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PIURA PERU
INTRODUCCION:
Las enfermedades infecciosas en los ltimos tiempos han mantenido un lugar preferencial en el
reamdica, sobre todo por la aparicin de enfermedades virales como el sida y el resurgimiento
decuadros infecciosos que se crean controlados como la tuberculosis. por otra parte, el uso
indiscriminado de antibiticos de amplio espectro ha incrementado la resistencia a los
antimicrobianos y la circulacin de cepas multirresistentes en los ambientes hospitalarios,
situacin que dificulta el manejo de pacientes hospitalizados. Es por ello, que el clnico recurre al
laboratorio de Microbiologa con el nico propsito de obtener resultados confiables y en el
menor tiempo posible. En tal sentido, la presente monografa se ha diseado de manera que sirva
de texto gua.
OBJETIVOS:
Para llevarlo a cabo, se parte de la informacin acumulada por el mdico y que se recoge en la
historia clnica del paciente en forma de sntomas, signos y diagnstico clnico ms probable a su
entender.
A la hora de llevar a cabo la identificacin es imprescindible la labor del laboratorio, que nos
aportar datos preliminares o definitivos sobre los agentes patolgicos causantes de la afeccin.
Para ello, se lleva a trmino un procedimiento ordenado que comprende:
1.- Toma de muestras (esputo, sangre, heces, tejidos) que dependern de la sospecha de
procedencia de la afeccin.
2.- Observacin al microscopio, si procede, de la muestra
3.- Obtencin de colonias aisladas, cultivo.
4.- Identificacin del gnero y de la especie mediante test bioqumicos, genticos, inmunolgicos.
5.- Test de sensibilidad a los antibiticos (punto de corte, antibiograma, MIC)
6.- Informe al clnico, quien proceder a establecer el tratamiento fundamentado en el diagnstico
microbiolgico o a modificar un tratamiento emprico administrado debido a la gravedad de la
infeccin.
A la hora de tomar las muestras microbiolgicas, debemos de hacerlo con el mayor rigor posible,
sien do para ello muy importante el cumplimiento de los siguientes requisitos que permitirn
garantizar el resultado correcto del estudio:
Una vez tenemos las muestras adecuadas, podemos comenzar a realizar las tcnicas diagnsticas
correspondientes. Dentro del diagnstico microbiolgico incluiremos:
Cada una de estas tcnicas tiene sus ventajas y sus inconvenientes, pero son todas ellas muy
necesarias para un buen resultado final.
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la
rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede
fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se
aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijacin
se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus
ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas
aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han
sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por
los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes
catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas
cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y
el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo
se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la
localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro
Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo
altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir,
pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad
por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que
es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble
en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la
microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de
las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que
pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o
agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
EXAMEN MICROSCPICO:
Habitualmente, la visin microscpica de los agentes patgenos no nos ofrecer un diagnstico definitivo,
sino una orientacin diagnstica. Sin embargo, la visualizacin de estructuras especficas puede ser un hecho
que nos garantizar una determinacin garantizada. Los microscopios pticos permiten ver bacterias, hongos
y protozoos. Para ver virus es necesaria una resolucin mucho mayor que slo alcanza el microscopio
electrnico, mientras que las tenias y trematodos no requieren tcnicas de ampliacin de imagen.
Los exmenes en fresco dejan visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teirlos, y por tanto
vivos. stos, son especialmente importantes en las infecciones producidas por parsitos intestinales puesto
que pueden detectar huevos, quistes y trofozoitos que por sus caractersticas morfolgicas pueden generar por
si solas un diagnstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse antes de realizar la preparacin en
fresco con el fin de aclarar y concentrar los parsitos. Tambin las infecciones producidas por Tricomonas
vaginalis se diagnostican de este modo en el exudado uretral.
Se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien diferenciales cuando usan ms de uno y tien
de forma especfica distintas estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las ms utilizadas ya que
ofrecen ms informacin diagnstica. Algunas de las ms importantes son:
a) Tincin de gram
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie
1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava
de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina
(color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada
que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de
bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar
su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es
gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido
teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La
pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente
de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,
lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal
violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de
colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn
teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo
es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las
gramnegativas se encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran,
mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas
est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de
que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y
disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a
causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son
permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as
el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado
dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules,
pero las gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene
poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta -
yodo.
El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son
ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y
otras gramnegativos.
b) Tincin de Ziehl-Neelsen
c) Tincin de auramina.
CRECIMIENTOS EN CULTIVOS
Al igual que ocurre con su nutricin, no todos necesitan las mismas condiciones fsicas
para crecer, por lo que hay que individualizar la temperatura, la humerdad, el pH y
otras caractersticas si queremos que nuestros cultivos salgan adelante.
Es por esto que los cultivos slidos tienen una serie de ventajas que se resumen en la
posibilidad de cuantificar el nmero de unidades formadoras de colonias (previa
dilucin) y en la capacidad para identificar preliminarmente un microorganismo
basndonos en las caractersticas de la colonia formada (tanto color como morfologa).
Hay muchos medios diferentes desarrollados para abarcar el mximo nmero posible
de agentes patgenos. Segn su capacidad para soportar el crecimiento microbiano se
clasifican en medios generales (para el crecimiento de la mayora), de enriquecimiento
(para bacterias y hongos sobretodo), selectivos (fomentan el crecimiento de
determinados agentes mientras que evitan la aparicin de otros) y diferenciales
(distinguen entre distintos agentes casi siempre en funcin de las colonias).
c) Otros medios
El agar McConkey es un medio selectivo para gram negativos. Tambin existen los
medios de manitol salado, caldo selenito, agar Campylosel (para Campylobacter) o el
medio CIN (para Yersinia).
Siendo el ms evidente el efecto citoptico de algunos virus. Este efecto consiste en los
cambios bioqumicos y moleculares, morfolgicos y de viabilidad celular, causados
durante el ciclo de replicacin viral y visibles mediante la microscopa ptica.
La mayor parte de las visiones del efecto citoptico se han dado en clulas infectadas
en cultivo, en las que se puede llegar a observar una prdida de adherencia al
sustrato, una inhibicin por contacto, agregacin celular, redondeamiento celular,
formacin de sincitios, transformacin celular, etc. Aunque todos los virus lticos
producen este tipo de efectos, pueden observarse una gran cantidad de
manifestaciones distintas.
TCNICAS INMUNOLGICAS
Por ltimo, una pequea resea sobre el diagnstico de las infecciones causadas por
hongos o virus.
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA
- Koneman E., Allen S., Jandon W., Schreckenberger P., Winn W. Diagnstico microbiolgico.
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- Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
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- Castro G, Aguilera M, Hernndez C, Arteaga R, Carmona A, Prez A, Giono S, Figueras M,
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- Finegold S, Baron E. Diagnstico microbiolgico Bayley Scout. 7a ed. Argentina: Editorial
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