Cuernavaca Morelos a 25 de agosto del 2017

Francia Contreras Mara Fernanda

Flores Rojas T. Valeria

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas a la Biologa del Desarrollo

Sistema UAS-GAL4:
Este sistema permite expresar de manera in vivo protenas de inters en cualquier momento del
desarrollo temprano en Drosophila Melanogaster. Para ello debe expresar el factor de transcripcin
de levaduras Gal4, la clula modelo se une al DNA mediante las secuencias UAS as se activara
la transcripcin de cualquier gen en la posicin 3 entonces la protena situada en la posicin 3
al UAS se expresara en todas las clulas con Gal4.

Gal4 permite separar qu clulas expresan un gen o protena, se han creado variedades genticas
de organismos modelo (moscas de la fruta), llamadas lneas GAL4, las cuales expresan GAL4 en
algn tejido animal. La presencia de GAL4, en clulas tiene poco o ningn efecto, ya que el
efecto principal de GAL4 es unirse a una regin UAS [1].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

Northern blot:

Un Northern blot es un mtodo utilizado para detectar molculas de ARN especficas entre una
mezcla de ARN. Puede usarse para analizar una muestra de ARN de un tipo particular de tejido
o clula para medir la expresin de ARN de genes particulares. Primero se debe desnaturalizar
el RNA. Las molculas de ARN se separan por tamao esto se observa mediante electroforesis
en gel. Despus el ARN se transfiere del gel a una membrana de transferencia, esta membrana
de transferencia lleva todas las bandas de ARN originalmente en el gel. La membrana se trata
con una sonda, que ha sido diseada para tener una secuencia que es complementaria a una
secuencia de ARN, esto permite que la sonda se una a un fragmento de ARN especfico en la
membrana. Adems, la sonda tiene una etiqueta, que un tomo radiactivo o un tinte fluorescente.
De este modo, la sonda permite que la molcula de ARN de inters sea detectada entre las
muchas molculas de ARN diferentes en la membrana [2].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

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Northem blot del desarrollo: para poder investigar la expresin de la protena pax6, pax6 es
crtica para el desarrollo normal del ojo, las mutaciones en este gen resultan ojos pequeos o sin
ojo y nariz, esta tcnica muestra que el gen es expresado en el embrin en el cerebro, ojo y
pncreas sin hacerlo en ningn otro tejido.

PCR:

Es una tcnica para la sntesis in vitro de secuencias especficas de ADN. Es una forma muy
rpida de multiplicar el ADN, obtenindose millones de copias de una determinada secuencia
de ADN. Las siglas PCR significan "Polimerase Chain Reaction", Reaccin en Cadena de la
Polimerasa. Se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas:

1) Desnaturalizacin del ADN doble cadena.

2) Hibridacin de los cebadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras.

3) Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa.

En la primera etapa la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se calienta la
muestra a altas temperaturas (93-97C). Para re-naturalizacin se debe disminuir la temperatura.

Como segundo paso los cebadores se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el
fragmento que se desea amplificar. Todo ese proceso se realiza a una temperatura baja de 50-
65C.

En la tercera etapa se produce la sntesis de una cadena sencilla en la direccin 5-3 mediante la
enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucletidos fosfato presentes en el medio
siguiendo la cadena molde [3].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

Las tcnicas de PCR son, muy tiles en casos en los que hay muy poca muestra para estudiar.

Hibridacin in situ:

La hibridacin in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio fsico en
el que se encuentra y as analizar su distribucin en clulas y tejidos.
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Primero se debe preparar la muestra con un pre-tratamiento que puede ser llevado a cabo antes
de hibridacin, esto con el fin de aumentar la eficiencia y reducir la tincin no especfica. El
tratamiento con proteasas facilita el acceso hacia la secuencia objetivo. La optimizacin de la
preparacin de la muestra, incluido la fijacin y el almacenamiento, es importante para la
deteccin intracelular de cidos nucleicos. La fijacin necesita preservar el DNA o RNA y la
morfologa del tejido. El tejido que va a ser fijado debe congelarse.

Como segundo paso se hace una construccin de la sonda con diferentes tipos de sondas tales
como cDNA, cRNA y oligonucletidos sintticos. La eleccin de la sonda depender de la
sensibilidad y especificidad, facilidad de produccin, un tamao ptimo es de 50-300
nucletidos.

Por ltimo se necesita hacer un etiquetado de sonda, puede realizarse mediante la incorporacin
de radioistopos como 3H, 32P, 35S, 14C, 125I o marcadores no radioactivos como por ejemplo
biotina, anticuerpos especficos. Los sitios de hibridacin pueden visualizarse mediante
radiografa con rayos-X o emulsiones liquidas [4].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

Hibridacin in situ se utiliza para visualizar a un embrin en su totalidad o parte de este puede Commented [vfr1]:

ser teido para unos RNA mensajeros ya que en lugar de radioactividad se utilizan colorantes lo
que permite observar los embriones enteros o a sus rganos sin tener que seccionarlos,
observando de este modo grandes regiones de expresin del gen [7].

Q-PCR (PCR tiempo real):

La PCR cuantitativa se basa en el mismo principio que la PCR, es un mtodo que tiene como
objetivo identificar y cuantificar las secuencias de DNA mediante el uso de marcadores
fluorescentes en la reaccin. Este es un mtodo cuantitativo en el cual la muestra que se requiere
es mnima, una de sus caractersticas importantes es el uso de un marcador fluorescente como el
bromuro de etidio si queremos mucha fluorescencia tenemos que aumentar la concentracin de
este y tambin se agrega una solucin mix donde vienen incluidos los elementos bsicos de la
PCR para la amplificacin del DNA.

La PCR cuantitativa o de tiempo real al igual que la PCR se lleva acabo tambin en tres pasos:
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1. Desnaturalizacin: las cadenas de DNA son calentadas a 90-95C con la intencin de
que sus cadenas se separes.

2. Alineamiento del primer/Hibridacin de sonda: los primers se alinean al extremo 3 del

templado ya separado, para que se pueda llevar acabo la reaccin, su temperatura debe de ser
ptima entre 50-60C.

3. Elongacin: la enzima Taq polimerasa empieza su funcin agregando dNTPs

complementarios.

En esta tcnica se utilizan primers marcados con fluorforos los cuales son conocidos como
LUX que re reprimen cuando estn libres en soluciones y fluorescen dbilmente cuando se
desnaturalizan, estos emiten una luz fuerte cuando se unen al DNA [5].

RT PCR (PCR retrotranscripcion):

La reaccin en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa a diferencia del PCR convencional
(el cual amplifica el DNA) lo que busca es poder cuantificar el RNA en lugar del DNA.

En esta tcnica el RNA se transcribe de forma inversa a cDNA por medio de la transcriptasa
inversa, sin embargo se utiliza el medio convencional de PCR para la amplificacin del cDNA.

Para esta tcnica se necesitan distintos elementos para hacer la reaccin los cuales son:

mRNA

transcriptasa reversa

buffer

primers

dNTPs

El procedimiento de esta tcnica es diferente al PCR convencional o al PCR en tiempo real ya

que aqu utilizamos RNA de una sola cadena y por tanto es ms difcil de manejar y se necesita
un mayor cuidado.
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Antes de iniciar la amplificacin del RNA es necesario hacer este paso primero ya que genera
una copia de la hebra del RNA la cual se convertir en una copia de cDNA (DNA
complementario) el cual es ms estable y puede resistir al PCR.

El proceso general es:

La unin del primer y la extensin del primer mediante la incorporacin de los nucletidos
complementarios posteriormente el fin de la transcripcin reversa en donde se obtiene la hebra
de cDNA complementaria al RNA y posteriormente hacemos el PCR convencional [6].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

RT PCR: los embriones de ratn de pre-implantacin por ejemplo tienen poco RNA mensajero
y no se puede obtener millones de estos embriones para estudiar mediante la combinacin de
tcnicas de PCR con la capacidad de la enzima transcriptasa inversa para producir DNA a partir
de RNA mensajero, se puede evitar el problema del escases de mensajeros.

Inmunohistoqumica:

Estas tcnicas estn diseadas para la deteccin de determinados antgenos de inters en regiones
especficas de nuestro tejido, para esto se deben de crear condiciones ptimas para la correcta
unin especifica entre el antgeno y anticuerpo. Esta unin se debe detectar por algn sistema
de revelado.

Las tcnicas de Inmunoistoqumica se clasifican en:

Directa

Si se emplea directamente un anticuerpo que est marcado con un fluorocromo.

Indirecta

Si se usa un anticuerpo primario que reaccionara con el antgeno y un anticuerpo secundario que
estar marcado con un fluorocromo.

Tcnica tipo sndwich: la cual sirve para saber si tenemos un tipo de antgeno en un suero.

Complejo avidina-biotina: nos dice si hay o no antgeno [8].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

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Inmunoistoquimica: Nos ayuda a diagnosticar y clasificar tumores malignos indiferenciados as
como a identificar agentes infecciosos en tejidos, tambin en la clasificacin de leucemias y
linfomas.

Generacin de animales transgnicos:

Los animales modificados genticamente producen muchas controversias como si esta tcnica
es tica, si los animales sufren, si es sano alimentarnos de ellos, etc. La generacin de animales
transgnicos es similar a las plantas transgnicas ya que tambin se le introducen genes nuevos
o se quitan genes que ya tiene la especie, posteriormente estas modificaciones en animales
transgnicos sern heredados a sus progenitores. El fin de todas estas modificaciones es mejorar
la raza del animal hacindolos ms resistentes a enfermedades, que su carne sea de mejor calidad,
mejorar su produccin, utilizarlos como modelos de enfermedades humanas, mejorar las
caractersticas reproductivas, etc.

Existen varias estrategias para la produccin de animales transgnicos:

Mtodo de las clulas madre embrionarias: este mtodo se basa en introducir DNA
exgeno en clulas madres para que sufran transformacin.

Microinyeccin de proncleo: el DNA exgeno se inyecta directamente en el proncleo

del espermatozoide o del ovulo.

Granjas moleculares: en este mtodo se cran varios tipos de animales como las ovejas,
las cabras, las vacas y cerdos para producir protenas de uso farmacutico, estas protenas se van
a encontrar en sus fluidos biolgicos como la leche, la sangre, su fluido seminal. De esta manera
se generan grandes cantidades de las protenas de inters.

Disparos genticos: Con esta tcnica se puede absorber DNA en forma de bolitas y se
introduce en las clulas [9].

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

Animales transgnicos: Los ratones transgnicos resultaron un modelo experimental ideal para
conocer la regulacin de cierto genes en un organismo entero, en donde hay una interaccin
entre distintos tejidos. Esto es muy diferente de lo que ocurre en un cultivo aislado de clulas,
dado que la expresin de un gen depende de factores especficos presentes en cada tejido, el
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estudio de los niveles de RNA mediante tcnicas, como hibridacin, PCR o animales
transgnicos permite medir el nivel de expresin de sus genes y los distintos tipos de clulas del
cuerpo y en las distintas etapas del desarrollo. [12]

Sourthern Blot:

El sourthern Blot es utilizado para verificar la ausencia o presencia de alguna secuencia

nucletidica especifica en el DNA, tambin sirve para identificar el tamao del fragmento de
restriccin que contiene dicha secuencia, esto por medio de una electroforesis en gel y
posteriormente transferido a una membrana nitrocelulosa o nylon. A este mtodo se le llama
tcnica de hibridacin.

Proceso general

El material de partida de esta tcnica es el DNA previamente ya purificado el cual debe de estar
ya cortado en fragmentos esto se hace por medio de una digestin enzimtica. Los fragmentos
de restriccin del DNA sern depositados en un gel de agarosa donde sern separados por
electroforesis. De acuerdo a su tamao los fragmentos ms cortos migraran ms rpido que los
de mayor tamao, los fragmentos se hacen visibles con el bromuro de etidio que lleva el gel, el
cual se intercala en el DNA. Posteriormente el DNA ser transferido a una membrana de
nitrocelulosa o nylon. Despus le aadiremos a la muestra cido nucleico marcada
radioactivamente, a lo cual se le dice hibridacin. La muestra de cido nucleico marcada
radioactivamente se liga a los segmentos de DNA complementario. Para que podamos detectar
la posicin de la muestra radioactiva se hace un revelado con rayos x, la cual nos revelara la
posicin de nuestra muestra.

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

Sourthern Blot: Mediante la tcnica de anlisis del DNA como PCR, o sourthern blot se
identifican los animales transgnicos. El sourthern es una de las tcnicas ms confiables para
verificar e identificar la presencia de una modificacin gentica. Adems provee informacin
respecto al nmero de copias presentes en el genoma de estudio, cambios (re arreglos o
deleciones) que pudieran haber ocurrido en el transgnero o en el genoma receptor.

Western Blot:
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La tcnica bsicamente se basa en la separacin electrofortica de protenas para su
caracterizacin e identificacin, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida que
posteriormente se va a transferir a una membrana, mediante un campo elctrico perpendicular
al gel.

Proceso general

Primero tenemos que obtener/preparar nuestra muestra y despus filtrarla en una columna de
cromatografa para por ltimo obtener nuestra protena. Posteriormente se hace una
electroforesis en gel poliacrilamida + SDS para que se separen por su peso molecular.

La siguiente etapa ser la transferencia electrofortica a una membrana (del gel a la membrana
para que quede conservado y lo podamos utilizar). Una vez que tenemos la protena en la
membrana tenemos que hacer la hibridacin del anticuerpo.

Tenemos que hacer varios lavados a la membrana para bloquear las zonas en las que hay ausencia
de protenas y que no se unan a estas zonas los anticuerpos, este proceso lo repetimos varias
veces, se adiciona un anticuerpo secundario que se unir de forma especfica a las protenas.

Por ltimo se hace una deteccin de las bandas, por medio del anticuerpo secundario que se
unir al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario va a emitir luz que por rayos x va a ser
detectado.

De qu le sirve a la Biologa del Desarrollo?

Western Blot: Nos ayuda a examinar cambios en niveles proteicos. Conociendo el producto final
del gen.

REFERENCIAS:

1. Wikipedia. (14 junip 2017). Sistema GAL4 / UAS. 25 agosto 2017, de Wikipedia Sitio
web: https://en.wikipedia.org/wiki/GAL4/UAS_system
2. Scitable by nature education. (2014). Northern blot. 25 agosto 2017, de Nature
Education Sitio web: https://www.nature.com/scitable/definition/northern-blot-287
3. Eva Mas, Julio Poza, Jess Ciriza, Pilar Zaragoza, Rosario Osta y Clementina Rodellar..
(15, noviembre 2001). Fundamento de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).
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25 agosto 2017, de Artculo publicado en la Revista AquaTIC n Sitio web:
http://www.revistaaquatic.com/aquatic/html/art1501/basespcr.htm
4. Wikipedia. (5 mayo 2017 a las 11:00.). Hibridacin in situ. 25 agosto 2017, de Wikipedia
Sitio web: https://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_in_situ
5. Adriana Cortazar Martinez, Elza Patricia Silvia Rincon. (2004). PCR. Instituto de
Biotecnologia, 1, 43.
6. Mabel Rodriguez, William Rodriguez. (2006). PCR en tiempo real. IBT-UNAM, 1, 55.
7. Miriam Ruth Bueno Topete Alejandra Natal Vega Magaa. (2013). Tcnicas de
hibridacin. En BIOLOGIA MOLECULAR. FUNDAMENTOS Y APLICACIONES
(8). MC GRAW HILL.
8. Antonio Martinez. (.). Inmunohistoqumica. ., de Centro de Diagnosico Biomedico Sitio
web:http://cdb.hospitalclinic.org/laboratorios/anatomia-
patologica/tecnicas/inmunohistoquimica-tecnica/
9. Reinhard Renneberg. (2008). Embriones,Clones Y Animales Transgenicos. En
Biotecnologia para principiantes (23). Barcelona, Bogot. Buenos Aires, Caracas,
Mxico: Revert.
10. Jess Fernndez Tressguerres, Vicente Martines Fernndez y Vctor Navas Serrano.
(2013). Biotecnologa aplicada. -: Das de santos.

11. Ma. de los Angeles Pearranda. (.). Animales modificados geneticamente, aplicaciones.
En Biotecnologia (10). Madrid.

12. Helena Curtis, Adriana Schnek. (30 junio 2008). Curtis Biologia. Medica panamericana.

13. liliana agresott. (20 noviembre 2013). inmunohistoquimica. 27 de agosto 2017, de

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