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RESSONÂNCIA MAGNÉTICA

NUCLEAR: Gradus Primus* Cláudia Jorge do Nascimento


Professora do Instituto de Química - UnB

Carlos Bloch Jr.


PESQUISA Professor do Instituto de Química - UnB
Pesquisador da EMBRAPA Recursos
Genéticos e Bioctenologia
cbloch@cenargen.embrapa.br

* Primeiros passos

INTRODUÇÃO

Por quase meio século, a determi-


nação de estrutura tridimensional (3D)
de proteínas vem sendo feita por
métodos de cristalografia e difração
de raio-X; é inquestionável a impor-
tância e a contribuição que aplica-
ções dessa técnica têm proporciona-
do à Bioquímica. Entretanto, há mais
ou menos vinte anos, a Ressonância
Magnética Nuclear (RMN), que já
ocupava um local de destaque nos
estudos estruturais de pequenas mo-
léculas, começou a ser utilizada na
determinação da estrutura tridimensi-
onal de peptídeos e proteínas em Figura 1: A Radiação Eletromagnética
solução, independentemente de da-
dos cristalográficos. Para que isso apenas por difração de raio-X. que possuam noções básicas em física
fosse possível, sensíveis avanços na Com a chegada da era pós-genô- e em química, uma visão global dos
instrumentação e na metodologia mica, nunca se exigiu tanto dos mé- fenômenos que fundamentam essa
dessa técnica tiveram que ocorrer, todos para obtenção de estruturas 3D técnica, e da maneira como tais fenô-
incluindo-se, entre os mais importan- de biomoléculas. Tradicionalmente, menos são utilizados no processo de
tes, o uso de campos magnéticos esse trabalho tem sido efetuado com determinação estrutural de substânci-
homogêneos de alta intensidade, características quase “artesanais” de- as relativamente simples, permitindo-
novas técnicas de pulso e a introdu- vido à alta complexidade da tarefa, lhes dar os primeiros passos para uma
ção de métodos computacionais mais ao tempo necessário para a obtenção melhor compreensão das metodolo-
avançados para a produção e a inter- de apenas uma estrutura (vários me- gias desenvolvidas na obtenção de
pretação dos dados de RMN de ma- ses) e aos elevados custos com infra- estruturas 3D de moleculas bem mais
cromoléculas. estrutura e manutenção. Por essas e complexas (peptídeos, proteínas e áci-
Atualmente, mais de duas mil es- por outras razões é que o uso da RMN dos nucléicos) disponíveis na literatu-
truturas 3D de proteínas determina- em Bioquímica ainda se encontra ra.
das por RMN têm suas coordenadas restrito a poucos grupos de excelên- É importante ressaltar que a abor-
atômicas depositadas no Brookhaven cia espalhados pelo mundo e que dagem escolhida será bastante simpli-
Protein Data Bank (http:// seus fundamentos teóricos permane- ficada, uma vez que para uma verda-
www.rcsb.org/pdb/) e esse número cem obscuros para a maioria daque- deira compreensão do fenômeno que
vem crescendo rapidamente. Verifi- les que têm algum interesse nos mais representa a Ressonância Magnética
caram-se também significativos pro- recentes avanços dessa nova era de Nuclear seria necessária uma descri-
gressos na determinação estrutural descobertas científicas. ção em termos de Mecânica Quântica,
de outros biopolímeros por RMN, O presente artigo tem como obje- com a utilização de operadores quân-
como é o caso dos ácidos nucléicos e tivo primordial oferecer a leitores ticos e matrizes de densidade, 1-4 o que
dos oligossacarídeos, antes obtidos que não sejam da área de RMN, mas está fora dos objetivos deste artigo.

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PRINCÍPIOS BÁSICOS DA
ESPECTROSCOPIA DE Tabela 1: Mostra a correlação existente entre o número atômico (Z) e o
número de massa (A) com o número de spin (I)
RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR I A Z Exemplos *
Meio inteiro Ímpar Par ou ímpar 1
H(1/2), 17O (5/2), 15N (1/2)
A Espectroscopia é o estudo da Inteiro Par Ímpar 2
H (1), 14N (1), 10B (3)
Zero Par Par 12
C (0), 16O (0), 32S (0)
interação da radiação eletromagnética
(REM) com a matéria. Essa radiação * O número entre parênteses indica o número de spin I do núcleo
pode ser vista como uma onda com exemplificado
duas componentes, uma elétrica e ou-
tra magnética, que oscilam perpendi-
cularmente entre si, sendo ambas tam- A grandeza física envolvida em pares não possuem spin, sendo, conse-
bém perpendiculares à direção de pro- RMN é o spin nuclear. O conceito de qüentemente, o número de spin igual
pagação da luz (Figura 1). A interação spin nuclear provém da Mecânica Qu- a zero. É o caso do 12C, 16O, 32S etc.
entre a radiação eletromagnética e a ântica, não possuindo conceito equi- (Tabela 1). Esses núcleos não têm
matéria pode ocorrer de duas formas: valente na Mecânica Clássica. Esse con- momento angular associado e, portan-
pela sua componente elétrica ou pela ceito é fundamental para a compreen- to, não exibem propriedades magnéti-
sua componente magnética. são do fenômeno e pode ser compre- cas, o que implica a ausência de sinais
Uma das diferenças fundamentais endido como uma propriedade que detectáveis por RMN. Núcleos com
entre a RMN e as outras formas de determinados núcleos apresentam. Tais spin I ≠ 0 são, em princípio, detectáveis
espectroscopia reside no fato de que, núcleos, devido à sua configuração por RMN. A detecção desses núcleos
na RMN, essa interação se dá com o nuclear, assumem um comportamento está relacionada a condições experi-
campo magnético da REM e não com o característico de momento angular, mentais especiais, que não serão aqui
campo elétrico, como é o caso, por capaz de gerar um momento magnéti- abordadas.
exemplo, do infravermelho ou do ul- co (Figura 2), pois uma carga em Dentre os diferentes núcleos detec-
travioleta. movimento gera um campo magnéti- táveis por RMN, núcleos com I = ½ são
A REM de interesse em análises co. O momento magnético µ gerado bastante apropriados para uma com-
químicas vai desde os raios gama (alta pode ser descrito em termos do núme- preensão mais simplificada da técnica.
energia) até as ondas de rádio (baixa ro de spin I, cujos valores, calculados
energia). Para cada tipo de espectros- pela mecânica quântica5,6, podem ser
copia é exigido um tipo de excitação e, 0, 1/2, 1, 3/2 etc. Como se sabe, 2- APLICAÇÃO DE UM CAMPO
para cada uma delas, existe uma quan- núcleos que apresentam tanto massas MAGNÉTICO: A ENERGIA E A
tidade definida de energia, ou seja, atômicas quanto números atômicos FREQÜÊNCIA EM RMN
esses fenômenos são quantizados. Isso
quer dizer que uma radiação de fre- Na ausência de um campo magné-
qüência determinada e característica é tico, os spins nucleares estão orienta-
absorvida para uma determinada tran- dos randomicamente, não apresentan-
sição. do nenhuma orientação definida (Fi-
A RMN encontra-se na região das gura 3). Entretanto, quando uma amos-
ondas de rádio (radiofreqüências). Em tra é submetida a um campo magnético
princípio, pode-se dizer que a RMN é externo B0, de alta intensidade e ho-
uma outra forma de espectroscopia de mogêneo, os spins nucleares tendem a
absorção. Em um campo magnético, assumir determinadas orientações. Se-
sob determinadas condições, uma gundo a mecânica quântica, o número
amostra pode absorver REM na região de spin I determina o número de
da radiofreqüência (rf), absorção essa orientações que um núcleo pode assu-
governada por características da amos- mir diante de um campo magnético
tra. Essa absorção é função de determi- externo pela relação7:
nados núcleos presentes na molécula, número de orientações possíveis = 2I + 1
que são sensíveis à radiação aplicada e, No caso de um núcleo com número
por isso, esses núcleos são alvo de de spin I = ½, apenas duas orientações
estudo para a compreensão da RMN. são possíveis, quando há aplicação de
um campo magnético: uma “parcial-
1- A DEFINIÇÃO DE Figura 2: Momento magnético mente alinhada” com o campo magné-
SPIN NUCLEAR µ gerado a partir do momento tico aplicado e outra “parcialmente
angular contra” o campo magnético (Figura

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efeito do campo magnético externo B0 entretanto, um estado é mais estável
aplicado sobre o sistema de spins em que o outro, devido a uma interação
estudo. Essa é mais uma das diferenças entre o campo e o momento magnético
básicas entre a RMN e outros tipos de associado ao spin nuclear. A absorção
Espectroscopia: em infra-vermelho e em RMN é, portanto, uma conseqüên-
ultra-violeta, por exemplo, já existem cia das transições entre o nível de
diferentes níveis energéticos (vibracio- menor energia e o de maior energia,
nais e eletrônicos, respectivamente), possíveis pela aplicação de um segun-
bastando a aplicação de uma radiação do campo magnético na região da
de freqüência apropriada para que radiofreqüência.
uma transição (vibracional ou eletrôni- O momento angular L e o momento
Figura 3: Spins randomica- ca) ocorra. No caso da RMN, os dife- magnético µ podem ser representados
mente orientados rentes níveis energéticos devem ser por vetores e a proporcionalidade en-
primeiramente criados pela aplicação tre eles é chamada de constante (ou
4). O ângulo θ que define a orientação de um campo magnético de alta inten- razão) giromagnética. Essa constante,
do vetor com relação a B0 também é sidade (B0); só assim é que se pode que determina a freqüência de resso-
determinado pela mecânica quântica proceder à Espectroscopia, aplicando- nância do núcleo, constitui um parâ-
(seus valores aproximados são 55º e se, então, a radiação de freqüência metro muito importante em RMN e é
125º). As duas orientações represen- apropriada para cada núcleo. representada por γ, apresentando um
tam diferentes estados energéticos. Isso O fenômeno da RMN ocorre na valor próprio para cada núcleo, poden-
acontece porque um núcleo com spin região das radiofreqüências (MHz) e a do ser expressa pela relação:
cria seu próprio campo magnético, γ = 2πµ / hI
como já mencionado. Quanto “mais onde h é a constante de Plank (∆E =
paralelo” forem esses dois campos (o hν).
do núcleo e o campo magnético exter- Se a constante giromagnética γ for
no), menor será a energia desse esta- positiva, como é o caso dos núcleos de
do. Assim, o estado de menor energia 1
H e 13C, o estado +½ representa um
é aquele que se encontra “parcialmen- nível de menor energia. Caso a cons-
te alinhado” com o campo e é denomi- tante giromagnética seja negativa, como,
nado estado α (ou +½), e o estado de por exemplo, para o 15N, ocorre o
maior energia, o “parcialmente con- oposto.9
tra”, é denominado estado β (ou -½) Além de ser responsável pela fre-
Figura 4: Direções quantizadas
(Figura 5). As energias desses níveis qüência de ressonância de cada nú-
assumidas pelos spins sob ação
podem ser descritas como Eα = - µB0 e de um campo magnético B0 cleo, a constante giromagnética influ-
Eβ = µB0, o que equivale a dizer que a encia outros fenômenos importantes
diferença de energia entre os dois da Ressonância Magnética Nuclear,10
níveis pode ser expressa por8: ∆E = (Eβ como é o caso do acoplamento de
- Eα) = 2µB0, desde que I = ½. interação da radiação eletromagnética spins (que será abordado mais adian-
A diferença de energia ∆E que com a matéria dá-se com a sua compo- te), da sensibilidade dos núcleos, em
surge entre os dois níveis está relacio- nente magnética. Portanto, para se processos de polarização cruzada, en-
nada com vários fatores, dentre eles, proceder a RMN, deve ser aplicado um tre outros.
segundo a equação anterior, a intensi- segundo campo magnético (chamado
dade do campo magnético B0 aplicado: de B1), proveniente de uma fonte de
quanto maior for o campo magnético radiofreqüência aplicada perpendicu-
aplicado, maior será a diferença de larmente ao campo B0. É esse segundo
energia entre os dois níveis (Figura 6) campo magnético que permite a obser-
e maior a diferença de população asso- vação de absorções em RMN.
ciada a esses níveis. Isso significa que,
para uma melhor resolução de spins 3- O CONCEITO DE CONSTANTE
nucleares em ambientes químicos se- GIROMAGNÉTICA - A EQUAÇÃO
melhantes, são desejáveis espectrôme- FUNDAMENTAL DA RMN
tros com campos cada vez mais inten-
sos. Na ausência do campo magnético Figura 5: Níveis energéticos
É interessante observar que a dife- externo B0, os estados α e β são dege- criados pela ação do campo
rença entre níveis de energia – inicial- nerados, uma vez que não há distinção magnético B0
mente inexistente – surge devido ao de energia. Aplicando-se o campo B0,

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nα/nβ = e∆E/kT trolados da ordem de microssegundos
onde k é a constante de Boltzmann e T, (µs) a milissegundos (ms). O pulso
a temperatura expressa em escala Kel- eletromagnético é criado por manipu-
vin. lação da fonte de radiação eletromag-
Pode-se deduzir que, à temperatu- nética, ligando-a ou desligando-a, e a
ra ambiente, como a diferença de ener- duração do pulso (µs a ms) é o tempo
gia ∆E é muito menor que kT (∆E << para o qual a fonte de radiação se
kT), haverá um pequeno excesso de encontra ligada.
população de spins no estado menos No método pulsado, os núcleos são
energético. Assim, para um valor posi- excitados em uma região de freqüênci-
tivo de γ, haverá um ligeiro excesso de as por um ou mais pulsos. Na resso-
população para o estado α, ou seja, nância, o campo B1, aplicado na forma
para os núcleos que estão alinhados de um pulso, faz com que alguns
Figura 6: Efeito do campo B0 com o campo magnético. Esse excesso núcleos – que se encontravam em
na diferença de energia entre
situação de equilíbrio (magnetização
os estados α e β
líquida em z), apenas sob influência de
B0 – absorvam energia e seus momen-
Substituindo-se as equações an- tos magnéticos nucleares passem a
teriores (∆E = hν e γ = 2πµ / hI) , pode- precessar no plano xy (Figura 12).14
se chegar a: Ou seja, o campo B1 altera a direção de
ν = γB0 /2π precessão da magnetização, acarretan-
que é a equação fundamental utilizada do, portanto, uma perturbação do sis-
em RMN e que define a condição de tema, retirando-o do equilíbrio.
ressonância para um núcleo com spin A nova componente gerada no pla-
I = ½. no xy pode ser observada com auxílio
de um detector no mesmo plano de
4- A MAGNETIZAÇÃO LÍQUIDA precessão. Para isso, a fonte de r.f.
deve ser desligada. Quando isto ocor-
Em um campo magnético externo, Figura 7: Precessão nuclear re, o sistema tende a retornar à situação
o momento magnético µ apresenta um original de equilíbrio. Este retorno é
ângulo θ com a direção do campo conhecido por processo de relaxação,
magnético B0 aplicado (Figura 4). Se- de população resulta em uma magne- que faz com que os núcleos percam o
gundo a Mecânica Clássica, bastante tização líquida na direção +z, uma vez excesso de energia e retornem às suas
útil para a visualização de muitos con- que no plano xy, a resultante é nula posições originais de equilíbrio.
ceitos de RMN, a interação entre um (Figuras 9, 10). O decaimento da magnetização xy
núcleo com um momento magnético µ – que dá origem ao sinal de RMN – para
e o campo B0 faz com que o momento 5- O EFEITO DA APLICAÇÃO DE B1 retornar à sua posição de equilíbrio é
magnético precesse em torno daquele SOBRE A MAGNETIZAÇÃO exponencial e dá origem ao chamado
eixo (Figura 7). A freqüência desse sinal FID (Free Induction Decay). Os
movimento é chamada freqüência de Em RMN, a aplicação do campo B1
Larmor, e seu valor é dado pela expres- é feita perpendicular ao campo B0
são anterior ν = γB0 /2π em Hertz. aplicado (portanto, na direção x ou y).
Os dois estados energéticos corres- Assumindo que B1 seja aplicado na
pondem, então, à precessão de µ em direção x, o campo oscilante nessa
torno do eixo, alinhado (menor ener- direção é equivalente à soma vetorial
gia, se γ for positiva) ou oposto ao de dois vetores de igual amplitude,
campo magnético aplicado B0. Consi- movendo-se em direções opostas no
derando que o campo B0 esteja aplica- plano xy (Figura 11). A magnitude de
do na direção z, no equilíbrio, os cada uma dessas componentes corres-
vetores dos momentos magnéticos es- ponde à metade do vetor B1 e somente
tarão distribuídos em dois cones, em uma delas tem efeito no vetor magne-
torno dos eixos +z e –z (Figura 8).11 tização. A outra pode, portanto, ser
A população dos dois diferentes negligenciada.12,13
estados energéticos α e β (respectiva- O campo B1 é aplicado na forma de Figura 8: Cone de precessão
mente nα e nβ) pode ser obtida a partir um pulso, ou seja, a fonte de r.f. nuclear
da equação de Boltzmann:7 permanece ligada por períodos con-

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seja, para que a interpretação do es- do ser observadas diferentes absor-
pectro seja facilitada, os sinais da FID ções a diferentes freqüências (Figura
são convertidos para um domínio de 15).
freqüências de ressonância, caracterís- O fator que rege essa diferença de
ticas de cada núcleo, através de uma freqüências de absorção é denomina-
operação matemática chamada trans- do blindagem. Esse fenômeno pode
formada de Fourier. A transformada de ser compreendido levando-se em con-
Fourier dos diferentes sinais de FID dá ta a vizinhança (núcleos e elétrons) na
origem ao espectro de RMN comumen- qual se encontra o núcleo que está
te analisado15 (Figura 15). Em outras sendo objeto de análise.
palavras, um espectro de RMN consiste Cada uma dessas partículas carre-
em uma série de ressonâncias em dife- gadas está sujeita à influência de cam-
rentes freqüências, denominadas des- pos magnéticos. Tomando como exem-
Figura 9: Resultante no plano xy locamentos químicos. plo um átomo de hidrogênio em uma
molécula, observa-se que, quando ela
6- O DESLOCAMENTO QUÍMICO é submetida a um campo magnético, o
sinais da FID (Figura 13) são detecta- campo induz uma circulação dos elé-
dos como uma função do tempo, en- Segundo a equação fundamental trons em torno do hidrogênio, em um
contrando-se aí todas as informações da RMN já apresentada (ν = γB0 /2π), plano perpendicular ao campo exter-
sobre acoplamento e deslocamento em um espectro de RMN, todas as no. Essa carga circulante gerada é tal
químico (fenômenos que serão vistos a absorções devidas a um mesmo tipo de que o campo magnético gerado (cha-
seguir) contidos em um espectro de núcleo deveriam ocorrer a uma mesma mado induzido) pode se opor ou não
RMN. Como existem vários núcleos em freqüência, uma vez que, segundo ao campo externo. No primeiro caso,
uma amostra, também são originados essa equação, a freqüência ν depende diz-se que os elétrons produzem um
vários sinais de FID que se superpõem, apenas do campo B0 aplicado e da efeito de blindagem sobre o hidrogê-
de forma que se torna muito difícil a constante giromagnética de cada nú- nio, no segundo, o efeito é de desblin-
extração das informações desejadas cleo. O espectro obtido experimental- dagem desse núcleo (Figura 16). Des-
(Figura 14). Para que as informações mente, no entanto, mostra que a situ- sa forma, o núcleo fica sujeito a um
se tornem acessíveis ao usuário, ou ação não é exatamente assim, poden- campo magnético efetivo (Befet = B0 -
Binduzido), e o grau de blindagem ou
desblindagem dependerá da densida-
de eletrônica próxima dele, ou seja, do
ambiente químico em que ele se en-
contra. Isso justifica diferentes absor-
ções para núcleos próximos a átomos
eletronegativos, onde a desblindagem
é maior, uma vez que átomos eletrone-
gativos diminuem a densidade eletrô-
nica dos átomos de hidrogênio que
estejam em suas vizinhanças. Para o
etanol (Figura 15), por exemplo, os
Figura 10: Magnetização líquida átomos de hidrogênio do grupo -CH2
encontram-se mais próximos do áto-
mo de oxigênio do que os do grupo –
CH3. Por isso, a densidade eletrônica
na região próxima ao grupo –CH2 será
menor que na região próxima ao grupo
–CH3, o que torna os primeiros mais
desblindados com relação a esses últi-
mos.
Conclui-se, então, que núcleos em
diferentes ambientes químicos apre-
sentarão diferentes freqüências de ab-
sorção devido a diferentes graus de
blindagem ou desblindagem. A dife-
Figura 11: Em vermelho estão mostradas as componentes de B1 rença entre essa freqüência de absor-

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plo, entre hidrogênio e carbono.
Por meio da Mecânica Quântica,7
sabe-se que o desdobramento de um
sinal de singleto para dupleto, tripleto,
etc. (chamado de multiplicidade) pode
ser dado pela relação 2nI+1, onde n é
o número de núcleos vizinhos em
diferentes ambientes químicos e I é o
número de spin do núcleo que está
sendo analisado. Para núcleos com
spin I = ½ , a multiplicidade será dada
simplesmente por (n+1).
Figura 12: Influência de B1 na magnetização líquida Assim, no espectro de hidrogênio
do etanol (Figura 15), desprezando-
se o hidrogênio do grupo –OH, devido
ção com relação a um determinado núcleos de hidrogênio da –CH3 são ao processo de troca química, (não
núcleo-referência (chamado padrão) é mais blindados que os do -CH2, os abordado aqui), serão observados dois
denominada deslocamento químico. primeiros absorvem a 1 ppm e esses sinais devidos a acoplamento homo-
Assim, núcleos quimicamente equiva- últimos a 3,5 ppm. nuclear: um relativo aos hidrogênios
lentes (em semelhantes ambientes ele- da metila e outro aos hidrogênios do
trônicos) apresentam o mesmo deslo- 7- ACOPLAMENTO SPIN-SPIN grupo –CH2, uma vez que se encon-
camento químico. No etanol, todos os tram em diferentes ambientes eletrôni-
três núcleos de hidrogênio do grupo – Observando-se um espectro de cos e que, portanto, apresentarão dife-
CH3 apresentam o mesmo desloca- RMN, pode-se ver que os sinais origi- rentes deslocamentos químicos. Esses
mento químico, ocorrendo a mesma nados das absorções nem sempre apa- sinais, entretanto, não aparecem como
coisa com os dois núcleos de hidrogê- recem como picos únicos ou singletos, singletos (Figura 15). A multiplicida-
nio do grupo –CH2. mas podem aparecer também como de é dada por (n+1): os três hidrogê-
Os valores de deslocamento quími- dupletos, tripletos, quartetos etc. (Fi- nios da metila têm dois vizinhos (os
co em unidades de freqüência são gura 15), o que está relacionado com dois hidrogênios do grupo –CH2); logo,
valores muito próximos. Por isso, é o que se chama acoplamento spin- o seu sinal aparecerá no espectro como
muito usual a chamada escala delta (δ δ), spin. Esse fenômeno é originado quan- um tripleto (2 + 1 = 3), observado em
dada pela relação: do núcleos em diferentes ambientes torno de 1 ppm. Analogamente, os dois
δ = νamostra x 106 / νespectrômetro eletrônicos estão próximos entre si hidrogênios do grupo –CH2 têm como
onde νamostra é dada em Hertz e νespectrô- (normalmente o efeito é observado em vizinhos os três hidrogênios da metila
metro
em MHz. A escala δ é, portanto, até três ligações, exceto quando existi- e seu sinal será um quarteto (3 + 1 = 4),
adimensional com valores expressos rem duplas ou triplas ligações). cuja absorção é obervada em torno de
em ppm. Os núcleos mais blindados Basicamente, existem dois tipos de 3,5 ppm.
apresentam valores de δ menores, en- acoplamento spin-spin: o acoplamen- A intensidade dos picos de um
quanto os mais desblindados apresen- to homonuclear, quando o acopla- multipleto não é a mesma. Ela está
tam valores de δ maiores. No espectro mento ocorre entre o mesmo tipo de associada ao número de transições
de RMN de hidrogênio (RMN-1H) do núcleos, como, por exemplo, quando naquela determinada freqüência de
etanol (Figura 15), podem ser obser- hidrogênios em diferentes ambientes cada um dos picos observados. Para
vados dois valores de deslocamento químicos acoplam entre si, e o acopla- núcleos com I = ½, a intensidade dos
químico: um primeiro, próximo a 1 mento heteronuclear, que ocorre entre picos do multipleto pode ser obtida a
ppm, mais blindado em relação ao núcleos diferentes, como, por exem- partir do triângulo de Pascal (Figura
segundo, próximo a 3,5 ppm. Como os 17), dispensando o cálculo dos núme-
ros de transições associadas a cada um
dos picos. Assim, para um dupleto, por
exemplo, a intensidade dos sinais será
de 1:1; para um tripleto, de 1:2:1; para
um quarteto, de 1:3:3:1; e assim por
diante, segundo os valores expressos
no triângulo de Pascal.
A distância entre cada um dos picos
Figura 13: Decaimento exponen- de um multipleto é chamada de cons-
Figura 14: FID do etanol
cial do sinal de RMN tante de acoplamento J (Figura 18), e

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tempo de evolução e tempo de detec-
Figura 15: Espectro de hidrogênio do etanol ção.
Tempo de preparação é o período
durante o qual um sistema de spins é
preparado para atingir o equilíbrio tér-
mico. Esse tempo pode incluir a aplica-
ção de um ou mais pulsos ou, simples-
mente, ser um período t ≠ 0; pode até
mesmo nem existir, dependendo do
experimento que está sendo realizado.
O importante é que o sistema de spins
se encontre em equilíbrio antes que o
experimento seja iniciado.
O tempo de evolução (chamado t1)
constitui o experimento de RMN pro-
priamente dito, durante o qual o siste-
ma de spins evolui fora da situação de
indica o quanto um acoplamento entre poderosa técnica para a elucidação equilíbrio pela aplicação de um ou
núcleos é efetivo: uma maior constante estrutural de moléculas orgânicas, inor- mais pulsos, dependendo da informa-
de acoplamento significa um acopla- gânicas e principalmente de biomolé- ção que se deseja obter. O tempo de
mento mais efetivo. culas. Essas moléculas apresentavam detecção (ou tempo de aquisição, cha-
Além disso, a constante de acopla- espectros de difícil interpretação devi- mado t2) é o período durante o qual se
mento também pode servir para iden- do, principalmente, à superposição de adquire o sinal do FID.
tificar diferentes acoplamentos no es- sinais ao longo de toda a faixa espectral Um experimento unidimensional
pectro. Essa identificação é facilitada e/ou em uma dada região de freqüên- pode apresentar esses três tempos (Fi-
tendo-se em conta que, se um núcleo cia17 (Figura 19). A RMN-2D possibili- gura 20). O tempo de evolução (t1) é
A acopla-se a um núcleo B com uma tou a interpretação dos espectros des- fixo e o sinal recebido é apenas função
constante de acoplamento JAB, a cons- sas moléculas, antes dificilmente iden- do tempo de detecção (t2), que é
tante de acoplamento de B com A (JBA) tificadas pelos métodos em uma di- variável. Em um experimento conven-
deve ser igual a JAB (JAB = JBA). Tabelas mensão. cional em uma dimensão, o tempo de
contendo diferentes valores de cons- Para entender as razões disso e o evolução t1 é zero e a detecção é
tantes de acoplamento para diferentes que é um espectro de RMN em duas realizada imediatamente após o pulso
grupos funcionais e moléculas podem dimensões, assim como o seu proces- de radiofreqüência (Figura 21). Os
ser encontradas na Literatura,7-10 o que samento, é necessário compreender spins sofrem ação do campo B1 e o
facilita a interpretação dos sinais em conceitos como tempo de preparação, resultado é, então, detectado. O sinal
um espectro de RMN de uma maneira
inequívoca. Os valores das constantes
de acoplamento J são dados em unida-
des de freqüência (Hz) e são chamadas
J, J, J,…, nJ, dependendo do número
1 2 3

de ligações existentes entre os núcleos


que acoplam (1, 2, 3, …, n ligações,
respectivamente).

A RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR EM DUAS
DIMENSÕES

Nas últimas quatro décadas, a rea-


lização de experimentos de RMN em
várias dimensões elevou sobremaneira
a capacidade de resolução dessa técni-
ca, ampliando, conseqüentemente, os
seus horizontes de aplicação. A RMN
em duas dimensões (RMN-2D) foi pro-
posta em 1971,16 e hoje representa uma Figura 16: Blindagem e desblindagem de um núcleo
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de contornos (Figuras 22, 23) é
Figura 17: Triângulo
muito mais utilizado, já que com ele
de Pascal mostrando a
se obtém um diagrama bastante cla-
intensidade relativa dos
ro, constituído por linhas de contor-
picos para diferentes
valores de multiplicida- no que são bem mais convenientes
de (n+1): para um de ser analisadas.
tripleto, n=2; para um Existem hoje diferentes tipos de
quarteto, n=3; e assim experimentos em RMN multidimen-
por diante. sional (2D e 3D) que utilizam dife-
rentes recursos tanto em termos de
software como de hardware.13
Experimentos menos recentes
também continuam sendo muito uti-
lizados para elucidação estrutural.
Os experimentos COSY (Correlated
SpectroscopY) e HETCOR (HETero-
nuclear CORrelation) são exemplos
disso. O espectro COSY fornece cor-
relações para o mesmo núcleo (por
exemplo, 1H com 1H, Figura 22). O
espectro de 1H aparece ao longo da
diagonal. Os pontos fora dessa dia-
gonal representam correlações entre
Figura 18: Constante de Acoplamento (J) hidrogênios não-equivalentes e são
denominados “cross-peaks”.
Os cross-peaks, como mostra a
detectado no domínio temporal (FID) ao longo de duas dimensões, F1 e F2.18 Figura 22, devem, obrigatoriamen-
é transformado para o domínio das Dessa forma, informações comple- te, formar um triângulo retângulo
freqüências mediante a transformada xas, que antes apareciam em apenas com relação aos picos correspon-
de Fourier e o espectro resultante é um uma dimensão (por exemplo, hidrogê- dentes na diagonal, em razão da
“gráfico” de amplitude x freqüência, nios em ambientes químicos seme- simetria do espectro, dado de grande
chamado unidimensional porque ape- lhantes que apresentam deslocamen- importância na interpretação do es-
nas um dos eixos corresponde a fre- tos químicos muito próximos, o que pectro, pois é uma garantia de que os
qüências de absorção (Figura 15). pode levar à superposição de sinais), picos realmente estão acoplando.
Em um experimento bidimensio- aparecem agora em duas dimensões, Caso não seja formado um triângulo
nal, é válido o mesmo diagrama tem- facilitando a interpretação do espectro retângulo, pode-se garantir que os
poral (Figura 20). A principal diferen- para determinação da estrutura mole- picos em análise não estão acoplan-
ça é que existem obrigatoriamente dois cular. do. Além disso, o experimento COSY
períodos variáveis: o tempo de evolu- O espectro bidimensional resultan- apresenta também a vantagem de
ção (t1, que em um experimento 1D te pode ser representado de duas for- obter os valores das contantes de
pode ser zero) e o tempo de aquisição mas: o gráfico superposto (stacked), acoplamento J em unidades de fre-
(t2). Fazendo-se uma série de experi- que mostra o espectro em três dimen- qüência Hz, o que representa mais
mentos nos quais variem progressiva- sões (F1, F2 e intensidade); e o gráfico uma garantia do acoplamento entre
mente os valores do tempo de evolu- de contorno, que representa um corte os picos que estão sendo analisados.
ção, desde zero até t1, tem-se duas horizontal do gráfico stacked. Esse No caso do espectro obtido pelo
variações no domínio temporal: uma corte é selecionado pelo próprio usu- experimento HETCOR (Figura 23),
devida a t1 e outra devida a t2. Se uma ário de acordo com a intensidade que o espectro não aparece na diagonal.
série de FIDs for detectada a partir se deseja obter. O corte leva a um Em uma dimensão, aparece o espec-
desses experimentos nos quais se vari- gráfico bidimensional F1 x F2 (Figuras tro do hidrogênio, por exemplo, en-
am os valores de t1, a transformada de 22, 23). quanto em outra dimensão aparece
Fourier ao longo de t2 dessas diferentes Embora o gráfico stacked seja mais o espectro do outro núcleo (no caso
FIDs fornecerá uma série de espectros fácil de ser visualizado, é, entretanto, do espectro da Figura 23, o outro
1D. Se uma outra transformada de mais difícil de ser analisado, uma vez núcleo é o de carbono-13). O espec-
Fourier for realizada ao longo de t1, que interpretação em três dimensões tro bidimensional mostra as correla-
então poderemos obter um espectro se torna mais complexa. Por isso, um ções existentes entre os dois núcleos
bidimensional, com sinais observados corte transversal que gera um gráfico como em um gráfico do tipo xy.

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21- julho/agosto 2001 59


Figura 19: Espectro de RMN-2D de uma proteína (Bloch Jr. C., et al. 1998)

CONCLUSÃO sibilitou um considerável avanço nos os projetos genomas concluídos neste


estudos de dinâmica molecular que, começo de século, além daqueles que
Apesar de relativamente recente, a antes da RMN, limitavam-se quase que ainda estão por vir, indicam as dimen-
Ressonância Magnética Nuclear já é exclusivamente a dados cristalográfi- sões do trabalho que se tem pela
referência mundial para a análise de cos. Mesmo com todo o avanço tecno- frente.
estruturas moleculares em diversas áreas lógico registrado ultimamente nesse De fato, vários grupos de pesquisa
do conhecimento. Na Bioquímica mo- campo, a determinação da estrutura têm-se unido em consórcios (The Rese-
derna, essa técnica permitiu, de forma tridimensional de uma biomolécula arch Collaboratory for Structural Bio-
inédita, a investigação de estruturas ainda não pode ser considerada uma informatics, http://www.rcsb.org/
tridimensionais de biomoléculas em tarefa trivial. As limitações e peculiari- index.html), assim como empresas de
condições próximas do estado fisioló- dades dessa técnica, bem como a gi- biotecnologia (Celera Genomics; http:/
gico (soluções aquosas). Tal fato pos- gantesca demanda imposta pelos vári- /www.celera.com/), para atacar de for-

Figura 20: Tempos


possíveis em um experi-
mento de RMN
Figura 21: Experimento de RMN em uma dimensão
60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21 - julho/agosto 2001
Morales, pelos elaboração e arte de
várias figuras apresentadas neste artigo.

REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS

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ma mais eficiente a etapa considerada cisivos na obtenção de estruturas 3D 13- Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
mais fascinante e desafiadora desses em larga escala. Espera-se que o pre- 1988, 27, 490-536, Horst Kessler*, Ma-
vários projetos, que é a determinação sente artigo possa dar uma contribui- thias Gehrke, Christian Griesinger
das estruturas tridimensionais de todas ção, por menor que seja, nessa direção 14- Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
as proteínas sintetizadas por um dado a partir da difusão dos fundamentos 1989, 22, 350-380, Reinhard Benn* and
ser vivo, ao longo de todas as etapas aqui apresentados e como introdução Harald Günhter*
metabólicas de seu desenvolvimento. a uma próxima publicação dedicada 15- J. Chem. Educ., 1989, 66(10), Roy
É possível que os próximos anos exclusimente à RMN de proteínas. W. King, Kathryn R. Williams
testemunhem iniciativas ousadas, a 16- Concepts in Magnetic Resonan-
exemplo do projeto genoma humano, AGRADECIMENTOS ce, 1989, 1, 7-13 , Daniel D. Traficante
na área de determinação estrutural de 17- Bloch Jr., C. et al. (1998), Pro-
proteínas, nos quais, tanto a cristolo- Ao Professor José Daniel Figueroa teins Struc. Func. Gen. 32 (3) 334-349.
grafia de raio-X quanto a RMN multidi- Villar pelos espectros do etanol gentil- 18- Farrar, T.C. (1989) Analytical
mensional deverão ocupar papéis de- mente fornecidos e a Rodrigo A.V. Chem. 59 (11), 749A-761A.

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