ARTICULOS TECNICOS Se Determinacion dela biomasa ands poe pen ae iaininadtssearseere| N1 Procesos bioldgicos ieee tee aoe CaEncictabosiecrberaigy: | le Métodos directos e indirectos ‘nos de ellos, destacando sus ventajas einconvenients Por: Carmen Arnéiz, Laura Isue y Juin Lebrato Snes Goipn de Totnmienta de Agus Ressler. Excusla Universitaria Pliténica Polees lene Universidad de Sevilla, C/. Virgen de Africa, 7.41011 Sevilla. Tel/Fax: 95455 2848 7 954 2827 7. E-mail lebrato@cica es Determinacién de la biomasa, com- pponentes celularesespecificos, méto- dos biogusmicos, métodos einéticos, ‘métodos directos, métodos indirec= tos, métodos de recuento, procesos biokégicos 1. Introduccion de los distintos métodos de deter- rrr I adeterminacién dela biomasa _minacién de la biomasa. Determining biomass in biological {3 una de las variables maim ; . ae portantes de un bioproceso, ya 2, Métodos directos de Directand indirect methods. «que su determinacién nos levaala _determinacin de la biomasa Exalvation of biomass concent | comprensiGn de la eficiencia del tion is an important problem encoun- mismo. Setratade una variableclave 2,1, Métodos gravimétricos tered in many microbial and other | para establecer las tasas de produc-Lacantidadtotal de biomasa pre- bioprocesses. Many direct and indi eerie thadh Mac hece tem andi; | cién, de consumo de nutrientes y el sente enuna muestra puede medirse Nine ticaleadbramensesrobt | céleulo de los balances de masa de en términos de peso seco por uni- nigues. In this work various methods | cualquier proceso biol6gico. dad de volumen, ya sea como s6li edn lies ara Los métodos clisicos de deter- dos en suspensién totales (SST) 0 rationtheir practcalimportance,use- | mtinacién de biomasa son métodos _s6lidos en suspensién voldtiles fuinessandconstrainsinapplication, | directos que se basan en el niimero. (SV). Las eélulas se separan del I~ de células 0 en el peso celular. Los quido bien por centrifugacién bien Keywords: métodos de enumeracién celular por filtracién. Biochemical methods, iomasseva- | son métodos de observacidn, basa- La principal desventaja de estas luation, bioprocesses, counting met- | dos en propiedades fisicas 0 en la _técnicases que su determinacidn in hrods, direct methods, indirect met- | actividad biol6gica. Actualmente _cluye no slo microorganismos ac- faisKinetc methods,cellularspeci- | ay un gran interés en métodos al- _tivos sino microorganismos inuer- fic components 205 / OCTUBRE / 2000 ternativos de determinacidn de la tos, material inerte, polimeros ex- biomasa. Estos métodos son indi-__tracelulares y materia orgénica ad- tectos yestiman algtin componente _sorbida. Ademés, no puede aplicar~ celular o alguna actividad metabé- se cuando los sustratos a degradar lica espeeffica. No requieren el soninsolubles. examen visual delos organismosni Los métodos gravimétricos son su incubacién. En la Figura 1 se simples, pero consumen bastante muestra un resumen esquemético tiempo y son poco reproducibles,ARTICULOS TECNICOS ‘Métodos de determinacién de la biomasa Métodos directos Métodos gravimétricos Métodos espectrofotomeéricos ‘Métodos microscépicos de recvento celular en cémaras Microscopic de epfluorescencia Noranja de acridina, DAPI, quelato de europio, Mg-ANS cic, sta FISH Métodos de siembra Métodos indirectos Métodosfisico-quimicos indirectos: COT, DOO Components celulares Acidos nucleicos Proteinas Poliscicdridos Lipidos ATP Métodos bioquimicos Acividad esterasa Actividad deshidrogenasa Métodos cinétcos ‘Adaptaciones dl Respirémetro de Warburg Tasade respiracién Tosade desoparicion de sustrato Potencial bioquimico de producci6n de metano ‘Métodos en continuo Fi, 1. Equema dela dlistitosmétodos de determina dela bionaso. directas (microseépicas, por re- Neubauer, Thoma, Burker, Turk, 2.4. Métodos microscépicos uento.en placao peso seco) con las Fuchs-Rosenthal, Malassez, Petroft — mediante epifluorescencia | indirectas de la turbidez. Esta recta Hauser, etc, Elrecuentodemicroor- La microscopfa de epifluores- contiene datos sobre el mimero de ganismos se realiza en lacuadricula _ceneia comenz6 a emplearse a prin- células, permitiendo la estimacién central de la camara y se multiplica__cipios de los 70 y hoy en dia se con- 2.2, Métodos de tal pardmetro a partir de una sola por la profundidad, obtenigndose el espectrofotométricos ‘medida de la turbidez. riimero de microorganismos por Se basanen laexistenciade una Se tratade métodos ripidos, pero _unidad de volumen (ntimero de cé- relacién directa entre el nimeroto de bajasensibilidad y que presentan_Iulas.m, generalmente).. tal de microorganismos presentes problemas de calibracién (tipo de El recuento de microorganismos en una muestra y su valor de turhi- cultivo, medio de cultivo) ydeinter- en cmaras no es un método muy ddez. Tras la determinacién de latur-_ferencias con particulas. exacto debido a las imregularidades © _ bidez de la suspensién celular me- en la distribucién de la muestra. S dante espectrofotometria, el resul- 2.3. Métodos microscépicos _Adems, puedenconfundirse las c&- SS tado se expresa en unidades de ab- de recuento celular en Tulas con otras formas orgainicas © ~~ sorbancia, Sin embargo, antes de eGmaras inorgfnion exisicates exclinedioy 2 uilizarla urbidez como métodode _—_Existen diversos tipos de cdma-__no permite distinguir eélulas vivas, 2 —recuento, hay que realizar una recta ras parael recuento de microorga-._decélulas muertas. B — decalibrado que relacione medidas nismos tales como la cémara de SI TTECNOLOGIADEL AGUA cme eesidera como uno de lus mejores mié= todos para la estimacién de la bio- ‘masa. Laepifluorescencia es debida un agente fluorocromo, a la adi- cién de algtn anticuerpo mareado con fluorescencia (inmunofluores- cencia) oa una autofluorescencia natural debida a la existencia de al- gin componente celular autofluo- rescente. Cuando Ia epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tincién de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante mi- ceroscopia éptica con iluminacién de epifluorescencia. Los sustratos flyorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observacién directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedarfan englobados aquellos Fluorocromos que tras ser adsorbi- dos acttian especificamente sobre cidos nucleicos u otros componen- tes celulares. El segundo incluirfa a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad meta- bélica, son convertidos en moléeu- las fluorescentes. Al primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimacién de la poblacién total de una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-feni- lindol (DAPI. Estos fluorocromos, Permiten distinguir células de parti cculas e idemtificar bacterias no s6lo por su color, sino también por su forma y tamaio. EI naranja de acridina colorea tanto el ADN como el ARN de las células emitiendo a una longitud de onda aproximada de 470 nm. Los deidos nucleicos de hebra simple se colorean de un color naranja-rojo fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan un color verde fluorescente. El fluorocromo DAPI es un colorante especifico del ADN su pico de excitacién se encuentra Proximo a la region ultravioleta (365 nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluoro- cromos, no permiten distinguir en- tre las células muertas, metabélica- ARTICULOS TECNICOS mente inactivas, ¥ las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en células muertas, El quelato de europio, al igual que el naranja de acridina 0 el DA PI, es un colorante especifico de dcidos nucleicos. Otros fluorocro- mos como las sales de magnesio del dcido 1-anilino-8-naftalensul- fFénico (Mg-ANS) tiien principal- mente componeates celulares co- ‘mo protefnas, lipidos o membrana celulares. En cambio, el comporta- miento de estos agentes fluorocro- mos es el comentado anteriormen- te, sobrestiman el niimero de célu- las viables al no distinguir células vivas de muertas. Enel segundo grupo quedarfan englobados fluorocromos como el eloruro de S-ciano-2,3-ditolil te- trazolio (CTC, Rodriguez et al., 1992) 6 el 5- (y 6-) diacetato de sulfofluoresceina (SFDA, Tsuji et al., 1995). Ambos fluorocromos, a diferencia con los anteriores, dis- tinguen bacterias metab6licamen- te activas de las que no lo son me- diante la observacién microsc6pi- ca del producto fluorescente resul- tado de Ia actividad metabsliea pa- ra la que son especificos. Enel ca- so del CTC la actividad metabélica es la respiratoria y en el del SEDA. es la actividad esterasa. La epi fluorescencia hasada en fluorocro- mos como el CTC y el SDA pon- ‘dra de manifiesto aquellos micro- organismos en los cuales estén presentes dichas actividades meta- bélicas, pero sin cuantifiearlas. Salvando este obstaculo se en- cuentran las medidas bioquimicas de determinacién indirecta de la biomasa, que sf cuantifican activi- dades metabslicas La epifluorescencia es un méto- do simple y rapido. No obstante, su reproducibilidad esté cuestionada y necesita un equipamiento relativa- mente cara, La fluorescencia mediante anti- ‘cuerpos marcados con agentes fluo- rescentes esté basada en las propie- dades inmunolégicas de las células. Es una técnica muy sensible y espe- La epifluorescencia es un método simple y rapido cifiea, y puede realizarse in situ ‘También puede Ievarse a cabo me- diante hibridaci6n de sondas fluo- rescentes de ADN 0 ARN (Fluores- cent in situ hybridization, FISH), eau vee nnd utilizadas en Ecology Microbiana, 2.5 Métodos de siembra El recuento de microorganis- mos viables se fundamenta en la capacidad de dichas eélulas via- bles de desarrollar una colonia vi- sible en un medio de cultivo apro- piado. En los recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1 ml de la suspensién microbiol6gi- cca se mezela con el medio de culti- vo fundido y parcialmente enfria- do en una placa de Petri. En los re- cuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensidn sobre la superficie del medio de cultivo. Los resultados de Ios recuentos en placa se exptc~ san como unidades formadoras de colonia (UFC) por unidad de volu men de Ia suspensién microbiol6- sgica. Para que el recuento sea esta- sticamente significativo, elm mero de colonias deberé estar comprendido entre 30 y 300 colo- nias. En el caso de muestras muy diluidas se puede emplear Ia filtra- cidn de membrana, en la que tras la filtraci6n de la muestra es el filtro el que es colocado finalmente so- bre el agar (Atlas, 1992) Otro tipo de recuentos los const tuyen aquellos que emplean un me- ‘TRENOLOGIADEL AGUA 205 / OCTUBRE / 2000 a N205 / OCTUBRE / 2000 «dio de cultivo liquide como.es el ea so de la estimacién del nimero mis probable (NMP). El recuento de microorganismos, viables se fundamenta en el desarro- Ilo de una colonia visible a partir de cada organismo viable. El principal problema de este método es que no todas las bacterias presentes en una ‘muestra pueden crecer en el medio y las condiciones de cultivo seleccio- nado. Suelen ser, portanto, métodos infraestimativos y estadfsticamente cuestionables (Lazarova y Manem, 1995), 3. Métodos indirectos de determinacién de la biomasa Estos métodos se basan funda mentalmente en la determinacién de algiin componente celular espe- -0,en [a cuamtificaci6n de algu- na actividad enzimatica (métodos bioguimicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la forma- cidn de algtin producto (métodos cinéticos). También se incluyen en este apartado algunos métodos fisi- coquimicos. Los métodos bioguimicos ¥ ci ticos determinan, més que la viabili- dad de las bacterias la actividad ya que dependen més del estado meta- bélico de los microorganismos que del mimero de individuos. 3.1. Componentes celulares especificos Cualquier componente celular seleccionado para la estimacién de la biomasa viva de una muestra de- be responder a tres eriterios funda- rentals: Estar presente sini lulas viva, Ser ripidamente degradado cuando la eélulas mueran, ‘ Ser relativamente constante en concentracién respecto a cam- bios enelestado lary entre distintas especies. Hasta el momento, no existe nin- ‘gd componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin em- bargo, los mas adecuados para est ween cé- sioldgica cel ‘TECNOLOGIA DEL AGUS ARTICULOS TECNICOS mar biomasa viva son los dcidos nu- leicas, las proteinas, los polisa dos, los ipidos y el ATP, 3.1.1. Acidos nucleicos ELADN y el ARN son dos com- ponentes de las bacterias cuya sinte- sises proporcional alatasa de creci miento. Mientras que las concentra- ciones de ARN varian considerable- rente Eon el esta fisioligico ce lular, la cantidad de ADN es rel vamente mas constante, La cantidad de ADN se determi- na mediante espectrofotometrfa, tras su extraccién y purificacién Existen diversas téenicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificacién son complejos, con diversas interferen- cias bastante costosos. 3.1.2. Proteinas Existen varias técnicas para el anélisis de proteinas totales de una muestra biol6gica. Algunos estén muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez.y sim- plicidad. Es el caso de las téenicas de Lowry et al, (1951) y Bradford (1976). La principal desventaja de la de- terminacién de proteinas es que su cantidad en las células esta sujeta a fuertes variaciones debido, funda- ‘mentalmente, a cambios en las con diciones fisicoquimicas y al estado fisiol6gico celular. 3, «3. Polisacéridos [La mayorta de las células proca- riotas contienen écido murdmico (un peptidoglicano) como compo- nente de la pared celular. Existen varias téenicas para la determina- cin del dcido murimico en mues- tras que contengan mieroorganis- ‘mos. Todas elas se basan en la con versiGn del dcido murdmico a lac~ tato, seguida del andlisis enzimati- 0.0 quimico de la concenteacisn de lactato. El cido murdmico se extrae de las células mediante una hidrélisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromato- _graffa de intercambio isnico. Otros andlisis mis sensibles necesitan del uso de cromatografia Niquida (HPLC) o gaseosa (GC). Todas es- tas técnicas son laboriosas, muy largas y necesitan de un equipa- miento caro (Figura 2) 3.1.4. Lipidos Los lfpidos son un componente fundamental de las membranas ce- lulares. Su determinacién para lacs timacién de la biomasa de una po blacién bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros métodos. La prineipal ventaja es su alto conteni- dl especifico y que se encuentranen cantidades relativamente constan- tes, Otta ventaja muy importante es que los lipidos no forman parte de las reservas celulares y se degradan répidamente durante ia isis bacte riana, Aproximadamente, entre un 90-98% de los lipids de las mem- branas celulares esti en forma de fosfolipidos (Lazarova y Manem, 1995). Las tenieas de anilisis se basan, fandamentalmente,en laextraccién celularde los fosfolipidos con un di solvente orgéinico, su posterior hi- drotisis Seida para liberar el fosFato y, por tiltimo, la determinacién co- lorimétrica de éste Son téei Jativamente sencillas,reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fos- {ato; Findlay etl, 1989). 3.1.5. Trifosfato de adenosina o ATP E] ATP presenta las ventajas de ser un componente biaquiimica cen- tral presente en todos los microor- ganismos y especifico de los micro- organismos vivos, circunstancias ambas que permiten relacionarlo con la biomasa viva, Una de las téenicas mas utiliza. ddas para medir ATP se basa en la re. accién luciferina-luciferasa, proce- so responsable de la luz emitida por las Iuciérnagas y que ha sido am- pliamente estudiado, En este meca- rismo de luminiscencia se sabe que intervienen luciferina (fenol hetero- ciclico, LH2), luciferasa (enzima, E), ATP, cationes de magnesio yARTICULOS TECNICOS Fig 2 Croatica cd to eaclrén GILSON yeno en un proceso de oxidorre- in que ocurre en doble etapa: LH,+ATP+E 9 =——> E-LH-AMP+0, — Ya que por cada molécula de Iu- ciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinacién del ATP en ‘una muestra biol6gica puede hacer- se mediante extraccién por ebulli- cin en tampon Tris (hipocloruro de tris-hidroximetil-aminoetano) del ATP, incubaci6n con luciferina-lu- ciferasa y posterior medida de la luz producida en un fotémetro con re- sistro. La mayor desventaja de esta téc- nica es la necesidad de procesar la ‘muestra con rapidez, ya que el estado fisioldgico de las células eambia ré- pidamente tras latoma de muestra La relacién entre el ATP, el ADP yel AMP y el contenido total de de- Soxirribonuclestidos refleja la carga energética de las cétulas (ATP +0.5, ADP)(AMP + ADP + ATP)]. Esta relacién puede duplicarse en s6lo unos segundos. Algunos autores su- sicren que la carga energética es un valor mucho mas preciso que el contenido absoluto de ATP yaque la composicién celular de desoxirribu- nucleotidos varia con el estado f1- siolégico de los microorganismos: durante el crecimiento bacteriano el pool energético disminuye, al dis- minuir la concentracién de ATP y aumentar las de ADP y AMP (Uh- linder y White, 1983), E-LH,-AMP + PPi L+H,0+ bioluminiscencia Q) 3.2. Métodos bioquimicos Las medidas de alguna actividad enzimética pueden considerarse co- ‘mo una alternativa a los métodos tradicionales. Los ensayos enzim ticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen ripidamiente. Adem, el equipamiento necesario rng esni costoso ni complejo. Lama yorfa de las medidas de actividad enzimética se realiza mediante la conversién de sustratos especificos productos coloreados que son cuantificados fotomeétricamente. La principal desventaja de los métodos bioquimicos es Ia varia- cidn de las actividades enzimaticas celulares con los cambios fisiol6gi- os y que, una vez.que los microor- ganismos mueren, las enzimas libe- radas pueden seguir activas. Entre las distintas medidas de actividad enzimatica cabe destacar la activi- dad esterasa y a actividad deshidro- genasa, 3.2.1 Actividad esterasa El diacetato de tluoresceina (FDA) es un compuesto que puede ser hidrolizado por enzimas tales como proteasas, lipasas y estera- sas, siendo el producto de dicha Por cada molécula de luciferina oxidada se emite un cuanto » de luz conversi6n enzimitica la fluores cefna, La fluorescesna puede ser vi sualizada como un producto intra- celular mediante el empleo de la microscopia de epifluorescencia 0 cuantificada mediante espectrofo- tometrfa tras ser extraida con disol- ventes organicos, El principio en el que se basa la técnica del FDA es en el cardcter hi- drofébico del diacetato de fluores- cefna, lo que le permite penetrar a través de la bicapa lipidica que for- ‘ma la membrana celular. Una vez-en el interior celular, es convertido me- inte la actividad esterasa en fluo- resceina, molécula de cardcter hi drofilico que puede ser almacenada intracelularmente dada la baja per- meabilidad de la membrana a ésta Ya que las cétulas muertas se carac- terizan por presentar abundantes otificios en sus membranas, el FDA s6lo temirécélulas viva, EI FDA se ha empleado princi- palmente en la determinaci6n de la actividad de hongos y bacterias en muestras de suelos. Sin embargo, se hhaencontrado que no todas las espe: cies presentes en el suelo son sensi- bles a esta técnica, ya sea porque el FDA no penetra adecuadamente en las eélulas 0 porque no es bien rete- nido. Tratando de minimizar estos problemas, en el campo de la epi fluorescencia se han utslizado der vados del FDA como el diacetato de 6-carboxifluorescefna (CFDA) y el diacetato de 5- (y 6-) sulfofluores- ceina (SEDA), este tiltimo mencio- / OCTUBRE / 2000 205ARTICULOS TECNICOS nado anteriormente y que por el mo- mento se ha revelado como el mas apropiado.. 3.2.2. Actividad deshidrogenasa (DHA) En una muestra biol6gica, la de- terminacién de la actividad del si tema de transporte electrénico pue~ de realizarse por medida de la acti- vidad deshidrogenasa. Todos los icroorganismos aerobios poseen un sistema de transporte de electro- nes activo, en el que el mis impor- tante aceptor terminal de electrones esel oxigeno, En lacorriente princi- pal de este transporte electrénico participan, entre otras, las deshidro- ‘genasas piridin-dependientes que necesitan NAD 0 NADP como co- enzima y las deshidrogenasas fla- la cuantificaciénde laactividadres-_tesen la muestra metabolizan la ma- vin-dependientes que contienen fla-_piratoria de la muestra. teria orginica con la consecuente vin-adenin-dinuclestido (FAD) 6 EL TTC presentael inconvenien- _disminucién del nivel de oxigeno, flavin mononuclestido (FMN) co- te de su elevada sensibilidad al oxf- que es consumido, y el aumento de ‘mo grupo prostético. Las deshidro- geno (Chung y Neethling, 1989).F1 _laconcentracién de CO,, que es pro- genasas son enzimas de oxido-re-_INTnotieneesta imitaciényswuso ducido. Eldidxido de carbono es ad- uccién que participan en el trans- esta cada vez mas extendido. Sin _sorbido en una solucién de potasa, porte de electrones desde un sustra- embargo, su precisién y correlucién por lo que la disminucién de la pre- to orginico a un aceptor final de con laeantidad de biomasa viva no siGneneste sistema cerradoes debi- clectrones mediante latransferencia est suficientemente demostrada__daal volumen de oxfgeno consumi- Figue.3 Vain a micexepo dpc [1000s de uno musa de fngo civ tose agin proteso dela INidebidrogenasa de hidrdgeno, Ladeterminacién de (Singhetal, 1994). do por los microorganismos, lo cual la actividad deshidrogenasa puede puede ser medido mediante un sen- hacerse midiendo la capacidad de 3,3, Métodos cinéticos sor de presi6n y registrado. La re- Jos microorganismos para reducir La base de estos métodos es 1a __presentacién nel tiempo del oxige- un indicador 0 colorante redox. En- medida del consumo de sustrato 0 no disuelto (mg.t") informa del tre estos colorantes se encuentran de la formacién de producto enen- consumo de oxfgeno, siendo la pen- sales de tetrazolio tales comoel clo- _sayos en discontinuo. El ejemplo dente de la recta de ajuste dptimo la ruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio mas tfpico en microorganismos ae-__tasa de consumo de oxgeno (OUR) (TTC) vel cloruro de 2-(p-iodofe-_robios es la determinacién de la enmg0O,.F'.-1 nil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazo- DBO, que indica la biodegradabili- Una adaptacién del respirémetro lio (INT). Ambas se caracterizan dad de un sustrato en disoluciéna de Warburg para medir el biogés porsersolublesen aguaensu forma través del consumo de oxigeno del producido en procesos anaerobios oxidada y por formar depésitos ce- medio. puede encontrarse en James et al lulares insolubles de TTC-formazin (1990). e INT mazén Figura3),respee- 3.3.1, Adaptaciones del 3 S tivamente, cuando son reducidas —_Respirémetro de Warburg 3.3.2. Tasa de respiracién Spor la actividad respiratoria. Estos La tasude consumo de oxigeno_ (Oxigen Uptake Rate, OUR) 2) depésitos rojizos de formazén, al ser puede ser determinada segtin el El consumo de oxigeno de los S —observados microseépicamente, _principioen el que se basael respi microorganismos presentes en una = permiten distinguir en muestras metro de Warburg, por el que a muestra bioldica debido ala respi: J __ acuosas las bacterias que respiran temperatura y volumen constantes, _raci6n end6gena de mantenimiento de aguellas que no (determinacién _lavariaciénen la camtidaddeun gas celular ya la oxidacton del sustrato directa de la biomasa). 0 bien, el puede medirse porla variaciénde su orgénico presente en dicha muestra formazin es extraido con disolven- _presién, En una planta piloto equi- (en ausencia de nitrificaci6n), rec tes organicos y determinado espec- pada para actar como un respiré- be el nombre de respiracidn. Asi trofotométricamente, permitiendo metro, los microorganismos presen- pues, se denomina tasa de respira-ARTICULOS TECNICOS Fig. Satna OXTOPIS6 WW poraldeteminoion e080. Instrumento para la medida del exigeno Electrodo de oxigeno Fig. 5 Disgeative de da del conse de orig La respiracion endégena es directamente proporcional a la concentracion de microorganismos cidn (en mg O,.1'.h-) ala velocidad con la que los microorganismos uti lizan el oxigeno en funcisn a estos dosconceptos. La respiracién endégena. en la prictica, se considera que es cons- {ante a temperatura y concentracién de microorganismos fijos. Por tan- to, serd directamente proporcional a la concentracién de microorganis- ‘mos presentes en la suspensién bio- 6gica, estimados como SSV. La respiracién debida a la meta bolizacién del sustrato orgdnico presente en la muestra 0 respira~ cidn exégena, serd proporcional a la concentracién de sustrato orgé nico répidamente biodegradable ¢ incluirfa, silo hubiera, el consumo de oxigeno ocasionado por nitrifi- La tasa de respiracién total refe- rida a la concentracién de microor- ganismos, expresada como SSV, es la tasa de respiracién especitica (SOUR). Su principal caracteristica es que define la actividad biol6gica ‘en un momento dado de una bioma- sa especifica, La medida de Ia actividad biol6- gica SOUR esté relacionada con la relacién “alimento/microorganis. mos” (F/M en terminologia anglo- sajona), yaque comprende latasa de respiracién exégena (proporcional a la DBO) y los SSV de un cultivo biol6gico. En la Figura 5 se mues- ‘rau esquema simplificado del dis- positivo empleado para la medida de consumo de oxigeno. TRENOLOGIA DEL AGUA CTUBRE / 2000 3TUBRE / 2000 205 / OF ARTICULOS TECNICOS 3.3.3. Tasa de desaparicién —Iadeterminacién on-line de la hia- phospholipid analysis in deter- de sustrato ‘masa de un proceso biol6gico. Las mining microbial biomass in se- Es el método mis convencional __t&enicas mas importantes se basan _diments. Appl. Envir. Microbiol., para determinar la actividad de una en propiedades eléctricas, microca- 55, 2888-2893, poblacién de microorganismos. La lorimétricas o espectrofotométricas James, A, Chernicharo, C.A.L. y disminucién de la concentracién de de los cultivos biol6gicos. Sinem- Campos, C.M.M (1990). The de- sustratoenel tiempo puedehacersea argo. a pesar del desarrollo teeno-_yelopmentof'anew methodology través de métodos indirectos, como _I6gico, no existe un sensor ideal pa- _for the assesment of specific met- laDQO 0el COT, o mediante técni- ra la monitorizacién en continuo de __~hanogenic activity. Wat. Res.,24, cas especificas, fundamentalmente a biomasa Singh etal, 1994), 813-825. cromatogrificas (GC 0 HPLC). La Lazarova, V. y Manem, J. (1995). ‘uisqueda de nuevos métodos ha le Biofilm characterization and a vado al empleo de técnicas basadas 5. Agradecimientos tivity analysis in water and was- enel empleo de electrodos selecti-_-‘Losautores desean expresar su. _tewater treatment. Wat. Res.,29, vos.enlosqueeledlculodelaactivi- agradecimiento ala Direccién Ge- 2227-2245. dad de a muestra iolégicase realiza _neral de Investigacién Ciemtifica y Lowry, O.H.. Rosebrough N.J., enbase al tiempo requerido paraque Técnica, Ministerio de Educacién y Fart, A.L. y Randall R.J. (1951). ccurra el 50% de la desaparicién del Cultura, porlafinanciacién de parte Protein measurement with folin- sustrato suministrado y paraelqueel de este trabajo mediante dos becas phenol reagent. J. Biol. Chem., electrodo es especifico del Programa de Formacién de Per- 193, 265-275. sonal Investigador, Refs.: IN92- Rodriguez, G.G., Phipps, D.. Ishi 3.3.4. Potencial bioquimico 28480461 y IN92-D28598661 __guro, Ky Ridgway, HF. (1992 de produccién de metano —_concedidas a M.C. Ariz y L. Isac, Use of fluorescent redox probe (BMP) respectivamente for direct visualization of acti- Esta técnica consiste en medir vely respiring bacteria, Appl. En- con una jeringa o un frascode Ma- 6, Bibliografi vir. Microbiol., 58, 1801-1808. riotterelleno de agua la produccién Atlas, RLM. (1992). Microbial Eco- Singh, A., Kuhad, R.C., Sahai, V. y total de biogas (CH, yCO,) produ- logy: Principes, Methods and Ghosh, P. (1994), Evaluation of cida por un reactor anaerobio dis- Applications. M.A. Levin, R.J biomass. Adv. Biochem. Eng continuo. Seidler y M. Rogal (Eds.).Mac-_Biotechnol.,51. 47-70. Graw-Hill, 29-43 ‘Tsuji, T, Kawasaki, ¥.,Takeshima, 3.5. Métodos fisicoquimicos Bradford M. (1976). Arapid and _—S.._ Sekiya, T.'y ‘Tanaka, S indirectos sensitive method for the quanti-. (1995), A new fluorescence stai- LamedidadelCOTodelaDQO —_tationonmicrogramquantitiesof ning assay for visualizing living son métodos muy usados para laes- protein utilizing the principle of microorganisms in soil. Appl. timacién indirecta de la biomasa _protein-dye binding. Analyt Envir. Microbiol., 61, 3415 suspendida fijada. Son muy sensi-. _Biochem., 72, 148-254, 3421 bles y precisos, pero presentan las Chung Y.C. y Neethling, J.B. — Ublinder D. y White, D.C. (1983). mismas importantes limitaciones (1989). Microbial activity mea- Relationship between physiolo- que los SST y SSV. surementes for anaerobic sludge gical status and formation of ex- digestion. J. Wat. Pollut. Control tracellular polysaccharide glyco 4. Métodos en continuo Fed, 61, 343-349. calyx in Pseudomonas atlantica Durante los ios 90 se han desa- Findlay, R. H., King,M.G.y Wa- Appl. Environ. Microbiol., 45, rrollado métodos cuantitativos para. tling, J. (1989). Efficacy of 64-70. EQUIPOS PRODUCTOS INDUSTRIALES 27.000 ejemplares distribuidos gratuitamente entre el sector industrial Control OJD - Distribucién nominativa Salicite informacion yun ejemplar de muestra Elsevier Informacién Profesional, S.A. Entenca, 28 Entlo, -08015 Barcelona - Tel: 292.46 38