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Es grato dirigirme a Usted para hacer de su conocimiento las actividades realizadas por el
suscrito, como parte del proyecto de tesis titulado Presencia de IMNV, IHHNV y VPAHPND en
langostinos silvestres del gnero Litopenaeus en Tumbes, en la Divisin de Laboratorios
de la Direccin Sanitaria y de Normatividad Pesquera y Acucola de SANIPES, segn se detalla
a continuacin:
Actividades:
Atentamente,
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Luis Alfredo Caldern Romero
Tesista
DNI: 46972646
RUC: 10469726466
Domicilio: Av. Mariscal Castilla N 115, Zorritos
ACTIVIDADES
Ver Anexo N 2.
En coordinacin.
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Luis Alfredo Caldern Romero
Tesista
ANEXOS
ANEXO N 1
Se evaluaron siete canales de marea del ecosistema de manglar de la Regin Tumbes (Fig. 1),
ubicados en las provincias de Tumbes y Zarumilla:
Los ejemplares se obtuvieron mediante lances de atarraya (1.22 cm de luz) en marea baja,
segn tabla de marea. Las muestras obtenidas fueron etiquetadas y preservadas en fresco con
gel-pack y llevadas al laboratorio donde fueron analizadas: INCABIOTEC S.A.C.
En el laboratorio se obtuvieron datos individuales de los ejemplares extrados como: peso, talla,
especie y alguna caracterstica adicional externa de inters (flacidez, coloracin rojiza, musculo
blanco, deformidad o necrosis cuticular).
TOTAL 140 88 52
Procesamiento de las muestras:
Para los anlisis de IHHNV e IMNV, se extrajeron como tejidos de referencia plepodos y
msculo, respectivamente, y se agruparon en pools de 10 langostinos, posteriormente se les
realiz la extraccin de ARN para su amplificacin.
a. Extraccin de ARN
a.1. Para la deteccin de IMNV se utiliz un protocolo adaptado de Poulos et al. 2006,
validado por la OIE. Las secuencias utilizadas son en base a las descritas en la
publicacin, pero mejoradas por Incabiotec SAC optimizando las caractersticas de
amplificacin y sensibilidad basndose sobre el genoma completo del IMNV (nmero de
acceso de GenBank AY570982). La extraccin de cidos nucleicos se realiz a partir de
tejidos del musculo y por medio de Trizol Reagent siguiendo las recomendaciones del
fabricante.
Se colocan aproximadamente 100 L de musculo de langostino. Lavar con 500 L
de agua ultra pura o solucin salina (lavar 5 veces).
Se recomienda centrifugar los tubos para facilitar la eliminacin del agua de los
lavados.
Macerar y colocar 500 L Tri Reagent (TRIZOL), y homogenizar con fuerza
utilizando la pipeta.
Incubar por 5 minutos a 4 C las diferentes muestras mezclando con el Tri Reagent
(TRIZOL).
Aadir 100 L de Cloroformo.
Mezclar vigorosamente invirtiendo los tubos durante 1 minuto y dejar reposar 2 a 15
minutos a temperatura ambiente (sobre hielo).
Centrifugar a 12000 por g 15 minutos a 4 C.
Transferir la fase superior a un nuevo microtubo libre de ARNasa.
Agregar 300 L de Isopropanol helado en el caso.
Mezclar invirtiendo el microtubo varias veces y dejar reposar 10 minutos a
temperatura ambiente (sobre hielo).
Microcentrifugar a 12000 x g por 10 minutos a 4 C.
Eliminar el sobrenadante sin desprender el sedimento de ARN.
Agregar 300 500 L de Etanol 75 % (lavar las paredes del tubo).
Homogenizar invirtiendo varias veces el microtubo.
Microcentrifugar a 7500 x g por 5 minutos a 4 C.
Eliminar el sobrenadante y dejar secar el pellet por 10 minutos a temperatura
ambiente.
Resuspender el sedimento en 20 a 50 L de Agua Ultra pura (mantener sobre hielo).
Tomar 2 L para la reaccin de Retrotranscripcin.
b. Extraccin de ADN
Tabla 3. Relacin de cebadores especficos para cada agente etiolgico evaluado y productos
de amplificacin de la PCR.
3. Anlisis de PCR
Y 2 series de amplificacin (PCR) del ADN del patgeno. La primera PCR, va a ser positiva
en el caso de una infeccin moderada, fuerte o muy fuerte. Cuando la primera reaccin
VPAHPND de la PCR es negativa, se realiza la segunda reaccin que permite determinar si la
muestra es realmente negativa o si se trata de una infeccin positiva pero muy leve.
4. Migracin por electroforesis
(%) = ( )
Resultados:
Las prevalencias del segundo muestreo fueron IHHNV (14.29 %) y VPAHPND (14.29 %) de los
pools positivos obtenidos. La prevalencia individual sera IHHNV (1.53 %) y VPAHPND (1.53 %),
es decir, estimamos que en la poblacin estarn infectados casi el 2 % de los individuos, para
ambos casos. Ver tabla 8.
Segn los resultados obtenidos se afirma la presencia de IHHNV y VPAHPND en Tumbes en las
poblaciones silvestres de peneidos del gnero Litopenaeus y libres de IMNV. Segn el segundo
muestreo, Tumbes 2017.
Vale aadir, que los langostinos silvestres pueden permanecer como infectados latentes, sin
embargo, si ingresan a los sistemas de cultivo podran propagar cualquier tipo de patgeno.
Se podra recomendar, para una mejor obtencin de datos, procesar las muestras de manera
individual y no mediante pools porque surgen problema de interpretacin de datos.
Tabla 5. Pools positivos en el segundo muestreo del anteproyecto de tesis, Tumbes 2017.
Deteccin de:
Estacin de N IMNV IHHNV VPAHPND
Muestreo Pools 1era PCR 2da PCR 1era PCR 2da PCR 1era PCR 2da PCR
Boca del 1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO
Rio Tumbes 2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO
1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
El Alcalde
2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
El Jel
2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
El Bendito
2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
La Soledad
2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
El 1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
Algarrobo 2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
1 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
La Envidia
2 NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
Tabla 7. Presencia de los agentes etiolgicos en estudio del segundo muestreo del
anteproyecto de tesis, Tumbes 2017.
Tabla 8. Prevalencia de los agentes etiolgicos en estudio del segundo muestreo del
anteproyecto de tesis, Tumbes 2017.