D E PA RTA M E N T O L A B O R AT O R I O B I O M D I C O N A C I O N A L Y D E R E F E R E N C I A

Instituto de
Salud Pblica
Ministerio de Salud

DOCUMENTOS TCNICOS PARA EL LABORATORIO CLNICO

RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN

DE AUTOANTICUERPOS EN EL LABORATORIO DE
INMUNOLOGA
JULIO, 2016
RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN DE AUTOANTICUERPOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA

AUTORES
BQ. Hugo Moscoso E.
Jefe Subdepartamento Enfermedades No Transmisibles.
Departamento Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Carolina Valenzuela B.
Jefe Seccin Inmunologa.
Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles.
Departamento Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.

REVISORES INTERNOS
TM. Ana Mara Castillo M.
Profesional Seccin Inmunologa.
Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles.
Departamento Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Leopoldo Galdames V.
Profesional Seccin Inmunologa.
Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles.
Departamento Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Ingrid Mansilla C.
Profesional Seccin Inmunologa.
Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles.
Departamento Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
Dra. Vernica Ramrez M.
Jefe Subdepartamento Coordinacin Externa.
Departamento Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.

REVISORES EXTERNOS
Dra. Patricia Abumohor G.
Miembro Sociedad Chilena de Reumatologa.
TM. Marcela Crespo O.
Miembro Sociedad Chilena de Qumica Clnica.
QF. Andoni Etcheverry L
Miembro Comit PEEC.
TM. Rebeca Montalva D
Miembro Comit PEEC.
TM. Marcelo Ramrez S.
Miembro Comit PEEC.
Dra. Anglica Rivera M.
Miembro Sociedad Mdica de Laboratorio Clnico.
RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN
DE AUTOANTICUERPOS EN EL LABORATORIO DE
INMUNOLOGA
RESUMEN
El siguiente documento establece recomenda-
ciones para la ejecucin de las metodologas ma-
yormente usadas por los laboratorios clnicos en
Chile, inmunofluorescencia indirecta (IFI) y enzi-
mainmunoanlisis (ELISA) para la determinacin
de diversos autoanticuerpos utilizados como mar-
cadores serolgicos en diferentes enfermedades
autoinmunes. La IFI que inici la pesquisa de au-
toanticuerpos en los aos 70, se complementa en la
actualidad con nuevos inmunoensayos disponibles.
ALCANCE
Estas recomendaciones aplican a las determina-
ciones de autoanticuerpos por inmunofluorescencia
indirecta y por enzimainmunoanlisis realizado en
los laboratorios clnicos.
INTRODUCCIN
La deteccin de autoanticuerpos dirigidos con-
tra distintas estructuras propias del organismo, en
algunos casos ubicadas en todas las clulas y en
otros casos en tejidos especficos, constituye un
conjunto de marcadores inmunolgicos caractersti-
cos de una variedad de enfermedades autoinmunes.
Principalmente ayudan al diagnstico, y en algunos
casos al pronstico y/o seguimiento de patologas
como las enfermedades del tejido conectivo (ejem-
plos: lupus eritematoso sistmico, artritis reumato-
dea), enfermedades gastrointestinales autoinmunes
(ejemplos: enfermedad celaca, anemia perniciosa),
enfermedades inflamatorias de pequeos vasos
sanguneos o vasculitis (ejemplos: granulomatosis
con poliangetis- antes denominada granulomatosis
de Wegener, sndrome de Churg-Strauss o ange-
tis granulomatosa alrgica) o las que afectan a un
rgano como las enfermedades autoinmunes del
hgado (ejemplos: cirrosis biliar primaria, hepatitis
autoinmune), enfermedades autoinmunes de la ti-
roides (ejemplos: tiroiditis de Hashimoto, enferme-
dad de Graves), entre muchas otras.
Desde los aos 70, la inmunofluorescencia in-
directa ha permitido detectar autoanticuerpos con
las ventajas de su simple ejecucin y la adecuada
sensibilidad y especificidad diagnstica que en ge-
neral otorga para la deteccin de estos marcadores.
Sin embargo, el consumo de tiempo en la lectura al
microscopio y la competencia del laboratorista en
esta accin determina, en gran medida, la validez de
los resultados. Hoy los laboratorios tienen la opcin
de equipos automatizados para realizar esta meto-
dologa.
En el transcurso del tiempo la tecnologa ha
permitido disponer de otros inmunoensayos, entre
ellos ELISA, que tienen la ventaja de pesquisar el
componente antignico especifico que detecta el
respectivo autoanticuerpo, ya sea de forma colectiva
(screening) e individual (nico perfil) por corrida;
adems la metodologa es de simple ejecucin y su
deteccin permite la obtencin de un resultado que
no es dependiente del operador.
A pesar de las ventajas que ofrecen los diversos
inmunoensayos frente a IFI para diferentes autoan-
ticuerpos, es importante indicar que en algunos ca-
sos se han complementado y en otros an no han
logrado reemplazarla.
Estas recomendaciones se originan del trabajo
realizado en siete Talleres de Autoinmunidad (17 y
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Instituto de Salud Pblica de Chile. 3
 RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN DE AUTOANTICUERPOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA
18 de octubre de 1996, 5 de diciembre 1997, 3 de
noviembre de 2000, 6 de diciembre 2004, 2-3 de
septiembre 2010; 29-30 de noviembre 2012, 7 de
julio 2014) con la participacin de los profesionales
de laboratorios de la Red de Inmunologa del pas,
orientados a la armonizacin de las metodologas
para la determinacin de autoanticuerpos.
TERMINOLOGIA
AAN: Anticuerpos anti-nucleares
ANCA: Anticuerpos anti-citoplasma de neutrfilos
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
dsDNA: ADN de doble hebra (del ingls double
strand DNA)
ELISA: Enzimainmunoanlisis; del ingls enzyme
linked immunosorbent assay
FITC: Isotiocianato de fluorescena; del ingls
fluorescein isothioscyanate
F/P: Relacin fluorocromo/protena
IFI: Inmunofluorescencia indirecta
LED: Diodo emisor de luz; del ingls light-emit-
ting diode
LKM: Antgeno microsomal del hgado y rin;
del ingls liver, kidney microsomal antigen.
MBG: Membrana basal del glomrulo
MPO: Mieloperoxidasa
PR-3: Proteinasa 3
VAA: Vasculitis asociada a ANCA
DESARROLLO
REQUISITOS TCNICOS (basados en ele-
mentos de calidad analtica y metrolgica)
El laboratorio debe verificar en caso de usar kit
comercial, validar en caso de usar metodologa
implementada en el laboratorio con el fin de asegu- f) La lectura de autoanticuerpos debe realizarse
rar el uso previsto de su aplicacin.
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1. Autoanticuerpos por inmunofluorescen-
cia indirecta (IFI)
1.1. En el procedimiento general para la de-
terminacin de autoanticuerpos por inmu-
nofluorescencia indirecta (autoanticuerpos
AAN, anti-dsDNA, anti-mitocondrial, anti-
msculo liso, anti-clulas parietales gstri-
cas, anti-LKM1, anti-tiroglobulina, anti-mi-
crosomal, anti-endomisio, anti-membrana
basal del glomrulo y ANCA) considerar los
siguientes aspectos:
a) En la utilizacin de reactivos comerciales, se
deben seguir las instrucciones de uso indicados
por el fabricante (inserto tcnico en espaol).
b) De acuerdo al autoanticuerpo a determinar se
debe seleccionar el sustrato, considerando te-
jido o clula, agentes fijadores y grado de sen-
sibilidad y especificidad diagnstica.
c) El conjugado que se debe utilizar es anti-IgG
humana-FITC, de preferencia con relacin F/P
2 a 3 para los autoanticuerpos, a excepcin
de anti-endomisio (punto 1.5) y ANCA (punto
1.6). Si el conjugado no es de kit, se debe usar
en la dilucin de trabajo determinada por el la-
boratorio por el mtodo tablero de ajedrez.
d) La determinacin de autoanticuerpos por IFI
debe incluir control positivo con trazabilidad
demostrada para los autoanticuerpos que dis-
ponen de material de referencia primario y con-
trol negativo de suero humano. Incluir ambos
controles por cada placa. Si es equipo automa-
tizado, incluirlos en cada corrida por nmero
de lote de placa.
e) En caso de no cumplir el control de calidad,
se invalida la placa corrida. Se debe revisar
el procedimiento realizado, la vigencia de cada
componente del ensayo, las diluciones aplica-
das, los tiempos de incubacin, el estado de
los controles aplicados y por ltimo la condi-
cin del microscopio y/ equipo automatizado.
en un microscopio de epifluorescencia con
lmpara de mercurio de 100 watts o con ilumi-
nacin LED.
 RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN DE AUTOANTICUERPOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA

g) Si el microscopio posee lmpara de mercurio, e) La incubacin de los sustratos con los sueros
mantener registro de horas de uso de sta. Para se debe realizar en cmara hmeda y a tempe-
lmpara de mercurio iluminacin LED se re- ratura ambiente (20 a 26C).
comienda utilizar un portaobjeto para control de f) Escurrir los sueros y controles de las lminas
intensidad de fluorescencia de origen comercial. evitando que se mezclen entre s.
h) Como medio de contraste se recomienda utili- g) La incubacin con el conjugado debe ser reali-
zar Azul de Evans. zada en oscuridad.
i) El lquido de montaje puede ser tampn fosfato h) Para los lavados manuales post incubacin con
salino-glicerol o Tris-glicerol. Se recomienda suero y conjugado, deben efectuarse 2 lavados
el uso de Tris-glicerol porque otorga mayor es- de 10 minutos cada vez en tampn fosfato sali-
tabilidad al fluorocromo. no 0,01M; pH 7,2 a temperatura ambiente (20
j) Mantener registros actualizados de los reacti- a 26C) en agitacin constante.
vos utilizados (N de lote, fecha de expiracin y i) El conjugado se debe utilizar en la dilucin
fabricante). indicada por el fabricante o la establecida por
k) Mantener registro de cada determinacin con el laboratorio. En los conjugados diludos se
sus resultados y la identificacin del profesio- debe evitar cambios frecuentes en su tempera-
nal responsable de la emisin. tura de almacenamiento a uso, es decir, de 2 a 8
l) El uso de equipo automatizado para IFI debe C a temperatura ambiente. Debera ser alicuo-
seguir las indicaciones del fabricante. tado y almacenado a la temperatura indicada en
oscuridad hasta su uso.
m) Ante cambio de metodologa IFI desde manual
a automatizada, se debe realizar verificacin del j) Las muestras positivas se deben titular a punto
mtodo y un estudio de comparacin de ambas final en diluciones mltiplo de 2 hasta un titulo
metodologas. Se sugiere aplicar el documento final 1/1280.
CLSI EP12-A2 User Protocol for Evaluation of k) Para denominacin de patrones AAN se re-
Qualitative Test Performance; Approved Guide- comienda adoptar la nomenclatura basada en
lineSecond Edition el segundo consenso brasileo, II Brazilian
n) Ante cambio de microscopio con iluminacin Consensus on Antinuclear Antibodies in HEp-
de lmpara de mercurio a LED, se debe validar 2 cells a lo menos en los patrones de reporte
en las mismas condiciones de aumento (40x), obligatorio. Ver figura 1.
apertura numrica (0,65), filtro secundario v/s l) En el informe se debe indicar resultado AAN,
intensidad de fluorescencia. ttulo y patrn; resultado citoplasma, ttulo y
1.2. En el procedimiento de la determina- patrn. Adems debe indicar metodologa y el
cin de AAN por IFI considerar: sustrato.
a) La inmunofluorescencia indirecta es el mtodo m) Cuando el laboratorio disponga de material de
de referencia para la determinacin de AAN. referencia terciario o controles expresados en
UI/mL, el resultado debera expresarse en esta
b) Se recomienda incluir en el procedimiento, unidad, adems del ttulo correspondiente.
adems de sueros control, un suero positivo
crtico o de punto final.
c) Para screening en clulas HEp-2 se recomien-
dan las diluciones 1/40 y 1/160.
d) El tiempo de exposicin de las lminas (sustra-
tos) al medio ambiente luego de retirarlo de su
envoltura debe ser el indicado por el fabricante.

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 RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN DE AUTOANTICUERPOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA

Figura 1:
Algoritmo para clasificacin de patrones AAN
(basado en II Consenso Brasileo; Rev. Bras. Reumatol; 2003, Vol 3, N3, p 129-140)

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1.3. En la determinacin de anticuerpos e) En sustrato fijado con etanol, si el patrn es
anti-DNA por inmunofluorescencia indirecta pANCA, debera confirmarse con sustrato fija-
considerar: do con formalina; se recomienda complemen-
a) Para screening en Crithidia luciliae se reco- tar con ELISA cuantitativo para MPO.
miendan las diluciones 1/5 y 1/10. f) Al obtener fluorescencia nuclear en sustrato
fijado con formalina, descartar AAN+ antes de
1.4. En la determinacin de anticuerpos informar ANCA atpico.
anti-msculo liso, anti-mitocondrial, anti-
clulas parietales gstricas, anti-LKM1, g) Usar denominacin ANCA atpico por el valor
anti-tiroglobulina y anti-microsomal por IFI diagnstico que tendra en otras enfermedades
considerar: no VAA.
a) Para screening se recomiendan las diluciones h) La lectura por IFI debera ser realizada a lo menos
1/20 y 1/100. por dos operadores diferentes y competentes.
b) La titulacin a punto final es optativa a cada i) En el informe indicar el resultado ANCA, dilu-
laboratorio. cin de screening y patrn. Adems, indicar
metodologa, nombre del sustrato y tipo de fi-
1.5. En la determinacin de anticuerpos jacin (etanol y/o formalina).
anti-endomisio por inmunofluorescencia in-
directa considerar: 2. Autoanticuerpos por enzimainmunoanli-
a) Para screening se recomiendan las diluciones sis (ELISA):
1/5 y 1/10. a) En el caso de las determinaciones de AAN y
b) Si no se utilizan reactivos comerciales, usar dsDNA positivas por ELISA, se sugiere confir-
conjugado anti-IgA humana-FITC en la dilu- mar por IFI.
cin de trabajo determinada por el laboratorio. b) De acuerdo al autoanticuerpo a determinar, se
c) La titulacin a punto final es optativa a cada debe seleccionar el kit a usar en conocimiento
laboratorio. de la composicin antignica, origen (huma-
no o animal, nativo, sinttico recombinante),
1.6. En la determinacin de ANCA por inmu- sistema de purificacin (qumico, columnas
nofluorescencia indirecta considerar: cromatogrficas o inmunoadsorcin), tipo de
a) Se recomienda dilucin de screening 1/20 unin del antgeno a la placa, sensibilidad y
usando sustrato fijado en etanol; se sugiere di- especificidad.
lucin 1/100 con el fin de detectar fenmenos c) En la utilizacin de reactivos comerciales se de-
de prozona. ben seguir las instrucciones de uso indicados
b) Se debe incluir controles positivos para pAN- por el fabricante (inserto tcnico en espaol).
CA, cANCA y un control negativo. Para cada d) La exposicin de los pocillos al medio ambien-
lote de placas se recomienda incluir suero con- te debe seguir las indicaciones del fabricante.
trol para ANCA atpico. e) Verificar la trazabilidad de los calibradores o
c) Si no se usan reactivos comerciales, el conju- controles cuando corresponda segn la dispo-
gado debe ser anti-IgG humana F(ab`)2 -FITC nibilidad de material de referencia primario.
utilizado en la dilucin de trabajo determinada f) Se debe verificar la conformidad del control de
por el laboratorio. calidad interno indicado por el fabricante. Lle-
d) En sustrato fijado con etanol, si el patrn es var registros; se recomienda llevar en grficas
cANCA, se recomienda complementar con ELI- de Levey y Jennings. En caso de no conformi-
SA cuantitativo para PR-3. dad del control interno se debe revisar la lon-

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Instituto de Salud Pblica de Chile. 7
 RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN DE AUTOANTICUERPOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA

gitud de onda usada para la lectura, revisar los 3.- Cabiedes, J and Nues-Alvarez, C. Anticuerpos
tiempos de incubacin, revisar la estabilidad antinucleares. Reumatol. Clin. 2010; 224-230.
del conjugado de acuerdo a las absorbancias 4.- Bogdanos, D, Invernizzi, P, Mackay, I and Ver-
en los ensayos anteriores y revisar el estado del gani, D. Autoimmune liver serology: Current
cromgeno en uso. diagnostic and clinical challenges. World J.
g) Realizar las lecturas de absorbancia en un lec- Gastroenterol. 2008; 14(21):3374-3387.
tor de placas debidamente calibrado en la esca- 5.- Hill, I.D. What are the Sensitivity and Specifi-
la de longitud de onda y absorbancia UV-VIS. city of serologic test for celiac disease? Gas-
Disponer de un programa de mantenciones troenterology.2005; 128 (4): s25-s32.
preventivas al da y sus respectivos registros.
6.- Galofr JC. y Davies TF. Utilidad clnica de los
h) El laboratorio debera verificar el valor de corte anticuerpos antitirodeos. Rev. Med. Univ. Na-
positivo propuesto por el fabricante. varra. 2008; 52(2): 3-8.
i) Se recomienda que el informe incluya, en caso 7.- Savige J, Dimech W, Fritzler M, Goeken J, Ha-
que corresponda, la composicin antignica y gen E.C, Jannette JC, Mc Evory R, Pussey C,
origen de los antgenos. Adems se recomien- Pollock W, Trevisin M, Wiik A, and Wong R. for
da que incluya el resultado expresado en las International Group for Consensus Statement
unidades indicadas en el inserto, el mtodo, el on Testing and Reporting on Antineutrophil
intervalo y/o valor de referencia sealado por el Cytoplasmic Antibodies (ANCA). Addendum
fabricante o el utilizado por el laboratorio. to the International Consensus Statement on
Testing and Reporting of Antineutrophil Cyto-
plasmic Antibodies. Am. J. Clin. Pathol. 2003;
AGRADECIMIENTOS 120: 312-318.
A los profesionales de la Red de Laboratorios de 8.- Carballo G, Ingnito F, Ginaca A, Carvajal P,
Inmunologa expositores y asistentes, que han par- Costa M. y Balbaryski J. Primer Consenso
ticipado de los siete talleres de autoinmunidad, por Argentino para Estandarizacin de la determi-
su colaboracin en las presentaciones realizadas y nacin de anticuerpos antinucleares por inmu-
en las observaciones compartidas en stos, realiza- nofluorescencia indirecta HEp-2. Acta Bioqum.
dos bajo la coordinacin del Laboratorio Nacional y Clin. Latinoam. 2012; 46(1): 3-13.
de Referencia de Inmunologa del Instituto de Salud
9.- Dellavance Alessandra, Gabriel Jnior Alexan-
Pblica. Una mencin especial para QF. Darwins
dre, Cintra Alice F. U, Ximenes Antnio Carlos,
Castillo A. quien inici y estimul el trabajo siste-
Nuccitelli Barbara, Tabilerti Ben Hur, Morei-
mtico de talleres y documentos tcnicos de con-
ra Caio, von Mhlen Carlos Alberto, Bichara
senso en el rea de autoinmunidad a nivel nacional.
Carlos David, dos Santos Cludio Henrique
Radmos, Yano Cristiane Martinez, Mangueira
Cristovo Luis Pitangueira, Carvalho Darlene
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Gonalves, Bonf Elosa Silva Dutra de O, Doi
1.- Kern, P, Kron, M and Hiesche, K. Measurement Elvira M, Guimares Fabiana Nunes de Carval-
of Antinuclear Antibodies: Assesment of Diffe- ho, e Arajo Flvia Ikeda, Mundim Hugo Men-
rent Test Systems. Clinical and Diagnostic La- dona, Rego Jozelia, Vieira Lisiane Ericonio
boratory Immunology. 2000; 72-78. dos Anjos, Poli Luciana, Andrade Lus Eduardo
Coelho, Callado Maria Roseli, Mesquita Mauro
2.- Kumar, Y, Bhatia, A and Walker Minz, R. Antinu-
Meira, Sugiyama Mitiko; Slhessarenko Natas-
clear Antibodies and their detection methods in
ha, da Silva Nilzio Antnio, Carballo Orlando
diagnosis of connective tissue diseases: a journey
Gabriel, Leser Paulo Guilherme, Francescanto-
revisited. Diagnostic Pathology. 2009; 4:1-10.
nio, Paulo Luiz Carvalho, Jarach Renata, Xavier

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

8 Instituto de Salud Pblica de Chile.
 RECOMENDACIONES PARA LA DETERMINACIN DE AUTOANTICUERPOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGA

Ricardo Machado, Levy Roger Abramino, Ne-

ves Suzane P. F, Cruvinel Wilson de Melo, dos
Santos Wilton Silva. II Brazilian Consensus on
Antinuclear Antibodies in Hep-2 Cells. Rev.
Bras. Reumatol; 2003; 3(3): 129-140.
10.- CLSI Document EP12-A2 User Protocol for
Evaluation of Qualitative Test Performance; Ap-
proved GuidelineSecond Edition.

Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Instituto de Salud Pblica de Chile. 9