimtica es influenciada por mltiples factores que

deben tenerse presente para la correcta medicin de la velocidad enzimtica, El pH
de los ensayos enzimticos debe mantenerse constante durante la incubacin (lo
que se logra utilizando un amortiguador o tampn apropiado) ya que la velocidad de
una reaccin enzimtica est influenciada por el pH del medio de incubacin. Los
residuos de aminocdos que participan en la catlisis presentan diferentes grados
de ionizacin a diferentes valores de pH del medio de incubacin, por lo que la
mayor velocidad alcanzada por la enzima ser cuando esta se incube en su pH
ptimo.
La temperatura modifica la velocidad de la reaccin enzimtica, por lo que debe
mantenerse constante durante el curso de la reaccin, lo que se consigue fcilmente
al realizar el ensayo en baos termoregulados. A medida que la temperatura de
incubacin aumenta, la actividad de la enzima aumenta, hasta alcanzar la
denominada temperatura ptima experimental. A temperaturas superiores, el
proceso de desnaturalizacin se hace cada vez ms evidente, hasta producirse una
total inactivacin de la enzima. No existen reglas definidas para elegir la
temperatura a la cual se realizar la determinacin de la actividad de la enzima, ya
que el tiempo de incubacin es una variable que influye en dicha eleccin; lo
habitual es que sea entre 20 y 45 C. La temperatura influye, adems, sobre la
estabilidad de la enzima, que en general es ms alta mientras ms baja sea la
temperatura.

Los valores normales de fosfatasa cida en hgado deben estar dentro de un rango
de 2.2 U / L a 10.5 U / L. Haciendo una comparacin con nuestro resultado
obtenido en la prctica de laboratorio que fue de 19851. 2 U/L esta cantidad est
fuera de los valores , posiblemente por un error en los tiempos de incubacin ,
alteracin de la pureza de los reactivos o alteracin en las concentraciones de
reactivos utilizados .

6.-Bibliografa
Aliaga P. 2017. Manual de prcticas de Enzimologa. VIII edicin.Dpto
Acadmico de Quimica Unalm. La Molina- Per. pg 2-4.
Brcena Ruiz, et al. 2014. Caracterizacin cintica de la fosfatasa
alcalina.Departamento de
Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio
Severo Ochoa, 14071-Crdoba pp1-2

Bermejo Martnez.1990. QUIMICA ANALITICA GENERAL E INSTRUMENTAL (T.2)

(6 ED.). S.A. EDICIONES PARANINFO. Madrid pp 165-193

E. Ctola. 2000. Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944. Rosario -

Argentina.En Lnea. Disponible en:
http://www.wiener-lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/fosf
atasa_acida_total_y_prostatica_cinetica_sp.pdf
J. Wesley Alexander y Robert A. Good. 1984 PRINCIPIOS DE INMUNOLOGA
CLNICA. editorial Reverte S.A. Barcelona.