Pewarnaan diferensial, prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan

diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut

teknik pewarnaan diferensial
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka.

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk

mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat
warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat
warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet,
alkohol, safranin, dan iodine.
1. Kristal violet
Memberikan warna ungu pada bakteri gram positif karena disebabkan kompleks zat
warna Kristal Violet dengan dinding sel bakteri.
2. Larutan lugol
- Meningkatkan afinitas pengikatan zat warna Kristal Violet oleh bakteri sehingga
pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat.
- Setelah penambahan lugol, zat warna Kristal violet lebih jelas terlihat
- Setelah penambahan lugol zat warna Kristal violet lebih sulit dilarutkan
- Tanpa penambahan lugol, zat warna Kristal violet akan larut sewakti penambahan
larutan pemucat, sehingga bakteri gram positif tidak akan berwarna ungu.
3. Larutan Pemucat
Bakteri gram positif tetap berwarna ungu karena kompleks persenyawaan Kristal violet-
lugol tetap terikat pada dinding sel. Bakteri gram negative berwarna pucat atau tidak
berwarna karena larutan pemucat melarutkan lipida dan menyebabkan pori-pori dinding
sel membesar, sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan Kristal violet-lugol.
4. Air fuchsin
Pada bakteri gram negative, penambahan air fuchsin menyebabkan sel bakteri berwarna
merah, karena persenyawaan kompleks Kristal violet-lugol larut dan dinding sel kemudian
mengikat zat warna kedua
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat
warna dan penambahan larutan pencuci

Warna merah yang timbul adalah karena bakteri tersebut

memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis sehingga bakteri
akan menyerap zat warna violet, tetapi ketika penambahan
alkohol 96%, violet pada bakteri gram negative inijadi luntur
disebabkan struktur dinding selnya yang sebagian besar
tersusun oleh lipid, sehingga akan menyerap kembali
pewarna safranin dan ikatan antara violet-lugol dengan
lapisan peptidoglikan lebih sedikit terjadi dan bakteri lebih
dominan terwarnai safranin yang berwarna merah.