UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS
ENZIMOLOGA
REPORTE DE PRCTICAS

TEMA: ACTIVIDAD ENZIMTICA DE FOSFATASA CIDA EN SUERO

FOSFATASA CIDA

PROFESORA:
ANA KITAZONO SUGAHARA

INTEGRANTES:
-CHRISTHIAN EGUIZBAL (CONCLUSIONES)
-RENZO RODRGUEZ (RESULTADOS Y DISCUSIONES)
-ANGEL ROJAS (MATERIALES Y METODOS)
-ROBERTO ROJAS (INTRODUCCIN)

LIMA PERU
2016
 ACTIVIDAD ENZIMTICA DE FOSFATASA CIDA EN SUERO

1. INTRODUCCIN
Las fosfatasas cidas son enzimas que en pH cido (aproximadamente 5,0) tienen la propiedad
de catalizar la hidrlisis de fosfo monosteres, liberando como productos de la reaccin fosfato
inorgnico y un alcohol, cuya naturaleza depende del sustrato utilizado. Pueden encontrarse
presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas las cantidades de
estas enzimas en prstata, estmago, hgado, msculo, bazo, eritrocitos y plaquetas.

Las distintas isoenzimas se diferencian entre s por su pH ptimo, peso molecular, y

requerimientos de activadores e inhibidores. La fosfatasa cida prosttica (PAP) constituye un
valioso auxiliar en el diagnstico precoz de cncer prosttico, una de las formas neoplsicas de
mayor morbilidad.

La determinacin de la actividad enzimtica de PAP usando -naftil fosfato como sustrato ha

mostrado sensibilidad y especificidad adecuadas para su utilizacin en el diagnstico de esta
enfermedad. (Young, 2001).

Se encuentran actividades elevadas de Fosfatasa cida total (ACP) en algunas enfermedades

hematolgicas (leucemia mieloctica, trombocitopenia idioptica) y seas (enfermedad de
Paget, carcinoma seo), as como en algunos tipos de cncer, enfermedades hepticas (hepatitis,
ictericia obstructiva), etc.

2. MATERIALES Y MTODOS
a. Materiales:
7 tubos de ensayo
3 ml de Buffer Citrato (0.5 ml para cada tubo de ensayo, 6 en total)
1.5 ml de PNFF 0.036 M
Bao Mara a 37C
0.4 ml de suero del paciente H1 (0.1 ml en 4 tubos)
12 ml de NaOH 0.15 M
Espectrofotmetro
Micropipetas de 200 l, 1000l y 5000 l de capacidad con sus tips
b. Mtodos:
Se sigui el procedimiento de la gua, de prcticas salvo que no se us tartrato (por
razones de seguridad) en 2 tubos, sino que se usaron esos 2 tubos adicionales para una
repeticin ms de M1 y M2. Lo que calculamos solo fue actividad de fosfatasa cida total
al final de la experiencia. En otras palabras, se sigui el siguiente esquema:

B M1 M2

Buffer Citrato 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

PNFF 0.036 M 0.25 ml 0.25 ml 0.25 ml

Pre-incubacin a 37C por 5 min

Suero - 0.1 ml 0.1 ml (30 s

despus de M1)

Incubacin a 37C por 30 min

NaOH 0.15 M 1.65 ml 1.65 ml 1.65 ml

Suero 0.1 ml - -

c. Fundamento:
1) La fosfatasa cida hidroliza el p-nitrofenil fosfato con liberacin de fosfato
inorgnico y p-nitrofenol.
2) El p-nitrofenol reacciona a su vez con un diazorreactivo presente en el sistema
produciendo un pigmento amarillo, de modo que el aumento de la absorbancia, ledo
a 402 nm, es proporcional a la actividad de fosfatasa cida total (ACP) de la muestra.

(Reaccin catalizada por la fosfatasa cida)

3. CLCULOS Y RESULTADOS
Resultados de la absorbancias de las muestras tratadas:
Absorbancias (A)
Prom. Mue stras
Mesa Muestra Blanco M1 M2 M1 M2 Sin Blanco

1 H1 0,252 0,426 0,425 0,427 0,432 0,1755

2 H2 0,177 0,318 0,311 0,324 0,33 0,14375
3 H3 0,245 0,382 0,376 0,134
4 M4 0,193 0,209 0,221 0,23 0,242 0,0325
5 M3 0,143 0,219 0,223 0,251 0,239 0,09

Concentraciones de las muestras:

Sabiendo que el coeficiente de extincin molar () del p-nitrofenolato es 18400 L.mol-
1 -1
L y que la longitud de la celda (l) es de 1cm, para calcular la concentracin (C) en
unidades de molaridad (M o mol/L) de cada una de las muestras hacemos uso de la
ecuacin de Lambert y Beer:
=

Teniendo de esta manera los siguientes resultados

Muestra Concentracin (M) = A/

H1 9.538043478 x 10-6

H2 7.8125 x 10-6

H3 7.282608696 x 10-6

M4 1.766304348 x 10-6

M3 4.891304348 x 10-6

Clculo de la actividad enzimtica:

Todos los ensayos de todas las muestras se hicieron en un volumen de 2.5 mL. Por
ende, calculamos las micromoles (mol) de producto formado por minuto de la
siguiente manera:

Para la muestra H1
9.538 mol -------------- 1000mL
x ------------- 2.5mL

x = 0.023845 molPNF-

Por ende, la actividad enzimtica de la fosfatasa cida de H1 ser

0,023845 molPNF
. . = = 7,9483 x 10 -4 mol/min
30
 Para la muestra H2
7.8125 mol -------------- 1000mL
x ------------- 2.5mL

x = 0.019531 molPNF-

Por ende, la actividad enzimtica de la fosfatasa cida de H2 ser

0,019531 molPNF
. . = = 6,5103 x 10 -4 mol/min
30

Para la muestra H3
7.283 mol -------------- 1000mL
x ------------- 2.5mL

x = 0.018208 molPNF-

Por ende, la actividad enzimtica de la fosfatasa cida de H3 ser

0,018208 molPNF
. . = = 6,0693 x 10 -4 mol/min
30

Para la muestra M4
1.766 mol -------------- 1000mL
x ------------- 2.5mL

x = 0.004415 molPNF-

Por ende, la actividad enzimtica de la fosfatasa cida de M4 ser

0,004415 molPNF
. . = = 1,4717 x 10 -4 mol/min
30

Para la muestra M3
4.891 mol -------------- 1000mL
x ------------- 2.5mL

x = 0.012228 molPNF-

Por ende, la actividad enzimtica de la fosfatasa cida de M3 ser

0,012228 molPNF
. . = = 4,076 x 10 -4 mol/min
30

Sin embargo, recordemos que estos datos provienen de 0.1 mL de suero, es decir, an
tenemos que encontrar la actividad realizada para 1mL (como generalmente se ve en
los estndares). De esta manera, aplicando una regla de tres simple de nuevo:

Para la muestra H1:

7,9483 x 10-4 U.E. -------------- 0.1mL
x ------------- 1 mL

x = 7,9483 x 10-3 U.E./mL o 7,9483 U.E/L

 Para la muestra H2:
6,5103 x 10-4 U.E. -------------- 0.1mL
x ------------- 1 mL

x = 6,5103 x 10-3 U.E./mL o 6,5103 U.E/L

Para la muestra H3:

6,0693 x 10-4 U.E. -------------- 0.1mL
x ------------- 1 mL

x = 6,0693 x 10-3 U.E./mL o 6,0693 U.E/L

Para la muestra M4:

1,4717 x 10-4 U.E. -------------- 0.1mL
x ------------- 1 mL

x = 1,4717 x 10-3 U.E./mL o 1,4717 U.E/L

Para la muestra M3:

4,0760 x 10-4 U.E. -------------- 0.1mL
x ------------- 1 mL

x = 4,0760 x 10-3 U.E./mL o 4,0760 U.E/L

En resumen, tenemos finalmente esto
M uestra Act. Enzimtica (U/mL) Act. Enzimtica (U/L)

H1 7,9483 x 10-3 7,9483

H2 6,5103 x 10-3 6,5103

H3 6,0693 x 10-3 6,0693

M4 1,4717 x 10-3 1,4717

M3 4,0760 x 10-3 4,0760

4. DISCUSIONES
La fosfatasa cida es una enzima presente en el hgado, bazo, leche, eritrocitos, plaquetas,
mdula sea, estmago y, en los varones, en la glndula prosttica. Su determinacin
clsicamente se basa en la hidrlisis de diferentes sustratos de fosfatos ligados a grupos
orgnicos (conocidos como fosfomonosteres) en el suero con pH cido, siendo la liberacin de
este grupo la que permite medir la actividad enzimtica segn Daz et al (1997) y Guija et al
(2007). Pero esta tcnica a veces suele tener resultados muy imprecisos por varios factores,
entre ellos si es que no se controlan los tiempos que deben ser rpidos tal como lo tratamos de
hacer en la prctica al controlar rigurosamente los 30 segundos. Como se ha mencionado antes,
el pH debe ser cido para funcionar y tambin se debe conocer al trabajar con una enzima la
concentracin de H+ por interactuar a nivel del sitio activo, por ello para la prctica necesitamos
usar un buffer citrato que mantiene un pH de 4,85, sabiendo que el pKa de la enzima fosfatasa
cida es de 4,7. De esta manera, estando en el rango ptimo, la enzima trabaja sin problemas.
 Viendo los resultados, notamos que la actividad de esta enzima es mucho mayor en hombres
que en mujeres. Podemos pensar que esto tiene pues el hombre tiene la glndula prosttica, que
como hemos citado en la literatura tambin secreta esta enzima al plasma, pero no es as. Segn
Firpo (2010), cuando se evala la actividad de fosfatasa cida los niveles en ambos sexos son
similares, pues el origen de esta no es principalmente la prstata, sino tal vez el hgado o el
bazo.

Ms bien, las variaciones estn al momento de elegir los rangos de tomar referencias de un
rango normal. Sin embargo, tomemos como referencia los parmetros de Firpo (2010), siendo
lo normal tener una actividad menor de 11 U/L. Valores superiores segn Remington (2003)
podra ser un diagnstico fundamental en la deteccin de carcinomas en estado de metstasis de
la prstata. Sin embargo, tendramos que saber la edad de estos individuos, pues segn Firpo
(2010) en ancianos esta cifra suele no ser muy elevada a pesar de tener el carcinoma metastsico,
por lo que se debe realizar el test de Sullivan, consistente en la inyeccin diaria de 25 mg de
propionato de testosterona para verificar el aumento de la enzima.

A pesar de lo expuesto anteriormente, en la actualidad estos ensayos se han vuelto muy

controversiales. En el ao de 1973, por ejemplo, Prout nos dice que altos niveles de la actividad
de esta enzima suelen ser causados por otros desrdenes, como lo son sarcomas osteognicos,
trombocitopenia, infarto prosttico, mieloma entre ellas. Sin embargo, podemos realizar el
mismo ensayo con el tartrato para averiguar la actividad de la fosfatasa cida prosttica.
Remington (2003) nos dice que el tartrato es un inhibidor de la enzima prosttica, por lo que al
terminar de evaluar la actividad podemos hacer una resta de la actividad de la enzima total con
la actividad de la enzima al aplicarle tartrato, de manera que esta tcnica le da un poco ms de
especificidad segn el primer autor citado en el presente prrafo, siendo los valores normales
menores de fosfatasa cida prosttica a 4 U/L.

Lo que podemos apreciar en la prctica es que las enzimas trabajan muy eficientemente a un
determinado pH y temperatura, que en caso de ser alterado, se desnaturalizan y detienen su
actividad, tal como sucedi al agregar la solucin de hidrxido de sodio, y por lo expuesto
anteriormente podemos ver la utilidad de la medicin de la actividad enzimtica a la hora de
realizar los anlisis clnicos.

5. CONCLUSIONES
La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de sustrato o la
aparicin de un producto de la reaccin en funcin del tiempo. La determinacin cuantitativa
de sustrato o de producto puede hacerse con diferentes mtodos analticos segn el caso, siendo
los ms utilizados los espectrofotomtricos y el utilizado en la prctica realizada.
La fosfatasa cida trabaja de una forma ms eficiente a un determinado pH y temperatura.
Cualquier alteracin detiene la reaccin que cataliza.
Adicionalmente, se pudo determinar que las muestras de suero pertenecen a individuos
con niveles de fosfatasa cida normales, de manera que la determinacin de la actividad de una
enzima ayudan en el diagnstico y en los anlisis clnicos.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Daz J., Fernndez M., Paredes F. 1997. Aspectos bsicos de bioqumica clnica Ed.
Daz de Santos. Madrid, Espaa. pp 108
Fersht A. 1980. Estructura y mecanismo de los enzimas. Ed. Revert S.A. Barcelona,
Espaa.
Firpo C. 2010. Manual de Ortopedia y traumatologa 3era edicin. Edicin electrnica.
Buenos Aires, Argentina. pp 45
Guija E., Sobern M., Haak-Mares H. 2007. Mecanismo de accin de las fosfatasas de
bajo peso molecular An Fac Med 68(4): 356-62
Prout GR Jr. 1973. Diagnosis and staging of prostatic carcinoma Cancer 32(5):1096-
103
Remington A. 2003. Farmacia. 20a ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires,
Argentina.
Young D.S. 2001. "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests" 4th ed.AACC Press