SEPARACIN

Transferir los carotenoides al ter de petrleo o hexano (a veces con ter etlico), de forma suave y gradual en
un embudo de separacin para evitar la formacin de emulsiones

Adicionar el extracto en varias porciones al ter de petrleo que se encuentra en el embudo.

Despus de cada incremento, se agrega agua contra la pared interna del embudo de tal forma que no haya agitacin.

Una vez separadas las fases, se descarta la inferior y se repite el proceso adicionando una nueva porcin del
extracto.

Cuando todo el extracto se encuentra en el embudo, se lava otras cuatro o cinco veces con agua para retirar la
acetona residual.

La fase de ter de petrleo con los carotenoides es despus secada con sulfato de sodio anhidro y concentrada
en un rotavapor a 30C.

SAPONIFICACIN

Adicionar a la solucin de carotenoides en ter de petrleo, igual volumen de KOH metanlico al 10%.

La reaccin debe realizarse durante la noche, en la obscuridad y a temperatura ambiente.

La solucin de carotenoides se lava cinco veces con agua en un embudo de separacin para retirar el lcali y despus
se seca con sulfato de sodio anhidro.

CROMATOGRAFA

- El mtodo tradicional para separar estos compuestos es la cromatografa descendente en columna (flujo por gravedad auxiliado con
trompa de vaco) llamada cromatografa en columna abierta (CCA). La separacin es seguida visualmente.

El volumen de la muestra debe ser del 1-5% del volumen de la cama

El adsorbente (fase estacionaria) que se va a utilizar es la almina neutra desactivada.

LA fase mvil ser el hexano (las ms comnmente utilizadas en la elucin son el ter de petrleo o hexano, con porcentajes crecientes
de ter etlico y acetona)

El concentrado de carotenoides es aplicado como una cobertura delgada al extremo superior de la columna

La cromatografa se desarrolla con los siguientes eluyentes:

- ter de petrleo
- 1% de ter etlico en ter de petrleo
- 2% de ter etlico en ter de petrleo
- 5% de ter etlico en ter de petrleo
- Acetona en ter de petrleo, aumentando de 1% hasta 100%, si se hace necesario.

La HPLC es la tcnica preferida en la actualidad, especialmente en pases desarrollados (11-14). La mayora de los mtodos utiliza HPLC de
fase inversa con columna C18, en la cual las interacciones son suaves, por lo tanto evitando la degradacin de los carotenoides durante la
cromatografa. Las fases mviles ms comunes son las combinaciones de acetonitrilo, metanol, diclorometano, tetrahidrofurano, cloroformo y
acetato de etilo. La elucin socrtica es ms simple, reproducible y rpida y es recomendada para la determinacin de las provitaminas A o
los carotenoides principales. Sin embargo, a pesar de las desventajas de ser ms compleja y requerir el reequilibrio entre anlisis, la elucin
con gradiente es necesaria para una separacin ms completa de los carotenoides. De hecho, a pesar de la amplia citacin del gran poder de
resolucin de la HPLC, difcilmente una nica separacin es suficiente para resolver todos los carotenoides de una muestra alimenticia. Tambin,
para muestras de alimentos, es importante usar precolumnas de proteccin para prevenir la entrada de impurezas a la columna analtica y
prolongar as su vida til.