Bit 07001

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
SOLANGE INS MUSSATTO DRAGONE
Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em processos qumicos e

biotecnolgicos
Lorena SP
2007
SOLANGE INS MUSSATTO DRAGONE
Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em processos qumicos e

biotecnolgicos
Tese apresentada Escola de Engenharia de

Lorena da Universidade de So Paulo para a
obteno do ttulo de Doutor em Biotecnologia
Industrial.
rea de Concentrao: Converso de biomassa

Orientador: Dra. Ins Conceio Roberto
Lorena SP
2007
AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogao na Publicao
Biblioteca Universitria
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de So Paulo
Dragone, Solange Ins Mussatto

Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em processos
qumicos e biotecnolgicos / Solange Ins Mussatto Dragone; orientador Ins
Conceio Roberto. -- 2007
173 f. : fig.
Tese (Doutorado Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia Industrial.

rea de Concentrao: Converso de Biomassa) Escola de Engenharia de
Lorena da Universidade de So Paulo, 2007
1. Bagao de malte 2. Hidrlise 3. Xilitol 4. cido lctico 5. Carvo ativado 6.

cidos fenlicos 7. Branqueamento I. Ttulo.
663.48 - CDU
Este trabalho eu dedico a:
Meu marido, Giuliano, por estar ao meu lado em todos os momentos, pelo seu amor, respeito,
carinho e confiana.
Minha me, Idalina, por tudo! Por ter me criado com tanto amor e carinho, por ter me
educado e sempre me apoiado em todos os momentos.
Meu pai, Ercy, que infelizmente no est mais presente fisicamente entre ns, mas que estar
sempre dentro de mim como um grande exemplo de dignidade, fora, amor e humildade.
AGRADECIMENTOS
Dra. Ins Conceio Roberto, pela amizade, confiana e orientao, no apenas durante o
doutorado, mas desde 1998, quando iniciei meus trabalhos de pesquisa sob sua orientao.
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), pela bolsa de

doutorado concedida.
Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) e ao Conselho

Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pelos apoios financeiros.
Novozymes, pela doao das enzimas.
Aos professores, George Jackson de Moraes Rocha, Adriane Maria Ferreira Milagres e Ismael
Maciel de Mancilha, pelas valiosas explicaes e sugestes dadas para que este trabalho
pudesse ser realizado da melhor forma possvel.
Aos professores Joo Batista de Almeida e Silva, Silvio Silvrio da Silva, Maria das Graas
de Almeida Felipe e Arnaldo Mrcio Ramalho Prata, pela amizade constante.
A todos os colegas e funcionrios da EEL-USP que de alguma forma contriburam para a

realizao deste trabalho, em especial Marcela, por quem tenho grande carinho e amizade,
ao meu grande amigo Jlio Csar dos Santos e ao Paulinho (meu padrinho).
Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP) e aos professores do Programa de Ps-

graduao em Biotecnologia Industrial de uma forma geral, pelos conhecimentos transmitidos
e pela abertura de novas fronteiras em minha vida.
RESUMO
MUSSATTO, S.I. Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em

processos qumicos e biotecnolgicos. 2007. 173 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia
Industrial) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de So Paulo, Lorena, 2007.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a possibilidade de aproveitamento integral do bagao de

malte em processos qumicos e biotecnolgicos. O material foi fracionado atravs de trs
diferentes procedimentos: hidrlise com cido diludo, para separao da hemicelulose;
hidrlise alcalina, para solubilizao da lignina e hidrlise enzimtica, para converso da
celulose em glicose. Para cada um destes procedimentos foi realizado um estudo de
otimizao das condies de fracionamento, empregando variveis previamente selecionadas.
Os hidrolisados obtidos nas condies otimizadas foram utilizados em processos qumicos ou
biotecnolgicos para obteno de compostos de interesse comercial, tais como: 1. xilitol,
produzido por fermentao da xilose a partir do hidrolisado hemicelulsico, pela levedura
Candida guilliermondii; 2. cido lctico, produzido por fermentao da glicose a partir do
hidrolisado celulsico, pela bactria Lactobacillus delbrueckii; 3. carvo ativado, produzido
por ativao qumica da lignina presente no licor alcalino. Foi tambm avaliada e otimizada a
liberao de cidos fenlicos durante a hidrlise alcalina da lignina e foi ainda realizado um
estudo sobre as caractersticas da polpa de celulose obtida nas condies otimizadas, antes e
aps seu branqueamento com perxido de hidrognio, para avaliar sua possibilidade de
emprego na produo de papel ou de derivados de celulose. Os resultados de hidrlise cida
da hemicelulose revelaram que a eficincia deste processo em reator foi >85% para todas as
condies avaliadas, porm, a produo de xilitol foi favorecida a partir do hidrolisado obtido
nas condies de relao slido:lquido de 1:8 g:g, 100 mg H2SO4/g de matria seca, 120C
por 17 min, atingindo um fator de rendimento de 0,70 g/g e produtividade de 0,45 g/l.h. Na
etapa de hidrlise alcalina, os melhores resultados foram obtidos quando o processo foi
realizado a 120C por 90 min, empregando NaOH 2% p/v e uma relao slido:lquido de
1:20 g:g. Nestas condies, a polpa obtida apresentou (% p/p): 90,4 de celulose, 8,2 de lignina
e 1,1 de hemicelulose. Nas condies otimizadas de hidrlise enzimtica para esta polpa (45
FPU/g de matria seca, substrato 2% p/v, 100 rpm, 45C, 96 h), a eficincia de converso da
celulose em glicose foi de 93,1%. A produo de cido lctico a partir deste hidrolisado
apresentou elevado rendimento (0,98 g/g), porm, a produtividade aumentou 2,8 vezes
quando o meio foi suplementado com nutrientes. Os carves obtidos por ativao qumica da
lignina apresentaram uma elevada eficincia para remoo de metais, principalmente nquel,
ferro, cromo e silcio, a qual foi superior obtida a partir de um carvo comercial. Atravs da
hidrlise alcalina do bagao de malte tratado com cido sulfrico diludo, foi possvel
recuperar vrios cidos fenlicos, principalmente os cidos ferlico e p-cumrico, que so os
dois cidos fenlicos presentes em maior quantidade neste material. Alm disso, a polpa
celulsica obtida nestas condies, quando branqueada por uma seqncia utilizando
hidrxido de sdio e perxido de hidrognio, apresentou caractersticas adequadas para
utilizao na produo de derivados de celulose. Em funo destes resultados, foi concludo
que o bagao de malte um subproduto industrial com grande potencial para aproveitamento
como matria-prima em processos qumicos e biotecnolgicos.
Palavras-chave: Bagao de malte. Hidrlise. Xilitol. cido lctico. Carvo ativado. cidos
fenlicos. Branqueamento.
ABSTRACT
MUSSATTO, S.I. Integral use of brewery by-product in chemical and biotechnological

processes. 2007. 173 f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) Escola de Engenharia
de Lorena, Universidade de So Paulo, Lorena, 2007.
The possibility of brewers spent grain integral use, in chemical and biotechnological
processes, was evaluated. The material was fractionated by means of three different
procedures: dilute acid hydrolysis, for the hemicellulose recovery; alkaline hydrolysis, for the
lignin solubilization, and enzymatic hydrolysis, for the cellulose conversion into glucose. A
study on the optimization of the fractionation conditions using previously selected variables
was performed for each one of these procedures. The hydrolysates produced under the
optimum conditions were used in chemical or biotechnological processes for obtainment of
commercial interest compounds, such as: 1. xylitol, produced by fermentation of xylose from
hemicellulosic hydrolysate, by Candida guilliermondii yeast; 2. Lactic acid, produced by
fermentation of glucose from cellulosic hydrolysate, by Lactobacillus delbrueckii bacterium;
3. activated charcoal, produced by chemical activation of the lignin present in the alkaline
liquor. The phenolic acids release during the lignin alkaline hydrolysis was also evaluated and
optimized. In addition, a study about the characteristics of the cellulose pulp produced under
the optimum conditions, before and after bleaching with hydrogen peroxide, was also
performed to evaluate the possibility of using this pulp on the production of paper or cellulose
derivatives. The hemicellulose acid hydrolysis results revealed that the efficiency of this
process in reactor was >85% for all the evaluated conditions, but the xylitol production was
favored from the hydrolysate obtained in the conditions of 1:8 g:g solid:liquid ratio, 100 mg
H2SO4/g dry matter, 120C for 17 min, attaining a yield factor of 0.70 g/g and productivity of
0.45 g/l.h. In the alkaline hydrolysis stage, the best results were obtained when the process
was performed at 120C for 90 min, using 2% w/v NaOH and a solid:liquid ratio of 1:20 g:g.
Under these conditions, the obtained pulp presented (% w/w): 90.4 cellulose, 8.2 lignin and
1.1 hemicellulose. In the optimized conditions of enzymatic hydrolysis for this pulp (45 FPU
/g dry matter, 2% w/v substrate, 100 rpm, 45C, 96 h), the efficiency of cellulose conversion
into glucose was 93.1%. The lactic acid production from this hydrolysate presented a high
yield (0.98 g/g), but the productivity increased 2.8-times when the medium was supplemented
with nutrients. The charcoals produced by chemical activation of the lignin presented high
efficiency for the removal of metals, mainly nickel, iron, chromium and silicon, which was
higher than that obtained from commercial charcoal. By alkaline hydrolysis of brewers spent
grain pretreated with dilute sulfuric acid, it was possible to recover several phenolic acids,
mainly ferulic and p-coumaric acids that are the two phenolic acids present in larger amount
in this material. Furthermore, the cellulose pulp obtained under these conditions presented
characteristics suitable for use on the production of cellulose derivatives when bleached by a
sequence using sodium hydroxide and hydrogen peroxide. Due to these results it was
concluded that brewers spent grain is an industrial by-product with great potential for use as
raw material in chemical and biotechnological processes.
Keywords: Brewers spent grain. Hydrolysis. Xylitol. Lactic acid. Activated charcoal.
Phenolic acids. Bleaching.
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 2.1 - Gros de cevada. ................................................................................................... 21
Figura 2.2 - Representao esquemtica do processo de obteno do bagao de malte a

partir da cevada natural........................................................................................ 23
Figura 2.3 - Bagao de malte.................................................................................................... 24
Figura 2.4 - Microscopia eletrnica de varredura de partculas do bagao de malte. (A)

Ampliao de 100 vezes; (B) Ampliao de 300 vezes....................................... 24
Figura 2.5 - Representao esquemtica da ao das enzimas celulolticas na estrutura da

celulose. ............................................................................................................... 31
Figura 2.6 - Estrutura da lignina proposta por ADLER (1977)................................................ 37
Figura 3.1 - Representao esquemtica do trabalho proposto para aproveitamento

integral do bagao de malte. ................................................................................ 40
Figura 3.2 - Reator utilizado nos experimentos de hidrlise cida. ......................................... 45
Figura 3.3 - Representao esquemtica dos procedimentos utilizados para preparo dos
meios de fermentao a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte. ................................................................................................................... 50
Figura 3.4 - Banho termostatizado com leo de silicone, utilizado para a hidrlise alcalina
do bagao de malte. ............................................................................................. 53
Figura 4.1 - Grficos de Pareto para estimativa dos efeitos das variveis: (1) relao
slido:lquido, (2) concentrao de cido sulfrico e (12) a interao entre
elas, nas respostas: eficincia de hidrlise da arabinana (A), eficincia de
hidrlise da xilana (B), eficincia de hidrlise da hemicelulose (xilana +
arabinana) (C) e concentrao de lignina solvel (D), obtidas nos processos
de hidrlise cida do bagao de malte em autoclave. Efeitos acima da linha
de p=0,05 so significativos ao nvel de 95% de confiana. ............................... 73
Figura 4.2 - Cromatograma do hidrolisado obtido em autoclave, nas condies de relao

slido lquido de 1:10 g:g e 120 mg de cido/g de matria seca. ........................ 75
Figura 4.3 - Crescimento da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte e em meio semidefinido (MSD),
contendo 20 g/l de xilose (diludo) ou 85 g/l de xilose (concentrado). ............... 86
Figura 4.4 - Consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado

Figura 4.5 - Produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado

Figura 4.6 - Desempenho da levedura Candida guilliermondii em meio semidefinido

preparado com (smbolos abertos) ou sem (smbolos fechados) arabinose.
Crescimento celular (, ), consumo de xilose (, ) e produo de xilitol
(, ).................................................................................................................. 90
Figura 4.7 - Consumo de xilose (A) e produo de xilitol (B) pela levedura Candida
guilliermondii em hidrolisado de bagao de malte: HDS (), HC (), HCT
() e HCDS ()................................................................................................. 94
Figura 4.8 - Superfcies de resposta para os teores de lignina residual e de celulose (%

p/p) nas polpas de bagao de malte, em funo das variveis operacionais
empregadas no processo de hidrlise alcalina. .................................................. 102
Figura 4.9 - Micrografia eletrnica de varredura (ampliao: 45 vezes) e aspecto visual

das partculas do bagao de malte nas formas: original (A), pr-tratado com
cido diludo (B) e aps a hidrlise alcalina (C). .............................................. 103
Figura 4.10 - Grficos de Pareto para o efeito das variveis: concentrao de NaOH,
temperatura e tempo de reao, nas respostas: concentrao de cido ferlico
(A) e concentrao de cido p-cumrico (B) nos licores obtidos por hidrlise
alcalina do bagao de malte. Efeitos acima da linha de p=0,05 so
significativos ao nvel de 95% de confiana...................................................... 107
Figura 4.11 - Valores previstos pelo modelo linear em funo dos valores observados para
as respostas de concentrao de cido ferlico (A) e concentrao de cido
p-cumrico (B) nos licores obtidos por hidrlise alcalina do bagao de malte. 109
Figura 4.12 - Superfcies de resposta descrita pelos modelos para o rendimento em glicose
( y 1 ) e o rendimento total (glicose + celobiose) ( y 2 ) da hidrlise enzimtica
do bagao de malte. ........................................................................................... 115
Figura 4.13 - Perfil da liberao de glicose durante a hidrlise enzimtica do bagao de

malte a 45C, 100 rpm e 8% p/v de concentrao de substrato, utilizando
diferentes relaes de enzima/substrato (15 a 85 FPU/g).................................. 119
Figura 4.14 - Efeito da relao enzima/substrato nos rendimentos de hidrlise da celulose

do bagao de malte a 45C, 100 rpm e 8% p/v de concentrao de substrato. .. 119
Figura 4.15 - Hidrlise enzimtica das amostras de bagao de malte original, celulignina e
polpa celulsica. (A) Concentrao de glicose e celobiose nos hidrolisados
obtidos; (B) Rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise para
cada amostra utilizada........................................................................................ 122
Figura 4.16 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das

amostras de bagao de malte. Material original antes (A) e aps (B) a
hidrlise enzimtica; Celulignina antes (C) e aps (D) a hidrlise enzimtica;
Polpa celulsica antes (E) e aps (F) a hidrlise enzimtica. Ampliao: 300
vezes. ................................................................................................................. 125
Figura 4.17 - Efeito da concentrao inicial de inculo nos parmetros fermentativos da
produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii a partir do
hidrolisado celulsico de bagao de malte. ....................................................... 130
Figura 4.18 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de

malte no consumo de glicose (A), produo de cido lctico (B), crescimento
celular (C) e pH da fermentao (D) por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1
(): hidrolisado no suplementado; Meio 2 (): hidrolisado suplementado
com extrato de levedura; Meio 3 (): hidrolisado suplementado com os
nutrientes do meio MRS; Meio 4 (): MRS com a mesma concentrao
inicial de glicose do hidrolisado. ....................................................................... 133
Figura 4.19 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de

malte nos parmetros fermentativos (YP/S e QP) da produo de cido lctico
por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1: hidrolisado no suplementado; Meio
2: hidrolisado suplementado com extrato de levedura; Meio 3: hidrolisado
suplementado com os nutrientes do meio MRS; Meio 4: MRS com a mesma
concentrao inicial de glicose do hidrolisado. ................................................. 136
Figura 4.20 - Efeito do controle de pH no consumo de glicose (A) e produo de cido

lctico (B) por Lactobacillus delbrueckii em meios: Hidrolisado no
suplementado () sem controle de pH e () com controle de pH; Hidrolisado
suplementado com os nutrientes do meio MRS () sem controle de pH e
(U) com controle de pH; Meio MRS com a mesma concentrao inicial de
glicose do hidrolisado () sem controle de pH e () com controle de pH. .... 138
Figura 4.21 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das

amostras de bagao de malte original (A), polpa do bagao original no
branqueada (B), polpa do bagao original branqueada (C); bagao de malte
pr-tratado (D), polpa do bagao pr-tratado no branqueada (E), polpa do
bagao pr-tratado branqueada (F). Ampliao: 300 vezes............................... 143
Figura 4.22 - Aparncia das amostras de bagao de malte original (A), polpa do bagao
original no branqueada (B), polpa do bagao original branqueada (C);
bagao de malte pr-tratado (D), polpa do bagao pr-tratado no
branqueada (E), polpa do bagao pr-tratado branqueada (F)........................... 144
Figura 4.23 - Massa precipitada e remoo de lignina em funo da reduo do pH do

licor alcalino de bagao de malte....................................................................... 146
Figura 4.24 - Efeito da reduo do pH (de 12,56 - amostra 1, para 2,15 - amostra 10) na
cor do licor alcalino de bagao de malte............................................................ 148
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de hidrlise

cida do bagao de malte, em autoclave, sob diferentes condies
operacionais. ........................................................................................................ 44

cida do bagao de malte, em reator, sob diferentes condies operacionais. .... 46
Tabela 3.3 - Composio do meio semidefinido utilizado para crescimento do inculo da

levedura Candida guilliermondii......................................................................... 47

alcalina do resduo do bagao de malte, sob diferentes condies
operacionais. ........................................................................................................ 52

enzimtica da celulose da polpa do bagao de malte, sob diferentes
condies operacionais. ....................................................................................... 54
Tabela 3.6 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de produo de

carvo ativado a partir da lignina do bagao de malte, sob diferentes
Tabela 4.1 - Composio qumica do bagao de malte. ........................................................... 69
Tabela 4.2 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de

degradao (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico
nos hidrolisados hemicelulsicos de bagao de malte obtidos em autoclave
sob diferentes condies operacionais................................................................. 71
Tabela 4.3 - Eficincia de hidrlise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana +

arabinana) durante a hidrlise cida do bagao de malte em autoclave, sob
diferentes condies operacionais. ...................................................................... 72
Tabela 4.4 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de

degradao (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico
nos hidrolisados hemicelulsicos de bagao de malte obtidos em reator sob
Tabela 4.5 - Eficincia de hidrlise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana +

arabinana) durante a hidrlise cida do bagao de malte em reator, sob
Tabela 4.6 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a
concentrao de lignina solubilizada durante a hidrlise cida do bagao de
malte. ................................................................................................................... 80
Tabela 4.7 - Consumo de xilose, crescimento celular e produo de xilitol nos

hidrolisados de bagao de malte produzidos em reator, sob diferentes
Tabela 4.8 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator
de rendimento (YP/S) e produtividade volumtrica em xilitol (QP) obtidos
durante a fermentao do hidrolisado de bagao de malte. ................................. 83
Tabela 4.9 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator
de rendimento em clulas (YX/S) obtido durante a fermentao do hidrolisado
de bagao de malte............................................................................................... 83
Tabela 4.10 - Composio qumica do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte nas

formas diluda (original) e concentrada. .............................................................. 85
Tabela 4.11 - Parmetros fermentativos obtidos durante o cultivo da levedura Candida

guilliermondii em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte e em meio
semidefinido. ....................................................................................................... 87
Tabela 4.12 - Composio dos hidrolisados de bagao de malte empregados como meio
de fermentao para produo de xilitol.............................................................. 91
Tabela 4.13 - Parmetros fermentativos e concentrao final de clulas obtidas durante a

produo de xilitol a partir dos hidrolisados de bagao de malte........................ 93
Tabela 4.14 - Concentrao de alguns compostos fenlicos identificados nos hidrolisados

de bagao de malte............................................................................................... 95
Tabela 4.15 - Composio qumica do bagao de malte nas formas original (BO) e pr-
tratado com cido sulfrico diludo (BPT), massa recuperada e perda de cada
frao aps o pr-tratamento cido...................................................................... 97
Tabela 4.16 - Composio qumica das polpas de bagao de malte e perdas de celulose e
lignina aps o tratamento de hidrlise alcalina sob diferentes condies
operacionais. ........................................................................................................ 99
Tabela 4.17 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e resultados do teste t de
Student, para os teores de celulose e lignina residual nas polpas obtidas a
partir do bagao de malte................................................................................... 100
Tabela 4.18 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus
respectivos R2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de
lignina residual e teor de celulose nas polpas obtidas. ...................................... 101
Tabela 4.19 - Porcentagem de lignina solubilizada e concentrao de cidos fenlicos no

licor obtido a partir da hidrlise alcalina do bagao de malte, sob diferentes
condies operacionais. ..................................................................................... 106
Tabela 4.20 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus
concentrao de cido ferlico e concentrao de cido p-cumrico no licor
alcalino obtido. .................................................................................................. 108
Tabela 4.21 - Rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise

enzimtica do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais............ 111
Tabela 4.22 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student, para o
rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise
enzimtica do bagao malte............................................................................... 112
Tabela 4.23 - Anlise de varincia com erro total e teste da curvatura, para o rendimento
em glicose e rendimento total da hidrlise enzimtica do bagao malte........... 113
Tabela 4.24 - Equaes do modelo para a hidrlise enzimtica do bagao de malte e seus
rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) de hidrlise... 114
Tabela 4.25 - Composio qumica das amostras de bagao de malte empregadas no

processo de hidrlise enzimtica. ...................................................................... 121
Tabela 4.26 - Composio de carboidratos nos hidrolisados enzimticos produzidos a

partir do bagao de malte nas formas original, celulignina e polpa celulsica. 127
Tabela 4.27 - Parmetros fermentativos e concentrao de glicose nos meios de

fermentao para a produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii... 138
Tabela 4.28 - Rendimento e caractersticas das polpas de celulose obtidas por hidrlise
alcalina do bagao de malte nas formas original e pr-tratado com cido
sulfrico diludo................................................................................................. 140
Tabela 4.29 - Volume de cido sulfrico adicionado nas amostras do licor alcalino de
bagao de malte, caracterizao do licor obtido e quantificao da massa de
lignina precipitada. ............................................................................................ 146
Tabela 4.30 - Remoo de metais, cor e compostos fenlicos a partir do hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte, por adsoro nos carves ativados
preparados a partir da lignina............................................................................. 149
Tabela 4.31 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a
remoo de nquel, ferro, cromo e silcio a partir do hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte, por adsoro nos carves ativados
preparados a partir da lignina............................................................................. 150
LISTA DE SIGLAS
ATP Adenosina Trifosfato

CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
MRS Man, Rogosa and Sharpe
UV Ultravioleta
VPSE Variable Pressure Secondary Electron
LISTA DE SMBOLOS
C graus Celsius
beta
p pra
alfa
SUMRIO
1 INTRODUO 19
2 REVISO DA LITERATURA 21
2.1 BAGAO DE MALTE 21

2.1.1 Da cevada ao bagao de malte 21
2.1.2 Caractersticas e aplicaes do bagao de malte 23
2.2 FRACIONAMENTO DA MATRIA-PRIMA LIGNOCELULSICA 26
2.2.1 Hidrlise com cido diludo 27
2.2.2 Hidrlise alcalina 29
2.2.3 Hidrlise enzimtica 30
2.3 PRODUTOS DE INTERESSE COMERCIAL QUE PODEM SER OBTIDOS POR
PROCESSOS BIOTECNOLGICOS A PARTIR DE MATRIAS-PRIMAS
LIGNOCELULSICAS 32
2.3.1 Xilitol 32
2.3.2 cido lctico 34
2.3.3 Carvo ativado 35
2.3.4 cidos fenlicos 36
2.3.5 Polpa de celulose branqueada 38
3 MATERIAIS E MTODOS 40
3.1 CARACTERIZAO QUMICA DO BAGAO DE MALTE E ENSAIOS

PRELIMINARES DE HIDRLISE CIDA EM AUTOCLAVE 41
3.1.1 Determinao do teor de umidade 41
3.1.2 Determinao dos teores de celulose, hemicelulose e lignina 41
3.1.3 Determinao do teor de cinzas 43
3.1.4 Determinao do teor de protenas 43
3.1.5 Determinao do teor de minerais 43
3.1.6 Hidrlise cida em autoclave 43
3.2 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE CIDA EM REATOR
VISANDO A MXIMA LIBERAO DE XILOSE E PRODUO DE XILITOL
A PARTIR DO HIDROLISADO 45
3.2.1 Hidrlise cida em reator 45
3.2.2 Fermentao dos hidrolisados obtidos para produo de xilitol 46
3.2.2.1 Microrganismo e preparo do inculo 46
3.2.2.2 Meio e condies de fermentao 48
3.3 AVALIAO DO COMPORTAMENTO CINTICO DA LEVEDURA Candida
guilliermondii DURANTE A PRODUO DE XILITOL A PARTIR DO
HIDROLISADO HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE DILUDO E
CONCENTRADO 48
3.3.1 Hidrolisado hemicelulsico 48
3.3.2 Microrganismo e preparo do inculo 48
3.3.3 Meios e condies de fermentao 49
3.4 INFLUNCIA DOS COMPOSTOS TXICOS PRESENTES NO HIDROLISADO
HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE NA BIOCONVERSO DE
XILOSE A XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii 49
3.4.1 Hidrolisado hemicelulsico 49
3.4.2 Microrganismo e preparo do inculo 50
3.4.3 Meios e condies de fermentao 50
3.5 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE ALCALINA DO BAGAO
DE MALTE PARA A PRODUO DE POLPA CELULSICA E LIBERAO
DE CIDOS FENLICOS 51
3.6 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE ENZIMTICA DO BAGAO

DE MALTE PARA MXIMA CONVERSO DA CELULOSE EM GLICOSE 52
3.6.1 Enzima 53
3.6.2 Hidrlise enzimtica 53
3.6.3 Efeito da hemicelulose e da lignina na hidrlise enzimtica da celulose do
bagao de malte 55
3.7 PRODUO DE CIDO LCTICO POR Lactobacillus delbrueckii A PARTIR DO
HIDROLISADO CELULSICO DE BAGAO DE MALTE 55
3.7.1 Hidrolisado celulsico 55
3.7.2 Fermentao do hidrolisado celulsico para produo de cido lctico 56
3.7.2.1 Microrganismo e preparo do inculo 56
3.7.2.2 Meios e condies de fermentao 57
3.8 BRANQUEAMENTO DAS POLPAS DE CELULOSE OBTIDAS A PARTIR DO
BAGAO DE MALTE 58
3.8.1 Obteno das polpas de celulose 58
3.8.2 Branqueamento das polpas de celulose 59
3.9 RECUPERAAO DA LIGNINA A PARTIR DO LICOR ALCALINO E SUA
UTILIZAO NA PRODUO DE CARVO ATIVADO 59
3.9.1 Obteno do licor alcalino contendo lignina solvel 59
3.9.2 Precipitao da lignina a partir do licor alcalino 60
3.9.3 Preparo dos carves ativados a partir da lignina 60
3.10 MTODOS ANALTICOS 61
3.10.1 Determinao da concentrao de glicose, xilose, arabinose, celobiose, xilitol,
cido actico e cido lctico 61
3.10.2 Determinao da concentrao de furfural, hidroximetilfurfural e compostos
fenlicos 62
3.10.3 Determinao da concentrao de metais 62
3.10.4 Determinao do pH 62
3.10.5 Determinao da densidade 63
3.10.6 Determinao da cor dos hidrolisados 63
3.10.7 Determinao da concentrao celular da levedura Candida guilliermondii 63
3.10.8 Determinao da concentrao celular da bactria Lactobacillus delbrueckii 63
3.10.9 Determinao dos parmetros do processo fermentativo para a produo de
xilitol 64
cido lctico 64
3.10.11 Determinao do teor de protenas totais presentes no extrato celuloltico 64
3.10.12 Determinao da atividade enzimtica do extrato celuloltico 65
3.10.13 Determinao do nmero kappa das polpas de celulose 65
3.10.14 Determinao da viscosidade das polpas de celulose 66
3.10.15 Determinao da alvura das polpas de celulose 67
3.10.16 Fotomicrografias 67
4 RESULTADOS E DISCUSSO 68

PRELIMINARES DE HIDRLISE CIDA EM AUTOCLAVE 68
4.1.1 Composio qumica do bagao de malte 68
4.1.2 Ensaios preliminares de hidrlise cida do bagao de malte em autoclave 70
4.1.3 Anlise estatstica da hidrlise cida do bagao de malte em autoclave 72
4.2 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE CIDA EM REATOR
VISANDO A MXIMA LIBERAO DE XILOSE E PRODUO DE XILITOL
A PARTIR DO HIDROLISADO 75
4.2.1 Composio qumica dos hidrolisados obtidos 76
4.2.2 Fermentabilidade dos hidrolisados de bagao de malte para produo de
xilitol 80
guilliermondii DURANTE A PRODUO DE XILITOL A PARTIR DO
HIDROLISADO HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE DILUDO E
CONCENTRADO 84
4.3.1 Composio qumica dos hidrolisados utilizados como meio de fermentao 85
4.3.2 Avaliao do crescimento celular da levedura Candida guilliermondii durante
a fermentao dos hidrolisados de bagao de malte 85
4.3.3 Avaliao da produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii
durante a fermentao dos hidrolisados de bagao de malte 88
4.3.4 Efeito da arabinose na produo de xilitol pela levedura Candida
guilliermondii 89
HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE NA BIOCONVERSO DE
XILOSE A XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii 91
4.4.1 Composio qumica dos hidrolisados de bagao de malte 91
4.4.2 Fermentao dos hidrolisados de bagao de malte contendo diferentes
concentraes de compostos txicos 92
DE MALTE PR-TRATADO PARA PRODUO DE POLPA CELULSICA 96
4.5.1 Caractersticas do bagao de malte utilizado nos experimentos 96
4.5.2 Hidrlise alcalina do bagao de malte pr-tratado 97
4.5.3 Anlise estatstica da hidrlise alcalina do bagao de malte 100
4.5.4 Micrografias das polpas de bagao de malte 102
4.5.5 Balano de massa da hidrlise alcalina 104
DE MALTE PR-TRATADO PARA LIBERAO DE CIDOS FENLICOS 104
4.6.1 Liberao de cidos fenlicos durante o pr-tratamento do bagao de malte
com cido sulfrico diludo 105
4.6.2 Liberao de cidos fenlicos durante a hidrlise alcalina do bagao de malte 105
4.6.3 Anlise estatstica para a remoo de cido ferlico e p-cumrico durante a
hidrlise alcalina do bagao de malte 106
4.7 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE ENZIMTICA DO BAGAO
DE MALTE PARA MXIMA CONVERSO DA CELULOSE EM GLICOSE 110
4.7.1 Composio qumica do substrato 110
4.7.2 Anlise estatstica da hidrlise enzimtica do bagao de malte 111
4.7.3 Anlise comparativa da hidrlise enzimtica do bagao de malte com a
hidrlise enzimtica de outros materiais lignocelulsicos 115
4.7.4 Efeito da carga de enzimas na hidrlise enzimtica da celulose do bagao de
malte 118
4.8 EFEITO DA HEMICELULOSE E DA LIGNINA NA HIDRLISE ENZIMTICA
DA CELULOSE DO BAGAO DE MALTE 120
4.8.1 Hidrlise enzimtica do bagao de malte com diferentes composies
qumicas 121
4.8.2 Estrutura morfolgica do bagao de malte aps a hidrlise enzimtica 124
4.8.3 Composio dos hidrolisados celulsicos produzidos 126
4.9 EMPREGO DO HIDROLISADO CELULSICO DE BAGAO DE MALTE COMO
MEIO DE FERMENTAO PARA PRODUO DE CIDO LCTICO 128
4.9.1 Aspectos gerais do processo fermentativo 128
4.9.2 Efeito do nvel de inculo na produo de cido lctico 129
4.10 EFEITO DO PH E DA SUPLEMENTAO NUTRICIONAL DO HIDROLISADO
CELULSICO DE BAGAO DE MALTE NA PRODUO DE CIDO
LCTICO POR Lactobacillus delbrueckii 132
4.10.1 Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico 132
4.10.2 Efeito do pH 136
BAGAO DE MALTE 139
4.11.1 Caractersticas das polpas obtidas 139
4.11.2 Branqueamento das polpas de celulose do bagao de malte 141
4.12 RECUPERAO DA LIGNINA A PARTIR DO LICAR ALCALINO E SUA
UTILIZAO NA PRODUO DE CARVO ATIVADO 145
4.12.1 Influncia do pH na precipitao da lignina a partir do licor alcalino 145
4.12.2 Produo de carvo ativado a partir da lignina e sua utilizao na adsoro de
metais e compostos fenlicos 149
5 CONCLUSES 152
REFERNCIAS 155
ANEXOS 172
ANEXO A Trabalhos que j foram publicados em peridicos cientficos a partir dos
resultados obtidos nesta tese. 172
ANEXO B Recomendaes para trabalhos futuros. 173
19
1 INTRODUO
Atualmente existe uma grande presso poltica e social no que diz respeito reduo da
carga poluente proveniente de atividades industriais. Esta uma preocupao dos rgos
ambientalistas no somente do Brasil, mas de pases do mundo todo. Praticamente todos os
pases, desenvolvidos ou em desenvolvimento, esto procurando se adaptar a esta realidade
modificando os seus processos de forma a reciclar ao mximo todo e qualquer resduo ou
subproduto produzido em suas estaes de processamento. Neste sentido, a maioria das
grandes empresas tem hoje uma viso onde os resduos e os subprodutos no devem mais ser
considerados inutilizveis, mas sim matrias-primas para outras indstrias. Seguindo este
raciocnio, alm de deixarem de ser problema, os resduos e os subprodutos passam a fazer
parte de novas tecnologias para desenvolvimento de produtos de interesse.
No processo de fabricao da cerveja, a gerao de subprodutos inevitvel, sendo o
bagao de malte, o lpulo gasto e a levedura, os mais produzidos. No entanto, como a maioria
destes subprodutos proveniente de matrias-primas agrcolas, eles podem ser reciclados e
reaproveitados. O presente trabalho teve como objetivo o aproveitamento integral do bagao
de malte em processos qumicos e biotecnolgicos. Inicialmente, a matria-prima foi
caracterizada quimicamente e em seguida foram avaliadas diversas condies de
fracionamento visando promover uma separao seletiva de todas as suas fraes polimricas
(celulose, hemicelulose e lignina). Nesta fase foram utilizados os procedimentos de hidrlise
cida (para separao da hemicelulose), hidrlise alcalina (para solubilizao da lignina) e
hidrlise enzimtica (para converso da celulose em glicose). Para cada um destes
procedimentos foi realizado um estudo de otimizao das condies de fracionamento,
empregando variveis previamente selecionadas. Os hidrolisados obtidos nas condies
otimizadas foram utilizados em processos qumicos e biotecnolgicos para produo de
compostos de interesse comercial, tais como: 1. xilitol, produzido por fermentao da xilose a
partir do hidrolisado hemicelulsico, pela levedura Candida guilliermondii; 2. cido lctico,
produzido por fermentao da glicose a partir do hidrolisado celulsico, pela bactria
Lactobacillus delbrueckii; 3. carvo ativado, produzido por ativao qumica da lignina
presente no licor alcalino. Foi tambm avaliada e otimizada a liberao de cidos fenlicos
durante a hidrlise alcalina da lignina, uma vez que estes compostos tambm apresentam
20
interesse comercial. Alm disso, foi ainda realizado um estudo sobre as caractersticas da
polpa de celulose obtida nas condies otimizadas, antes e aps o seu branqueamento com
perxido de hidrognio (tecnologia livre de cloro), para avaliar sua possibilidade de emprego
na produo de papel ou de derivados de celulose.
Este trabalho est inserido no programa de pesquisas do Grupo de Microbiologia
Aplicada e Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de
Lorena, que tem como objetivo o desenvolvimento de tecnologias para o aproveitamento de
resduos e subprodutos agrcolas e agro-industriais, visando a produo de insumos por via
biotecnolgica.
21
2 REVISO DA LITERATURA
2.1 BAGAO DE MALTE
2.1.1 Da cevada ao bagao de malte
A cevada, cereal empregado principalmente como matria-prima para a elaborao de

cervejas, um dos cereais mais importantes mundialmente, ficando atrs apenas do trigo,
milho e arroz (KENDAL, 1994). O Brasil o segundo maior produtor de cevada cervejeira da
Amrica Latina seguido da Argentina, com uma produo anual de 275 mil toneladas
(LIZARAZO; de FRANCISCO, 2003). O gro de cevada (Figura 2.1) rico em amido e
protenas e composto basicamente por trs partes: uma casca externa, um endosperma
amilceo e o germe (embrio). A casca atua como uma proteo externa para o gro e
constituda principalmente de material celulsico, apresentando protenas, resinas e tanino em
menores quantidades (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001).
Figura 2.1 - Gros de cevada.
Antes de ser utilizada no processo cervejeiro, a cevada obtida nos campos submetida a
um processo de maltagem, o qual serve para elevar o contedo enzimtico dos gros. No
entanto, a cevada recm colhida no pode ser diretamente malteada, pois ainda no apresenta
caractersticas adequadas de poder germinativo. Por este motivo, aps a colheita ela mantida
armazenada durante 4 a 6 semanas at atingir a plenitude de seu poder germinativo, o que
comprovado atravs de testes laboratoriais. Aps este tempo, a cevada j pode ser malteada
(TSCHOPE, 2001).
22
O processo de malteao consiste em trs etapas: macerao, germinao e secagem.

Durante a macerao, os gros limpos de cevada so colocados em tanques com gua
(temperatura entre 5 e 18C) onde so mantidos por um perodo de aproximadamente dois
dias, sendo realizadas sucessivas trocas de gua a cada 6 a 8 horas. Aps 2 dias a cevada
atinge um teor de umidade de 42 a 48%. Nesta etapa, o metabolismo da semente ativado
atravs da hidratao, induzindo a germinao. Em seguida, a cevada macerada colocada
para germinar em compartimentos apropriados que permitem a passagem de um fluxo de ar
mido atravs do leito de cevada, mantendo a temperatura dos gros na faixa de 15 a 21C.
Nesta segunda etapa ocorrem mudanas fsico-qumicas e estruturais do gro, sendo formadas
e ativadas as principais enzimas do malte (amilases, proteases, glucanases, entre outras). Ao
trmino da germinao (processo que dura de 6 a 7 dias), o malte de cevada obtido secado
em uma temperatura de 40 a 60C at obter um teor de umidade de 4 a 5%, para evitar a
contaminao microbiana e desenvolver o sabor caracterstico do malte. Em seguida o malte
desidratado armazenado em silos durante 3 a 4 semanas para homogeneizar seu teor de
umidade (LIZARAZO; de FRANCISCO, 2003; TSCHOPE, 2001; VENTURINI FILHO;
CEREDA, 2001).
Nas cervejarias, o malte de cevada modo e em seguida submetido a um processo de
mosturao, onde os gros modos da cevada malteada so misturados com gua e a mistura
obtida aquecida em vrios nveis de temperatura (aumentados lentamente de 37 a 78C).
Este processo tem como objetivo promover a hidrlise enzimtica dos constituintes do malte,
principalmente do amido, que convertido em acares fermentveis (maltose e maltotriose)
e no-fermentveis (dextrinas). Posteriormente, realizada uma filtrao para separar a frao
lquida, denominada mosto, a qual empregada como meio de fermentao para a produo
da cerveja (DRAGONE, 2007; LINKO et al. 1998). A frao slida obtida composta pelo
bagao do malte de cevada. A Figura 2.2, uma representao esquemtica do processo de
obteno do bagao de malte a partir da cevada natural obtida nos campos.
Segundo Townsley (1979), o processo cervejeiro seletivo e remove a partir da cevada
malteada somente os nutrientes que so necessrios para a fabricao do mosto. O bagao
obtido do malte de cevada pode ser proveniente somente da matria-prima empregada (malte
de cevada), ou da matria-prima e de adjuntos (arroz ou milho) que podem ser incorporados
ao processo durante a mosturao. A adio de adjuntos feita dependendo do tipo de
processo cervejeiro utilizado e do tipo de cerveja que se deseja produzir (REINOLD, 1997).
23
CEVADA
gua Macerao
(5 a 18C) / 48 h
PROCESSO DE
Germinao MALTAGEM
Secagem
Ar mido
(15 a 21C) / 6 a 7 dias
Armazenamento
MALTE DE CEVADA
Moagem
gua / Mosturao
aquecimento
Frao lquida PROCESSO
Filtrao CERVEJEIRO
Mosto
Frao slida
BAGAO DE MALTE
Figura 2.2 - Representao esquemtica do processo de obteno do bagao de malte a partir da

cevada natural.
2.1.2 Caractersticas e aplicaes do bagao de malte
O bagao de malte consiste basicamente da casca do gro de cevada obtida aps a

elaborao do mosto cervejeiro (Figura 2.3). Por esta razo, sua composio qumica pode
variar de acordo com o tipo de cevada utilizada e o seu tempo de colheita, as condies de
malteao e mosturao a que esta foi submetida e tambm com a qualidade e o tipo de
adjuntos adicionados ao processo cervejeiro (HUIGE, 1994; SANTOS et al., 2003).
24
Figura 2.3 - Bagao de malte.
Embora sua composio qumica possa sofrer pequenas variaes, o bagao de malte
um material lignocelulsico rico em protenas e fibras, fraes que correspondem a
aproximadamente 20-30% e 70-80% de sua composio, respectivamente (HERNNDEZ et
al., 1999). A estrutura fibrosa deste material pode ser facilmente visualizada na Figura 2.4.
Hemicelulose, celulose e lignina so os principais componentes destas fibras (REINOLD,
1997). Alm de fibras e protenas, o bagao de malte tambm apresenta em sua composio,
lipdeos e cinzas (SANTOS et al., 2003), minerais, vitaminas e aminocidos (HUIGE, 1994).
De acordo com Kunze (1996), 25% dos minerais presentes no bagao de malte encontram-se
na forma de silicatos. Na Figura 2.4, os pontos brilhantes presentes na parte externa do
material correspondem a estes compostos. Nota-se, portanto a presena de grandes
quantidades de silicatos na estrutura do bagao de malte.
A B
Figura 2.4 - Microscopia eletrnica de varredura de partculas do bagao de malte. (A) Ampliao de
100 vezes; (B) Ampliao de 300 vezes.
25
O bagao de malte o mais importante subproduto proveniente da indstria cervejeira,

representando aproximadamente 85% do total de subprodutos gerados (REINOLD, 1997).
Segundo Townsley (1979), o bagao de malte corresponde em mdia por 31% do peso do
malte original e sua gerao da ordem de 20 kg/ hl de cerveja produzida (REINOLD, 1997).
Considerando essa relao e sabendo que a produo de cervejas no Brasil no ano de 2006 foi
de 9,5 bilhes de litros (DRAGONE, 2007), possvel estimar que somente no ano passado, a
produo de bagao de malte no Brasil foi de cerca de 1,9 milhes de toneladas.
Apesar de ser obtido em grandes quantidades durante o ano todo e apresentar uma
composio qumica rica em carboidratos e protenas, entre outros compostos, o bagao de
malte muito pouco reaproveitado sendo seu principal emprego (mido ou seco) como rao
para animais, devido ao elevado teor de protenas e fibras (REINOLD, 1997). Alguns estudos
avaliaram a adio deste material na alimentao humana, na manufatura de pes, biscoitos e
petiscos (BARTOLOM et al., 2002; ZTRK et al., 2002; SANTOS et al., 2003), tendo
chegado s seguintes concluses: 1. o bagao de malte na forma em que produzido nas
cervejarias, apresenta uma granulometria grosseira para adio direta em alimentos, devendo
ser primeiramente processado para fornecer farinhas; 2. como as protenas do bagao de malte
mido liberam uma colorao marrom clara, o bagao s pode ser usado na formulao de
produtos que no so brancos, como bolos, pes e alguns cookies; 3. sua adio em alimentos
deve ser feita em pequenas quantidades (5 a 15%), pois grandes quantidades provocam
alterao no sabor, no aroma e nas propriedades fsicas do produto final, como por exemplo,
na cor e na textura (MIRANDA; GROSSMANN; NABESHIMA, 1994; TOWNSLEY, 1979).
Alguns trabalhos tm avaliado tambm a possibilidade de emprego do bagao de malte
em processos biotecnolgicos como substrato para cultivo de microrganismos ou para a
produo de enzimas. Wang, Sakoda e Suzuki (2001), encontraram uma boa eficincia
biolgica e valor nutricional do fungo Pleurotus ostreatus quando cultivado em bagao de
malte e consideraram este material como um dos melhores substratos para cultivo desta
espcie de fungo. De acordo com Townsley (1979), o bagao de malte favorece o crescimento
de fungos devido ao seu elevado teor de protenas. No entanto, Wang, Sakoda e Suzuki
(2001) consideram que o crescimento destes microrganismos em bagao de malte
favorecido no somente pelo elevado teor de protenas e umidade deste material, mas tambm
devido a algumas propriedades fsicas, como o tamanho de partcula, densidade, porosidade e
capacidade de reteno de gua. Quando utilizado como substrato para produo de enzimas,
o bagao de malte mostrou-se como uma excelente fonte de nitrognio e energia para
26
produo de alpha-amylase por Bacillus subtilis (DUVNJAK; BUDIMIR; SUSKOVIC, 1983)

ou Aspergillus oryzae (FRANCIS et al., 2003), xilanase por Aspergillus awamori
(BHUMIBHAMON, 1978) ou Streptomyces isoladas do cerrado brasileiro (NASCIMENTO
et al., 2002) e ferulosil esterase por Streptomyces avermitilis (BARTOLOM et al., 2003).
Dragone (2007) e Brnyik et al. (2004) utilizaram o bagao de malte como suporte para
a imobilizao das leveduras no processo de produo de cerveja e concluram que este
material uma alternativa promissora para a imobilizao destes microrganismos quando
comparado com outros suportes encontrados comercialmente, pois alm da capacidade de
imobilizao de clulas, apresenta vantagens do ponto de vista econmico e simplicidade de
preparao.
A extrao de compostos de interesse comercial por processamento hidroltico ou
enzimtico do bagao de malte tambm tem sido avaliada. Kabel et al. (2002) e Carvalheiro et
al. (2004b) obtiveram vrias misturas de oligossacardeos com diferentes pesos moleculares,
quando submeteram o bagao de malte a um tratamento hidrotrmico. A hidrlise deste
material com cido sulfrico diludo proporcionou a liberao de acares, principalmente
xilose e arabinose (CARVALHEIRO et al., 2004a), enquanto que por tratamento enzimtico
j foram obtidos acares (glicose, xilose) e cidos hidroxicinmicos (ferlico e p-cumrico)
(BARTOLOM et al., 2002; BELDMAN; HENNEKAM; VORAGEN, 1987; KHAN;
LAMB; SCHNEIDER, 1988).
A possibilidade de emprego do bagao de malte em processos de bioconverso tem sido
muito pouco explorada. Carvalheiro et al. (2004a) hidrolisaram o bagao de malte com cido
diludo e verificaram que o hidrolisado produzido, rico em acares, proporcionou elevados
rendimentos em biomassa quando fermentado pela levedura Debaryomyces hansenii. A
produo de xilitol e arabitol a partir deste hidrolisado tambm foi avaliada por Carvalheiro et
al. (2005), que concluram que este hidrolisado apresenta caractersticas favorveis para uso
na produo de xilitol.
2.2 FRACIONAMENTO DA MATRIA-PRIMA LIGNOCELULSICA
A utilizao biotecnolgica dos diferentes componentes passveis de serem obtidos a

partir dos materiais lignocelulsicos, requer uma separao seletiva dos mesmos, uma vez que
a estrutura complexa da lignocelulose em plantas atua como uma barreira que as protege do
27
ataque de bactrias e fungos. Por isso, para que se possa aproveitar integralmente o bagao de
malte, necessrio primeiramente submet-lo a tratamentos de fracionamento, capazes de
promover uma separao seletiva de seus componentes polimricos (celulose, hemicelulose e
lignina).
A separao dos principais componentes dos materiais lignocelulsicos pode ser
realizada atravs de diferentes tcnicas de fracionamento, as quais incluem tratamentos
trmicos, qumicos, fsicos, biolgicos, ou uma combinao entre estes. A escolha do
tratamento deve ser feita em funo do grau de separao requerido e da finalidade do
processo. No entanto, para que o processo seja economicamente vantajoso, o tratamento
empregado deve ser eficiente do ponto de vista energtico e qumico, e deve promover ou
proporcionar a converso efetiva do carboidrato de interesse, para que se obtenha um produto
final com alto rendimento. Logo, a degradao ou a perda de carboidratos deve ser evitada,
bem como a formao de compostos inibidores do metabolismo celular ou da ao de enzimas
usadas nos processos de converso da biomassa (McMILLAN, 1994).
Apesar de existirem vrios mtodos de tratamento, os processos de hidrlise com cido
diludo, hidrlise alcalina e hidrlise enzimtica so as tcnicas mais empregadas para
fracionamento dos materiais lignocelulsicos em geral.
2.2.1 Hidrlise com cido diludo
A hidrlise com cido diludo um dos processos mais utilizados para separao da
hemicelulose (heteropolmero composto por pentoses e hexoses, cujo acar principal a
xilose) da biomassa lignocelulsica. Baseia-se em uma tcnica realizada normalmente em
temperaturas entre 120 e 200C, com a adio de pequenas quantidades de cidos minerais
como H2SO4 ou HCl (PALMQVIST; HAHN-HGERDAL, 2000).
Neste processo de hidrlise, o cido empregado libera prtons que rompem as ligaes
ter entre os acares existentes na cadeia polimrica formada pela hemicelulose e a celulose.
O rompimento destas ligaes promove a liberao de vrios compostos, principalmente
xilose, arabinose e glicose (AGUILAR et al., 2002). Segundo McMillan (1994) a hidrlise
completa da hemicelulose ocorre entre 5 a 10 minutos para uma temperatura de 160C, ou
entre 30 a 60 minutos para uma temperatura de 140C. Temperaturas mais elevadas (acima de
200C) favorecem a hidrlise da celulose. Devido estrutura ramificada das xilanas e ao seu
grau de cristalinidade ser inferior ao da celulose, as ligaes glicosdicas entre os monmeros
28
de D-xilose na hemicelulose so menos estveis que as ligaes glicosdicas entre os

monmeros de D-glicose na celulose. Como conseqncia, as pentoses so facilmente
extradas do material lignocelulsico atravs desta tcnica de hidrlise.
No entanto, alm de acares, a hidrlise cida tambm promove a liberao de outros
compostos no meio reacional, tais como o cido actico e compostos provenientes da
degradao dos acares (furfural e hidroximetilfurfural) e da lignina (fenlicos e aromticos)
(AGUILAR et al., 2002; NEUREITER et al., 2002; TLLEZ-LUIS; RAMREZ; VZQUEZ,
2002). De acordo com Curreli et al. (2002) a formao de produtos de degradao o
principal problema encontrado quando os materiais lignocelulsicos so tratados com cidos
minerais. Um hidrolisado com elevado rendimento em produtos de degradao apresentar
um baixo rendimento na recuperao de acares. Alm disso, como o cido actico e os
produtos de degradao atuam como inibidores do microrganismo em processos
fermentativos, necessrio obter hidrolisados com baixas concentraes destes compostos, o
que requer ento um estudo para otimizao das condies operacionais a serem empregadas
(MUSSATTO; ROBERTO, 2004a).
Matos (2001) otimizou as condies de hidrlise cida do bagao de cana-de-acar e
obteve a mxima recuperao de xilose (22,71 g/l) empregando uma concentrao de cido
sulfrico de 130 mg/g de matria seca, durante 30 minutos de reao. Canilha (2002) avaliou
o efeito da temperatura, concentrao de cido sulfrico, tempo de reao e relao
slido:lquido no processo de hidrlise cida da palha de trigo e observou que a temperatura e
a concentrao de cido exerceram grande influncia na recuperao de xilose. Nas condies
otimizadas por este autor (140C, H2SO4 1%, 20 minutos e relao slido:lquido de 1:15 g:g),
foram obtidas 15,33 g/l de xilose. Roberto, Mussatto e Rodrigues (2003) otimizaram as
condies de hidrlise cida da palha de arroz e atingiram um rendimento em xilose de 77%
quando a reao foi realizada com uma soluo de cido sulfrico 1%, durante 27 minutos.
De uma forma geral, a hidrlise com cido diludo considerada uma tcnica vantajosa,
pois promove elevados rendimentos em acares com baixa formao de produtos de
degradao (PALMQVIST; HAHN-HGERDAL, 2000). Alm disso, o uso de reagentes
diludos e temperatura de reao relativamente baixa fazem desta tcnica de hidrlise uma
tecnologia barata e pouco agressiva ao meio ambiente (CURRELI et al., 2002).
29
2.2.2 Hidrlise alcalina
A lignina uma macromolcula polifenlica que pode ser facilmente solubilizada

atravs da tcnica de hidrlise alcalina empregando hidrxido de sdio como agente qumico.
De acordo com Gonalves, Schuchardt e Corra (1997), o uso de reagentes alcalinos e
temperaturas elevadas causa uma srie de reaes de clivagem das ligaes tipo ter entre as
unidades de fenilpropano, as quais promovem a dissoluo da lignina. Sun e Cheng (2002)
reportaram que o tratamento de materiais lignocelulsicos com NaOH diludo promove um
inchamento do material, aumentando sua rea superficial interna e diminuindo seu grau de
polimerizao e cristalinidade. Este tratamento promove ainda a separao das estruturas da
lignina e dos carboidratos, sendo que a estrutura da lignina, alm de separada tambm
rompida e solubilizada, restando uma polpa rica em celulose como material slido residual.
A hidrlise alcalina considerada muito til para a deslignificao de matrias-primas
vegetais e plantas fibrosas em geral, sendo um dos processos mais antigos utilizados para
obteno de polpa celulsica (FOELKEL; BARRICHELO, 1975), porm ainda hoje muito
empregado em inmeras indstrias de celulose e papel, de pequeno e mdio porte. Quando
comparado com outros mtodos de polpao comumente utilizados (mtodos Kraft e sulfito),
a hidrlise alcalina, tambm denominada como polpao soda, apresenta a vantagem de
causar um menor impacto ambiental, pois no requer o uso de agentes sulfurados (IGLESIAS
et al., 1996; XIAO; SUN; SUN, 2001).
Segundo Fengel e Wegener (1989) a solubilizao da lignina e a qualidade da polpa
celulsica obtida por hidrlise alcalina de materiais lignocelulsicos, varia de acordo com a
matria-prima utilizada e com as condies de processo empregadas, tais como a relao
slido:lquido, o tempo de reao, a temperatura e a concentrao de NaOH, sendo este ltimo
considerado como o fator de maior influncia na dissoluo da lignina. Por esta razo, as
condies timas de hidrlise alcalina devem ser estabelecidas para cada matria-prima
utilizada. Silva, Rocha e Moura (1990) avaliaram a hidrlise alcalina do bagao de cana-de-
acar com concentraes de NaOH variando de 0,25 a 1% e tempos de reao de 5 a
120 minutos e observaram que, para as mximas condies empregadas (1% NaOH, 120
minutos) o contedo de lignina solubilizada foi de 97,16%. Balcz e Rocha (2002)
conseguiram solubilizar 95% da lignina existente no bagao de cana-de-acar pr-tratado em
meio cido, empregando um processo de hidrlise com soluo de NaOH 1,5%, a 100C,
durante 1 h. Segundo estes autores, quando a concentrao de NaOH empregada foi reduzida
30
para 1%, a porcentagem de lignina solubilizada foi diminuiu para 89%.
2.2.3 Hidrlise enzimtica
Enzimas produzidas por uma variedade de microrganismos (bactrias e fungos) so

capazes de romper a estrutura dos materiais lignocelulsicos, liberando os acares no meio
reacional. Este processo de hidrlise enzimtica, tambm denominado sacarificao, tem sido
normalmente empregado para liberao dos acares da frao celulsica (polmero linear de
unidades de glicose unidas por ligaes do tipo -(14)) dos materiais, apresentando bons
resultados. Contudo, antes de ser hidrolisada enzimaticamente, a matria-prima normalmente
necessita ser submetida a uma etapa prvia de tratamento, a qual tem por objetivo promover a
abertura da estrutura lignocelulsica (atravs da remoo da hemicelulose e da lignina),
aumentando sua porosidade e facilitando o acesso das enzimas celulolticas celulose (CAO;
TAN, 2002; SUN; CHENG, 2002). O pr-tratamento pode ser fsico (ex. moagem), fsico-
qumico (ex. exploso a vapor, com amnia ou com CO2), qumico (ex. hidrlise com cido
diludo, hidrlise alcalina, ozonlise) ou biolgico (empregando microrganismos para
degradar o material) (SUN; CHENG, 2002).
As enzimas celulolticas incluem a -1-4-endoglucanase (endoglucanase, EC 3.2.1.4),
-1-4-exoglucanase (celobiohidrolase, EC 3.2.1.91), e -glucosidase (celobiase, EC 3.2.1.21),
que atuam sinergisticamente rompendo a estrutura da celulose em glicose (BELDMAN;
HENNEKAM; VORAGEN, 1987; CAO; TAN, 2002). Uma representao esquemtica da
ao destas trs classes de enzimas na estrutura da celulose, mostrada na Figura 2.5.
As endoglucanases so enzimas que atuam randomicamente ao longo da molcula de
celulose, degradando as regies amorfas e clivando as ligaes -14-glicosdicas,
promovendo, desta forma, um decrscimo significativo em seu grau de polimerizao com
pouca liberao de acares redutores. As exoglucanases atuam nas regies terminais da
molcula de celulose, hidrolisando ambas as regies amorfas e cristalinas e promovendo sua
despolimerizao gradativa atravs da remoo de unidades de celobiose terminais. As
enzimas endoglucanases e exoglucanases geram glicose e principalmente celobiose como
produtos de reao. Finalmente, as glucosidases hidrolisam a celobiose em monmeros de
glicose. Estas trs classes de enzimas, individualmente, acarretam alteraes bastante
diferenciadas na estrutura da celulose e por apresentarem propriedades complementares,
31
descrevem um alto grau de sinergismo durante a hidrlise da celulose (CAO; TAN, 2002; van
WYK, 1998).
P o lis s a c a r d e o s m e n o r e s
e n d o g lu c a n a se
lig a e s B (1 -4 )
CELULOSE
lig a e s B (1 -4 )
e x o g lu c a n a s e
lig a e s B (1 -4 )
g lu c o sid a se
C E L O B IO S E
G L IC O S E
Figura 2.5 - Representao esquemtica da ao das enzimas celulolticas na estrutura da celulose.
Para que ocorra a hidrlise enzimtica da celulose necessrio primeiramente que haja
a difuso das enzimas no lquido e posterior transferncia destas para a superfcie do material,
formando ento o complexo enzima-celulose (CAO; TAN, 2002). A adsoro das enzimas na
superfcie da celulose caracteriza o primeiro estgio do processo de hidrlise, ocorrendo em
seguida a biodegradao da celulose em acares fermentveis e finalmente a dessoro da
celulase (SUN; CHENG, 2002). Durante o processo, as enzimas podem sofrer uma perda
progressiva de sua atividade cataltica, devido a fatores como: (a) inibio devido ao acmulo
do produto final de hidrlise no meio reacional (glicose e celobiose); (b) inativao ou
desnaturao devido ao efeito prolongado da temperatura e da agitao; (c) ocorrncia de uma
adsoro no especfica e/ou no produtiva de um ou mais componentes enzimticos sobre o
material (RAMOS; SADDLER, 1994). Alm disso, as variveis operacionais (pH, agitao,
temperatura, tempo de reao, concentrao de enzimas, concentrao de substrato) utilizadas
tambm podem interferir na eficincia do processo de hidrlise, inibindo ou acelerando a
velocidade da reao (KAYA; HEITMANN; JOYE, 2000). Segundo Aguiar e Menezes
(2002), a relao celulase/bagao apresentou grande influncia na hidrlise enzimtica do
32
bagao de cana-de-acar e a presena da enzima -glucosidase potencializou a hidrlise da

celulose. Kaur, Arneja e Singh (1998) avaliaram a hidrlise enzimtica da palha de arroz e
otimizaram as condies de reao (para uma mxima liberao de acares redutores) como
sendo baseadas no uso de uma concentrao de substrato de 4% p/v, pH 5,0, temperatura de
50C, concentrao de enzima de 25 FPU/g de substrato e tempo de reao de 48 h. De uma
forma geral, o processo de hidrlise enzimtica considerado interessante, pois proporciona
elevado rendimento e gera produtos mais puros e com baixo poder inibitrio (SUN; CHENG,
2002).
2.3 PRODUTOS DE INTERESSE COMERCIAL QUE PODEM SER OBTIDOS POR

PROCESSOS BIOTECNOLGICOS A PARTIR DE MATRIAS-PRIMAS
LIGNOCELULSICAS
2.3.1 Xilitol
O xilitol um polilcool de frmula estrutural C5H12O5, com aparncia de um p branco

cristalino, inodoro e de valor calrico igual a 2,4 kcal/g. Por apresentar um poder adoante
similar ao da sacarose e possuir importantes propriedades fsico-qumicas e fisiolgicas, o
xilitol considerado como um produto com potencial para aplicaes em diversos setores
industriais, como por exemplo, na manufatura de alimentos, produtos farmacuticos e
cosmticos (BAR, 1991). O xilitol considerado ainda como um adoante perfeitamente
capaz de substituir com vantagens a sacarose, pois alm de poder adoante apresenta
propriedade anticariognica e possui vrias aplicaes clnicas que o indicam no tratamento
de pessoas com diabetes, desordem no metabolismo de lipdeos, leses renais e parenterais, na
preveno de otite, infeces pulmonares e osteoporose (MUSSATTO; ROBERTO, 2002).
Na natureza, o xilitol pode ser encontrado em frutas, vegetais e cogumelos. Entretanto,
sua extrao diretamente de fontes naturais um processo antieconmico e impraticvel, uma
vez que o xilitol encontrado apenas em pequenas quantidades (menos que 900 mg/ 100 g)
(PARAJ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998a). Uma alternativa extrao do xilitol
diretamente de suas fontes naturais, a sua obteno pela hidrogenao da D-xilose presente
na frao hemicelulsica da matria vegetal, o que pode ser realizado por via qumica
33
(empregando agentes qumicos como catalisadores) ou por via biotecnolgica (utilizando

microrganismos como catalisadores do processo de reduo).
O processo qumico atualmente utilizado para a produo de xilitol em escala
industrial. Esse processo inclui cinco etapas: 1. hidrlise cida do material natural rico em
xilana; 2. purificao do hidrolisado at obter uma soluo de xilose pura; 3. hidrogenao
cataltica da xilose pura a xilitol, com uso de um catalisador (liga Ni-Al2O3); 4. purificao da
soluo de xilitol obtida; 5. cristalizao do xilitol (MELAJA; HMLINEN, 1977). De
acordo com alguns autores, o custo envolvido na produo de xilitol pela via qumica
relativamente alto, pois este processo requer um grande aporte energtico devido ao uso de
elevada presso (at 50 atm) e temperatura (80-140C), utiliza um catalisador de alto custo e
necessita de vrias etapas para purificao da soluo de xilose. Alm disso, o xilitol obtido
com um rendimento da ordem de 50-60% (PARAJ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998a;
SAHA, 2003).
Uma alternativa interessante ao processo qumico de produo de xilitol a obteno
por processo biotecnolgico, a qual apresenta um menor impacto ambiental e requer um
menor consumo de energia (KIM et al., 2004). Dentre os microrganismos estudados para esta
bioconverso, as leveduras, especialmente as do gnero Candida, so consideradas as
melhores produtoras e por isso tem sido amplamente empregadas neste processo (BARBOSA
et al., 1988).
A produo de xilitol por via biotecnolgica influenciada por vrios fatores, os quais
incluem o tipo e a concentrao inicial de substrato, o nvel e a idade do inculo, o pH, a
temperatura e a demanda de oxignio (PARAJ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998b;
WINKELHAUSEN; KUZMANOVA, 1998). Porm, quando hidrolisados hemicelulsicos
so utilizados como meio de fermentao, existe ainda um outro fator capaz de interferir no
desempenho do processo de bioconverso: a presena de compostos provenientes da
degradao dos acares ou da lignina, os quais podem ser txicos ao microrganismo
dependendo da concentrao em que se encontram no meio de fermentao (MUSSATTO;
ROBERTO, 2004a). A concentrao mxima de cada um destes compostos que pode estar
presente no meio de fermentao varia de acordo com a espcie de microrganismo utilizada e
o seu grau de adaptao ao meio, o tipo de processo fermentativo empregado e a presena
simultnea de vrios inibidores, que pode proporcionar um efeito sinergstico (PARAJ;
DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998b). Hidrolisados hemicelulsicos obtidos a partir de
diferentes matrias-primas podem ser utilizados como meio de fermentao para a produo
34
biotecnolgica de xilitol, porm, por apresentarem composies qumicas diferentes, cada um

deles requer um estudo que defina as condies mais adequadas para realizao deste
bioprocesso (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a).
2.3.2 cido lctico
cido lctico o nome comercial do cido 2-hidrxi-propanico, cuja frmula

estrutural C3H6O3. Com a aparncia de um lquido incolor, inodoro e viscoso, o cido
lctico considerado o mais importante cido orgnico existente, apresentando numerosas
aplicaes como regulador de pH, conservante, agente tamponante ou solvente, nas indstrias
de alimentos, qumicos, frmacos, couros e tecidos (HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL,
2000; PARAJ; ALONSO; SANTOS, 1996). Recentemente, este composto tambm tem
recebido grande ateno como matria-prima para a manufatura de plsticos biodegradveis,
os quais so alternativas menos agressivas ao meio ambiente do que os plsticos obtidos a
partir de materiais petroqumicos (JIN; HUANG; LANT, 2003). Devido a todas estas
aplicaes, a produo de cido lctico que corresponde atualmente a um mercado superior a
100.000 toneladas/ano est prevista em aumentar ainda cerca de 15% com a possibilidade de
produo de plsticos biodegradveis (IDRIS; SUZANA, 2006). Todo este aumento na
demanda de produo gera um grande interesse em encontrar mtodos alternativos para
produzir cido lctico com o menor custo possvel.
Industrialmente, a produo de cido lctico pode ser feita por processo qumico ou
biotecnolgico. A sntese qumica baseia-se principalmente na hidrlise da lactonitrila por
cidos fortes. No entanto, outras rotas tambm podem ser utilizadas para obteno deste
cido, tais como a degradao de acares catalisada por bases, oxidao de propilenoglicol,
hidrlise do cido cloropropinico, reao de acetaldedo, monxido de carbono e gua sob
elevada temperatura e presso (DATTA et al., 1995; JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY,
2007). Por outro lado, o processo biotecnolgico utilizado para a produo de cido lctico
baseia-se na bioconverso de uma soluo de acares (a qual pode conter como fonte de
carbono, glicose, frutose, sacarose ou lactose) por bactrias (HOFVENDAHL; HAHN-
HGERDAL, 2000). Segundo John, Nampoothiri e Pandey (2007) a produo biotecnolgica
de cido lctico apresenta vrias vantagens quando comparada sntese qumica, tais como
baixo custo do substrato, uso de temperaturas mais brandas e menor consumo de energia.
Alm disso, a produo de cido lctico por processo fermentativo tem tambm aumentado o
35
seu mercado, principalmente na indstria de alimentos, devido preferncia dos

consumidores por produtos de origem natural (MOLDES; ALONSO; PARAJ, 1999).
De acordo com John, Nampoothiri e Pandey (2006) um dos principais problemas
relacionados com a produo biotecnolgica de cido lctico em larga escala, o custo da
matria-prima utilizada. Vrios substratos podem ser utilizados como fonte de carbono neste
processo, os quais incluem glicose, sacarose, lactose, maltose, manose, xilose e galactose. O
uso de resduos agro-industriais em substituio a estas fontes de carbono pode ser uma
alternativa interessante, devido a grande disponibilidade e aos baixos custos com que eles
podem ser obtidos (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2006; TANAKA et al., 2006).
Paraj, Alonso e Santos (1996) produziram cido lctico a partir dos hidrolisados de madeira
de eucalipto e madeira de pinus, empregando a espcie Lactobacillus delbrueckii como
microrganismo e encontraram uma produtividade volumtrica de 2,74 g/l.h em 14 h de
processo, a partir de uma concentrao inicial de substrato de aproximadamente 37 g/l.
Richter e Berthold (1998) produziram cido lctico com um rendimento de 94%, empregando
como matria-prima o talo de sorgo e o gro de centeio e a espcie Lactobacillus paracasei
como microrganismo.
Assim como a produo de xilitol, a produo de cido lctico por microrganismos
tambm influenciada pelas condies experimentais utilizadas, tais como pH, agitao,
temperatura, fonte de carbono, composio do meio de fermentao, carga e idade do inculo,
aerao, concentrao inicial de acar e forma de conduo do processo (contnuo,
semicontnuo ou descontnuo) (BAI et al., 2003; HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL,
2000; SILVA; MANCILHA, 1991). Conhecer o efeito destas variveis e estabelecer as
melhores condies de processo de grande importncia para se obter elevados rendimentos e
produtividades.
2.3.3 Carvo ativado
Durante a hidrlise alcalina dos materiais lignocelulsicos, a lignina dissolvida

podendo ser separada na forma de um licor negro que representa o efluente do processo
(FENGEL; WEGENER, 1989). Este licor contm uma srie de compostos que so txicos e
precisam ser removidos antes da descarga deste efluente ao meio ambiente (KARAM;
NICELL, 1997). Com o objetivo de diminuir o impacto ambiental, as indstrias de polpa e
papel normalmente queimam a lignina dissolvida no licor negro para gerao de energia.
36
Entretanto, a lignina pode ser utilizada como matria-prima para a obteno de vrios
produtos de interesse comercial, tais como carvo ativado, vanilina, fenis, benzeno,
fertilizantes, polmeros, agentes dispersantes, emulsificantes e quelantes, antioxidantes,
adesivos, entre outros (GARGULAK; LEBO, 2000). Normalmente a lignina isolada do licor
negro por precipitao com cido sulfrico ou clordrico, seguido por uma etapa de filtrao e
lavagem com gua para eliminao do lcali residual (SANTOS; CURVELO, 2001).
A lignina, por si s, j apresenta poder adsorvente com capacidade de remover corantes,
surfactantes, pesticidas, fenis e metais, tais como chumbo, cobre, zinco, cdmio, mercrio e
cromo. Porm, quando transformada em carvo ativado, sua capacidade de adsoro de
compostos aumentada. A transformao da lignina em carvo pode ser feita por ativao
fsica ou qumica. A ativao fsica um processo realizado em duas etapas onde o material
inicialmente carbonizado a 600-900C e em seguida ativado em presena de um gs oxidante
(por ex. CO2) a 600-1200C. Na ativao qumica, a lignina impregnada com um agente
qumico (H3PO4, KOH ou NaOH) e aquecida em atmosfera inerte a 450-900C, quando os
processos de carbonizao e ativao ocorrem simultaneamente (SUHAS; CARROTT;
RIBEIRO CARROTT, 2007). Segundo Guo e Rockstraw (2006), a ativao qumica mais
amplamente utilizada do que a ativao fsica, pois requer uma menor temperatura e
proporciona um maior rendimento do produto. Dentre os agentes qumicos que podem ser
empregados nesta tcnica, o cido fosfrico destaca-se como sendo o mais utilizado, devido a
questes econmicas e ambientais, uma vez que ele requer baixas temperaturas de ativao
(aprox. 400-500C) e pode ser recuperado ao final do processo (HSISIHENG; TIEN-SHENG;
LI-YEH, 1998; DIAO; WALAWENDER; FAN, 2002).
As caractersticas dos carves obtidos por ativao qumica da lignina, tais como rea
superficial e distribuio do tamanho dos poros (micro, meso e macroporos) interferem na sua
capacidade de adsoro e podem variar de acordo com as condies de temperatura, tempo de
carbonizao, tipo de agente qumico, relao agente/lignina e tempo de impregnao,
utilizadas no processo de ativao (SUHAS; CARROTT; RIBEIRO CARROTT, 2007).
2.3.4 cidos fenlicos
Alm da produo de polpa de celulose, a hidrlise alcalina de materiais

lignocelulsicos tambm fornece uma srie de compostos fenlicos de interesse comercial
provenientes da solubilizao da lignina, uma vez que esta uma macromolcula polifenlica
37
(Figura 2.6). Tais compostos incluem a vanilina e uma srie de cidos fenlicos, dentre estes
os cidos ferlico, p-cumrico, p-hidroxibenzico, vanlico, sirngico, entre outros, os quais
apresentam uma srie de possveis aplicaes, podendo ser convertidos quimicamente a teres
de arila (usados como aditivo para gasolina), solventes e cidos orgnicos (FENGEL;
WEGENER, 1989) e por bioconverso, a vanilina (LESAGE-MEESEN et al., 1996).
Figura 2.6 - Estrutura da lignina proposta por ADLER (1977).
O cido ferlico, por exemplo, considerado como um dos mais importantes cidos
fenlicos existentes, pois apresenta ao anti-oxidante, anti-inflamatria, anti-microbiana,
anti-trombose e anti-cncer (OU; KWOK, 2004). Devido a todas estas propriedades, ele tem
recebido grande ateno para aplicao nas indstrias farmacutica, cosmtica e alimentcia
(KROON; WILLIAMSON, 1999). O cido p-cumrico tambm outro cido fenlico de
grande interesse devido a suas propriedades anti-oxidantes (TORRES y TORRES;
ROSAZZA, 2001). Alm disso, ambos cidos podem ser utilizados como precursores para a
produo de compostos naturais aromticos de valor agregado.
38
A possibilidade de se obter compostos fenlicos (principalmente cidos fenlicos e

vanilina) a partir de matrias-primas de baixo custo, como os materiais lignocelulsicos, tem
estimulado as pesquisas nesta rea. Diversas matrias-primas j foram avaliadas para esta
finalidade, incluindo a madeira de eucalipto, farelo de cevada, fibras de aveia, sabugo e
folhagem de milho (CRUZ et al., 1999, 2001; GONZLES et al., 2004; LEHTINEN;
LAAKSO, 1998).
2.3.5 Polpa de celulose branqueada
No mundo todo, aproximadamente 95% das matrias-primas utilizadas pela indstria

papeleira para obteno de polpa celulsica so madeiras (JIMNEZ et al., 2005). No entanto,
vrias vantagens tm sido mencionadas sobre a produo de polpas a partir de resduos
agrcolas, as quais incluem uma fcil capacidade de polpao, obteno de fibras de excelente
qualidade para tipos especiais de papel e obteno de uma polpa branqueada de alta qualidade
(LPEZ et al., 2000; NAVAEE-ARDEH; MOHAMMADI-ROVSHANDEH; POURJOOZI,
2004). Alm disso, o aumento do consumo e da produo de papel durante a ltima dcada
(50% de aumento) tem despertado um grande interesse em se utilizar resduos agrcolas para
esta finalidade. Atualmente, estes resduos esto gradualmente substituindo a madeira na
produo de polpa e papel, por razes econmicas e ambientais (LOPEZ et al., 2001, 2003).
Segundo Jimnez et al. (1999) e Lpez et al. (2000), as polpas obtidas a partir destas matrias-
primas podem ser utilizadas em mistura ou no com polpas obtidas a partir de madeiras ou
com papel reciclado, para obteno de vrios produtos, tais como papel, papelo e outros
derivados lignocelulsicos.
O branqueamento das polpas de celulose nada mais que um tratamento fsico-qumico
que tem por objetivo remover os compostos que geram cor, melhorando tambm as
propriedades da polpa celulsica. Neste processo, so utilizados reagentes que modificam
quimicamente as substncias coloridas, descorando-as (DANILAS, 1988), o que leva a um
aumento da alvura da polpa. A alvura o fator de refletncia utilizado para avaliar a eficincia
do branqueamento na remoo da cor amarela da polpa celulsica (BIERMANN, 1996).
Nas indstrias de polpa e papel, a etapa de branqueamento uma das mais crticas, pois
gera um grande volume de efluentes txicos formados por compostos organoclorados de
baixa massa molar provenientes do uso de agentes qumicos clorados. A maior parte destes
compostos apresenta efeito cumulativo nos organismos, alm de possuir carter txico,
39
mutagnico e/ou carcinognico (RAHMAWATI et al., 2005; WANG; FERGUSON;

McCARTHY, 1992). Embora o cloro e seus derivados sejam considerados agentes de
branqueamento eficientes e de baixo custo (BIANCHI; CRISOL; SCHUCHARDT, 1999),
preocupaes ambientais relacionadas com a descarga destes efluentes tm criado uma grande
necessidade em se desenvolver novas tecnologias que utilizem seqncias de branqueamento
menos poluentes (RAHMAWATI et al., 2005; TANAKA et al., 2004; TUTUS, 2004).
Recentemente, o branqueamento de polpas com tecnologias totalmente livres de cloro,
baseadas no uso de agentes qumicos oxidativos tais como oxignio molecular, oznio ou
perxido de hidrognio, tem se mostrado como alternativas com grande potencial para
substituir os procedimentos convencionais que utilizam compostos clorados (SHATALOV;
PEREIRA, 2007). Dentre estes agentes oxidativos o perxido de hidrognio reconhecido
como um agente oxidante forte, porm pouco agressivo ao meio ambiente, sendo considerado
um dos mais importantes agentes qumicos de branqueamento (RAWMAWATI et al., 2005).
As polpas de celulose branqueadas podem ser utilizadas para diferentes fins,
dependendo do nvel de alvura que apresentam. Khristova et al. (2006) produziram polpas
branqueadas com 76,9% de alvura, as quais foram consideradas adequadas para uso em papis
para escrita e impresso. De acordo com Caraschi, Filho e Curvelo (1996), polpas
branqueadas de baixo rendimento (30 a 35%), com um alto contedo de celulose pura (>85%)
e baixos contedos de poliose (1 a 10%) e lignina (<0,05%) so adequadas para uso na
obteno de derivados de celulose, tais como viscose, acetato de celulose e celofane.
40
3 MATERIAIS E MTODOS
A Figura 3.1 uma representao esquemtica do trabalho proposto para

aproveitamento integral do bagao de malte. Os experimentos foram realizados nos
laboratrios do Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos do Departamento de
Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP).
Bagao de malte
Obteno / Caracterizao
Otimizao das condies de hidrlise cida
Hidrolisado Resduo slido contendo

hemicelulsico celulose + lignina
Processo Fermentativo Otimizao das condies de hidrlise

alcalina
Produo de
XILITOL
Resduo slido Licor contendo
contendo celulose lignina solvel
CIDOS
Processo Qumico Otimizao das condies de FENLICOS
hidrlise enzimtica
Processo Qumico
Produo de Hidrolisado
POLPA BRANQUEADA celulsico Produo de
CARVO ATIVADO
Processo Fermentativo
Produo de
CIDO LCTICO
Figura 3.1 - Representao esquemtica do trabalho proposto para aproveitamento integral do bagao
de malte.
41
O bagao de malte utilizado nos experimentos foi fornecido pela Microcervejaria do

Departamento de Biotecnologia da EEL-USP. Primeiramente o bagao foi lavado com gua
para remoo dos resduos do processo cervejeiro, sendo em seguida secado em estufa eltrica
a 50 5C at apresentar um teor de umidade de aproximadamente 10% e armazenado para
uso nas etapas seguintes.

PRELIMINARES DE HIDRLISE CIDA EM AUTOCLAVE
3.1.1 Determinao do teor de umidade
Amostras de aproximadamente 1 grama do bagao de malte foram colocadas em uma

balana com secagem por ao de raios infravermelhos (Denver Instrument IR30). As
amostras foram mantidas a 100C at obter peso constante e a umidade do bagao de malte foi
ento determinada pela diferena de peso obtida antes e aps o aquecimento.
3.1.2 Determinao dos teores de celulose, hemicelulose e lignina
O bagao de malte (10% de umidade) foi caracterizado quanto aos teores de celulose,
hemicelulose e lignina, baseando-se nas metodologias descritas por Browning (1967) e Rocha
(2000). Aproximadamente 2 gramas de amostra do material foram transferidas para um
bquer de 50 ml e adicionou-se 10 ml de H2SO4 72% p/p. A reao foi mantida em banho
termostatizado a 45 1C, por 7 minutos, sob agitao constante. Aps esse tempo, a reao
foi interrompida pela adio de 50 ml de gua destilada e todo o contedo do bquer foi
transferido quantitativamente para um Erlenmeyer de 500 ml, onde o volume total de gua foi
elevado para 275 ml. Em seguida, o Erlenmeyer foi fechado com papel alumnio e
autoclavado a 1 atm, 120C, durante 45 minutos, para promover a hidrlise completa dos
oligmeros restantes. Aps autoclavagem, o frasco foi resfriado at temperatura ambiente e o
material slido foi separado da frao lquida por filtrao utilizando papel de filtro
previamente tarado. O hidrolisado foi recolhido em um balo volumtrico de 500 ml e o
slido contido no papel de filtro foi lavado com gua destilada at atingir o volume do balo.
A lignina retida no papel de filtro foi lavada ainda com cerca de 800 ml de gua destilada e
42
secada em estufa 105C at atingir peso constante. A relao entre o peso do resduo e o
peso inicial da amostra foi utilizada para determinar a porcentagem de lignina insolvel
presente no bagao de malte (equao 1). Uma alquota de aproximadamente 1 ml da frao
lquida obtida foi filtrada em filtro Sep Pak C18 e analisada por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE) para determinao das concentraes de glicose, xilose e arabinose, as
quais foram utilizadas para o clculo da porcentagem de celulose e hemicelulose presente na
amostra (IRICK et al., 1988) de acordo com as equaes 2 e 3:
% lignina insolvel = PR*10000/(PA*PSA) equao 1
% celulose = Gli*5000*Fc*Fph/(PA*PSA) equao 2
% hemicelulose = (Xil*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)+(Arab*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)
equao 3
onde: Fc = fator de converso (0,9 para a celulose e 0,88 para a hemicelulose); Fph = fator de
perda de hidrlise (1,055 para celulose e 1,155 para hemicelulose); Gli, Xil, Ara =
concentrao de glicose, xilose e arabinose, respectivamente (g/l); PA = peso inicial da
amostra (g); PR = peso do resduo de lignina (g); PSA = peso seco da amostra (%).
Para determinao da lignina solvel, uma alquota de 5 ml do hidrolisado foi

alcalinizada com 1 ml de NaOH 6M at atingir pH 12, diluda em balo volumtrico de 50 ml
e analisada por espectroscopia de UV (espectrofotmetro Beckman DU 640B) a um
comprimento de onda de 280 nm. Amostras do hidrolisado foram tambm analisadas por
CLAE para determinao das concentraes de furfural e hidroximetilfurfural, as quais
juntamente com a leitura de absorbncia, foram empregadas para calcular a porcentagem de
lignina solvel na amostra, de acordo com as equaes 4 e 5 a seguir:
% lignina solvel = (4,187x10-2*(Ahid280-Apd280)-3,279x10-4)*200 equao 4
Apd280 = (Cfurf*Efurf)/200+(CHMF*EHMF)/200 equao 5

43
onde: Ahid280 = absorbncia do hidrolisado a 280 nm; Cfurf e CHMF = concentrao de furfural e
hidroximetilfurfural, respectivamente, no hidrolisado (g/l); Efurf = absortividade do furfural
(146,85 l/g.cm); EHMF = absortividade do hidroximetilfurfural (114 l/g.cm).
3.1.3 Determinao do teor de cinzas
Para determinao de teor de cinzas do bagao, cerca de 1 grama da amostra (pesada em

balana analtica) foi colocada em um cadinho de porcelana previamente tarado e aquecida
em mufla eltrica a 800C por 2 h. As cinzas foram determinadas pela diferena de peso das
amostras, antes e aps a incinerao (equao 6). Antes de serem pesadas, as amostras foram
colocadas em um dessecador por 50 minutos.
% cinzas = PC*100/PA equao 6
Onde: PC = peso de cinzas (g); PSA = peso seco da amostra (%).
3.1.4 Determinao do teor de protenas
O teor de protenas foi determinado como o contedo total de nitrognio pelo mtodo
Kjeldahl, utilizando o fator de correo N 6,25.
3.1.5 Determinao do teor de minerais
Os teores de diversos minerais presentes no bagao de malte foram determinados por

espectrometria de emisso atmica por ionizao acoplada a plasma, em um aparelho AR
Labs modelo 3410, aps oxidao com cido ntrico, conforme metodologia desenvolvida nos
laboratrios do Departamento de Engenharia de Materiais, DEMAR, EEL-USP.
3.1.6 Hidrlise cida em autoclave
Estes experimentos foram realizados sob diferentes condies operacionais (Tabela

3.1), para avaliar a influncia das variveis concentrao de cido sulfrico (98% p/p) e
44
relao slido:lquido, na eficincia de hidrlise da hemicelulose (xilana + arabinana). Para os

experimentos, uma massa de 30 g do bagao de malte e a quantidade necessria de soluo
cida foram acondicionados em frascos Erlenmeyer de 500 ml, os quais foram devidamente
fechados e autoclavados a 120C durante 27 minutos. Os hidrolisados obtidos foram
separados do resduo slido por filtrao e caracterizados quanto concentrao de acares
(xilose, arabinose e glicose), cido actico, furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel. A
evaporao de gua ocorrida durante o processo de hidrlise foi estimada e utilizada para
corrigir os valores de concentrao dos compostos identificados nos hidrolisados.
Tabela 3.1 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de hidrlise cida do
bagao de malte, em autoclave, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis originais das variveis Nveis codificados das variveis
Concentrao de Relao Concentrao de Relao

H2SO4 (mg/g) slido:lquido (g:g) H2SO4 slido:lquido
1 100 1:10 -1 -1
2 120 1:10 +1 -1
3 100 1:20 -1 +1
4 120 1:20 +1 +1
5 110 1:15 0 0
6 110 1:15 0 0
7 110 1:15 0 0
O rendimento em acares recuperados (YS, em gramas de substncia que pode ser

obtida a partir de 100 g do bagao de malte em peso seco) e a eficincia de hidrlise (, %)
foram calculados atravs das equaes 7 e 8:
YS = (C*V/M)*100 equao 7
= (YS/Ymx)*100 equao 8
onde: C a concentrao da substncia na fase lquida (g/l), M a quantidade de bagao de

malte (em peso seco) utilizada no experimento (g), V o volume de soluo lquida utilizada
(l) e Ymx o rendimento mximo em acares recuperados que pode ser obtido (g/100 g em
peso seco).
45
3.2 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE CIDA EM REATOR VISANDO

A MXIMA LIBERAO DE XILOSE E PRODUO DE XILITOL A PARTIR DO
HIDROLISADO
3.2.1 Hidrlise cida em reator
Nesta etapa, os experimentos de hidrlise cida foram realizados em reatores de

capacidade 1,5 L, com forma de tubos cilndricos de 42,5 cm de altura e 6,7 cm de dimetro,
confeccionados em ao-inox e munidos de aquecimento por resistncia eltrica, controle de
temperatura e manmetro. Um conjunto de quatro reatores com estas caractersticas foi
montado e, uma vez ligado, o sistema girava em torno de um eixo (localizado prximo
metade da altura total do sistema), completando uma volta em um tempo de 40 segundos
(Figura 3.2).
Figura 3.2 - Reator utilizado nos experimentos de hidrlise cida.
Estes experimentos foram realizados empregando diferentes condies de relao

slido:lquido, concentrao de cido sulfrico (98% p/p) e tempo de reao (Tabela 3.2),
para avaliar a influncia destas variveis na eficincia de hidrlise da hemicelulose (xilana +
arabinana). Nos ensaios, cada reator foi preenchido com 90 g de bagao de malte e a
quantidade necessria de soluo cida, sendo em seguida fechado e submetido a um
aquecimento at 120C, temperatura onde a reao foi mantida por diferentes tempos, de
46
acordo com o planejamento experimental apresentado na Tabela 3.2. O tempo necessrio para
aquecimento dos reatores at 120C foi de aproximadamente 1,5 h, sendo que um tempo
similar a este tambm foi necessrio para o posterior resfriamento dos reatores at
temperatura ambiente.
Ao trmino das hidrlises, os materiais slidos residuais foram separados por filtrao e
os hidrolisados obtidos foram caracterizados quanto concentrao de acares (xilose,
arabinose e glicose), cido actico, furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel. O
rendimento em acares recuperados e a eficincia de hidrlise para cada condio avaliada
foram calculados conforme descrito no item 3.1.6. A anlise dos resultados obtidos e
otimizao da melhor condio de hidrlise foram realizadas atravs do emprego da
metodologia estatstica de superfcie de resposta, utilizando o programa Statistica verso 5.0.
Tabela 3.2 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise cida do
bagao de malte, em reator, sob diferentes condies operacionais.
Concentrao Relao Tempo Concentrao Relao Tempo

de H2SO4 slido:lquido de H2SO4 slido:lquido
(mg/g) (g:g) (min)
1 100 1:8 17 -1 -1 -1
2 140 1:8 17 +1 -1 -1
3 100 1:12 17 -1 +1 -1
4 140 1:12 17 +1 +1 -1
5 100 1:8 37 -1 -1 +1
6 140 1:8 37 +1 -1 +1
7 100 1:12 37 -1 +1 +1
8 140 1:12 37 +1 +1 +1
9 120 1:10 27 0 0 0
10 120 1:10 27 0 0 0
11 120 1:10 27 0 0 0
12 120 1:10 27 0 0 0
3.2.2 Fermentao dos hidrolisados obtidos para produo de xilitol
3.2.2.1 Microrganismo e preparo do inculo
O microrganismo utilizado nestes experimentos foi a levedura Candida guilliermondii

FTI 20037, da coleo de culturas do Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos do
47
Departamento de Biotecnologia da EEL-USP. A cultura foi mantida repicada em tubos de

ensaio contendo gar extrato de malte inclinado e conservada em geladeira a 4C. Um repique
com cerca de 24 h foi utilizado para o preparo do inculo.
O meio utilizado para crescimento do inculo foi formulado utilizando solues
concentradas de cada componente (Tabela 3.3), as quais foram preparadas separadamente e
esterilizadas a 121C por 20 minutos, exceto a soluo de xilose que foi autoclavada a 112C
por 15 minutos. As solues foram ento misturas assepticamente de forma a se obter a
concentrao desejada de cada nutriente no meio de cultura.
Para a utilizao do farelo de arroz como nutriente, preparou-se uma suspenso de
farelo em gua destilada, em uma concentrao de 10% p/v. Esta suspenso foi esterilizada a
121C por 20 minutos, resfriada at temperatura ambiente e posteriormente centrifugada em
condies asspticas a 1100 g por 20 minutos. A frao lquida ento obtida (extrato de
farelo de arroz) foi transferida para um frasco previamente esterilizado e conservada em
geladeira at a sua utilizao, por um perodo de no mximo 24 h.
Tabela 3.3 - Composio do meio semidefinido utilizado para crescimento do inculo da levedura
Candida guilliermondii.
Componente Concentrao (g/l)
Xilose 20,0
Sulfato de amnio 3,0
Cloreto de clcio 0,1
Extrato de farelo de arroz 20,0*
* valor em % p/v
O inculo foi preparado transferindo-se uma alada de clulas, proveniente do repique

em meio de manuteno, para tubos de ensaio contendo cerca de 5 ml de gua destilada
esterilizada. Alquotas de 2 ml desta suspenso foram transferidas para frascos Erlenmeyer de
250 ml contendo 100 ml do meio descrito na Tabela 3.3. Os frascos foram incubados 30C
em agitador rotatrio (Tecnal TE-420) a 200 rpm por 24 h. Aps este tempo as clulas foram
separadas por centrifugao a 1100 g por 20 minutos e ressuspendidas diretamente no meio
de fermentao.
48
3.2.2.2 Meio e condies de fermentao
As fermentaes foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml

de meio de fermentao (hidrolisado com o pH ajustado para 6,5 pela adio de NaOH em
pastilhas) inoculado com uma concentrao celular inicial de 1 g/l. Os frascos inoculados
foram incubados 30C em agitador rotatrio (Tecnal TE-420) a 200 rpm por 24 h. Durante
as fermentaes foram retiradas amostras para determinao do crescimento celular, consumo
de glicose e xilose e produo de xilitol.

guilliermondii DURANTE A PRODUO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO
HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE DILUDO E CONCENTRADO
3.3.1 Hidrolisado hemicelulsico
O hidrolisado hemicelulsico utilizado nestes experimentos foi produzido em reatores

de 1,5 L de capacidade (item 3.2.1), empregando as seguintes condies de reao: 100 mg
H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos. Ao trmino
da reao, o material slido residual foi separado por filtrao e parte do hidrolisado obtido
foi submetida a um processo de concentrao sob vcuo, em evaporador com capacidade de 4
litros, a uma temperatura de 70 5C, visando aumentar a concentrao de xilose para
aproximadamente 85 g/l. Os hidrolisados diludo (original) e concentrado foram analisados
para determinao das concentraes de acares, cido actico, furfural, hidroximetilfurfural
e compostos fenlicos.
3.3.2 Microrganismo e preparo do inculo
As condies de cultivo do microrganismo e preparo do inculo utilizadas nestes

experimentos foram as mesmas descritas anteriormente no item 3.2.2.1.
49
3.3.3 Meios e condies de fermentao
Para serem utilizados com meio de fermentao, os hidrolisados (diludo e concentrado)

tiveram o pH ajustado para 6,5 pela adio de NaOH (pastilhas), sendo que o precipitado
formado foi removido por centrifugao (1100 g, 20 minutos). Alm das fermentaes em
meio hidrolisado, foram tambm realizados alguns ensaios em meio semidefinido contendo as
mesmas concentraes de acares (glicose, xilose e arabinose) presentes nos hidrolisados.
Alm de acares, os meios semidefinidos foram suplementados com 3,0 g/l de sulfato de
amnio, 0,1 g/l de cloreto de clcio e 10% v/v de extrato de farelo de arroz, o qual foi
preparado conforme descrito no item 3.2.2.1. As fermentaes foram realizadas em frascos
Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio de fermentao (pH 6,5) inoculado com uma
concentrao celular inicial de 1 g/l. Os frascos foram incubados em agitador rotatrio
(Tecnal TE-420) a 200 rpm, 30C durante 30 h (meios diludos) ou 96 h (meios
concentrados). Durante as fermentaes foram retiradas amostras para determinao do
crescimento celular, consumo de glicose, xilose e arabinose e produo de xilitol.

HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE NA BIOCONVERSO DE XILOSE A
XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii
3.4.1 Hidrolisado hemicelulsico
O hidrolisado hemicelulsico utilizado nestes experimentos foi produzido em reatores

de 1,5 L de capacidade (item 3.2.1), empregando as seguintes condies de reao: 100 mg
H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos. Ao trmino
da reao, o material slido residual foi separado por filtrao e parte do hidrolisado obtido
foi submetida a um processo de concentrao sob vcuo, em evaporador com capacidade de 4
litros, a uma temperatura de 70 5C, visando aumentar a concentrao de xilose para
aproximadamente 85 g/l. Os hidrolisados diludo (original) e concentrado foram analisados
para determinao das concentraes de acares, furfural, hidroximetilfurfural cido actico
e compostos fenlicos (vanilina, seringaldedo, cido ferlico e cido sirngico).
50
3.4.2 Microrganismo e preparo do inculo
As condies de cultivo do microrganismo e preparo do inculo utilizadas nestes

experimentos foram as mesmas descritas anteriormente no item 3.2.2.1.
3.4.3 Meios e condies de fermentao
Os procedimentos utilizados para preparo dos meios de fermentao a partir do

hidrolisado de bagao de malte original, esto apresentados na Figura 3.3.
Hidrolisado original
Ajuste do pH para 6,5
Concentrao (4 vezes)
Hidrolisado
Hidrolisado concentrado diludo (HD)
Suplementao com
Ajuste do pH para 6,5
acares (xilose, glicose e
arabinose) at uma
Hidrolisado concentrao 4 vezes maior
do que no hidrolisado
concentrado (HC) diludo e posterior ajuste do
pH para 6,5
Tratamento com carvo
ativado e posterior ajuste
do pH para 6,5 Hidrolisado diludo
suplementado (HDS)
Hidrolisado concen-
trado tratado (HCT)
Diluio at uma concentrao de

acares igual do hidrolisado
diludo, suplementao com acares
(xilose, glicose e arabinose) at
concentraes 4 vezes maiores e
posterior ajuste do pH para 6,5
Hidrolisado
concentrado, diludo e
suplementado (HCDS)
Figura 3.3 - Representao esquemtica dos procedimentos utilizados para preparo dos meios de
fermentao a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte.
51
O pH dos hidrolisados foi ajustado para 6,5 pela adio de NaOH (pastilhas) e o
precipitado formado foi removido por centrifugao (1100 g, 20 minutos). O tratamento do
hidrolisado com carvo ativado consistiu na adio de 2,5 g de carvo/100 g de hidrolisado
em pH 2,0, a 150 rpm, 45C durante 60 minutos. Os cinco meios de fermentao obtidos
foram analisados por CLAE para determinao da concentrao de acares, cido actico,
furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenlicos.
As fermentaes foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml
de meio de fermentao inoculado com uma concentrao celular inicial de 1 g/l. Os frascos
foram incubados em agitador rotatrio (Tecnal TE-420) a 200 rpm, 30C durante 30 h (HD)
ou 96 h (HDS, HC, HCT e HCDS). Durante as fermentaes foram retiradas amostras para
determinao do crescimento celular, consumo de glicose, xilose e arabinose e produo de
xilitol.
3.5 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE ALCALINA DO BAGAO DE

MALTE PARA A PRODUO DE POLPA CELULSICA E LIBERAO DE CIDOS
FENLICOS
O resduo do bagao de malte obtido aps a etapa de hidrlise cida nas condies de
100 mg H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos, foi
submetido a um processo de hidrlise alcalina empregando hidrxido de sdio como agente
qumico. As reaes foram realizadas em ampolas de ao inoxidvel de 200 ml de capacidade
total, mantendo uma relao slido:lquido de 1:20 g:g, porm, empregando vrias
combinaes entre as variveis temperatura, tempo de reao e concentrao de NaOH, de
acordo com o planejamento fatorial completo 23 apresentado na Tabela 3.4. Aps serem
preenchidas com o bagao de malte e a soluo de NaOH, as ampolas foram devidamente
fechadas e introduzidas em um banho com leo de silicone, onde foram mantidas durante o
tempo desejado. Ao trmino de cada reao, as ampolas foram retiradas do banho de silicone
e imediatamente resfriadas em um banho de gelo. Os licores obtidos, contendo a lignina
solvel, foram separados do resduo slido por filtrao em tecido 100% polister e
caracterizados quanto concentrao de cidos fenlicos (ferlico, p-cumrico, sirngico,
vanlico e p-hidroxibenzico). Os resduos slidos obtidos (polpa celulsica) foram lavados
52
com gua at pH neutro, secados em estufa a 50 5C at atingir um teor de umidade de

aproximadamente 10% e caracterizados quimicamente quanto aos teores de celulose,
hemicelulose, lignina e cinzas, conforme metodologia descrita nos itens 3.1.2 e 3.1.3.
Tabela 3.4 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise alcalina do
resduo do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Temperatura Tempo NaOH Temperatura Tempo NaOH
(C) (min) (% p/v)

1 80 30 1,0 -1 -1 -1
2 120 30 1,0 +1 -1 -1
3 80 90 1,0 -1 +1 -1
4 120 90 1,0 +1 +1 -1
5 80 30 2,0 -1 -1 +1
6 120 30 2,0 +1 -1 +1
7 80 90 2,0 -1 +1 +1
8 120 90 2,0 +1 +1 +1
9 100 60 1,5 0 0 0
10 100 60 1,5 0 0 0
11 100 60 1,5 0 0 0
12 100 60 1,5 0 0 0
A anlise dos resultados obtidos e otimizao da melhor condio de hidrlise foram

realizadas atravs do emprego da metodologia estatstica de superfcie de resposta, utilizando
o programa Statistica verso 5.0.
3.6 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE ENZIMTICA DO BAGAO DE

MALTE PARA MXIMA CONVERSO DA CELULOSE EM GLICOSE
Nestes experimentos foi utilizada a polpa celulsica do bagao de malte obtida aps
pr-tratamento do material por uma seqncia de hidrlises cida (empregando 100 mg
H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos) e alcalina
(empregando uma soluo de NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por
90 minutos). Os processos de hidrlise foram realizados conforme descrito nos itens 3.2.1 e
3.5. Para a hidrlise alcalina, foram empregadas ampolas de ao inoxidvel de 500 ml de
53
capacidade e um banho de leo de silicone (Lauda) especialmente confeccionado para esta

finalidade (Figura 3.4). Aps esta seqncia de tratamentos, o material slido residual obtido
(polpa celulsica) foi peneirado e apenas as partculas que passaram em peneira da Srie
Tyler n 10 (<1,68 mm) foram utilizadas nas reaes de hidrlise enzimtica.
Figura 3.4 - Banho termostatizado com leo de silicone, utilizado para a hidrlise alcalina do bagao
de malte.
3.6.1 Enzima
O extrato enzimtico comercial, Celluclast 1.5L (Novozymes) produzido por

Trichoderma reesei, foi a nica fonte de enzimas utilizada nos experimentos. Este extrato era
um lquido de cor castanha com densidade de aproximadamente 1,20 g/ml, teor de protenas
de 27 mg/ml e atividade celuloltica total de 74 FPU/ml.
3.6.2 Hidrlise enzimtica
Os experimentos de hidrlise enzimtica foram realizados empregando diferentes

condies de agitao, relao enzima/substrato e concentrao de substrato, de acordo com o
planejamento fatorial completo 23 apresentado na Tabela 3.5. Para os experimentos, a enzima
foi adicionada em tampo citrato de sdio 50 mM (pH 4,8) suplementado com 0,02% p/v de
54
azida de sdio, para prevenir a contaminao microbiana. Os ensaios foram realizados em

frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 25 ml de volume de reao (mistura enzima-tampo).
Aps a adio do substrato, os frascos foram fechados com papel filme e incubados em
agitador rotatrio (Tecnal TE-420) a 45C durante 96 h.
Tabela 3.5 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise enzimtica da
celulose da polpa do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Agitao Enzima/Substrato Substrato Agitao Enzima/Substrato Substrato
(rpm) (FPU/g) (% p/v)

1 100 5 2 -1 -1 -1
2 200 5 2 +1 -1 -1
3 100 45 2 -1 +1 -1
4 200 45 2 +1 +1 -1
5 100 5 8 -1 -1 +1
6 200 5 8 +1 -1 +1
7 100 45 8 -1 +1 +1
8 200 45 8 +1 +1 +1
9 150 25 5 0 0 0
10 150 25 5 0 0 0
11 150 25 5 0 0 0
12 150 25 5 0 0 0
Amostras do meio reacional foram retiradas a cada 24 h at o tempo final de hidrlise

(96 h), para determinar a concentrao de glicose e celobiose liberada. Assim que retirada, a
amostra foi aquecida em banho maria a 100C durante 5 minutos, para precipitar as protenas
e desta forma cessar a atividade enzimtica. Aps resfriada, a mistura reacional foi
centrifugada a 4000 rpm durante 10 minutos e os hidrolisados obtidos foram analisados para
determinar a concentrao de glicose e celobiose presente. Atravs destes valores, o
rendimento total de hidrlise da celulose (YT = rendimento em glicose + rendimento em
celobiose) foi calculado (equao 9). A anlise dos resultados obtidos e otimizao da melhor
condio de hidrlise enzimtica foram feitas atravs da metodologia estatstica de superfcie
de resposta, empregando o programa Statistica verso 5.0.
YT (%) = (glicose/celobiose) 0,9 100 + (celobiose/celulose) 0,95 100 equao 9

55
3.6.3 Efeito da hemicelulose e da lignina na hidrlise enzimtica da celulose do

bagao de malte
Nestes experimentos, amostras do bagao de malte com diferentes composies

qumicas foram utilizadas como substrato no processo de hidrlise enzimtica: 1. bagao de
malte na forma original; 2. bagao de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo (100 mg
H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos); 3. bagao
de malte pr-tratado por com cido sulfrico diludo (100 mg H2SO4/g de matria seca,
relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos) e posteriormente com hidrxido de
sdio (soluo de NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos).
Os processos de hidrlise foram realizados conforme descrito nos itens 3.2.1 e 3.5. A
composio qumica destes materiais foi determinada de acordo com as metodologias
descritas nos itens 3.1.2 e 3.1.3.
Os experimentos de hidrlise enzimtica foram realizados conforme descrito no item
3.6.2, porm, em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de volume de reao e
utilizando condies de agitao, relao enzima/substrato e concentrao de substrato, de
100 rpm, 45 FPU/g e 2% p/v, respectivamente. As reaes foram mantidas a 45C durante
96 h. Os hidrolisados obtidos foram analisados por CLAE para determinao das
concentraes de glicose, celobiose, xilose e arabinose. O rendimento total de hidrlise da
celulose (rendimento em glicose + rendimento em celobiose), para cada substrato utilizado,
foi calculado atravs da equao 9 (item 3.6.2).
3.7 PRODUO DE CIDO LCTICO POR Lactobacillus delbrueckii A PARTIR DO

HIDROLISADO CELULSICO DE BAGAO DE MALTE
3.7.1 Hidrolisado celulsico
O hidrolisado celulsico utilizado como meio de fermentao para a produo de cido

lctico, foi obtido atravs da hidrlise enzimtica da polpa de celulose a partir do bagao de
malte pr-tratado com cido sulfrico diludo e posteriormente com soluo de NaOH. As
condies de hidrlise utilizadas em cada uma destas etapas foram: 1. hidrlise cida: 100 mg
H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos; 2. hidrlise
56
alcalina: soluo de NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos;
3. hidrlise enzimtica: concentrao de substrato de 8% p/v, 45 FPU/g, 100 rpm, 45C por 96
h. Estes processos foram realizados conforme descrito nos itens 3.2.1, 3.5 e 3.6.2,
respectivamente. A atividade celuloltica total do extrato enzimtico comercial, Celluclast
1.5L (Novozymes), utilizado nestes experimentos de hidrlise enzimtica foi de 98 FPU/ml.
3.7.2 Fermentao do hidrolisado celulsico para produo de cido lctico
3.7.2.1 Microrganismo e preparo do inculo
O microrganismo utilizado nos experimentos foi a bactria Lactobacillus delbrueckii

UFV H2B20, proveniente da coleo de culturas da Universidade Federal de Viosa (Viosa,
Brasil). A espcie foi mantida repicada em tubos de ensaio contendo meio MRS gar com a
seguinte composio (g/l): glicose (20), peptona (10), extrato de carne (8), extrato de levedura
(4), acetato de sdio.3H2O (5), citrato triamoniacal (2), fosfato dipotssico (2), sulfato de
magnsio.7H2O (0,2), sulfato de mangans.4H2O (0,05), gar (14) e 1 ml de Tween 80. A
cultura foi conservada em geladeira a 4C.
O meio utilizado para preparo do inculo foi o MRS caldo, cuja composio a mesma
do MRS gar ausente apenas em gar. Para a formulao deste meio, todos os componentes
foram pesados individualmente e misturados um a um em um fraco Erlenmeyer contendo
gua destilada, sob agitao. Aps completa homogeneizao, o meio foi autoclavado a 1 atm
durante 15 minutos, sendo ento resfriado e guardado em geladeira at o momento de uso.
Para o preparo do inculo, duas aladas de clulas mantidas em meio MRS gar foram
transferidas para um tubo de ensaio contendo 10 ml do meio MRS caldo. O tubo foi fechado
com rolha e papel filme e foi mantido em estufa a 37C, sem agitao, durante 24h.
Nos experimentos realizados para avaliar o efeito da concentrao inicial de inculo,
aps 24 h na estufa, 1 ml do inculo foi transferido para um novo tubo de ensaio contendo
10 ml do meio MRS caldo, sendo mantido novamente em estufa a 37C, sem agitao, por
mais 24 h. Aps este tempo, as clulas foram separadas por centrifugao (1100 g, 15 min)
e ressuspendidas em gua destilada esterilizada de forma a se obter uma suspenso com
concentrao celular de aproximadamente 5 g/l. A partir desta suspenso, diferentes volumes
foram adicionados aos meios de fermentao para se obter concentraes iniciais de clulas
57
de 0,5, 0,75 e 1,0 g/l no incio da fermentao.

Nos experimentos realizados para avaliar o efeito do pH e da suplementao nutricional
do hidrolisado, aps 24 h na estufa, 2 ml do inculo foram transferidos para um Erlenmeyer
de 250 ml contendo 110 ml de meio MRS caldo, sendo mantido novamente em estufa a 37C,
sem agitao, por mais 24 h. Aps este tempo, as clulas foram separadas por centrifugao
(1100 g, 15 min) e transferidas diretamente para o meio de fermentao de forma a se obter
uma concentrao celular de 1 g/l no incio da fermentao.
3.7.2.2 Meios e condies de fermentao
Inicialmente os experimentos foram realizados em tubos de ensaio para avaliar o efeito

da concentrao inicial de inculo na produo de cido lctico. O meio de fermentao
utilizado nestes experimentos foi constitudo pelo hidrolisado celulsico de bagao de malte
com o pH original (4,72) ajustado para 6,0 pela adio de NaOH 5N. Aps o ajuste de pH,
10 ml do hidrolisado foi adicionado em cada tubo de ensaio de 25 ml, os quais foram ento
fechados e autoclavados a 0,5 atm durante 15 minutos. As fermentaes foram conduzidas a
37C, sem agitao, durante 48 h. A cada 24 h foi retirado um tubo de ensaio para
determinao da concentrao celular, pH, consumo de glicose e produo de cido lctico.
Posteriormente, foram realizados experimentos em tubos de ensaio para avaliar o efeito
da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de malte na produo de
cido lctico. Os meios usados nestes experimentos foram preparados das seguintes formas:
Meio 1: Hidrolisado com o pH ajustado para 6,0 pela adio de NaOH 5N.
Meio 2: Hidrolisado com o pH ajustado para 6,0, suplementado com 5 g/l de extrato de
levedura.
Meio 3: Hidrolisado com o pH ajustado para 6,0, suplementado com os mesmo nutrientes do
meio MRS caldo.
Meio 4: Meio MRS caldo com uma concentrao de glicose igual do hidrolisado (57 g/l).
Depois de formulados, os meios foram autoclavados a 0,5 atm por 15 minutos. As
fermentaes foram conduzidas em tubos de ensaio de 25 ml contendo 10 ml de meio de
fermentao, a 37C, sem agitao, durante 72 h. A cada 12 h foi retirado um tubo de ensaio
para determinao da concentrao celular, pH, consumo de glicose e produo de cido
lctico.
58
Os experimentos para avaliar o efeito do controle do pH na produo de cido lctico

por fermentao do hidrolisado celulsico de bagao de malte, suplementado ou no com
nutrientes, foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 ml. Estes ensaios foram realizados
com os meios 1, 2 e 4 descritos anteriormente. Aps a formulao, 100 ml de cada meio
foram adicionados aos frascos Erlenmeyer e autoclavados a 0,5 atm durante 15 min. Para
avaliar o efeito do controle de pH, foram realizadas fermentaes com e sem a adio de
NaOH 5N durante a fermentao. Estas fermentaes foram realizadas a 37C, sem agitao,
durante 60 h. O desempenho das fermentaes foi avaliado atravs de retiradas peridicas de
amostras (2 ml) a cada 12 h, para determinao da concentrao celular, pH, consumo de
glicose e produo de cido lctico.
Em todas as fermentaes, assim que retiradas do meio de fermentao as amostras
foram centrifugadas a 4330 g por 10 min. O sobrenadante foi separado e utilizado para
determinao do pH e das concentraes de glicose, celobiose e cido lctico por CLAE. O
precipitado foi lavado com gua destilada e utilizado para determinao da concentrao
celular.

BAGAO DE MALTE
3.8.1 Obteno das polpas de celulose
Nesta etapa do trabalho foram obtidas duas polpas de celulose, uma a partir do bagao
de malte original e outra a partir do bagao de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo
nas condies de 100 mg H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C
por 17 minutos, conforme descrito no item 3.2.1. As condies utilizadas para obteno da
polpa de celulose a partir destes materiais basearam-se no uso de uma soluo de NaOH
2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos, conforme metodologia
descrita no item 3.5.
59
3.8.2 Branqueamento das polpas de celulose
As polpas de bagao de malte obtidas conforme item 3.8.1 foram submetidas a um

processo de branqueamento qumico realizado em trs etapas. Inicialmente, uma amostra de
30 g de cada polpa foi colocada em um bquer de 600 ml juntamente com uma soluo de
hidrxido de sdio 0,07N de forma a se obter uma consistncia de 10%. Em seguida foi
adicionado perxido de hidrognio (5% em base seca) e o meio reacional foi mantido a 70C,
durante 40 min, sob agitao. Aps este tempo a polpa obtida foi filtrada em um funil de
Bchner, lavada com gua destilada at pH neutro e secada temperatura ambiente. Este
procedimento foi realizado por duas vezes seguidas. Na terceira etapa do branqueamento, a
polpa foi submetida reao com hidrxido de sdio 0,25 N de forma a se obter uma
consistncia de 10% e a reao foi mantida a 70C durante 60 minutos, sob agitao. Aps
este tempo, a polpa obtida foi filtrada em um funil de Bchner, lavada com gua destilada at
pH neutro e secada em temperatura ambiente at obter um teor de umidade de
aproximadamente 10%.
As polpas obtidas antes e aps o branqueamento foram caracterizadas quanto aos teores
de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas (itens 3.1.2 e 3.1.3), nmero kappa, viscosidade e
alvura. O rendimento das polpas foi determinado pela diferena entre as massas antes e aps o
branqueamento.
3.9 RECUPERAAO DA LIGNINA A PARTIR DO LICOR ALCALINO E SUA

UTILIZAO NA PRODUO DE CARVO ATIVADO
3.9.1 Obteno do licor alcalino contendo lignina solvel
O licor utilizado nestes experimentos foi obtido a partir da hidrlise alcalina do bagao
de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo (100 mg H2SO4/g de matria seca, relao
slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos, conforme metodologia descrita no item
3.2.1). As condies utilizadas para hidrlise alcalina basearam-se no uso de uma soluo de
NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos, conforme
metodologia descrita no item 3.5.
60
3.9.2 Precipitao da lignina a partir do licor alcalino
Nestes ensaios, foi avaliada a influncia do pH na precipitao da lignina a partir do

licor alcalino. Um volume de 20 ml do licor foi colocado em 10 tubos de centrfuga de 50 ml
de capacidade total. A cada tubo foi adicionado um diferente volume de cido sulfrico
concentrado (98% p/p) visando obter diferentes valores de pH, variando de 12,56 a 2,15.
Aps a adio do cido, os tubos foram fechados, homogeneizados e centrifugados a 4000
rpm durante 10 min. A lignina precipitada foi separada do licor, lavada com cerca de 40 ml de
gua destilada, homogeneizada e centrifugada novamente a 4000 rpm por 10 min. Este
procedimento de lavagem foi realizado duas vezes para cada amostra. Ao trmino da lavagem,
a lignina obtida foi secada em estufa a 60C at apresentar massa constante. Os licores obtidos
foram mantidos a 4C durante 24 h e posteriormente centrifugados a 4000 rpm por 10 min. A
lignina ento precipitada foi lavada com gua conforme descrito anteriormente e secada em
estufa a 60C at massa constante. A massa total de lignina precipitada foi considerada como
a soma da massa precipitada aps a adio do cido e a massa precipitada aps o
resfriamento. Os licores obtidos foram caracterizados quanto ao pH, concentrao total de
lignina solvel e concentrao dos cidos fenlicos: ferlico, p-cumrico, p-hidroxibenzico,
sirngico e vanlico. A remoo de lignina a partir do licor foi calculada pela diferena entre a
concentrao de lignina solvel antes e aps o tratamento de precipitao.
3.9.3 Preparo dos carves ativados a partir da lignina
A lignina seca, recuperada a partir do licor alcalino por precipitao pela adio de
cido sulfrico at pH 2,15, foi macerada e passada por uma peneira de 170 mesh. Apenas as
partculas que passaram por esta peneira (<88 m) foram utilizadas para a produo de
carvo. O processo de ativao da lignina foi realizado empregando diferentes temperaturas
de carbonizao e relaes entre H3PO4/lignina, de acordo com o planejamento fatorial
completo 22 apresentado na Tabela 3.6. A lignina foi inicialmente impregnada com cido
fosfrico (85% p/p) na proporo de 1 a 3 g H3PO4/g lignina e mantida em temperatura
ambiente durante 1 h. Aps este tempo a mistura foi acondicionada em uma mufla onde foi
mantida a 100C durante 1 h. Em seguida a temperatura da mufla foi aumentada at a
temperatura de carbonizao desejada, sendo mantida durante 2 h. Os carves ativados
obtidos foram lavados com gua milli Q a 60C, durante 48 h, at apresentarem pH neutro.
61
Em seguida, estes foram secados em estufa a 105C durante 2,5 h, para perder a umidade.
Os carves obtidos nas diferentes condies de ativao foram utilizados para
destoxificao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte. A concentrao de metais
(nquel, clcio, magnsio, zinco, ferro, cromo, alumnio e silcio) e compostos fenlicos no
hidrolisado antes e aps o tratamento, foi determinada para poder calcular a eficincia de cada
carvo na remoo destes compostos. A cor dos hidrolisados antes e aps os tratamentos
tambm foi determinada. Uma anlise estatstica dos resultados foi realizada empregando o
programa Statistica verso 5.0.
Tabela 3.6 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de produo de carvo
ativado a partir da lignina do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Relao Temperatura de Relao Temperatura de

cido/lignina (g/g) carbonizao (C) cido/lignina carbonizao
1 1 300 -1 -1
2 3 300 +1 -1
3 1 600 -1 +1
4 3 600 +1 +1
5 2 450 0 0
6 2 450 0 0
3.10 MTODOS ANALTICOS
3.10.1 Determinao da concentrao de glicose, xilose, arabinose, celobiose, xilitol,

cido actico e cido lctico
As concentraes de glicose, xilose, arabinose, celobiose, xilitol, cido actico e cido

lctico foram determinadas por CLAE, em um equipamento Waters nas seguintes condies:
detector de ndice de refrao, coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm),
temperatura de 45C, cido sulfrico 0,01N como eluente em um fluxo de 0,6 ml/min e
volume de amostra de 20l. Antes de serem injetadas no cromatgrafo, as amostras foram
diludas com gua deionizada e filtradas em filtros Sep Pak C18 (Millipore). As concentraes
dos compostos foram calculadas a partir de curvas de calibrao obtidas com solues padro.
62
3.10.2 Determinao da concentrao de furfural, hidroximetilfurfural e compostos

fenlicos
As concentraes de furfural, hidroximetilfurfural, vanilina, seringaldedo e dos cidos

ferlico, p-cumrico, sirngico, vanlico e p-hidroxibenzico foram determinadas por CLAE,
em um equipamento Waters nas seguintes condies: detector UV a 276 nm, coluna Waters
Resolve C18 5 m (300 x 3,9 mm), temperatura ambiente, acetonitrila/gua (1/8 com 1% de
cido actico) como eluente em um fluxo de 0,9 ml/min e volume de amostra de 20 l. Antes
de serem injetadas no cromatgrafo, as amostras foram diludas com gua deionizada e
filtradas em membranas do tipo HSWP com poros de 0,45 m (Millipore). As concentraes
destes compostos foram calculadas a partir de curvas de calibrao obtidas de solues
padro.
3.10.3 Determinao da concentrao de metais
As concentraes dos metais, nquel, clcio, magnsio, zinco, ferro, cromo, alumnio e
silcio foram determinados por espectrometria de absoro atmica por chama, em um
equipamento PerkinElmer modelo Analyst 800. Para as determinaes, 1 ml da amostra foi
transferido para um bquer de vidro contendo 5 ml de gua (Millipore 18,2 m.cm), o qual
foi colocado em uma chapa com aquecimento. Durante o aquecimento da amostra, foi
adicionado 2 a 3 ml de uma mistura cida de HNO3:HCl, para digerir os acares formando
CO2 e H2O. O tempo de digesto foi de 3 a 4 h ou at que fosse notada mudana da cor
inicial. Aps a digesto, a amostra foi resfriada e transferida quantitativamente para um balo
volumtrico, onde o volume foi completado com gua (Millipore 18,2 m.cm). A diluio foi
feita em funo da concentrao da amostra e da sensibilidade do aparelho.
3.10.4 Determinao do pH
Os valores de pH das amostras foram determinados por potenciometria, em um aparelho

Micronal modelo B474, com correo de temperatura.
63
3.10.5 Determinao da densidade
Os valores de densidade dos hidrolisados foram determinados em temperatura

ambiente, atravs do uso de um picnmetro de 50 ml.
3.10.6 Determinao da cor dos hidrolisados
Para determinao da cor, o pH das amostras do hidrolisado foi ajustado para 5,5, pela
adio de NaOH 6N. Em seguida as amostras foram centrifugadas (4330 g, 10 minutos),
filtradas em membrana HSWP com poros de 0,45 m (Millipore) e diludas em gua destilada
tambm com o pH ajustado para 5,5. As solues obtidas foram analisadas em
espectrofotmetro (Beckman DU 640B) em um comprimento de onda de 440 nm. Nesta
anlise, o valor zero foi atribudo gua destilada, e a diferena entre as leituras foi calculada
como porcentagem de remoo de cor.
3.10.7 Determinao da concentrao celular da levedura Candida guilliermondii
O crescimento celular da levedura Candida guilliermondii foi acompanhado por medida

da densidade tica a 600 nm em espectrofotmetro (Beckman DU 640B). Amostras de
volume conhecido foram centrifugadas a 4330 g por 10 minutos, para recuperao da massa
celular que posteriormente foi lavada 2 vezes com gua destilada e diluda para uma faixa de
leitura entre 0,05 a 0,5 unidades de DO. A concentrao celular foi determinada utilizando
uma equao obtida por regresso linear dos dados entre peso seco e absorbncia a 600 nm.
3.10.8 Determinao da concentrao celular da bactria Lactobacillus delbrueckii
O crescimento celular da bactria Lactobacillus delbrueckii foi acompanhado por

medida da densidade tica a 620 nm em espectrofotmetro (Hitachi U-1800). A massa de
clulas, proveniente de amostras de volume conhecido, foi lavada com gua destilada e
devidamente diluda para uma faixa de leitura entre 0,05 a 0,5 unidades de DO. A
concentrao celular foi determinada utilizando uma equao obtida por regresso linear dos
dados entre peso seco e absorbncia a 620 nm.
64

xilitol
O fator de converso de xilose em xilitol (YP/S, g/g) foi calculado pela relao entre a
concentrao de xilitol formado (g/l) e a concentrao de xilose consumida (g/l). O fator de
converso de substrato em clulas (YX/S, g/g) foi calculado pela relao entre a concentrao
de clulas formadas (g/l) e a concentrao de substrato (glicose + xilose) consumido (g/l). O
fator de rendimento de xilitol por clula (YP/X, g/g) foi determinado pela relao entre a
concentrao de xilitol formado (g/l) e a concentrao de clulas presentes no meio de
fermentao (g/l). A produtividade volumtrica em xilitol (QP, g/l.h) foi calculada pela
relao entre a concentrao de xilitol formado (g/l) e o tempo de fermentao (h). O
coeficiente volumtrico de consumo de xilose (QS, g/l.h) foi calculado pela relao entre a
concentrao de xilose consumida (g/l) e o tempo de fermentao (h). A eficincia de
produo de xilitol (, %) foi calculada pela relao entre os valores de YP/S obtido (g/g) e o
valor mximo terico para este parmetro (0,917 g/g) de acordo com Barbosa et al. (1988).

cido lctico
O fator de converso de glicose em cido lctico (YP/S, g/g) foi calculado pela relao
entre a concentrao de cido lctico formado (g/l) e a concentrao de glicose consumida
(g/l). A produtividade volumtrica em cido lctico (QP, g/l.h) foi calculada pela relao entre
a concentrao de cido lctico formado (g/l) e o tempo de fermentao (h). O fator de
rendimento de cido lctico por clula (YP/X, g/g) foi determinado pela relao entre a
concentrao de cido lctico formado (g/l) e a concentrao de clulas presentes no meio de
fermentao (g/l). O rendimento mximo terico para a produo de cido lctico de 1 g/g
(para microrganismos homofermentativos).
3.10.11 Determinao do teor de protenas totais presentes no extrato celuloltico
O teor de protenas totais do extrato enzimtico comercial foi determinado de acordo

com o mtodo de Bradford (1976), utilizando como padro a albumina de soro bovino.
65
3.10.12 Determinao da atividade enzimtica do extrato celuloltico
A atividade celuloltica total do extrato enzimtico comercial foi determinada de acordo

com o procedimento descrito por Mandels, Andreotti e Roche (1976), sendo expressa como
unidades de papel de filtro (FPU). Nesta anlise, 1,5 ml da soluo de enzima diluda em
tampo citrato de sdio 0,05M (pH 4,8) foi adicionado em um tubo de ensaio contendo uma
tira de 50 mg de papel de filtro Whatman no1. Esta mistura foi incubada a 50C durante 1 h.
Os acares redutores liberados do papel de filtro pela ao do extrato celuloltico foram
estimados pelo mtodo do cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) segundo Miller (1959). soluo
incubada foram adicionados 3 ml de DNS e esta foi mantida durante 5 minutos em banho
maria a 100C. Aps resfriamento foi feita a leitura da absorbncia a 540 nm em
espectrofotmetro (Hitachi U-1800). Os acares redutores foram expressos em moles de
glicose liberados, com base em uma curva de calibrao feita entre absorbncia e
concentrao de glicose. Uma unidade de papel de filtro definida como a quantidade de
enzima necessria para liberar 1 mol de glicose a partir de papel de filtro Whatman no 1, em
1 minuto, a 50C.
3.10.13 Determinao do nmero kappa das polpas de celulose
O nmero kappa (medida indireta de determinao da lignina residual na polpa) foi

determinado pela oxidao por permanganato de potssio e titulao iodomtrica com
tiossulfato de sdio, seguindo-se metodologia padro (TAPPI, 1985). Amostras de polpas,
com massas entre 0,30 e 0,35 g foram pesadas com preciso de 0,1 mg em bqueres e
suspensas em 10 ml de gua destilada. Cada suspenso de polpa foi transferida com 140 ml de
gua para um erlenmeyer de 500 ml que foi mantido a 25oC sob agitao magntica.
Uma soluo foi preparada misturando 25 ml de uma soluo padro de KMnO4 0,1 N
(recm preparada) com 25 ml de H2SO4 4 N, em um erlenmeyer de 125 ml que foi mantido a
25oC sob agitao magntica (soluo A). Essa soluo foi adicionada quantitativamente a
cada erlenmeyer contendo a suspenso de polpa, utilizando-se 50 ml de gua destilada para
lavar as paredes do frasco. Aps exatos 10 min (medidos com um cronmetro) foram
adicionados 5,0 ml de uma soluo de KI 0,1 N. Essa mistura foi titulada com uma soluo
padronizada de Na2S2O3 0,1 N at prximo ao ponto de viragem (desaparecimento da cor
castanha). Em seguida, foram adicionados 2,5 ml de uma soluo de amido 2% e a titulao
66
prosseguiu at a viragem de azul a incolor.

Em um experimento paralelo foi quantificado o consumo de KMnO4 sem a adio de
polpa (branco), substituindo-se a suspenso de polpa por 150 ml de gua destilada e seguindo-
se o mesmo procedimento descrito acima.
O nmero kappa foi determinado pelas equaes 10, 11 e 12 a seguir (TAPPI, 1985),
baseados no volume de KMnO4 e nos ajustes para o volume consumido e para a temperatura.
P = (b-a)*N/0,1 equao 10
f = 0,0084*P + 0,895 equao 11
k = P*f *[1 + 0,013*(25 T)]/W equao 12
onde: P = volume de KMnO4 que reagiu (ml); a = volume de Na2S2O3 consumido pela
amostra (ml); b = volume de Na2S2O3 consumido pelo branco (ml); f = fator de correo
determinado para cada P (TAPPI, 1985); N = normalidade da soluo de Na2S2O3; T =
temperatura da anlise (oC); W = massa da polpa seca (g); k = nmero kappa.
3.10.14 Determinao da viscosidade das polpas de celulose
Para a determinao da viscosidade das polpas foi utilizado um viscosmetro em U

(Ostwald Fensk) imerso em banho termostatizado a 25 0,1C. A determinao da
constante do viscosmetro (kv) foi feita com H2SO4 98% p/p. O lquido foi aspirado at
ultrapassar as duas marcas de calibrao e deixado escoar, sendo ento determinado o tempo
necessrio para que o menisco do lquido ultrapassasse as 2 marcas. Atravs dos valores de
densidade e viscosidade do H2SO4 98% p/p, na temperatura de trabalho, foi calculada a
constante do viscosmetro pela equao 13:
kv = V/t*d equao 13
onde: kv = constante do viscosmetro (cP*cm3/s*g), V = viscosidade do H2SO4 a 25C =

19,25 cP (TAPPI, 1982); d = densidade do H2SO4 a 25C = 1,84 g/cm3 (WEAST, 1984); t =
tempo de escoamento (s).
A viscosidade das polpas foi determinada pelo mtodo padro Tappi (1982). Uma
massa de 0,125 g de cada polpa seca foi pesada (com preciso de 0,1 mg) e em seguida foram
adicionados 25 ml de etilenodiamina cprica (soluo 0,5 M em Cu+2). A mistura obtida foi
mantida sob agitao magntica por 20 min, sendo, aps esse tempo, filtrada em cadinho de
vidro sinterizado (no 3) e transferida para o viscosmetro previamente aferido. Depois de
67
atingido o equilbrio trmico, a soluo foi aspirada e o tempo de escoamento foi medido
conforme descrito anteriormente. A viscosidade da polpa foi determinada pela equao 14:
V = kv*t*d Equao 14
onde: V = viscosidade da soluo (cP); kv = constante do viscosmetro (cP*cm3/s*g); t =

tempo de escoamento (s); d = densidade da soluo de celulose (1,052 g/cm3 TAPPI, 1982).
3.10.15 Determinao da alvura das polpas de celulose
A alvura das polpas foi determinada de acordo com a norma Tappi (1991). Para
determinao da alvura, foram preparados corpos de prova seguindo a norma Tappi T-218 sp-
97. Cerca de 4 g de polpa (base seca) foram suspensas em 1300 ml de gua destilada e a
suspenso obtida foi agitada durante 5 min, sendo posteriormente vertida em um funil de
Bchner de 70 mm de dimetro e filtrada a vcuo. Aps filtrao, o funil foi invertido e a
polpa foi liberada atravs da passagem de um fluxo de ar. A folha de prova assim formada foi
ento prensada e colocada para secar em ambiente protegido da luz. Aps um dia, as folhas,
com gramatura de 0,09 g/cm2, tiveram a porcentagem de reflexo em 457 nm determinada em
um aparelho Photovolt modelo 577. A porcentagem de reflexo foi determinada em trs
pontos diferentes das polpas e os resultados foram apresentados como mdia destas medidas.
A gramatura, ou seja, a massa por unidade de rea do papel, foi calculada atravs da equao
15, onde g = gramatura (g/cm2), m = massa do corpo de prova (g) e A = rea do corpo de
prova (cm2).
g = (m/A)*104 Equao 15
3.10.16 Fotomicrografias
Amostras secas do bagao de malte foram colocadas na base de um suporte metlico,

onde foram aderidas atravs de uma fita adesiva. Em seguidas, estas foram recobertas com
ouro e analisadas em um microscpio eletrnico de varredura da marca Leo 1450VP, sendo
ento obtidas as fotomicrografias. Estas anlises foram realizadas no Departamento de
Engenharia de Materiais (DEMAR) da EEL-USP.
68
4 RESULTADOS E DISCUSSO

PRELIMINARES DE HIDRLISE CIDA EM AUTOCLAVE
4.1.1 Composio qumica do bagao de malte
Aps obteno, o bagao de malte foi lavado com gua para remover os acares
residuais provenientes do mosto, e secado at atingir 10% de umidade. Este procedimento foi
realizado para poder manter as caractersticas do material durante a estocagem, uma vez que,
o bagao de malte procedente do mosto cervejeiro contm acares fermentveis e apresenta
um teor de umidade de aproximadamente 80%, o que favorece sua deteriorao. A secagem
da matria-prima tambm interessante em termos de reduo de volume e diminuio dos
custos de armazenamento.
A composio qumica do bagao de malte utilizado neste trabalho est apresentada na
Tabela 4.1, onde os valores esto expressos como porcentagem em peso seco de celulose
(glucana), hemicelulose (xilana + arabinana), lignina total (Klason + solvel em cido), cinzas
grupos acetil, protenas, e extrativos. Observa-se que o bagao de malte produzido a partir de
100% malte de cevada um material lignocelulsico composto principalmente por (% p/p):
hemicelulose (28,42), lignina (27,78), celulose (16,78) e protenas (15,25). A estrutura
hemicelulsica formada pelos polissacardeos xilana e arabinana em uma proporo de
2,3:1. Embora o teor de arabinana no bagao de malte seja elevado, xilana e glucana so os
principais polissacardeos presentes neste material, assim como em outros resduos agrcolas.
Por outro lado, o bagao de malte apresenta um alto teor de lignina (27,78 % p/p) que o
diferencia da maioria dos resduos agrcolas. Bagao de cana-de-acar, palha de arroz e
palha da cevada, por exemplo, apresentam teores de lignina de 18,10, 17,20 e 15,80 % p/p,
respectivamente (ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; SUN et al., 2004, 2005).
O teor de protenas no bagao de malte (15,25 % p/p) tambm maior do que os teores
encontrados em outros materiais lignocelulsicos, tais como as palhas de cevada, aveia, arroz
e trigo, as quais contm entre 3,0 a 5,0 % p/p de protenas (THEANDER; AMAN, 1984). Os
aminocidos ligados s protenas no foram determinados no presente trabalho, mas alguns
69
autores relataram que o bagao contm os aminocidos: leucina, valina, alanina, serina,
glicina, cido glutmico, cido asprtico, tirosina, prolina, treonina, arginina, lisina, cistina,
histidina, isoleucina, metionina, fenilalanina, e triptofano (HUIGE, 1994; MARIANI, 1953).
Tabela 4.1 - Composio qumica do bagao de malte.

Componente (% p/p)
Celulose (glucana) 16,78
Hemicelulose 28,42
Xilana 19,94
Arabinana 8,48
Lignina total 27,78
Lignina Klason 22,96
Lignina solvel em cido 4,82
Cinzas 4,60
Grupos acetil 1,35
Protenas 15,25
Extrativos (por diferena) 5,82
Minerais (mg/kg)
Clcio 3515,0
Sdio 309,3
Potssio 258,1
Magnsio 1958,0
Alumnio 36,0
Ferro 193,4
Brio 13,6
Estrncio 12,7
Mangans 51,4
Cobre 18,0
Zinco 178,0
Fsforo 5186,0
Enxofre 1980,0
Cromo 5,9
Silcio 10740,0
Alm de celulose, hemicelulose, lignina e protenas, o bagao de malte tambm

apresenta 4,6% p/p de cinzas. Uma anlise de espectrometria de emisso atmica revelou que
diversos minerais esto presentes na composio deste material, os quais incluem: clcio,
sdio, potssio, magnsio, alumnio, ferro, brio, estrncio, mangans, cobre, zinco, fsforo,
enxofre, cromo e silcio, em nveis que variam de 5,9 a 10740,0 mg/kg em peso seco (Tabela
4.1). Assim como nas palhas de cereais (aveia, cevada, arroz e trigo) (THEANDER; AMAN,
70
1984), as cinzas do bagao de malte tambm so ricas em silcio; entretanto, o bagao

apresenta teores mais elevados de fsforo e clcio, minerais existentes em menores
propores nestas outras matrias-primas.
O teor de extrativos (ceras, gorduras, gomas, amidos, resinas, taninos, leos essenciais,
e vrios outros constituintes citoplasmticos (KUHAD; SINGH, 1993)) no bagao de malte
foi calculado por diferena. As vitaminas presentes neste material no foram determinadas,
mas alguns autores relataram a presena de (ppm): biotina (0,1), colina (1800), cido flico
(0,2), niacina (44), cido pantotnico (8,5), riboflavina (1,5), tiamina (0,7) e vitamina B6 (0,7)
(HUIGE, 1994; MARIANI, 1953).
Aps sua caracterizao, o bagao de malte foi submetido a um processo de hidrlise
cida visando recuperar os acares provenientes da hemicelulose (xilose e arabinose). A
partir da composio qumica do material, o rendimento mximo destes acares que poderia
ser obtido no hidrolisado foi calculado e correspondeu a 19,6 g de xilose e 8,3 g de arabinose
(g/100 g em peso seco).
4.1.2 Ensaios preliminares de hidrlise cida do bagao de malte em autoclave
Estes ensaios foram propostos para se ter uma avaliao preliminar do comportamento
da reao do bagao de malte em meio cido sulfrico, visando recuperar os acares da
frao hemicelulsica. Nesta etapa, foi utilizado um planejamento fatorial completo 22 para
avaliar a influncia das variveis relao slido:lquido e concentrao de cido sulfrico, na
hidrlise do bagao de malte. As faixas de valores das variveis utilizadas foram selecionadas
de acordo com trabalhos da literatura que utilizaram valores similares para hidrlise cida de
outros materiais lignocelulsicos (AGUILAR et al., 2002; ROBERTO; MUSSATTO;
RODRIGUES, 2003; TLLEZ-LUIS; RAMREZ; VZQUEZ, 2002).
Os hidrolisados obtidos nas diferentes condies de hidrlise foram analisados para
determinao da concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de
degradao (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico. Os resultados
obtidos esto apresentados na Tabela 4.2. Nota-se que a concentrao destes compostos nos
hidrolisados variou para cada condio de hidrlise empregada. Todos os hidrolisados
continham xilose e arabinose em concentraes muito mais elevadas que a de glicose, sendo
que as mximas concentraes destes acares (obtidas no ensaio 3) corresponderam a 13,21
e 8,21 g/l, respectivamente, enquanto que a mais alta concentrao de glicose (tambm obtida
71
no ensaio 3) correspondeu a apenas 0,32 g/l. Estes resultados sugerem que as condies de
hidrlise utilizadas foram capazes de hidrolisar apenas a frao hemicelulsica do material,
sem interferir praticamente na estrutura da celulose, que teria permanecido inalterada.
Tabela 4.2 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradao (furfural,
hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico nos hidrolisados hemicelulsicos de
bagao de malte obtidos em autoclave sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveisa Respostas (g/l)
S:L A Glicose Xilose Arabinose Furfural HMFb Lignina cido

(g:g) (mg/g) solvel actico
1 1:10 100 0,17 9,65 8,08 0,04 0,10 3,79 0,49
2 1:20 100 0,01 2,15 3,91 0,04 0,13 3,29 0,08
3 1:10 120 0,32 13,21 8,21 0,02 0,03 2,05 0,60
4 1:20 120 0,05 3,68 4,00 0,01 0,04 2,40 0,19
5 1:15 110 0,12 6,27 5,62 0,03 0,06 2,78 0,34
6 1:15 110 0,11 5,88 5,52 0,03 0,07 2,56 0,30
7 1:15 110 0,11 5,35 5,36 0,03 0,06 2,61 0,27
a
S:L = relao slido:lquido; A = concentrao de cido sulfrico; b hidroximetilfurfural.
De acordo com Lee et al. (1978), durante o processo de hidrlise cida a hemicelulose
hidrolisada mais rapidamente do que a celulose; e quando a reao conduzida em condies
que favorecem a hidrlise da celulose, a maior parte da xilose degradada a furfural, sendo
ento muito pouco recuperada. No presente trabalho, as condies de hidrlise utilizadas
praticamente no hidrolisaram a celulose e tambm no favoreceram a formao de furfural e
hidroximetilfurfural (subprodutos provenientes da degradao de pentoses e hexoses,
respectivamente), uma vez que estes compostos estavam presentes nos hidrolisados em
concentraes muito baixas (<0,13 g/l, Tabela 4.2). Estes resultados mostram, portanto, que
para todas as condies de hidrlise estudadas, apenas pequenas quantidades de acares
foram degradadas. As concentraes de furfural e hidroximetilfurfural obtidas foram inclusive
menores do que os valores encontrados em hidrolisados cido diludos produzidos a partir de
outras matrias-primas lignocelulsicas, tais como silagem, gramneas, bagao de cana-de-
acar, palhas de arroz e de sorgo e madeiras (AGUILAR et al., 2002; KIM; YUM; PARK,
2000; NEUREITER et al., 2004; ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; TLLEZ-
LUIS; RAMREZ; VZQUEZ, 2002).
Durante a hidrlise cida do bagao de malte, os grupos acetil ligados estrutura da
xilana tambm foram liberados no meio reacional, uma vez que foi verificada a presena de
72
cido actico em todos os hidrolisados obtidos (Tabela 4.2). Porm, este composto tambm
estava presente em baixas concentraes nos hidrolisados, variando de 0,08 a 0,6 g/l. A
hidrlise cida foi ainda capaz de solubilizar parte da estrutura da lignina do bagao de malte,
sendo que a lignina solvel foi o subproduto obtido em maior concentrao nos hidrolisados
(variando de 2,05 a 3,79 g/l, Tabela 4.2). A escolha de uma condio de hidrlise que
minimize a formao destes compostos de grande interesse, pois favoreceria o emprego do
hidrolisado em processos de bioconverso uma vez que a lignina solvel composta
principalmente por compostos fenlicos, os quais so extremamente txicos para os
microrganismos (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a).
4.1.3 Anlise estatstica da hidrlise cida do bagao de malte em autoclave
A partir das concentraes de xilose e arabinose presente nos hidrolisados, foram

calculadas as eficincias de hidrlise da xilana, da arabinana, e da hemicelulose (xilana +
arabinana) (Tabela 4.3). As estimativas dos efeitos das variveis utilizadas na hidrlise e a
significncia estatstica delas foram determinadas pelo teste t de Student e podem ser
visualizados nos grficos de Pareto apresentados na Figura 4.1.
Tabela 4.3 - Eficincia de hidrlise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana)

durante a hidrlise cida do bagao de malte em autoclave, sob diferentes condies
operacionais.
Ensaio Eficincia de hidrlise (%)
Xilana Arabinana Hemicelulose

1 48,93 96,35 63,08
2 21,89 93,59 43,28
3 66,97 97,84 76,18
4 37,44 95,68 54,81
5 47,71 100,00 63,48
6 44,75 98,80 60,87
7 40,67 95,80 57,12
Observa-se que ambas as variveis, relao slido:lquido e concentrao de cido, no

apresentaram influncia significativa ao nvel de 95% de confiana sobre a hidrlise da
arabinana (Figura 4.1A). Este fato justificvel uma vez que a eficincia de hidrlise da
arabinana foi maior que 93,6 % para todas as condies de hidrlise avaliadas (Tabela 4.3).
73
Por outro lado, a eficincia de hidrlise da xilana variou significativamente, de 21,89 a

66,97%, demonstrando que houve influncia das condies de hidrlise, sobre esta resposta.
interessante notar que a condio que proporcionou o menor valor de eficincia de hidrlise
da arabinana (93,59%, ensaio 2) tambm proporcionou o menor valor de eficincia de
hidrlise da xilana (21,89%). No entanto, se compararmos estes dois valores fica evidente que
a arabinana do bagao de malte hidrolisada muito mais facilmente do que a xilana. Kabel et
al. (2002) tambm observaram que durante o tratamento hidrotrmico do bagao de malte, a
arabinose foi removida mais facilmente da estrutura da hemicelulose do que a xilose. De
acordo com Carvalheiro et al. (2004b), a arabinose possui uma maior sensibilidade trmica do
que a xilose e por esta razo ela liberada primeiro da estrutura da hemicelulose.
p=0,05
p=,05 p=0,05
(1) -0,98 (1) -9,69
(2) 0,72 (2) 5,75
(12) 0,12 (12) -0,43
(A) (B)
0 1 2 3 4 0 2 4 6 8 10 12
Estimativa dos efeitos Estimativa dos efeitos
p=0,05 p=0,05
(1) -7,48 (2) -6,42
(2) 4,47 (12) 2,18
(12) -0,28 (1) -0,40
(C) (D)
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8
Estimativa dos efeitos Estimativa dos efeitos
Figura 4.1 - Grficos de Pareto para estimativa dos efeitos das variveis: (1) relao slido:lquido, (2)
concentrao de cido sulfrico e (12) a interao entre elas, nas respostas: eficincia de
hidrlise da arabinana (A), eficincia de hidrlise da xilana (B), eficincia de hidrlise da
hemicelulose (xilana + arabinana) (C) e concentrao de lignina solvel (D), obtidas nos
processos de hidrlise cida do bagao de malte em autoclave. Efeitos acima da linha de
p=0,05 so significativos ao nvel de 95% de confiana.
74
O efeito da relao slido:lquido e da concentrao de cido na eficincia de hidrlise

da xilana est apresentado na Figura 4.1B. Como se pode observar, ambas as variveis
apresentaram efeito principal significativo ao nvel de 95% de confiana nesta resposta. O
efeito negativo da relao slido:lquido indica que a eficincia de hidrlise da xilana foi
favorecida quando a relao slido:lquido foi diminuda; enquanto que o efeito positivo da
concentrao de cido demonstra que a eficincia de hidrlise foi maior quanto maior a
concentrao de cido utilizada. O aumento no rendimento de xilose devido ao aumento da
concentrao de cido sulfrico tambm foi observado durante a hidrlise de outros materiais
lignocelulsicos, tais como bagao de cana-de-acar, silagem e gramneas (NEUREITER et
al., 2002, 2004). Quando comparamos as Figuras 4.1B e 4.1C, observa-se que as variveis
operacionais apresentaram efeitos similares para ambas as eficincias de hidrlise da xilana e
da hemicelulose. Isto provavelmente se deve ao fato de que a eficincia de hidrlise da
arabinana foi praticamente a mesma para todas as condies avaliadas. Logo, a eficincia de
hidrlise da hemicelulose foi dependente principalmente da hidrlise da xilana. A interao
entre as variveis no foi significativa para nenhuma das respostas analisadas, sugerindo que
o efeito de cada varivel deve ser interpretado individualmente.
A anlise estatstica para a resposta de lignina solvel (Figura 4.1D) revelou que apenas
a concentrao de cido apresentou efeito significativo ao nvel de 95% de confiana para esta
resposta e com um efeito negativo, indicando que a solubilizao da lignina foi favorecida
quanto menor a concentrao de cido utilizada no processo. Entretanto, o valor mximo de
lignina solvel no pode ser obtido em ausncia de cido, mas uma concentrao mnima
deste requerida. Por outro lado, para se obter uma baixa concentrao de lignina solvel, a
concentrao de cido deve ser aumentada. Isto ocorre porque o cido promove a reticulao
da lignina, impedindo sua solubilizao. Logo, com o aumento na concentrao de cido uma
maior parte da lignina se torna reticulada e deixa de ser solubilizada no meio reacional
(FENGEL; WEGENER, 1989).
Uma anlise de varincia com estimativa de curvatura foi realizada para todas as
respostas estudadas e revelou que este parmetro no apresentou significncia estatstica
mesmo a 90% de confiana. Isto significa que na regio em estudo, os valores das respostas
variaram de forma linear. Como as condies que promoveram os mais altos valores de
eficincia de hidrlise da xilana e da hemicelulose foram as mesmas que proporcionaram os
mais baixos valores de lignina solvel, as melhores condies para hidrlise cida do bagao
de malte em autoclave, na regio em estudo, foram baseadas no uso de uma relao
75
slido:lquido de 1:10 g:g e uma concentrao de cido sulfrico de 120 mg/g de matria
seca. Entretanto, os valores de eficincia obtidos com o uso destas condies de hidrlise
(67% para a xilana e 76,2% para a hemicelulose, ensaio 3) revelam que as condies de
hidrlise cida do bagao de malte ainda precisam ser otimizadas de forma a aumentar a
recuperao dos acares da frao hemicelulsica, principalmente xilose. Observando o
cromatograma obtido para esta condio de hidrlise (Figura 4.2), nota-se a existncia de
picos entre os tempos de reteno de 6,5 a 8 minutos, sugerindo a presena de oligmeros no
hidrolisado. De acordo com alguns autores, a hemicelulose apresenta duas fraes de xilana
com diferentes suscetibilidades hidrlise, sendo que uma reage mais rapidamente do que a
outra. A frao que mais facilmente hidrolisada com cidos diludos corresponde a 60-80%
do total enquanto que os restantes 20-40% correspondem a uma frao mais difcil de ser
hidrolisada (GARROTE; DOMNGUEZ; PARAJ, 2002; KIM; YUM; PARK, 2002;
LAVARACK; GRIFFIN; RODMAN, 2002).
arabinose - 10.486
1400.00
xilose - 9.517
1200.00
1000.00
800.00
MV
600.00
glicose - 8.863
400.00
12.046
200.00
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
Minutes
Figura 4.2 - Cromatograma do hidrolisado obtido em autoclave, nas condies de relao slido
lquido de 1:10 g:g e 120 mg de cido/g de matria seca.
4.2 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE CIDA EM REATOR VISANDO

A MXIMA LIBERAO DE XILOSE E PRODUO DE XILITOL A PARTIR DO
HIDROLISADO
Nesta etapa do trabalho, os experimentos de hidrlise cida foram realizados em reator

visando aumentar a eficincia de hidrlise da hemicelulose do bagao de malte, conforme
76
discutido na seo anterior. Estes ensaios foram realizados de acordo com um planejamento
fatorial completo 23 para avaliar o efeito das variveis relao slido:lquido, concentrao de
cido sulfrico e tambm do tempo de reao, nas respostas de eficincia de hidrlise da
xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) e na fermentabilidade dos
hidrolisados obtidos para a produo de xilitol.
4.2.1 Composio qumica dos hidrolisados obtidos
Assim como nos experimentos de hidrlise em autoclave, xilose e arabinose tambm

foram os principais acares presentes nos hidrolisados produzidos em reator (Tabela 4.4). A
partir das concentraes destes compostos foram calculadas as eficincias de hidrlise, cujos
valores obtidos esto apresentados na Tabela 4.5. Analisando esta tabela, observa-se que os
resultados de hidrlise cida do bagao de malte em reator foram superiores aos obtidos em
autoclave, principalmente em relao eficincia de hidrlise da xilana e da hemicelulose.
Em autoclave, a mxima eficincia de hidrlise da xilana e da hemicelulose foi 67% e 76,2%,
respectivamente, enquanto que em reator estes valores atingiram 94,2% e 96,5%, (ensaio 8
Tabela 4.5). Mesmo para a condio que proporcionou os mais baixos resultados de eficincia
em reator, os valores de hidrlise da xilana e da hemicelulose foram 28% e 16% superiores
melhor condio obtida em autoclave. Isto demonstra que os ensaios preliminares em
autoclave foram importantes, pois mostraram a direo para a qual os valores das variveis
exerciam maior influncia no processo de hidrlise. Alm disso, os melhores resultados
obtidos nesta etapa podem ser atribudos tambm ao sistema de agitao, presente em reator e
ausente em autoclave, o que permitiu uma maior interao entre as partculas do material e a
soluo cida.
Os elevados valores de eficincia de hidrlise (>85,8%) obtidos para ambos, xilana e
arabinana, proporcionaram elevados valores de eficincia de hidrlise da hemicelulose,
variando de 88,7 a 96,5% para todas as condies avaliadas. A anlise estatstica destes
resultados revelou que no houve diferena entre os tratamentos a um nvel de confiana de
95%, o que permite concluir que a faixa de valores estudada em reator j se encontra dentro
de uma regio tima, onde a extrao de xilose e arabinose foi mxima independente das
variaes aplicadas.
77
Tabela 4.4 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradao (furfural,
hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico nos hidrolisados hemicelulsicos
de bagao de malte obtidos em reator sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveisa Concentrao (g/l)b
S:L A T Gli Xil Arab Furfural HMF Lignina Ac.

(g:g) (mg/g) (min) solvel actico
1 1:8 100 17 1,19 21,88 10,71 0,63 0,09 4,22 1,20
2 1:12 100 17 0,57 14,28 7,17 0,31 0,05 2,66 0,77
3 1:8 140 17 1,72 21,44 10,10 0,99 0,08 2,70 1,19
4 1:12 140 17 1,08 15,11 7,21 0,48 0,04 2,73 0,76
5 1:8 100 37 1,25 20,96 10,12 0,87 0,07 3,22 1,34
6 1:12 100 37 0,57 14,36 6,81 0,28 0,03 2,26 1,12
7 1:8 140 37 1,89 22,62 10,51 1,02 0,07 2,56 1,39
8 1:12 140 37 0,96 15,48 7,12 0,46 0,03 2,20 0,81
9 1:10 120 27 1,33 18,16 8,65 0,58 0,04 3,40 1,12
10 1:10 120 27 1,30 17,69 8,40 0,65 0,05 3,50 1,03
11 1:10 120 27 1,36 17,60 8,23 0,50 0,04 3,16 1,08
12 1:10 120 27 1,12 16,94 8,03 0,60 0,05 3,13 0,99
a
S:L = relao slido:lquido; A = concentrao de cido sulfrico; T = tempo de reao.
b
Gli = glicose; Xil = xilose; Arab = arabinose; HMF = hidroximetilfurfural
Tabela 4.5 - Eficincia de hidrlise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana)

durante a hidrlise cida do bagao de malte em reator, sob diferentes condies
operacionais.
Ensaio Variveisa Eficincia de hidrlise
S:L A T Xilana Arabinana Hemiceluloseb

(g:g) (mg/g) (min)
1 1:8 100 17 88,7 100,0 92,7
2 1:12 100 17 87,1 99,0 91,8
3 1:8 140 17 86,7 96,1 89,5
4 1:12 140 17 91,7 100,0 95,1
5 1:8 100 37 87,2 96,6 90,0
6 1:12 100 37 87,5 97,6 90,5
7 1:8 140 37 91,5 100,0 94,1
8 1:12 140 37 94,2 100,0 96,5
9 1:10 120 27 92,0 100,0 95,3
10 1:10 120 27 89,6 100,0 92,7
11 1:10 120 27 89,1 98,1 91,8
12 1:10 120 27 85,8 95,7 88,7
a
b
Hemicelulose = xilana + arabinana.
78
Glicose tambm estava presente nos hidrolisados obtidos em reator, em concentraes

bem menores do que as de xilose e arabinose (Tabela 4.4). Segundo Tllez-Luis, Ramrez e
Vzquez (2002), a glicose liberada nos hidrolisados pode ser proveniente da hemicelulose ou
da celulose. No entanto, normalmente a celulose no hidrolisada nas condies operacionais
empregadas para hidrlise com cido diludo. Como no presente trabalho as concentraes de
glicose e hidroximetilfurfural (produto da degradao da glicose) nos hidrolisados foram
muito baixas (<1,9 e <0,1 g/l, respectivamente), provvel, portanto, que praticamente toda a
glicose tenha sido liberada a partir da hemicelulose do bagao de malte.
Alm de acares, os hidrolisados obtidos em reator tambm continham cido actico,
furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel (Tabela 4.4), assim como observado nos
hidrolisados obtidos em autoclave. O cido actico um composto que, quando presente nos
hidrolisados em concentraes maiores que 3 g/l, atua como um potente inibidor do
metabolismo microbiano se o hidrolisado for utilizado como meio de fermentao (FELIPE et
al., 1995). Segundo Lawford e Rousseau (1998), este cido atravessa a membrana celular e
diminui o pH intracelular, afetando ento o metabolismo do microrganismo. Como os
hidrolisados de bagao de malte continham cido actico em concentraes variando de 0,76
a 1,39 g/l (Tabela 4.4), provavelmente este cido no ser capaz de afetar o metabolismo
microbiano quando o hidrolisado for utilizado como meio de fermentao. Porm, no se deve
desconsiderar seu efeito interativo com outros compostos txicos.
Furfural e hidroximetilfurfural foram encontrados em pequenas quantidades (<1,02 g/l)
nos hidrolisados, demonstrando que novamente houve pouca degradao dos acares durante
o processo de hidrlise cida, independente das condies operacionais utilizadas. Apesar de
pequenas, as concentraes de furfural nos hidrolisados foram superiores s concentraes de
hidroximetilfurfural (Tabela 4.4), sugerindo que os acares do tipo pentoses foram mais
suscetveis degradao do que os acares do tipo hexoses. De acordo com Pessoa Jr,
Mancilha e Sato (1997), a degradao dos acares durante o processo de hidrlise cida
ocorre quando se utiliza uma elevada concentrao de cido, ou quando a homogeneizao do
reator feita de forma inadequada, criando regies com alta acidez. Tllez-Luis, Ramrez e
Vzquez (2002) observaram um aumento na concentrao de furfural quando aumentaram a
concentrao de cido e o tempo de reao utilizados na hidrlise cida da palha de sorgo.
Lavarack, Griffin e Rodman (2002) tambm verificaram que o aumento da concentrao de
cido durante a hidrlise cida do bagao de cana-de-acar favoreceu a degradao de xilose
a furfural. No presente trabalho, as baixas concentraes de furfural e hidroximetilfurfural
79
obtidas nos hidrolisados provavelmente foram resultados da baixa concentrao de cido

(<1,5%) e temperatura de reao (<120C) utilizadas.
Alm de cido actico, furfural e hidroximetilfurfural, todos os hidrolisados obtidos
tambm continham lignina solvel, em concentraes que variaram de 2,2 a 4,22 g/l (Tabela
4.4). Quando comparado com os outros subprodutos presentes nos hidrolisados de bagao de
malte, estes foram os compostos produzidos em maior concentrao. Segundo Paraj,
Dominguez e Dominguez (1998b) os compostos provenientes da degradao da lignina so
mais txicos aos microrganismos do que o cido actico, hidroximetilfurfural e furfural,
mesmo quando presentes em baixas concentraes.
Ao contrrio dos outros subprodutos, a concentrao de lignina solvel nos hidrolisados
foi fortemente influenciada pelas condies de hidrlise empregadas. A anlise estatstica
para esta resposta (Tabela 4.6) revelou que todas as variveis estudadas (relao
slido:lquido, concentrao de cido e tempo de reao) apresentaram efeito significativo a
95% de confiana e com sinal negativo, o que significa que a concentrao de lignina solvel
no hidrolisado foi aumentada quando a relao slido:lquido, a concentrao de cido e o
tempo de reao empregados na hidrlise foram diminudos.
De acordo com Fengel e Wegener (1989), uma pequena frao da molcula de lignina
sempre solubilizada durante o tratamento dos materiais lignocelulsicos com cidos
minerais. No entanto, quando a concentrao de cido aumentada, a lignina se torna menos
solvel (conforme mencionado no item 4.1.3), pois as reaes de condensao passam a
ocorrer em maior proporo, modificando suas propriedades e tambm a estrutura, que se
torna mais rgida e difcil de solubilizar. O efeito do tempo de reao na solubilizao da
lignina tambm est relacionado com a condensao desta molcula. Segundo Allen, Cousin e
Pierce (1980) duas reaes consecutivas ocorrem quando a lignina hidrolisada com cidos
diludos: 1. despolimerizao da lignina pelo cido; 2. condensao/repolimerizao da
lignina parcialmente hidrolisada. Inicialmente, a reao de hidrlise predominante,
proporcionando um aumento na quantidade de lignina solvel. Entretanto, com o passar do
tempo as reaes de condensao tornam-se predominantes, causando um aumento na
quantidade de lignina insolvel residual. Recentemente, estudando a autohidrlise do bagao
de malte, Carvalheiro et al. (2004b) observaram que a recuperao de lignina no resduo
slido foi maior quando o tempo de reao foi aumentado.
80
Tabela 4.6 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a concentrao de
lignina solubilizada durante a hidrlise cida do bagao de malte.
Variveis independentes e EE E t
interaes
Mdia 2,819 0,083 33,92*
Curvatura 0,957 0,288 3,33*
X1 -0,712 0,166 4,29*
X2 -0,542 0,166 3,26*
X3 -0,517 0,166 3,11*
X1X2 0,547 0,166 3,29*
X1X3 0,052 0,166 0,32
X2X3 0,182 0,166 1,10
* valores significativos ao nvel de 95% de confiana.
X1 = relao slido:lquido; X2 = concentrao de cido sulfrico; X3 = tempo de reao.
4.2.2 Fermentabilidade dos hidrolisados de bagao de malte para produo de xilitol
A eficincia de hidrlise e a concentrao de compostos txicos no hidrolisado no so

as duas nicas respostas que devem ser avaliadas em estudos para otimizao das condies
de hidrlise. Em termos de aplicao prtica, a fermentabilidade do hidrolisado obtido
tambm muito importante e deve ser considerada. No presente trabalho, todos os hidrolisados
de bagao de malte produzidos foram empregados como meio de fermentao para a
produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii. De uma forma geral, esperado que
os hidrolisados apresentem uma boa fermentabilidade devido presena de baixos nveis de
compostos txicos e tambm porque o bagao de malte um material que apresenta um
elevado teor de protenas (15,25% p/p) que podem ser solubilizadas durante o procedimento
de hidrlise atuando como fonte de nitrognio para os microrganismos. Confirmando esta
idia, os resultados apresentados na Tabela 4.7 revelam que a levedura foi capaz de crescer e
produzir xilitol em todos os hidrolisados de bagao de malte, mas os resultados de
fermentao variaram para cada um deles, mostrando que cada condio de hidrlise produziu
um hidrolisado com diferentes caractersticas.
O consumo de glicose pela levedura foi total em todos os meios utilizados, enquanto
que o consumo de xilose variou de 67 a 96,9%, dependendo do hidrolisado empregado
(Tabela 4.7). Por outro lado, no houve consumo de arabinose pelo microrganismo durante o
tempo de fermentao considerado (24 h).
81
Tabela 4.7 - Consumo de xilose, crescimento celular e produo de xilitol nos hidrolisados de bagao
de malte produzidos em reator, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis das variveis Resultados dos processos fermentativosb
utilizadas na hidrlisea
S:L A T So Scons X P YP/S QP YX/S
(g:g) (mg/g) (min) (g/l) (%) (g/l) (g/l) (g/g) (g/l.h) (g/g)
1 1:8 100 17 21,88 78,7 3,86 10,76 0,70 0,45 0,23
2 1:12 100 17 14,28 89,3 3,97 6,30 0,46 0,26 0,28
3 1:8 140 17 21,44 75,2 3,65 9,28 0,53 0,39 0,19
4 1:12 140 17 15,11 86,1 3,61 6,98 0,50 0,29 0,24
5 1:8 100 37 20,96 82,5 4,15 9,07 0,50 0,38 0,21
6 1:12 100 37 14,36 94,5 4,51 5,32 0,38 0,22 0,31
7 1:8 140 37 22,62 67,0 3,18 9,08 0,55 0,38 0,17
8 1:12 140 37 15,48 87,2 3,98 6,43 0,43 0,27 0,24
9 1:10 120 27 18,16 79,1 3,27 7,87 0,55 0,33 0,21
10 1:10 120 27 17,69 88,1 4,46 8,05 0,51 0,33 0,26
11 1:10 120 27 17,60 88,1 4,28 7,76 0,48 0,32 0,24
12 1:10 120 27 16,94 96,9 4,57 7,45 0,41 0,31 0,24
a
b
So = concentrao inicial de xilose; Scons = porcentagem de xilose consumida; X = concentrao
celular; P = concentrao de xilitol; YP/S (g/g) = fator de rendimento em xilitol (gramas de xilitol
produzido/ gramas de xilose consumida); Qp (g/l.h) = produtividade volumtrica em xilitol
(concentrao de xilitol formado/ tempo de fermentao); YX/S (g/g) = fator de rendimento em clulas
(gramas de clulas formadas/ gramas de substrato (xilose + glicose) consumido).
O crescimento celular variou de 3,18 a 4,57 g/l, enquanto que a produo de xilitol
variou significativamente, de 5,32 a 10,76 g/l, dependendo do hidrolisado utilizado (Tabela
4.7). Como a produo de xilitol tende a aumentar com o aumento da concentrao inicial de
xilose (MUSSATTO; ROBERTO, 2003; PARAJ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1995)
estes resultados devem ser comparados em termos dos parmetros fermentativos YP/S, QP e
YX/S. De uma forma geral, quando comparado com a fermentao de hidrolisados produzidos
a partir de outras matrias-primas lignocelulsicas, todos os hidrolisados obtidos a partir do
bagao de malte apresentaram boa fermentabilidade. Paraj, Dominguez e Dominguez (1995)
obtiveram um YP/S de 0,38 g/g e QP de 0,055 g/l.h durante a fermentao do hidrolisado de
madeira contendo 17 g/l de xilose, suplementado com nutrientes. Cruz et al. (2000)
conseguiram atingir um YP/S de 0,66 g/g e QP de 0,41 g/l.h durante a fermentao do
hidrolisado de farelo de cevada suplementado ou no com nutrientes. No presente trabalho,
valores de YP/S e QP de at 0,70 g/g e 0,45 g/l.h, respectivamente, foram obtidos a partir do
hidrolisado de bagao de malte contendo 21,9 g/l de xilose, no suplementado com nutrientes.
82
Devido s diferenas observadas nos resultados de fermentao dos hidrolisados de

bagao de malte, uma anlise estatstica foi realizada para avaliar os efeitos das variveis
operacionais empregadas no processo de hidrlise, nos valores de YP/S e QP obtidos. De
acordo com esta anlise, a relao slido:lquido foi a varivel de maior influncia em ambas
as respostas, YP/S e QP, apresentando um efeito negativo (Tabela 4.8). O tempo de reao
tambm apresentou significncia estatstica ao nvel de 90% de confiana para QP, com um
efeito negativo. Estes resultados indicam que a produo de xilitol pela levedura Candida
guilliermondii foi favorecida em hidrolisados produzidos com a menor relao slido:lquido
(1:8 g:g) e menor tempo de reao (17 minutos). A concentrao de cido no apresentou
efeito principal significativo para estas respostas, mas sua interao com o tempo de reao
(BC = +2,59) e com a relao slido:lquido (AB = +4,54) foi significativa ao nvel de 90%
de confiana para QP. O sinal positivo destas interaes sugere que os valores de QP foram
maiores em hidrolisados produzidos com a menor concentrao de cido (100 mg/g de
matria seca). A curvatura no foi significativa para ambas as respostas, YP/S e QP (Tabela
4.8), revelando que os valores destes parmetros aumentaram linearmente quando os valores
das variveis operacionais utilizadas nas hidrlises foram diminudos.
interessante notar que o hidrolisado produzido nas condies que favoreceram YP/S e
QP (condies do ensaio 1) foi o que apresentou a mais alta concentrao de lignina solvel
(Tabela 4.4). Em um trabalho realizado por Mussatto e Roberto (2004b) sobre a produo de
xilitol a partir de hidrolisado de palha de arroz, os mais altos valores dos parmetros
fermentativos tambm no foram obtidos a partir do hidrolisado que continha a menor
concentrao de lignina solvel. Isto sugere que os hidrolisados que so mais txicos aos
microrganismos no so aqueles que apresentam as maiores concentraes de lignina solvel.
Provavelmente a lignina contm compostos que no interferem no metabolismo microbiano,
ou ainda que possam favorecer o processo fermentativo, apresentando algum efeito
estimulante. Tais compostos poderiam ter sido solubilizados em maior quantidade no
hidrolisado produzido nas condies do ensaio 1. Como a lignina formada por uma srie de
componentes aromticos e fenlicos, tais como hidroquinona, lcool vanlico, cidos ferlico,
p-cumrico, sirngico, vanlico, entre outros (ZALDIVAR; MARTINEZ; INGRAM, 2000),
um estudo sobre o efeito de cada um destes na bioconverso de xilose a xilitol poderia ser til
para explicar os resultados aqui observados.
83
Tabela 4.8 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator de
rendimento (YP/S) e produtividade volumtrica em xilitol (QP) obtidos durante a
fermentao do hidrolisado de bagao de malte.
Variveis YP/S (g/g) QP (g/l.h)
independentes e
interaes EE E t EE E t
Mdia 0,506 0,022 22,65* 0,330 0,004 85,65*
Curvatura -0,037 0,077 0,48 -0,015 0,013 1,12
X1 -0,127 0,045 2,85* -0,140 0,008 18,17*
X2 -0,007 0,045 0,17 0,005 0,008 0,65
X3 -0,082 0,045 1,84 -0,035 0,008 4,54*
X1X2 0,052 0,045 1,17 0,035 0,008 4,54*
X1X3 0,007 0,045 0,17 0,005 0,008 0,65
X2X3 0,057 0,045 1,29 0,020 0,008 2,59*
O fator de rendimento em clulas, YX/S, tambm foi avaliado durante a fermentao dos
hidrolisados de bagao de malte e apresentou diferenas significativas em funo do meio
utilizado (Tabela 4.7). A anlise estatstica para esta resposta revelou que os valores de YX/S
foram afetados principalmente pela relao slido:lquido e pela concentrao de cido,
variveis que apresentaram efeitos positivo e negativo, respectivamente (Tabela 4.9). Isto
significa que os valores de YX/S foram favorecidos em hidrolisados produzidos com a mais
alta relao slido:lquido e a mais baixa concentrao de cido.
Tabela 4.9 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator de
rendimento em clulas (YX/S) obtido durante a fermentao do hidrolisado de bagao de
malte.
Variveis YX/S (g/g)
independentes e
interaes EE E t
Mdia 0,234 0,006 35,50*
Curvatura 0,007 0,023 0,33
X1 0,067 0,013 5,12*
X2 -0,047 0,013 3,61*
X3 -0,002 0,013 0,19
X1X2 -0,007 0,013 0,57
X1X3 0,017 0,013 1,33
X2X3 -0,007 0,013 0,57
84
De uma forma geral, a anlise estatstica dos parmetros fermentativos revelou que os
hidrolisados de bagao de malte produzidos a partir de uma baixa relao slido:lquido,
favoreceram a formao de produto (os valores de YP/S foram aumentados); enquanto que
aqueles obtidos a partir de uma alta relao slido:lquido favoreceram o crescimento celular
(os valores de YX/S foram aumentados). Em outras palavras, com o aumento na relao
slido:lquido foram produzidos hidrolisados que proporcionaram um desvio no metabolismo
microbiano, da formao de produto para o crescimento celular.
Com base nos resultados da anlise estatstica, a melhor condio para hidrlise do
bagao de malte com cido sulfrico diludo foi estabelecida como sendo baseada no uso de
uma relao slido:lquido de 1:8 g:g, 100 mg de cido sulfrico/g de matria seca e um
tempo de reao de 17 minutos. Vale a pena ressaltar que, alm de proporcionar os melhores
resultados, esta condio foi tambm a mais economicamente vivel dentre todas as que
foram avaliadas, uma vez que necessitou de uma menor quantidade de cido e um tempo de
reao mais curto, requerendo, portanto, um menor consumo de energia.

guilliermondii DURANTE A PRODUO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO
HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE DILUDO E CONCENTRADO
Normalmente os hidrolisados hemicelulsicos no so utilizados como meio de

fermentao para produo de xilitol na forma em que so obtidos, pois o baixo teor de xilose
presente ( 15-20 g/l), no considerado favorvel para que o processo de bioconverso
ocorra com elevada eficincia (FELIPE et al., 1993; PARAJ; DOMINGUEZ;
DOMINGUEZ, 1995). Por este motivo, primeiramente os hidrolisados so submetidos a um
processo de concentrao para aumentar o teor de xilose a valores acima de 50 g/l. Porm,
durante esta etapa, a composio qumica do hidrolisado sofre algumas modificaes que
podem influenciar no desempenho do microrganismo durante a fermentao. Nesta fase do
trabalho, foi ento avaliado o comportamento cintico da levedura Candida guilliermondii
durante a produo de xilitol a partir do hidrolisado de bagao de malte diludo e concentrado.
85
4.3.1 Composio qumica dos hidrolisados utilizados como meio de fermentao
O hidrolisado de bagao de malte utilizado nesta etapa foi produzido nas condies de
hidrlise previamente otimizadas. A composio qumica deste hidrolisado na forma original
(diludo) e concentrado, est apresentada na Tabela 4.10. Nota-se que durante a etapa de
concentrao do hidrolisado, o teor dos acares foi aumentado proporcionalmente ao fator de
concentrao utilizado (aproximadamente 4 vezes), mostrando que no houve degradao de
acares durante a realizao deste processo. As concentraes de cido actico e compostos
fenlicos tambm foram aumentadas, mas no proporcionalmente ao fator de concentrao
empregado, sugerindo que estes compostos podem ter sido parcialmente volatilizados ou
degradados durante a etapa de concentrao do hidrolisado. O mesmo pode ter ocorrido para o
hidroximetilfurfural, cujo teor no hidrolisado no foi alterado aps o processo de
concentrao. Por outro lado, o teor de furfural foi diminudo significativamente, o que
justificvel uma vez que este composto voltil a 70C sob vcuo (PERRY; GREEN, 1997).
Tabela 4.10 - Composio qumica do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte nas formas
diluda (original) e concentrada.
Componentes Concentrao no hidrolisado de bagao de malte (g/l)
Diludo Concentrado
Glicose 1,51 6,08
Xilose 22,97 88,62
Arabinose 10,24 40,70
cido actico 1,25 3,83
Furfural 0,66 0,01
Hidroximetilfurfural 0,10 0,10
Compostos fenlicos 4,01 10,38
4.3.2 Avaliao do crescimento celular da levedura Candida guilliermondii durante a

fermentao dos hidrolisados de bagao de malte
O perfil do crescimento celular da levedura Candida guilliermondii nos hidrolisados de

bagao de malte diludo e concentrado, est apresentado na Figura 4.3. Visando comparar o
desempenho da levedura em um meio ausente em compostos txicos, alguns ensaios foram
tambm realizados em meio semidefinido contendo as mesmas concentraes de acares
86
presentes nos hidrolisados (diludo e concentrado). Observa-se que o crescimento da levedura

foi similar em ambos os meios contendo 20 g/l de xilose, porm, em meios concentrados
(85 g/l de xilose) o crescimento foi maior em meio semidefinido do que em hidrolisado. Estes
resultados sugerem que, alm de monossacardeos, o hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte apresenta em sua composio alguns compostos que podem estar atuando como fonte
de nitrognio para o microrganismo, favorecendo seu crescimento. No entanto, quando o
hidrolisado foi concentrado, o aumento na concentrao de alguns compostos, provavelmente
os que so txicos para o microrganismo, afetou o crescimento celular.
5
Clulas (g/l)
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo de fermentao (h)
MSD diludo hidrolisado diludo
MSD concentrado hidrolisado concentrado
Figura 4.3 - Crescimento da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulsico de

bagao de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diludo) ou
85 g/l de xilose (concentrado).
Embora o crescimento celular tenha sido menor em hidrolisado concentrado do que em

meio semidefinido, o fator de converso de substrato em clulas (YX/S) foi maior a partir do
hidrolisado concentrado (Tabela 4.11). Este resultado revela que o crescimento celular foi
menor em hidrolisado concentrado por que a capacidade da levedura em consumir xilose foi
afetada neste meio, o que pode ser verificado atravs dos valores de velocidade especfica de
consumo de xilose (QS) apresentados na Tabela 4.11. A Figura 4.4 mostra claramente que em
meios concentrados, o consumo de xilose aps 96 h de fermentao foi total em meio
semidefinido, enquanto que em hidrolisado, 61% da xilose presente no incio da fermentao
ainda no havia sido consumida. Nos meios de fermentao diludos, o consumo de xilose e o
87
crescimento celular ocorreram de forma similar, sugerindo que o metabolismo da levedura

no foi afetado nestes meios.
Tabela 4.11 - Parmetros fermentativos obtidos durante o cultivo da levedura Candida guilliermondii
em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte e em meio semidefinido.
Meio de fermentaoa Parmetros fermentativosb
YX/S YP/X YP/S QP QS
(g/g) (g/g) (g/g) (g/l.h) (g/l.h) (%)
Semidefinido diludo 0,14 2,59 0,54 0,37 0,68 58,9
Hidrolisado diludo 0,20 2,34 0,65 0,38 0,62 70,9
Semidefinido concentrado 0,05 10,21 0,76 0,66 1,08 82,9
Hidrolisado concentrado 0,10 2,28 0,37 0,13 0,38 40,3
a
Meios diludos: 20 g/l de xilose; Meios concentrados: 85 g/l de xilose.
b
YX/S = fator de converso de substrato (xilose + glicose) em clulas; YP/X = fator de rendimento de
xilitol por massa celular; YP/S = fator de rendimento de xilitol por xilose consumida; QP =
produtividade volumtrica em xilitol; QS = velocidade especfica de consumo de xilose; = eficincia
de produo de xilitol (% do valor mximo terico = 0,917 g/g).
90
80
70
60
Xilose (g/l)
50
40
30
20
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 4.4 - Consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulsico
de bagao de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diludo)
ou 85 g/l de xilose (concentrado).
88
4.3.3 Avaliao da produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii durante a

fermentao dos hidrolisados de bagao de malte
A produo de xilitol em meios diludos e concentrados foi inicialmente avaliada em

meios semidefinidos simulando a concentrao de xilose presente nos hidrolisados de bagao
de malte. Nestes meios, o aumento da concentrao inicial de xilose, de 20 para 85 g/l
favoreceu o fator de rendimento e a produtividade volumtrica em xilitol em 40% e 78%,
respectivamente (Tabela 4.11). De fato, baixas concentraes de substrato proporcionam
menores rendimentos, pois parte da fonte de carbono utilizada para crescimento celular,
enquanto que em altas concentraes de xilose a produo de xilitol passa a ser favorecida.
O efeito positivo do aumento da concentrao de xilose na produo de xilitol no pde
ser observado em meios hidrolisado, provavelmente devido a alta concentrao de compostos
txicos presentes (Figura 4.5). Os valores de fator de rendimento de xilitol por massa celular
(YP/X) mostram que a capacidade da levedura em converter xilose a xilitol foi fortemente
afetada em hidrolisado concentrado, uma vez que o valor deste parmetro foi 4,5 vezes menor
em hidrolisado do que em meio semidefinido (Tabela 4.11). Logo se pode concluir que, assim
como foi observado para o crescimento celular, o aumento da concentrao de compostos
txicos no hidrolisado tambm afetou a produo de xilitol e conseqentemente interferiu nos
valores dos parmetros fermentativos YP/S, QP e . Os valores destes parmetros foram
inclusive menores do que os obtidos em hidrolisado diludo (Tabela 4.11). Uma forte inibio
no desempenho da levedura Candida guilliermondii tambm foi observada durante a
produo de xilitol a partir de hidrolisado de palha de arroz concentrado (90 g/l de xilose),
proporcionando baixos valores de fator de rendimento (0,49 g/g) e produtividade volumtrica
(0,32 g/l.h) (MUSSATTO; SANTOS; ROBERTO, 2004).
importante ressaltar que no presente trabalho, os hidrolisados de bagao de malte
(diludo e concentrado) foram utilizados como meio de fermentao sem ser submetidos a
nenhum tratamento prvio para reduzir a concentrao dos compostos txicos presentes.
Provavelmente os baixos valores de fator de rendimento e produtividade volumtrica obtidos
a partir do hidrolisado concentrado podem ser melhorados se o hidrolisado for tratado antes
de ser utilizado como meio de fermentao. Tratamentos de destoxificao de hidrolisados
por ajuste de pH (ROBERTO et al., 1991a), uso de carvo ativado (DOMINGUEZ; GONG;
TSAO, 1996; MUSSATTO; SANTOS; ROBERTO, 2004) ou resinas de troca inica
89
(DOMINGUEZ et al., 1997; MANCILHA; KARIM, 2003) tm sido considerados eficientes

para reduzir a concentrao de compostos txicos, melhorando o desempenho da levedura e
favorecendo a produo de xilitol, como conseqncia.
60
50
40
Xilitol (g/l)
30
20
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 4.5 - Produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulsico
de bagao de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diludo)
ou 85 g/l de xilose (concentrado).
4.3.4 Efeito da arabinose na produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii
A bioconverso de xilose a xilitol a partir de hidrolisados hemicelulsicos pode ser

afetada pela presena e concentrao de outros acares no meio de fermentao. De acordo
com Walther, Hensirisak e Agblevor (2001), elevadas concentraes de acares podem
causar estresse osmtico, inibio da induo da enzima xilose redutase ou ainda um desvio
da produo de xilitol para a produo de etanol.
O hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte apresenta uma elevada concentrao
de arabinose, quando comparado aos hidrolisados obtidos a partir de outras matrias-primas
lignocelulsicas. Para avaliar a influncia deste acar na converso de xilose a xilitol pela
levedura Candida guilliermondii, foram realizados alguns ensaios em meios semidefinidos
preparados com a mesma concentrao de glicose e xilose presente no hidrolisado de bagao
de malte concentrado, porm, com e sem a adio de arabinose. Os resultados obtidos
revelaram um consumo seqencial dos acares xilose e arabinose durante a fermentao,
sendo que a arabinose apenas foi consumida quando toda a xilose presente no meio j havia
90
sido esgotada. No meio que no continha arabinose, a levedura consumiu xilitol ao trmino da
xilose. Este fato explica a diferena observada na concentrao de xilitol obtida ao final das
fermentaes (Figura 4.6). Apesar de no ter sido consumida pela levedura durante a
fermentao de xilose, a presena de arabinose no meio de fermentao no interferiu no
crescimento celular, consumo de xilose e na produo de xilitol, conforme pode ser observado
na Figura 4.6.
90 7
75 6
60
Xilose e Xilitol (g/l)
Clulas (g/l)
45 4
30 3
15
2
0
1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 4.6 - Desempenho da levedura Candida guilliermondii em meio semidefinido preparado com
(smbolos abertos) ou sem (smbolos fechados) arabinose. Crescimento celular (, ),
consumo de xilose (, ) e produo de xilitol (, ).
Ao final da fermentao o xilitol foi o composto presente em maior concentrao no

meio (cerca de 60 g/l), seguido pela arabinose, tambm presente em elevada concentrao
(40 g/l). Como a presena de arabinose na concentrao existente no hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte no interferiu na produo de xilitol pela levedura
Candida guilliermondii, uma alternativa interessante que poderia ser avaliada seria a
realizao de um processo fermentativo em dois estgios a partir deste hidrolisado, visando a
produo de xilitol a partir da xilose e arabitol a partir da arabinose. Desta forma poderiam ser
obtidos dois compostos de elevado valor comercial. A produo de arabitol tem sido pouco
estudada, mas as leveduras Candida entomaea e Pichia guilliermondii so consideradas boas
produtoras deste composto (SAHA; BOTHAST, 1996).
91

HEMICELULSICO DE BAGAO DE MALTE NA BIOCONVERSO DE XILOSE A
XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii
4.4.1 Composio qumica dos hidrolisados de bagao de malte
Como o aumento na concentrao inicial de xilose importante para se obter uma

elevada produo de xilitol e, considerando que em hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte concentrado o desempenho da fermentao pela levedura Candida guilliermondii foi
afetado, realizou-se ento nesta etapa um estudo para avaliar o efeito dos compostos txicos
presentes neste hidrolisado na bioconverso de xilose a xilitol. Vrios meios de fermentao
foram preparados a partir do hidrolisado de bagao de malte diludo de forma que
apresentassem diferentes concentraes de compostos txicos, sendo em seguida utilizados
para a produo de xilitol. A composio destes meios est apresentada na Tabela 4.12.
Tabela 4.12 - Composio dos hidrolisados de bagao de malte empregados como meio de
fermentao para produo de xilitol.
Composto Concentrao no hidrolisado (g/l)
HDa HDSb HCc HCTd HCDSe

Glicose 1,51 6,00 6,08 6,02 5,93
Xilose 22,97 84,21 88,62 86,94 86,52
Arabinose 10,24 38,75 40,70 39,96 39,77
Furfural 0,66 0,61 0,01 0,00 0,00
Hidroximetilfurfural 0,10 0,08 0,10 0,01 nd
cido actico 1,25 1,22 3,83 1,53 1,05
Fenlicos totais 4,01 3,93 10,38 5,38 3,34
a
HD = hidrolisado diludo; b HDS = hidrolisado diludo suplementado com acares; c HC =
hidrolisado concentrado; d HCT = hidrolisado concentrado tratado com carvo ativado; e HCDS =
hidrolisado concentrado, diludo com gua e suplementado com acares. nd = no detectado.
Conforme mencionado anteriormente, durante a etapa de concentrao do hidrolisado

alguns compostos tiveram seus teores aumentados enquanto que outros, por apresentarem
certa volatilidade nas condies operacionais utilizadas, foram parcialmente removidos ou
degradados. O tratamento do hidrolisado concentrado com carvo ativado (HCT) reduziu a
concentrao dos compostos txicos presentes e praticamente no interferiu na concentrao
dos acares. Furfural e hidroximetilfurfural foram praticamente eliminados do hidrolisado
92
atravs deste tratamento, enquanto que a concentrao de compostos fenlicos e cido actico
foi reduzida em 48% e 60%, respectivamente (Tabela 4.12). Uma concentrao ainda mais
baixa destes compostos foi obtida quando o hidrolisado concentrado foi diludo e
posteriormente suplementado com acares (HCDS). Em HCDS, a concentrao de
compostos fenlicos e cido actico foi 68% e 72% menor do que em hidrolisado
concentrado, sendo similar concentrao encontrada nos hidrolisados diludos (original, HD,
e suplementado com acares, HDS). No entanto, a presena de furfural e hidroximetilfurfural
nos hidrolisados diludos constitui a principal diferena entre estes e o HCDS.
4.4.2 Fermentao dos hidrolisados de bagao de malte contendo diferentes

concentraes de compostos txicos
A fermentao para produo de xilitol a partir do hidrolisado diludo (HD)

proporcionou um valor de YX/S (fator de rendimento de clulas por substrato consumido) mais
elevado do que os obtidos nas fermentaes dos outros hidrolisados (Tabela 4.13). De fato,
Felipe et al. (1993) e Paraj, Dominguez e Dominguez (1995) reportaram que em meios de
fermentao contendo concentraes de xilose inferiores a 50 g/l o comportamento cintico
da levedura desviado da produo de xilitol para o aumento da massa celular. No entanto,
quando o hidrolisado concentrado (HC) foi utilizado como meio de fermentao, a produo
de xilitol no foi favorecida, mas ao contrrio, observa-se na Tabela 4.13 que os valores dos
parmetros fermentativos YP/S e QP foram os mais baixos dentre todos os meios avaliados.
Porm, a capacidade produtiva da levedura (YP/X) em HC foi a mesma que em HD. Isto
demonstra que o aumento da concentrao de compostos txicos no meio interferiu
principalmente no consumo de xilose pela levedura, uma vez que a xilose consumida foi
convertida em xilitol com a mesma eficincia que em hidrolisado diludo.
O consumo de glicose no foi afetado pelo aumento da concentrao de compostos
txicos no hidrolisado, uma vez que este acar foi totalmente consumido pela levedura logo
no incio de todas as fermentaes. Por outro lado, a arabinose no foi consumida em nenhum
dos meios avaliados, durante o tempo de fermentao considerado.
93
Tabela 4.13 - Parmetros fermentativos e concentrao final de clulas obtidas durante a produo de
xilitol a partir dos hidrolisados de bagao de malte.
Hidrolisadoa Parmetros fermentativosb
YP/S QP YX/S YP/X X

HD 0,65 0,38 0,20 2,34 70,88 4,91
HDS 0,79 0,86 0,06 10,00 86,15 6,23
HC 0,37 0,13 0,10 2,28 40,35 5,28
HCT 0,55 0,18 0,13 2,83 59,98 6,02
HCDS 0,67 0,78 0,07 7,60 73,06 7,37
a
HD = hidrolisado diludo; HDS = hidrolisado diludo suplementado com acares; HC = hidrolisado
concentrado; HCT = hidrolisado concentrado tratado com carvo ativado; HCDS = hidrolisado
concentrado, diludo com gua e suplementado com acares.
b
YP/S = fator de rendimento de xilitol por xilose consumida (g/g); QP = produtividade volumtrica em
xilitol (g/l.h); YX/S = fator de rendimento de clulas por substrato (xilose + glicose) consumido (g/g);
YP/X = fator de rendimento de xilitol por massa celular (g/g); = eficincia de produo de xilitol (%
do valor mximo terico = 0,917 g/g); X = concentrao total de clulas ao final da fermentao.
Analisando os hidrolisados com elevada concentrao de acares, observa-se na Figura

4.7 que a diferena na concentrao de compostos txicos influenciou tanto no consumo de
xilose como na produo de xilitol. Os hidrolisados HC e HCT apresentaram perfis muito
similares em relao ao consumo de xilose (Figura 4.7A), sugerindo que apesar da elevada
remoo de compostos txicos (cerca de 50%), o tratamento do hidrolisado com carvo
ativado no favoreceu o consumo desta pentose. Entretanto, a produo de xilitol (Figura
4.7B) foi levemente melhorada a partir de hidrolisado tratado, refletindo tambm em um
aumento no valor dos parmetros fermentativos (Tabela 4.13). Estes resultados sugerem que a
produo de xilitol a partir do hidrolisado de bagao de malte favorecida quando a
concentrao dos compostos txicos presentes diminuda. Porm, importante destacar que
as condies empregadas neste trabalho para tratamento do hidrolisado com carvo ativado,
foram otimizadas para o hidrolisado hemicelulsico de palha de arroz (MUSSATTO;
ROBERTO, 2004b). O hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte tratado nestas
condies no proporcionou uma melhora significativa na produo de xilitol, como foi
observada em hidrolisado de palha de arroz, o que permite concluir que as condies de
tratamento do hidrolisado devem ser otimizadas para cada matria-prima utilizada.
O consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii foi mais rpido em HDS e
HCDS, do que em HC ou HCT (Figura 4.7A). Alm disso, HDS e HCDS tambm
proporcionaram uma maior concentrao de xilitol ao final do processo (Figura 4.7B). Dentre
estes, a mxima produo de xilitol ocorreu em HDS (62,3 g/l em 72 h de fermentao),
94
correspondendo a um fator de rendimento de 0,79 g/g e uma produtividade volumtrica de

0,86 g/l.h. Apesar de ambos hidrolisados terem apresentado similares rendimentos de clula
por substrato consumido (YX/S), os valores de rendimento de xilitol por massa celular (YP/X)
confirmam que a capacidade produtiva da levedura foi maior em HDS do que em HCDS
(Tabela 4.13). Analisando a composio destes dois hidrolisados (Tabela 4.12) nota-se que a
principal diferena entre eles est no teor de furfural, composto que estava presente em HDS e
ausente em HCDS. Tal fato sugere que a presena deste composto no hidrolisado (0,61 g/l),
alm de no ter inibido o processo fermentativo, favoreceu a produo de xilitol. Ojamo,
Ylinen e Linko (1988) relataram um efeito benfico de baixas concentraes de furfural
(<0,6 g/l) na produo de xilitol. Alm disso, vrios autores tm reportado que o furfural
somente txico para os microrganismos quando em concentraes maiores que 1 g/l
(MARTINEZ et al., 2000; PARAJ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1997; ROBERTO et
al., 1991b).
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
90 10 70 10
A B
60
75
8 8
50
60
Xilitol (g/l)
6 40 6
Xilose (g/l)
45
30
4 4
30
20
15 2 10 2
0 0
0 0
0 15 30 45 60 75 90 105 0 15 30 45 60 75 90 105
Tempo de fermentao (h) Tempo de fermentao (h)
Figura 4.7 - Consumo de xilose (A) e produo de xilitol (B) pela levedura Candida guilliermondii em
hidrolisado de bagao de malte: HDS (), HC (), HCT () e HCDS ().
Uma outra possvel explicao para a diferena observada durante a fermentao de

HDS e HCDS (Tabela 4.13), seria em funo da concentrao individual de alguns compostos
fenlicos. Os compostos fenlicos totais compreendem uma srie de compostos provenientes
da degradao parcial da lignina durante o processo de hidrlise cida, os quais incluem
vanilina, seringaldedo, cidos ferlico, p-cumrico, sirngico, entre outros. Individualmente,
95
estes compostos apresentam diferentes graus de toxicidade para os microrganismos. Por

exemplo, Cortez (2005) observou que concentraes de vanilina de at 2 g/l favoreceram a
produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii, enquanto que o seringaldedo na
mesma concentrao foi fortemente txico a este microrganismo. No presente trabalho foi
constatado a presena de vanilina, seringaldedo, cido ferlico e cido sirngico na
composio dos hidrolisados de bagao de malte (Tabela 4.14). Quando o hidrolisado foi
concentrado, a concentrao de seringaldedo foi aumentada em 3,4 vezes, enquanto que a
concentrao de vanilina, que no considerada txica ao microrganismo, foi aumentada em
2,4 vezes. possvel ento que durante o processo de concentrao do hidrolisado, compostos
fenlicos de maior toxicidade ao microrganismo (no identificados neste trabalho) tenham
tido suas concentraes aumentadas em maior proporo do que os compostos fenlicos de
menor toxicidade. Isto explicaria a maior toxicidade do HCDS quando comparado ao HDS,
apesar de ambos apresentarem um teor similar de compostos fenlicos.
Tabela 4.14 - Concentrao de alguns compostos fenlicos identificados nos hidrolisados de bagao de
malte.
Composto Concentrao no hidrolisado (g/l)
HDa HDSb HCc HCTd HCDSe

Vanilina 0,0302 0,0291 0,0719 0,0359 0,0218
Seringaldedo 0,1776 0,1753 0,6127 0,3163 0,1932
cido ferlico 0,0598 0,0595 0,2246 0,0898 0,0709
cido sirngico nd nd 0,0435 0,0165 0,0122
a
HD = hidrolisado diludo; b HDS = hidrolisado diludo suplementado com acares; c HC =
hidrolisado concentrado; d HCT = hidrolisado concentrado tratado com carvo ativado; e HCDS =
hidrolisado concentrado, diludo com gua e suplementado com acares. nd = no detectado.
Comparando a fermentao do HCT com a do HDS observa-se que houve uma grande
diferena nos resultados do processo fermentativo, as quais refletiram principalmente em um
aumento de 4,8 vezes em QP (de 0,18 para 0,86 g/l.h, respectivamente), e de 3,5 vezes em
YP/X (de 2,83 para 10,0 g/g, respectivamente). Analisando a composio destes hidrolisados
(Tabela 4.12), a diferena observada em suas fermentabilidades pode ser atribuda a maior
concentrao de compostos fenlicos totais em HCT. De fato, dentre os compostos txicos
identificados no hidrolisado de bagao de malte, os compostos fenlicos parecem ser os mais
txicos ao microrganismo devido a elevada concentrao em que se encontram presentes. Por
outro lado, como o cido actico em concentraes maiores que 3 g/l txico para a levedura
96
Candida guilliermondii (FELIPE et al., 1995), provvel que este cido tambm tenha
influenciado na elevada toxicidade observada para o hidrolisado concentrado. Porm, deve-se
considerar tambm que, apesar de que o cido actico estava presente nos meios HCT, HDS e
HCDS em concentraes consideradas no txicas para o metabolismo do microrganismo, a
presena de compostos fenlicos nestes meios pode potencializar a toxicidade do cido
actico como conseqncia de um efeito sinergstico entre estes compostos.

MALTE PR-TRATADO PARA PRODUO DE POLPA CELULSICA
4.5.1 Caractersticas do bagao de malte utilizado nos experimentos
Esta etapa do trabalho teve como objetivo otimizar as condies de hidrlise alcalina do
bagao de malte visando a obteno de uma polpa rica em celulose. Nestes ensaios, foi
utilizado como matria-prima o material slido resultante aps a remoo da hemicelulose
(celulignina) nas condies otimizadas de hidrlise cida. Segundo vrios autores, a remoo
desta frao prvia a hidrlise alcalina de grande interesse, por vrias razes: 1. a
hemicelulose tambm atacada durante o processo de hidrlise alcalina, contribuindo,
portanto, para um maior consumo do reagente qumico (FENGEL; WEGENER, 1989;
GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996; ZHAO et al., 2002); 2. a remoo da hemicelulose
aumenta a porosidade do material, facilitando a difuso e impregnao do hidrxido de sdio
na etapa posterior, melhorando desta forma a deslignificao (remoo da lignina) e a
uniformidade da polpa obtida (ZHAO et al., 2002); 3. a hemicelulose uma valiosa fonte de
xilose, acar que pode ser utilizado para obteno de produtos de valor agregado, tais como
xilitol (MUSSATTO; ROBERTO, 2004b) ou etanol (FERRARI et al., 2004). Logo, com a
dissoluo desta frao no licor alcalino, potenciais aplicaes para o material lignocelulsico
seriam perdidas.
Anlises da composio qumica do bagao de malte antes e aps o processo de
hidrlise cida foram realizadas com o objetivo de monitorar o rendimento de biomassa
recuperada, bem como as perdas de celulose, hemicelulose e lignina ocorridas (Tabela 4.15).
De acordo com esta anlise, o rendimento de biomassa recuperada aps o pr-tratamento
cido do material foi da ordem de 48,55% (p/p). A hemicelulose foi a principal frao
97
removida, restando 3,83 g a partir de cada 28,4 g presente no material original. Por outro lado,
a estrutura da celulose permaneceu praticamente inalterada, uma vez que foi observada uma
reduo de apenas 0,3 g (de 16,8 g para 16,5 g) nesta frao aps o pr-tratamento. A
porcentagem de lignina solubilizada neste estgio (14% p/p) foi maior do que a porcentagem
de celulose solubilizada, porm muito menor do que o valor observado para a hemicelulose.
Isto j era esperado, pois segundo McMillan (1994), a celulose e a lignina so mais resistentes
ao ataque com cidos diludos do que a hemicelulose, embora uma pequena parte da lignina
(aproximadamente 10% p/p) possa ser solubilizada em meio cido. Uma elevada remoo,
similar quela obtida para a hemicelulose (cerca de 85% p/p), foi observada tambm para a
frao restante do material (denominada por outros, correspondente a protenas, extrativos e
cinzas) restando apenas 4,32 g a partir de cada 27 g tratadas. Devido elevada remoo destas
duas fraes a partir do bagao de malte original, o resduo slido obtido tornou-se
enriquecido em celulose e lignina, conforme pode ser observado em sua composio qumica,
apresentada na Tabela 4.15.
Tabela 4.15 - Composio qumica do bagao de malte nas formas original (BO) e pr-tratado com
cido sulfrico diludo (BPT), massa recuperada e perda de cada frao aps o pr-
tratamento cido.
Frao Composio (g/100 g) Massa recuperadaa Perdas
BO BPT (g) (% p/p)

Celulose 16,8 34,0 16,50 1,80
Hemicelulose 28,4 7,9 3,83 86,50
Lignina 27,8 49,2 23,90 14,00
Outrosb 27,0 8,9 4,32 84,00
Total 100 100 48,55 51,45
a
Massa recuperada a partir de 100 g do bagao original, calculada pela porcentagem de cada frao
em 48,55 g do material pr-tratado (massa total recuperada aps o pr-tratamento).
b
Outros compostos incluem cinzas, protenas e extrativos.
4.5.2 Hidrlise alcalina do bagao de malte pr-tratado
O principal objetivo da polpao qumica liberar as fibras de celulose do material

atravs da deslignificao, sem degradar ou remover os principais polissacardeos da parede
celular. No entanto, o processo de hidrlise alcalina no totalmente seletivo para a lignina, e
os carboidratos, incluindo a celulose, tambm podem ser degradados (FENGEL; WEGENER,
98
1989; GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996). No presente trabalho, o meio reacional foi
imediatamente resfriado em banho de gelo ao trmino da reao, com o objetivo de impedir a
hidrlise alcalina e a reao de peeling da celulose, as quais devem ser evitadas por dois
motivos: 1. a hidrlise alcalina pode romper a cadeia polimrica da celulose, diminuindo
drasticamente seu tamanho (BERGGREN et al., 2003; KNILL; KENNEDY, 2003); 2. a
reao de peeling promove a remoo das unidades de acares redutores finais da cadeia
polissacardica, o que tambm indesejvel (BERGGREN et al., 2003; GRACE; LEOPOLD;
MALCOLM, 1996; KNILL; KENNEDY, 2003). Mesmo tomando este cuidado, a celulose
pode ser parcialmente degradada sob condies severas de reao. Logo, a realizao de
estudos que estabeleam as melhores condies de polpao necessria para minimizar a
degradao da celulose, maximizando a solubilizao da lignina durante a hidrlise alcalina.
No presente trabalho, um planejamento experimental foi proposto para avaliar o efeito
das variveis utilizadas na hidrlise alcalina do bagao de malte e estabelecer as melhores
condies para realizao deste processo. A composio qumica das polpas obtidas para cada
condio de hidrlise avaliada est apresentada na Tabela 4.16. Observa-se nesta tabela que o
teor de celulose nas polpas variou fortemente dependendo da condio de hidrlise utilizada
(de 43,6% p/p no ensaio 5, a 72,1% p/p no ensaio 8) e, embora a maior parte dos tratamentos
tenha promovido perdas insignificantes desta frao (< 1,8% p/p), perdas de at 23,3% p/p no
teor de celulose foram observadas durante o tratamento alcalino. A Tabela 4.16 mostra
tambm que todas as polpas obtidas apresentavam um resduo de hemicelulose, que variou de
5,6 a 10,7% p/p. Durante o tratamento alcalino do talo de milho, palha de centeio e palha de
arroz, Xiao, Sun e Sun (2001) tambm obtiveram polpas com resduos de hemicelulose
correspondentes a 7,7, 9,9 e 5,0% p/p, respectivamente.
Alm de um resduo de hemicelulose, todas as polpas produzidas a partir do bagao de
malte tambm continham um resduo de lignina, que variou de 10,4% p/p (ensaio 8) a
28,5% p/p (ensaio 1) (Tabela 4.16). De fato, resduos de hemicelulose e lignina podem ser
encontrados em polpas obtidas por tratamento alcalino porque parte destas fraes encontra-se
fortemente ligada celulose, sendo, portanto, muito resistentes ao processo de hidrlise. De
acordo com McKinney (citado por GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996) algumas
pentosanas so resistentes ao tratamento alcalino porque durante este processo ocorre uma
reao de transglicosilao, onde parte da hemicelulose que quimicamente ligada lignina
por ligaes glicosdicas passa a formar ligaes glicosdicas com a celulose. Por outro lado, a
dificuldade em remover os ltimos traos de lignina durante a reao com NaOH pode ser
99
explicada de duas formas: 1. uma pequena frao da lignina fortemente ligada aos
carboidratos por ligao qumica; 2. os ltimos traos de lignina reagem entre si ou com os
carboidratos, formando produtos que so difceis de serem dissolvidos no licor alcalino
(GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996).
Tabela 4.16 - Composio qumica das polpas de bagao de malte e perdas de celulose e lignina aps o
tratamento de hidrlise alcalina sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveis Composio da polpa (% p/p) Perda durante a
independentesa polpao (% p/p)
X1 X2 X3 Celulose Hemicelulose Lignina Outrosb Celulose Lignina

1 1,0 80 30 51,2 10,7 28,5 9,6 0,0 60,5
2 2,0 80 30 54,1 10,0 26,3 9,6 0,0 65,0
3 1,0 120 30 57,9 7,1 23,8 11,2 10,9 74,7
4 2,0 120 30 55,3 6,1 21,5 17,1 12,5 76,5
5 1,0 80 90 43,6 7,1 22,5 26,8 23,3 72,6
6 2,0 80 90 56,0 8,6 23,5 11,9 1,7 71,5
7 1,0 120 90 61,3 5,6 21,1 12,0 15,0 79,8
8 2,0 120 90 72,1 7,8 10,4 9,7 1,8 90,2
9 1,5 100 60 56,4 6,1 20,1 17,4 0,0 74,8
10 1,5 100 60 54,9 7,0 21,7 16,4 0,0 72,3
11 1,5 100 60 55,4 7,2 22,8 14,6 0,0 71,3
a
X1 = concentrao de NaOH (% p/p); X2 = temperatura (C); X3 = tempo de reao (min).
b
Outros incluem protenas, cinzas e extrativos.
Vale a pena observar que, mesmo nas condies mais brandas de reao utilizadas
(NaOH 1% p/v, 80C, 30 min - ensaio 1) obteve-se uma significativa dissoluo da lignina
(60,5% p/p), a qual correspondeu a uma reduo no teor de lignina do material de 49,2% p/p
(no bagao de malte pr-tratado) para 28,5% p/p (na polpa obtida aps a deslignificao).
Valor similar de dissoluo da lignina (68,8% p/p) foi obtido durante o tratamento da palha de
centeio com uma soluo de NaOH 4% p/v, a 30 C por 18 h (XIAO; SUN; SUN, 2001).
Porm, apesar de no presente trabalho terem sido utilizadas temperaturas mais elevadas de
reao (80-120C), as condies aqui empregadas podem ser mais econmicas e menos
agressivas ao meio ambiente, pois requerem um menor tempo de reao e uma soluo de
NaOH menos concentrada.
100
4.5.3 Anlise estatstica da hidrlise alcalina do bagao de malte
Para otimizar as condies de hidrlise alcalina, o primeiro passo identificar as

variveis que exerceram maior influncia nas respostas, o que pode ser feito atravs de uma
anlise dos efeitos estimados das variveis. Esta anlise revelou um efeito principal negativo e
significativo da temperatura (p<0,05), tempo de reao (p<0,05) e concentrao de NaOH
(p<0,10), no contedo de lignina residual na polpa de bagao de malte (Tabela 4.17). Os
sinais negativos indicam que a polpa obtida nas condies mais brandas de reao apresenta
uma maior quantidade de lignina residual. Em outras palavras, a quantidade de lignina
residual na polpa menor quanto maior a concentrao da soluo de NaOH, a temperatura e
o tempo de reao empregado no processo. O aumento na concentrao de NaOH at 2% p/v
e o aumento na temperatura at 100C tambm foram as variveis de maior influncia na
solubilizao da lignina durante a polpao de Miscanthus sinensis (IGLESIAS et al., 1996).
Tabela 4.17 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e resultados do teste t de Student, para os
teores de celulose e lignina residual nas polpas obtidas a partir do bagao de malte.
Variveis Lignina residual (% p/p) Teor de celulose (% p/p)
independentes
e interaes EE E t EE SE t
X1 -3,550 1,638 2,167c 5,875 0,768 7,647a
X2 -6,000 1,638 3,662b 10,425 0,768 13,569a
X3 -5,650 1,638 3,448b 3,625 0,768 4,718a
X1X2 -2,950 1,638 1,800 -1,775 0,768 2,310c
X1X3 -1,300 1,638 0,793 5,725 0,768 7,451a
X2X3 -1,250 1,638 0,763 6,475 0,768 8,427a
a
p<0,01; b p<0,05; c p<0,10. X1 = concentrao de NaOH; X2 = temperatura; X3 = tempo de reao.
Para a resposta de teor de celulose, a anlise estatstica revelou um efeito principal

positivo altamente significativo (p<0,01) de todas as variveis estudadas (Tabela 4.17), ou
seja, quanto maior a concentrao de NaOH, a temperatura e o tempo de reao, maior o teor
de celulose na polpa obtida. Dentre as variveis, a temperatura foi a que apresentou maior
efeito nesta resposta, uma vez que seu aumento de 80 para 120 C resultou em um aumento
mdio no teor de celulose na polpa de 10,42% p/p. O aumento da concentrao de NaOH (de
1 para 2% p/v) e do tempo de reao (de 30 para 90 min), causaram efeitos menos marcantes,
com variaes no contedo de celulose, de 5,87 e 3,62% p/p, respectivamente. As interaes
101
entre tempo de reao e temperatura, tempo de reao e concentrao de NaOH, e

concentrao de NaOH e temperatura tambm foram significativas para esta resposta, com
p<0,01, p<0,01 e p<0,10, respectivamente.
A significncia estatstica dos efeitos principais e interaes entre as variveis foi
determinada por anlise de varincia e uma anlise de regresso mltipla foi realizada para
ajustar os dados experimentais a equaes polinomiais (Tabela 4.18). As respostas foram
descritas como funes de primeira ordem e os elevados valores de R2 (>0,90) obtidos
indicam que os modelos selecionados so adequados para o processo, mostrando uma forte
concordncia entre os resultados experimentais e os valores tericos previstos pelos modelos.
Tabela 4.18 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus respectivos R2,
ajustados aos dados experimentais para as respostas de lignina residual e teor de
celulose nas polpas obtidas.
Resposta Equaes do modeloa R2
Lignina residual ( y 1 em %) y 1 = 22,018 1,775X1 3,0X2 2,825X3 0,90
1,475X1X2 0,650X1X3 0,625X2X3
Teor de celulose ( y 2 em %) y 2 = 56,200 + 2,937X1 + 5,212X2 + 1,812X3 0,99
0,887X1X2 + 2,862X1X3 + 3,237X2X3
a
X1 = concentrao de NaOH; X2 = temperatura; X3 = tempo de reao.
As superfcies de resposta descritas pelas equaes do modelo para a lignina residual e o

teor de celulose (Figura 4.8) mostram claramente que o aumento no valor das variveis
operacionais favoreceu linearmente o aumento no teor de celulose e a diminuio no teor de
lignina residual na polpa obtida. Os melhores valores foram atingidos quando o processo de
hidrlise alcalina foi realizado a 120C, durante 90 minutos, empregando uma soluo de
NaOH 2% p/v. Nestas condies obteve-se uma polpa com elevado teor de celulose (72,1%
p/p) e baixo teor de lignina residual (10,4% p/p). Considerando que uma pequena frao da
hemicelulose e da lignina muito difcil de ser removida da estrutura lignocelulsica durante
o processo de deslignificao, maiores esforos no foram dados visando reduzir ainda mais
os contedos destas fraes nas polpas de bagao de malte. Isto porque o aumento no
consumo de energia devido ao uso de uma temperatura e tempo de reao maior,
provavelmente no justificaria o pequeno aumento no teor de celulose ou a pequena
diminuio no teor de lignina residual na polpa.
102
76
32
28 70
LIGNINA RESIDUAL (%)
CELULOSE (%)
24 64
20 58
16 52
12 46
120 2,0
CO
110 1,75
NC
30
TE
EN
M
100 45 1,5 80
TR
PE
90
A
)
RA
60 min
90 O(
O
1,25 100
TU
75
( C)
o
EA
RA
110
Na
80 ER TUR
A
o
90 D
(C
1,0
O
PO 120 ERA
H
M P
)
TE TEM
(%
)
Figura 4.8 - Superfcies de resposta para os teores de lignina residual e de celulose (% p/p) nas polpas
de bagao de malte, em funo das variveis operacionais empregadas no processo de
hidrlise alcalina.
4.5.4 Micrografias das polpas de bagao de malte
A influncia dos processos de hidrlise cida e alcalina (nas condies otimizadas) na

estrutura da partcula do bagao de malte pode ser observada na Figura 4.9. As Figuras 4.9A
(partcula do bagao de malte na forma original) e 4.9B (partcula de bagao de malte pr-
tratada com cido diludo) mostram que o pr-tratamento cido promoveu algumas rupturas
na estrutura do material devido remoo da hemicelulose. Durante a hidrlise alcalina, a
lignina foi atacada e solubilizada no licor produzido. Como conseqncia, a estrutura do
bagao foi fortemente rompida e um resduo rico em celulose foi gerado. A remoo da
lignina permitiu a separao das fibras da celulose, como pode ser visualizado na Figura 4.9C.
Em termos de cor, a polpa celulsica obtida apresentou uma colorao bege clara, a qual foi
muito diferente da cor original do bagao de malte (amarelo escuro). Na verdade, o bagao de
malte pr-tratado com cido diludo apresentou uma cor marrom escura, causada pelo
aumento no teor de lignina aps a hidrlise cida. Posteriormente, a elevada remoo desta
frao (90,2% p/p) durante a hidrlise alcalina promoveu a descolorao do material (Figura
4.9).
103
Figura 4.9 - Micrografia eletrnica de varredura (ampliao: 45 vezes) e aspecto visual das partculas
do bagao de malte nas formas: original (A), pr-tratado com cido diludo (B) e aps a
hidrlise alcalina (C).
104
4.5.5 Balano de massa da hidrlise alcalina
Como j foi mencionado anteriormente, o rendimento em biomassa recuperada aps o

processo de hidrlise cida foi de 48,55 g/100 g de bagao de malte original. Um valor similar
de rendimento em biomassa recuperada foi obtido para o processo de hidrlise alcalina, sendo
recuperadas 46,3 g a partir de 100 g do material pr-tratado. Isto significa que para cada 100 g
de bagao de malte original, foram recuperadas 22,5 g de polpa contendo 72,1% p/p de
celulose. Durante a hidrlise alcalina, apenas 1,8% da frao celulsica presente no material
pr-tratado foi removida. Ao final deste processo, 16,2 g de celulose foram recuperadas a
partir de 16,8 g de celulose presentes em 100 g do bagao de malte original, o que
correspondeu a uma recuperao de 96,4% do total desta frao existente inicialmente.
A frao hemicelulsica ainda presente no material pr-tratado foi removida em
54,3% p/p durante a hidrlise alcalina, sendo recuperadas 1,75 g a partir das 28,4 g presentes
em 100 g do material original. Isto significa que 6,16% da hemicelulose presente inicialmente
no bagao de malte foi resistente a ambos os processos de tratamento, cido e alcalino. A
remoo da frao correspondente a outros materiais (cinzas, protenas e extrativos), foi
similar remoo obtida para a hemicelulose, correspondendo a 49,5% p/p. Isto significa que
para 27 g desta frao presentes em 100 g do bagao de malte original, 2,18 g permaneceram
no material aps as reaes cida e alcalina (8,07% do total existente inicialmente). A lignina
foi a principal frao removida durante a hidrlise alcalina (90,2% p/p), sendo recuperadas
somente 2,34 g a partir das 23,9 g presentes no material pr-tratado. A porcentagem de lignina
que permaneceu na polpa aps os dois processos de hidrlise, correspondeu a 8,42% do total
desta frao presente no material original.

MALTE PR-TRATADO PARA LIBERAO DE CIDOS FENLICOS
Alm da produo de polpa celulsica, a deslignificao dos materiais lignocelulsicos

gera um efluente lquido, denominado licor alcalino, o qual rico em compostos fenlicos
provenientes da degradao da lignina. Como estes compostos (principalmente os cidos
fenlicos) apresentam grande interesse comercial, e, considerando que os cidos ferlico e p-
cumrico so os dois cidos fenlicos presentes em maior quantidade no bagao de malte
105
(BARTOLOM; FAULDS; WILLIAMSON, 1997; BARTOLOM et al., 2003), fez-se ento

nesta etapa um estudo sobre a influncia das variveis operacionais empregadas na hidrlise
alcalina do bagao de malte, na liberao destes compostos.
4.6.1 Liberao de cidos fenlicos durante o pr-tratamento do bagao de malte com

cido sulfrico diludo
Inicialmente, o hidrolisado hemicelulsico obtido por hidrlise cida do bagao de

malte foi analisado quimicamente para verificar se houve liberao de cidos fenlicos
durante esta etapa de tratamento do material. Os resultados obtidos revelaram a presena de
apenas um cido fenlico: o cido ferlico, em concentrao de 51,0 mg/l. A presena deste
cido j foi tambm observada em hidrolisados hemicelulsicos obtidos a partir da hidrlise
cida de outras matrias-primas lignocelulsicas, tais como palha de arroz (CORTEZ, 2005),
bagao de cana-de-acar (VAN ZYL; PRIOR; DU PREEZ, 1988) e alguns tipos de madeira
(JNSSON et al., 1998; TRAN; CHAMBERS, 1985). A pequena liberao de cido ferlico
durante esta etapa de hidrlise provavelmente ocorreu devido localizao deste cido na
parede celular do material. De acordo com alguns autores, o cido ferlico encontra-se ligado
tanto com a arabinose nas hemiceluloses, quanto com a lignina, enquanto que os outros cidos
fenlicos encontram-se predominantemente ligados com a lignina (MAILLARD; BERSET,
1995; SUN et al., 2000). Isto explica porque apenas parte do cido ferlico foi solubilizada
junto com a arabinoxilana durante o pr-tratamento cido do bagao de malte, enquanto que
os outros cidos fenlicos no foram solubilizados neste estgio.
4.6.2 Liberao de cidos fenlicos durante a hidrlise alcalina do bagao de malte
Durante a hidrlise alcalina do bagao de malte pr-tratado, 60 a 90% p/p da lignina

presente no material foi solubilizada dependendo das condies de reao utilizadas. Os
licores ento produzidos continham vrios cidos fenlicos, dentre os quais, ferlico e p-
cumrico foram os mais abundantes (Tabela 4.19). De acordo com White e Xing (1997), os
cidos ferlico, p-cumrico, sirngico, p-hidroxibenzico, vanlico, cafico e protocatecuico
so os cidos fenlicos mais encontrados em cereais. Isto justifica a presena de grande parte
deles nos licores alcalinos produzidos a partir do bagao de malte, uma vez que este material
proveniente do gro de cevada. Alm disso, as maiores concentraes dos cidos ferlico e p-
106
cumrico tambm podem ser explicadas, uma vez que estes so os cidos fenlicos presentes
em maior quantidade no gro de cevada, estando concentrados principalmente na casca do
gro (MAILLARD; BERSET, 1995; WHITE; XING, 1997) e o bagao de malte composto
basicamente por esta frao do gro de cevada original. O cido ferlico tambm o cido
fenlico encontrado em maior quantidade em outros gros de cereais, tais como centeio
(ANDREASEN et al., 2000), trigo (LEMPEREUR; ROUAU; ABECASSIS, 1997), arroz e
milho (ADOM; LIU, 2002).
Tabela 4.19 - Porcentagem de lignina solubilizada e concentrao de cidos fenlicos no licor obtido a
partir da hidrlise alcalina do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveisa LSb Concentrao de cidos fenlicos no licor (mg/l)
X1 X2 X3 (% p/p) Ferlico p-Cumrico Sirngico Vanlico p-HBc
1 1,0 80 30 60,6 74,20 67,10 4,90 3,10 1,30

2 2,0 80 30 65,0 85,00 100,70 4,70 2,70 1,50
3 1,0 120 30 74,7 85,70 95,80 5,20 3,00 4,50
4 2,0 120 30 76,5 111,90 114,70 5,40 2,90 7,80
5 1,0 80 90 72,6 91,50 91,60 5,00 2,90 1,60
6 2,0 80 90 71,5 100,30 105,90 5,40 2,40 1,40
7 1,0 120 90 79,8 112,40 106,70 7,10 2,60 13,70
8 2,0 120 90 90,2 145,30 138,80 8,10 3,10 26,90
9 1,5 100 60 74,8 99,50 114,40 5,80 3,60 5,50
10 1,5 100 60 72,3 92,90 104,10 5,50 3,40 3,60
11 1,5 100 60 71,3 96,80 100,80 5,70 3,40 3,10
a
X1, concentrao de NaOH (% p/p); X2, temperatura (C); X3, tempo de reao (min).
b
lignina solubilizada; c cido p-hidroxibenzico.
4.6.3 Anlise estatstica para a remoo de cido ferlico e p-cumrico durante a

hidrlise alcalina do bagao de malte
A Tabela 4.19 mostra que houve uma grande variao nas concentraes dos cidos
ferlico (74,20 a 145,3 mg/l) e p-cumrico (67,10 a 138,8 mg/l) nos licores obtidos, em
funo das condies de reao utilizadas. Por esta razo, uma anlise estatstica foi realizada
para avaliar a influncia das variveis operacionais empregadas na hidrlise alcalina do
bagao de malte, na liberao destes cidos. Os grficos de Pareto apresentados na Figura
4.10 representam os efeitos estimados de cada varivel estudada, bem como da interao entre
elas, nas concentraes dos cidos ferlico e p-cumrico obtidas no licor alcalino. Observa-se
107
atravs destes grficos que todas as variveis estudadas influenciaram na liberao destes dois
cidos a partir do bagao de malte, sendo que todas apresentaram efeito positivo. Tal efeito
significa que quanto maior a concentrao de NaOH, a temperatura e o tempo de reao
empregados na hidrlise alcalina, maior foi a liberao de cido ferlico e p-cumrico a partir
do material. Quando todas as variveis foram utilizadas em seu nvel superior (concentrao
de NaOH de 2,0% p/v), temperatura de 120C e tempo de reao de 90 min ensaio 8),
90,2% p/p da lignina presente no bagao de malte foi solubilizada.
A cido ferlico
p=0,05
Temperatura (X2) 8,60
Tempo (X 3) 7,65
NaOH (X1) 6,49
X1X2 3,26
X2X3 2,27
X1X3 0,39
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Efeito estimado (Valor absoluto)
B cido p-cumrico
p=0,05
NaOH (X1) 4,31
Temperatura (X2) 3,95
Tempo (X 3) 2,82
X1X3 -0,26
X2X3 0,23
X1X2 0,13
0 1 2 3 4 5 6
Efeito estimado (Valor absoluto)
Figura 4.10 - Grficos de Pareto para o efeito das variveis: concentrao de NaOH, temperatura e
tempo de reao, nas respostas: concentrao de cido ferlico (A) e concentrao de
cido p-cumrico (B) nos licores obtidos por hidrlise alcalina do bagao de malte.
Efeitos acima da linha de p=0,05 so significativos ao nvel de 95% de confiana.
108
A temperatura foi a varivel de maior influncia (+8,60) na liberao de cido ferlico,

seguida pelo tempo de reao (+7,65) e pela concentrao de NaOH (+6,49) (Figura 4.10A).
A interao entre concentrao de NaOH e temperatura (X1X2) tambm foi estatisticamente
significativa para esta resposta, com um efeito de sinal positivo (+3,26), indicando que a
liberao deste cido ainda mais favorecida quando elevadas concentraes de NaOH e
temperatura so empregadas simultaneamente. Para a liberao de cido p-cumrico, apenas
os efeitos principais das variveis foram estatisticamente significativos sendo que dentre
estes, o maior efeito foi o da concentrao de NaOH (+4,31), seguido pela temperatura
(+3,95) e pelo tempo de reao (+2,82) (Figura 4.10B).
Uma vez que 90,2% p/p da lignina presente no material foi solubilizada quando a
hidrlise alcalina foi realizada nos nveis mais altos das variveis, maiores esforos no foram
feitos para solubilizar o restante da lignina que permaneceu no bagao de malte. Isto porque o
gasto energtico envolvido no uso de uma temperatura ainda mais elevada ou de um tempo de
reao mais prolongado, provavelmente no justificaria o pequeno aumento na concentrao
dos cidos fenlicos no licor alcalino. Por este motivo, optou-se por estabelecer as melhores
condies operacionais de hidrlise alcalina dentro da faixa de valores avaliada.
Uma anlise de regresso mltipla foi ento realizada para obter modelos matemticos
que descrevam a relao entre as variveis operacionais e as respostas estudadas. De acordo
com esta anlise, modelos lineares podem ser bem ajustados para explicar a variao de
ambas as respostas (concentrao de cido ferlico e de cido p-cumrico) como funo das
variveis operacionais empregadas na hidrlise alcalina do bagao de malte, uma vez que a
curvatura no foi significativa para nenhuma das respostas. Os modelos matemticos que
descrevem a concentrao de cido ferlico e cido p-cumrico no licor alcalino foram
representados pelas equaes dadas na Tabela 4.20.
Tabela 4.20 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus respectivos R2,
ajustados aos dados experimentais para as respostas de concentrao de cido ferlico e
concentrao de cido p-cumrico no licor alcalino obtido.
cido ferlico ( y 1 em mg/l) y 1 = 99,59 + 9,84X1 + 13,04X2 + 11,59X3 + 0,99
4,94X1X2 + 3,44X2X3
cido p-cumrico ( y 2 em mg/l) y 2 = 103,69 + 12,36X1 + 11,342X2 + 8,09X3 0,92
a
X1 = concentrao de NaOH; X2 = temperatura; X3 = tempo de reao.
109
A interao entre as variveis temperatura e tempo de reao (X2X3) foi mantida na

equao do modelo para a resposta de cido ferlico, para minimizar o erro de determinao.
De uma forma geral, os elevados valores de R2 (0,92) obtidos indicam que os modelos
selecionados so adequados para o processo, mostrando uma forte concordncia entre os
resultados experimentais e os valores tericos previstos pelas equaes. A Figura 4.11 mostra
os valores de concentrao de cido ferlico e cido p-cumrico previstos pelos modelos e os
valores reais obtidos nos ensaios. Observa-se nestas figuras uma distribuio dos pontos ao
redor da linha, para ambas as respostas, o que confirma que os modelos lineares foram bem
ajustados.
A cido ferlico
160
150
Valores previstos (mg/l)
140
130
120
110
100
90
80
70
60
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
Valores observados (mg/l)
B cido p-cumrico
150
140
Valores previstos (mg/l)
130
120
110
100
90
80
70
60
50
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
Valores observados (mg/l)
Figura 4.11 - Valores previstos pelo modelo linear em funo dos valores observados para as respostas
de concentrao de cido ferlico (A) e concentrao de cido p-cumrico (B) nos
licores obtidos por hidrlise alcalina do bagao de malte.
110
Para finalizar, realizou-se um balano de massa para quantificar a extrao de cido

ferlico obtida a partir do bagao de malte. Considerando que este cido est presente no
material em uma concentrao de 0,32% p/p (BARTOLOM; FAULDS; WILLIAMSON,
1997), a quantidade liberada durante o pr-tratamento com cido sulfrico foi estimada em
11%. Logo, a porcentagem de cido ferlico no material submetido hidrlise alcalina era de
aproximadamente 0,285% p/p, quantidade que foi totalmente solubilizada no licor durante a
realizao da hidrlise nas condies operacionais otimizadas.
A extrao enzimtica de cido ferlico a partir do bagao de malte tem sido estudada
por alguns autores, porm, os resultados obtidos so menores do que os encontrados no
presente trabalho. Por exemplo, o emprego de uma esterase de Aspergillus niger proporcionou
a liberao de apenas 3,3% do cido ferlico presente neste material. Quando esta enzima foi
utilizada juntamente com uma xilanase de Trichoderma viride, a liberao deste cido foi
aumentada para 30% (BARTOLOM; FAULDS; WILLIAMSON, 1997). Um resultado um
pouco maior (43% de liberao) foi obtido atravs do cultivo de Streptomyces avermitilis
CECT3339 em bagao de malte (BARTOLOM et al., 2003). Alm de proporcionar menores
rendimentos de extrao, o uso de enzimas requer um tempo de reao mais prolongado (at
48 h, aproximadamente). No presente trabalho, o uso de uma soluo diluda de NaOH
(2% p/v) em um curto tempo de reao (90 min) foi suficiente para extrair todo o cido
ferlico presente no bagao de malte.
4.7 OTIMIZAO DAS CONDIES DE HIDRLISE ENZIMTICA DO BAGAO DE

MALTE PARA MXIMA CONVERSO DA CELULOSE EM GLICOSE
4.7.1 Composio qumica do substrato
A polpa de celulose obtida nas condies otimizadas de hidrlise alcalina foi utilizada
nesta etapa do trabalho como substrato para obteno de glicose. No entanto, como a reao
de hidrlise alcalina foi conduzida em um banho termostatizado diferente daquele onde foram
realizados os experimentos do planejamento experimental, a polpa de celulose aqui obtida
apresentou uma composio qumica diferente daquela obtida anteriormente. A composio
desta polpa foi de (% p/p): 90,5% celulose, 1,1% hemicelulose e 8,2% de lignina; enquanto
que a composio da polpa obtida anteriormente na melhor condio de hidrlise foi de
111
(% p/p): 72,1% celulose, 7,8% hemicelulose e 10,4% lignina. Provavelmente, a maior

solubilizao da hemicelulose e da lignina ocorreu devido ao melhor controle de temperatura
e agitao do banho utilizado, que pode ter proporcionado uma transferncia de calor mais
adequada para o meio reacional. Como conseqncia, houve um aumento no teor de celulose
do material, o que bastante interessante, pois permite obter uma maior quantidade de glicose
aps a reao enzimtica.
4.7.2 Anlise estatstica da hidrlise enzimtica do bagao de malte
A hidrlise enzimtica da polpa de celulose foi realizada empregando diferentes

condies de agitao, relao enzima/substrato e concentrao de substrato, de acordo com
um planejamento fatorial completo 23, visando maximizar o rendimento em glicose liberada.
Os resultados obtidos, analisados em termos de rendimento em glicose e rendimento total
(glicose + celobiose) de hidrlise, esto apresentados na Tabela 4.21.
Tabela 4.21 - Rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise enzimtica
do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveis Respostas
Agitao Enz/Subst Substrato Rendimento em Rendimento

(rpm) (FPU/g)a (% p/v) glicose (%) total (%)
1 100 5 2 42,6 65,9
2 200 5 2 23,7 51,6
3 100 45 2 93,1 99,4
4 200 45 2 84,5 89,1
5 100 5 8 25,9 40,7
6 200 5 8 17,9 36,9
7 100 45 8 73,8 83,7
8 200 45 8 71,2 80,5
9 150 25 5 70,3 79,6
10 150 25 5 67,0 80,5
11 150 25 5 71,7 81,7
12 150 25 5 71,2 81,0
a
Relao enzima/substrato.
Nota-se na Tabela 4.21 que ambas as respostas variaram de acordo com as condies de
processo utilizadas. Uma anlise de estimativa dos efeitos foi ento realizada para identificar
as variveis de maior influncia no processo de hidrlise. De acordo com esta anlise (Tabela
112
4.22), apenas a varivel relao enzima/substrato apresentou efeito significativo (p<0,01) para
ambas as respostas. Tal efeito, de sinal positivo, indica que o aumento no valor desta varivel
favoreceu o rendimento em glicose e o rendimento total de hidrlise da celulose em glicose +
celobiose. As outras duas variveis estudadas (agitao e concentrao de substrato) no
apresentaram efeito significativo, mesmo a um nvel de 90% de confiana, para o rendimento
em glicose; mas para o rendimento total de hidrlise, a varivel concentrao de substrato
apresentou um efeito significativo a 90% de confiana e de sinal negativo, indicando que
quanto menor a concentrao de substrato utilizada, maior foi o rendimento total de hidrlise
obtido.
Tabela 4.22 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student, para o rendimento em
glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise enzimtica do bagao
malte.
Variveis Rendimento em glicose (%) Rendimento total de hidrlise (%)
independentes e
interaes EE E t EE SE t
X1 -9,525 8,641 -1,102 -7,905 6,335 -1,248
X2 53,110 8,641 6,146*** 39,400 6,335 6,220***
X3 -13,765 8,641 -1,593 -16,050 6,335 -2,534*
X1X2 3,900 8,641 0,451 1,145 6,335 0,181
X1X3 4,225 8,641 0,489 4,405 6,335 0,695
X2X3 -2,530 8,641 -0,293 3,900 6,335 0,616
*** Valor significativo a 99% de confiana; *Valor significativo a 90% de confiana.
X1 = agitao; X2 = relao enzima/substrato; X3 = concentrao de substrato.
A significncia estatstica dos efeitos principais e interaes entre as variveis foi

determinada por anlise de varincia. Para a resposta de rendimento em glicose, a anlise de
varincia realizada para um modelo linear revelou que apenas a relao enzima/substrato foi
significativa a um nvel de 99% de confiana, com um coeficiente de determinao (R2) de
0,89. No entanto, quando se fez a estimativa da curvatura (Tabela 4.23), todas as variveis
estudadas, bem como todas as interaes entre elas passaram a ser significativas a pelo menos
95% de confiana e o coeficiente de determinao (R2) aumentou para 0,99, sugerindo que
um modelo matemtico de segunda ordem mais adequado para explicar as variaes do
rendimento em glicose, em funo das variveis avaliadas na regio de estudo. Resultados
similares foram obtidos para a anlise de varincia dos resultados de rendimento total da
hidrlise enzimtica. A anlise de varincia para esta resposta mostrou que para um modelo
113
linear, apenas as variveis relao enzima/substrato e concentrao de substrato foram

significativas (a um nvel de 99% e 90% de confiana, respectivamente) com um coeficiente
de determinao (R2) de 0,90. Entretanto, quando se fez a estimativa da curvatura (Tabela
4.23), todas as variveis estudadas, bem como as interaes entre elas (exceto a interao
entre agitao e relao enzima/substrato) passaram a ser significativas a pelo menos 95% de
confiana e o coeficiente de determinao (R2) aumentou para 0,99, sugerindo que um modelo
matemtico de segunda ordem tambm mais adequado para representar as variaes do
rendimento total de hidrlise, em funo das variveis estudadas, na regio analisada.
Tabela 4.23 - Anlise de varincia com erro total e teste da curvatura, para o rendimento em glicose e
rendimento total da hidrlise enzimtica do bagao malte.
Varivel Rendimento em glicose
SQ GL MQ F p
Curvatura 741,926 1 741,926 621,551 0,000***
X1 181,451 1 181,451 152,011 0,000***
X2 5641,344 1 5641,344 4726,055 0,000***
X3 378,950 1 378,950 317,467 0,000***
X1X2 30,420 1 30,420 25,484 0,007***
X1X3 35,701 1 35,701 29,909 0,005***
X2X3 12,802 1 12,802 10,725 0,031**
Erro 4,775 4 1,194
Total 7027,370 11
Varivel Rendimento total de hidrlise
SQ GL MQ F p
Curvatura 397,232 1 397,232 389,649 0,000***
X1 124,978 1 124,978 122,592 0,000***
X2 3104,720 1 3104,720 3045,448 0,000***
X3 515,205 1 515,205 505,369 0,000***
X1X2 2,622 1 2,622 2,572 0,184
X1X3 38,808 1 38,808 38,067 0,004**
X2X3 30,420 1 30,420 29,839 0,005***
Erro 4,078 4 1,019
Total 4218,063 11
GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrtica; MQ = mdia quadrtica.
*** Valor significativo a 99% de confiana; **Valor significativo a 95% de confiana.
R2 = 0,99 para ambos, rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise.
114
Para estabelecer as equaes matemticas de segunda ordem que descrevam o

comportamento destas respostas em funo das variveis estudadas, seria necessria a
realizao de alguns ensaios adicionais modificando a faixa de valores das variveis. No
entanto, estes ensaios no foram realizados por duas razes: 1. no planejamento experimental
estudado foi possvel atingir elevados valores de rendimento (93,1% em glicose e 99,4% total
- ensaio 3). Logo, estes ensaios adicionais no proporcionariam um aumento significativo nos
valores destas respostas; 2. quando a anlise de varincia foi realizada sem estimativa da
curvatura, foram obtidos altos valores de R2 (>0,89), os quais indicam uma boa concordncia
entre os resultados experimentais e os valores previstos pelas equaes de primeira ordem.
Por este motivo, o modelo linear foi ento aplicado para as duas respostas, obtendo-se as
equaes apresentadas na Tabela 4.24.
Tabela 4.24 - Equaes do modelo para a hidrlise enzimtica do bagao de malte e seus respectivos
R2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de rendimento em glicose e
rendimento total (glicose + celobiose) de hidrlise.
Rendimento em glicose y 1 = 59,65 4,76X1 + 26,55X2 6,88X3 + 0,89
( y 1 em %) 1,95X1X2 + 2,11X1X3 1,26 X2X3
Rendimento total de hidrlise y 2 = 72,57 3,95X1 + 19,70X2 8,02X3 + 0,90
( y 2 em %) 0,57X1X2 + 2,20X1X3 1,95 X2X3
a
Atravs das equaes obtidas do modelo (Tabela 4.24) foi possvel construir uma
representao tridimensional da superfcie de resposta para o rendimento em glicose e para o
rendimento total de hidrlise, na regio estudada (Figura 4.12). Estas figuras mostram
claramente que ambas as respostas foram bem ajustadas a uma superfcie plana e que os
maiores valores de rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise podem ser obtidos
utilizando o nvel superior de relao enzima/substrato (45 FPU/g) e inferior de concentrao
de substrato (2% p/v) e agitao (100 rpm).
115
100
RENDIMENTO EM GL
90
80
70
60
50
40
ICOSE
30
33,560 20
39,639 (%)
45,719 8,0
51,798 45
SU 6,5 )
57,878 BS 35 U/g
TR 5,0 FP
63,957
AT 25 T O(
70,037 3,5 RA
O 15 ST
76,116 (%
/S UB
82,196 p/ 2,0 5 A
v) ZIM
88,275 EN
above
acima
110
RENDIMENTO TOTAL
100
90
80
70
60
50
47,939
(%)
40
52,980
58,021 8
63,062 SU 6,5 45
68,103 BS 35 )
TR U/g
73,144 5
25 ( FP
AT O
78,185 O 3,5 AT
(% 15 TR
83,226 U BS
88,267 p/ 2 5 A/S
v) IM
Z
93,307 EN
above
acima
Figura 4.12 - Superfcies de resposta descrita pelos modelos para o rendimento em glicose ( y 1 ) e o
rendimento total (glicose + celobiose) ( y 2 ) da hidrlise enzimtica do bagao de malte.
4.7.3 Anlise comparativa da hidrlise enzimtica do bagao de malte com a hidrlise

enzimtica de outros materiais lignocelulsicos
A anlise estatstica da hidrlise enzimtica do bagao de malte revelou que o

rendimento em glicose e o rendimento total de hidrlise foram aumentados quando agitao
utilizada no processo foi diminuda (Tabelas 4.22 e 4.23). Uma influncia similar da agitao
116
foi tambm observada durante a hidrlise enzimtica de outras matrias-primas

lignocelulsicas. Durante a hidrlise enzimtica de Avicel, por exemplo, Mukataka, Tada e
Takahashi (1983) verificaram que o uso de elevadas agitaes (> 200 rpm) diminuiu o
rendimento de converso da celulose, enquanto que o uso de uma agitao mais moderada
(100 a 200 rpm) proporcionou melhores resultados de rendimento de hidrlise. Por outro lado,
Gan, Allen e Taylor (2002) constataram que o aumento da velocidade de agitao de 50 para
90 rpm no influenciou significativamente na hidrlise enzimtica de um material celulsico
obtido a partir de madeira dura.
De acordo com Ingesson et al. (2001) a hidrlise enzimtica da celulose requer uma
adequada mistura do meio reacional para garantir o contato entre as enzimas e o substrato e
promover a transferncia de massa e calor dentro do reator. O uso de alguma agitao
necessrio, pois aumenta a velocidade e o rendimento da hidrlise, mas o uso de uma agitao
muito elevada pode causar a perda da atividade das enzimas devido fora de cisalhamento
gerada pelo misturador, reduzindo o rendimento de converso (INGESSON et al., 2001;
WRIGHT, 1988).
A concentrao de substrato foi outra varivel que influenciou no rendimento em
glicose e no rendimento total de hidrlise da celulose do bagao de malte (Tabela 4.22), sendo
que o valor de ambas as respostas foi aumentado quando a concentrao de substrato foi
diminuda. Em termos numricos, o aumento da concentrao de substrato de 2 para 8% p/v
proporcionou uma reduo de 13,8% no rendimento em glicose. Resultados bastante similares
foram observados durante a hidrlise enzimtica de -celulose, onde o aumento da
concentrao de substrato de 2,5 para 7,5% p/v reduziu o rendimento em glicose em 14%
(INGESSON et al., 2001).
O efeito da concentrao de substrato na hidrlise enzimtica da celulose tambm j foi
avaliado para outros materiais lignocelulsicos, tais como bagao de cana-de-acar
(MANONMANI; SREEKANTIAH, 1987), sabugo de milho (CHEN; XIA; XUE, 2007) e
madeira mole (TENGBORG; GALBE; ZACCHI, 2001). Em todos estes casos, assim como
no presente trabalho, foi observado que a concentrao de glicose no hidrolisado e o
rendimento da hidrlise enzimtica apresentam perfis opostos, com a concentrao de glicose
aumentando e o rendimento de hidrlise diminuindo com o aumento da concentrao de
substrato. Este efeito pode ser atribudo a uma possvel inibio pelo produto, causada pela
alta concentrao de glicose obtida meio, e s limitaes de transferncia de massa dentro da
117
mistura reacional devido alta viscosidade da suspenso (INGESSON et al., 2004; WEN;
LIAO; CHEN, 2004). Outros fatores que podem contribuir para um baixo grau de converso
da celulose quando se utiliza altas concentraes de substrato, principalmente quando so
empregadas baixas quantidades de enzima, incluem diferentes tipos de inativao da enzima e
uma adsoro no especfica das enzimas na molcula de lignina (VLASENKO et al., 1997).
A hidrlise enzimtica do bagao de malte tambm foi influenciada pela relao
enzima/substrato empregada de forma que, quanto maior a carga de enzimas utilizada, maior
foi o rendimento de hidrlise obtido (Tabela 4.22). Na verdade, esta foi a varivel de maior
influncia na hidrlise enzimtica do bagao de malte, sendo que seu aumento de 5 para 45
FPU/g de substrato proporcionou um aumento de 53,1% e 39,4% no rendimento em glicose e
no rendimento total de hidrlise, respectivamente. Durante a hidrlise enzimtica da madeira
de lamo, Sattler et al. (1989) tambm observaram um aumento (31%) no rendimento de
converso da celulose quando a relao enzima/substrato foi aumentada de 5 para 50 FPU/g
de substrato. De fato, o favorecimento da hidrlise enzimtica devido ao aumento da relao
enzima/substrato j foi observado para diferentes substratos celulsicos, obtidos a partir de
madeira dura (GAN; ALLEN; TAYLOR, 2002), madeira mole (PAN et al., 2005), bagao de
cana-de-acar (MANONMANI; SREEKANTIAH, 1987), cascas de arroz (YEZ;
ALONSO; PARAJ, 2006) e palha de arroz (KAUR; ARNEJA; SINGH, 1998; VLASENKO
et al., 1997). No entanto, a quantidade de enzimas requerida para se atingir uma completa
converso da celulose em glicose varia para cada matria-prima utilizada. Por exemplo,
durante a hidrlise enzimtica de madeira, a mxima converso de celulose em glicose foi
obtida utilizando uma relao enzima/substrato de 11,4 FPU/g. O aumento na quantidade de
enzimas no favoreceu o processo de hidrlise e no afetou o rendimento final em glicose
(EKLUND; GALBE; ZACCHI, 1990). Por outro lado, durante a hidrlise enzimtica da palha
de arroz pr-tratada por exploso a vapor, foi necessrio o uso de 100 FPU/g de substrato para
hidrolisar completamente a celulose (VLASENKO et al., 1997). No presente trabalho, uma
relao enzima/substrato de 45 FPU/g foi suficiente para promover uma hidrlise completa da
celulose a partir do bagao de malte.
118
4.7.4 Efeito da carga de enzimas na hidrlise enzimtica da celulose do bagao de

malte
Conforme apresentado no item 4.7.2, a concentrao de substrato otimizada para a

hidrlise enzimtica da celulose do bagao de malte foi de 2% p/v. A concentrao mxima
de glicose no hidrolisado que pode ser obtida a partir desta concentrao de substrato, de
20,1 g/l. Este valor baixo se for desejada a utilizao do hidrolisado como meio de
fermentao, para produo de etanol ou cido lctico, por exemplo, o que necessitaria a
realizao de uma etapa de concentrao para aumentar o teor de glicose. Porm, a incluso
desta etapa pode aumentar o custo global do processo. Desta forma, poderia ser mais
vantajoso produzir diretamente um hidrolisado com uma concentrao mais elevada de
glicose, de forma que a etapa de concentrao no se torne necessria. Isto possvel
aumentando a concentrao de substrato utilizada no processo de hidrlise. No presente
trabalho, a concentrao mxima de substrato avaliada foi de 8% p/v, pois para concentraes
maiores no foi possvel obter uma mistura adequada do meio reacional, devido alta
viscosidade da suspenso. Porm, com o uso de uma concentrao de substrato de 8% p/v e
uma relao enzima/substrato de 45 FPU/g, no foi atingida a mxima converso de celulose
em glicose (rendimento em glicose = 73,8%). Para tentar melhor os resultados de rendimento
do processo de hidrlise, alguns ensaios foram realizados empregando uma concentrao de
substrato de 8% p/v, mas aumentado a quantidade de enzima utilizada para at 85 FPU/g de
substrato. Os resultados obtidos nestes experimentos esto apresentados na Figura 4.13.
A Figura 4.13 mostra claramente o aumento na liberao de glicose a partir da celulose
do bagao de malte, quando a relao enzima/substrato utilizada no processo de hidrlise foi
aumentada de 15 para 45 FPU/g de substrato. Porm, o uso de uma quantidade maior de
enzimas no favoreceu a hidrlise da celulose em glicose, de forma que o rendimento em
glicose foi mantido constante para relaes enzima/substrato de 45 a 85 FPU/g (Figura 4.14).
Estes resultados sugerem que o aumento na quantidade de enzimas favorece a hidrlise
enzimtica da celulose do bagao de malte, mas at certo limite, acima do qual a velocidade
da reao no mais alterada. Por esta razo, os ensaios onde se utilizou 45 FPU/g a
85 FPU/g de substrato proporcionaram resultados similares de rendimento em glicose e
rendimento total de hidrlise de cerca de 74% e 84%, respectivamente. Em nenhum destes
casos foi obtida, portanto, uma completa converso da celulose em glicose, provavelmente
devido a uma possvel inibio das enzimas pelo produto da reao. De acordo com alguns
119
autores, as enzimas celulolticas de Trichoderma reesei so altamente sensveis inibio

causada por ambos os produtos de hidrlise, glicose e celobiose (VLASENKO et al., 1997;
WEN; LIAO; CHEN, 2004), sendo que quanto maior a concentrao destes compostos no
meio reacional, maior a inibio que eles causam a estas enzimas.
70
60
Concentrao de glicose (g/l)
50
40
30
15 FPU/g
25 FPU/g
20
35 FPU/g
45 FPU/g
10 55 FPU/g
65 FPU/g
75 FPU/g
0 85 FPU/g
0 20 40 60 80 100
Tempo de hidrlise (h)
Figura 4.13 - Perfil da liberao de glicose durante a hidrlise enzimtica do bagao de malte a 45C,
100 rpm e 8% p/v de concentrao de substrato, utilizando diferentes relaes de
enzima/substrato (15 a 85 FPU/g).
90
85
Rendimento de hidrlise (%)
80
75
70
65
60
55
50
Rendimento em glicose
45 Rendimento total de hidrlise
40
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Relao enzima/substrato (FPU/g)
Figura 4.14 - Efeito da relao enzima/substrato nos rendimentos de hidrlise da celulose do bagao
de malte a 45C, 100 rpm e 8% p/v de concentrao de substrato.
120
Apesar da converso da celulose ter sido incompleta, alguns dos hidrolisados obtidos
nestes experimentos apresentaram uma concentrao de glicose de aproximadamente 59 g/l,
valor mais adequado para uso em processos fermentativos. Porm, alm de glicose estes
hidrolisados tambm continham celobiose em concentraes variando de 6,7 a 7,9 g/l. Uma
alternativa para reduzir a concentrao deste composto no hidrolisado seria a suplementao
do extrato enzimtico com a enzima -glicosidase, a qual atua na converso da celobiose em
glicose (CAO; TAN, 2002). Porm, o alto custo envolvido com a adio de uma outra enzima
no processo, pode no justificar a adio de -glicosidase para converter esta baixa
concentrao de celobiose. De acordo com Chen, Xia e Xue (2007) o custo da enzima
contribui significativamente no custo total do processo de converso de biomassas e, portanto,
a quantidade de enzima utilizada no processo deve ser minimizada o mximo possvel. Alm
disso, dependendo do processo fermentativo a ser realizado, a presena de celobiose no meio
de fermentao pode no interferir no desempenho do microrganismo. Alguns autores
verificaram inclusive consumo de celobiose quando o hidrolisado de madeira foi utilizado
como meio de fermentao para a produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii
NRRL B-445 (MOLDES; ALONSO; PARAJ, 1999).
4.8 EFEITO DA HEMICELULOSE E DA LIGNINA NA HIDRLISE ENZIMTICA DA

CELULOSE DO BAGAO DE MALTE
Estes ensaios foram realizados com o objetivo de avaliar a influncia das fraes de
hemicelulose e lignina na hidrlise enzimtica do bagao de malte e assim verificar a
necessidade de se submeter o material a duas etapas prvias de tratamento para poder atingir
elevados rendimentos de hidrlise. Trs amostras com diferentes composies qumicas foram
preparadas a partir deste material e utilizadas como substrato nos experimentos de hidrlise:
1. bagao de malte na forma original; 2. bagao de malte obtido aps o processo de hidrlise
cida (celulignina); 3. bagao de malte obtido aps as seqncias de hidrlise cida e alcalina
(polpa celulsica). Conforme se observa na Tabela 4.25, o bagao de malte original
composto principalmente por hemicelulose e lignina. Na amostra tratada com cido
(celulignina) a lignina a frao presente em maior quantidade, enquanto que a polpa
basicamente constituda por celulose.
121
Tabela 4.25 - Composio qumica das amostras de bagao de malte empregadas no processo de
hidrlise enzimtica.
Componente Composio qumica (g/100 g)
Bagao de malte Celulignina Polpa celulsica

original
Celulose 16,8 34,0 90,4
Hemicelulose 28,4 7,9 1,1
Lignina 27,8 49,2 8,2
Outrosa 27,0 8,9 0,3
a
outros componentes incluem cinzas, protenas e extrativos
4.8.1 Hidrlise enzimtica do bagao de malte com diferentes composies qumicas
Os resultados da hidrlise enzimtica do bagao de malte com diferentes composies

qumicas esto apresentados na Figura 4.15. Observa-se nesta figura que os resultados obtidos
variaram com a composio do material. A formao de glicose (Figura 4.15A) foi favorecida
na amostra com baixo teor de hemicelulose e lignina (polpa celulsica), a qual tambm
proporcionou o mais alto rendimento total de hidrlise da celulose (Figura 4.15B). Por outro
lado, o material original rendeu os mais baixos valores de glicose liberada e rendimento total
de hidrlise. Esses resultados sugerem que a composio qumica do substrato, isto , a
presena de hemicelulose e/ou de lignina na amostra afetou negativamente a hidrlise
enzimtica da celulose.
Os resultados obtidos a partir do resduo de celulignina revelam a influncia da
hemicelulose na hidrlise enzimtica da celulose, uma vez que, apesar do teor de lignina na
amostra ter sido aumentado aps o pr-tratamento cido, a hidrlise enzimtica desta amostra
proporcionou maiores valores de liberao de glicose e rendimento total de hidrlise do que
os obtidos a partir do material original. Esta melhora nos resultados pode ser atribuda,
portanto, baixa presena de hemicelulose no material. A remoo de lignina, alm da
hemicelulose, aumentou ainda mais esses resultados. A partir da polpa celulsica, foram
atingidos os mais altos valores de rendimento em glicose (85,6%) e rendimento total de
hidrlise (91,7%). Tais valores foram 14,5% e 17,4% superiores queles obtidos a partir da
celulignina, e 280% e 310% superiores queles obtidos a partir do material original. Conclui-
se, portanto, que quanto menor os teores de hemicelulose e lignina na amostra, melhor o
desempenho da hidrlise enzimtica da celulose.
122
20
(A)
18
Glicose (Gli) e Celobiose (Cel) (g/l)

16
14
G li - O riginal
12 G li - C elulignina
G li - Polpa celulsica
10 C el - O riginal
C el - C elulignina
8 C el - Polpa celulsica
-2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tem po de hidrlise (h)
100
(B)
90
Rendimento total de hidrlise, YT (%)
80
Rendimento em glicose, YG (%)
70
60
YT - O riginal
50 YT - C elulignina
YT - Polpa celulsica
YG - O riginal
40
YG - C elulignina
YG - Polpa celulsica
30
20
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo de hidrlise (h)
Figura 4.15 - Hidrlise enzimtica das amostras de bagao de malte original, celulignina e polpa
celulsica. (A) Concentrao de glicose e celobiose nos hidrolisados obtidos; (B)
Rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise para cada amostra utilizada.
De acordo com Mansfield, Mooney e Saddler (1999), os materiais lignocelulsicos na

sua forma original so relativamente resistentes ao enzimtica. Porm, a remoo da
hemicelulose e da lignina modifica a estrutura do material, tornando a celulose mais aberta e
acessvel ao contato com as enzimas. Por essa razo, a hidrlise enzimtica dos materiais
lignocelulsicos em sua forma original ocorre com baixa eficincia.
123
Assim como foi observado no presente trabalho, a remoo parcial da hemicelulose e da

lignina tambm proporcionou uma melhora no rendimento em glicose durante a hidrlise
enzimtica da celulose a partir de outros materiais lignocelulsicos, tais como cascas de arroz
(YEZ; ALONSO; PARAJ, 2006), sabugo de milho (HGREN et al., 2007), bagao de
cana-de-acar (MARTN; KLINKE; THOMSEN, 2007) e madeira de lamo (CHANG;
HOLTZAPPLE, 2000). De acordo com Liao et al. (2005), tanto a hemicelulose como a
lignina, inibem fsica e/ou quimicamente a ao das enzimas, impedindo a celulose de ser
atacada. Com a remoo dessas duas fraes, a cristalinidade da celulose reduzida, enquanto
que a porosidade do material e a rea superficial acessvel s enzimas so aumentadas,
favorecendo a ao enzimtica (MANSFIELD; MOONEY; SADDLER, 1999; SUN;
CHENG, 2002). Estudando a hidrlise enzimtica de Pinus radiata, Wong et al. (1988)
concluram que durante o pr-tratamento do material, a remoo da hemicelulose e
redistribuio da lignina aumentaram a rea superficial presente na forma de poros,
melhorando desta forma a acessibilidade s enzimas.
Pan et al. (2005) sugeriram que a lignina reduz a hidrlise da celulose atravs de dois
distintos mecanismos: 1. formando uma barreira fsica que impede ou previne o acesso da
enzima celulose; 2. adsorvendo irreversivelmente as enzimas celulase, impedindo, portanto,
a ao delas sobre a celulose. Por essa razo, em amostras com elevado teor de lignina grande
parte das enzimas so adsorvidas ou bloqueadas por esta molcula e apenas uma pequena
parte consegue se adsorver efetivamente na superfcie do substrato. Por outro lado, para
amostras com baixo teor de lignina, muitas enzimas podem ser adsorvidas na celulose, sendo
efetivas e digerindo rapidamente a biomassa (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000).
Embora a lignina seja considerada um dos fatores mais limitantes da hidrlise
enzimtica da celulose (BERLIN et al., 2005), no presente trabalho foi verificado uma grande
influncia negativa da hemicelulose na ao das enzimas celulose. Isto porque, quando esta
frao foi removida quase que totalmente (86,5% de remoo, junto com apenas 14% de
remoo da lignina, obtendo a celulignina), o rendimento total de hidrlise aumentou em 3,5
vezes comparado com o rendimento obtido a partir do material original, atingindo um valor de
78,1% (Figura 4.15B). O pr-tratamento do bagao de malte pelas seqncias de hidrlise
cida e alcalina promoveu uma remoo quase total de ambas as fraes, hemicelulose e
lignina (99,3% e 94,7% de remoo, respectivamente), porm, o rendimento total de hidrlise
foi aumentado em 4 vezes quando comparado com o rendimento obtido a partir do material
original, atingindo um valor de 91,8%. Estes resultados sugerem, portanto, que no
124
necessrio promover uma remoo total das fraes de hemicelulose e lignina da amostra,
para se atingir elevados rendimentos durante a hidrlise enzimtica da celulose. Alguns
autores tambm relataram que no necessrio remover completamente a lignina do material
para que a hidrlise enzimtica da celulose seja completa (GREGG; SADDLER, 1996). Neste
caso, uma anlise econmica poderia ser til para avaliar se os melhores resultados obtidos no
rendimento da hidrlise enzimtica a partir da polpa celulsica justificariam o custo envolvido
com a realizao da etapa de tratamento alcalino da celulignina, antes da hidrlise enzimtica.
De um ponto de vista ambiental a no realizao desta etapa seria benfica, pois a degradao
da lignina durante a hidrlise alcalina gera um licor rico em compostos fenlicos, dentre os
quais, muitos so txicos e precisam ser removidos antes da descarga deste efluente no meio
ambiente (KARAM; NICELL, 1997).
tambm interessante notar que a partir da celulignina do bagao de malte, mas
principalmente a partir da polpa celulsica, a hidrlise enzimtica da celulose apresentou uma
fase inicial logartmica associada com uma rpida liberao de glicose, seguida por uma
diminuio na velocidade de produo deste acar medida que a reao avanou (Figura
4.15A). Para explicar este comportamento, alguns autores sugeriram que durante a hidrlise
enzimtica da celulose, as enzimas celulolticas degradam rapidamente a frao amorfa mais
acessvel do substrato. Com o progresso da hidrlise, a celulose torna-se mais resistente
hidrlise como resultado do aumento da cristalinidade (GHARPURAY; LEE; FAN, 1983;
GREGG; SADDLER, 1996; PURI, 1984). Outros fatores associados com a natureza do
sistema enzimtico utilizado tambm tm sido sugeridos para explicar a diminuio da
velocidade da hidrlise da celulose. Estes incluem a inativao trmica das enzimas, a
adsoro irreversvel ou ligao no especfica das celulases e a inibio das enzimas pelo
produto da reao (GREGG; SADDLER, 1996; MORIYAMA; SAIDA, 1986; RAMOS;
NAZHAD; SADDLER, 1993).
4.8.2 Estrutura morfolgica do bagao de malte aps a hidrlise enzimtica
Vrios autores consideram que o melhor desempenho da hidrlise enzimtica quando se

utiliza substratos pr-tratados, est relacionado s modificaes morfolgicas causadas pelo
pr-tratamento na estrutura do material (GHARPURAY; LEE; FAN, 1983; RAMOS;
NAZHAD; SADDLER, 1993). Por este motivo, algumas fotomicrografias em microscpio
eletrnico de varredura foram realizadas, para as diferentes amostras de bagao de malte, com
125
o objetivo de se verificar as mudanas estruturais ocorridas no material durante os processos

de hidrlise cida, alcalina e enzimtica (Figura 4.16).
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Figura 4.16 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das amostras de
bagao de malte. Material original antes (A) e aps (B) a hidrlise enzimtica;
Celulignina antes (C) e aps (D) a hidrlise enzimtica; Polpa celulsica antes (E) e
aps (F) a hidrlise enzimtica. Ampliao: 300 vezes.
126
A Figura 4.16A mostra que o bagao de malte na sua forma original apresenta uma
estrutura de fibras rgidas e altamente ordenadas. Com a remoo da hemicelulose, a estrutura
deste material foi modificada, mas a estrutura principal no foi rompida (Figura 4.16C).
Quando a lignina tambm foi removida (Figura 4.16E), a estrutura do material foi fortemente
modificada resultando em uma estrutura muito diferente das outras duas, original e
celulignina. Neste caso, as fibras de celulose tornaram-se totalmente expostas, o que
aumentou a rea superficial e a porosidade do material. Conseqentemente, essas fibras
encontram-se mais susceptveis ao das enzimas do que as outras duas amostras de bagao
de malte. Ooshima, Burns e Converse (1990) tambm observaram que quanto mais severo o
pr-tratamento utilizado, maior a rea superficial da celulose disponvel para as enzimas.
Aps a hidrlise enzimtica, observa-se que a estrutura do material original
praticamente no foi modificada (Figura 4.16B), confirmando a baixa eficincia de hidrlise
obtida. A imagem da celulignina hidrolisada (Figura 4.16D) mostra uma maior destruio das
fibras neste caso quando comparada com as fibras hidrolisadas a partir do material original, o
que justifica o melhor desempenho da hidrlise a partir da celulignina do que a partir da
amostra original. As fibras hidrolisadas a partir da polpa celulsica do bagao de malte foram
completamente destrudas (Figura 4.16F), o que explica os altos valores de rendimento em
glicose e rendimento total de hidrlise, atingidos a partir deste substrato. Nota-se ainda neste
caso que as fibras de celulose tornaram-se mais estreitas e curtas, sugerindo um ataque
longitudinal e lateral das fibras.
4.8.3 Composio dos hidrolisados celulsicos produzidos
A composio em termos de carboidratos (glicose, celobiose, xilose e arabinose) dos

hidrolisados produzidos a partir do bagao de malte encontra-se na Tabela 4.26. Observa-se
nesta tabela que a glicose foi o principal acar presente nos hidrolisados produzidos a partir
da celulignina e da polpa celulsica. Embora a concentrao tenha sido diferente para cada
caso, estes valores esto relacionados com a composio qumica do material, de forma que
quanto maior o teor de celulose presente, maior a concentrao de glicose que poderia ser
obtida no hidrolisado. Para o bagao de malte nas formas original, celulignina e polpa
celulsica, a mxima concentrao de glicose que poderia ser obtida no hidrolisado seria de
3,7 g/l, 7,6 g/l e 20,1 g/l, respectivamente. Estes resultados demonstram, portanto, que a
liberao de glicose a partir do material foi favorecida com a realizao dos pr-tratamentos
127
de hidrlise cida e alcalina, uma vez que a concentrao de glicose nos hidrolisados
enzimticos correspondeu a 23%, 74% e 86% do mximo que poderia ser obtido para o
material na forma original, celulignina e polpa celulsica, respectivamente.
Tabela 4.26 - Composio de carboidratos nos hidrolisados enzimticos produzidos a partir do bagao
de malte nas formas original, celulignina e polpa celulsica.
Componente Concentrao de carboidratos no hidrolisado (g/l)
Original Celulignina Polpa celulsica

Glicose 0,84 5,65 17,21
Celobiose - 0,24 1,17
Xilose 0,86 0,60 -
Arabinose 1,90 - -
A arabinose foi o principal acar encontrado no hidrolisado produzido a partir da

amostra original. Existem duas explicaes possveis para este fato: 1. a arabinose presente no
bagao de malte apresenta uma alta sensibilidade trmica, a qual maior do que aquela
apresentada pela xilose (CARVALHEIRO et al., 2004b), e por esta razo ela teria sido
facilmente liberada da estrutura da hemicelulose durante o processo de hidrlise; 2. as
celulases so geralmente misturas de vrias enzimas e, alm daquelas envolvidas no processo
de hidrlise da celulose (endoglucanase, exoglucanase, e -glucosidase) existem tambm
vrias enzimas auxiliares que atacam a hemicelulose, tais como glucuronidase, acetilesterase,
xilanase, -xilosidase, galactomananase e glucomananase (DUFF; MURRAY, 1996; SUN;
CHENG, 2002) que poderiam ter atacado a estrutura da hemicelulose liberando xilose e
arabinose no meio reacional.
Um aspecto importante que deve ser considerado quando se avalia a composio de
hidrolisados com respeito presena de subprodutos. De acordo com Martn et al. (2002), a
baixa formao de subprodutos uma importante vantagem da hidrlise enzimtica quando
comparada hidrlise cida, por exemplo. No presente trabalho, todos os hidrolisados
produzidos continham outros carboidratos (xilose, arabinose ou celobiose) em sua
composio, alm de glicose. O hidrolisado obtido a partir do bagao de malte original
continha xilose e arabinose em concentraes mais elevadas que a de glicose, enquanto que o
hidrolisado produzido a partir da celulignina continha celobiose e xilose em mistura com a
glicose, porm, em concentraes menores que a deste acar (Tabela 4.26). No hidrolisado
128
obtido a partir da polpa celulsica, somente celobiose foi detectada em mistura com a glicose.
Em termos de proporo, nota-se que a xilose estava presente no hidrolisado original, em uma
relao de 1/1 com a glicose. Porm, no hidrolisado da celulignina, esta proporo foi
reduzida para 1/9,4 e no hidrolisado da polpa celulsica no foi detectada a presena de
xilose. Esta diminuio na relao xilose/glicose se deve liberao da xilose durante as
etapas de pr-tratamento do bagao de malte. A mesma explicao pode ser dada para
justificar a presena de arabinose apenas no hidrolisado do bagao de malte original (Tabela
4.26). Por outro lado, a presena de celobiose foi verificada nos hidrolisados obtidos a partir
da celulignina e da polpa de celulose, mas no a partir do material original. Alm disso,
quanto mais pr-tratado o material, maior a concentrao de celobiose obtida no hidrolisado
(Tabela 4.26) o que sugere um efeito maior de inibio das enzimas neste hidrolisado,
afetando a capacidade de converso da celobiose em glicose. Tal efeito pode estar relacionado
com a alta concentrao de glicose obtida neste meio.
A presena de compostos txicos ao metabolismo microbiano (hidroximetilfurfural,
furfural, cido actico e compostos fenlicos) no foi detectada nos hidrolisados produzidos.
Este fato pode ser atribudo alta especificidade das enzimas celulase (BEGUIN; AUBERT,
1994), e tambm s condies brandas de reao empregadas. A ausncia de compostos
txicos de fundamental importncia para o emprego do hidrolisado em processos de
bioconverso, pois a maior limitao do uso de hidrolisados para esta finalidade se deve
inibio causada pelos compostos txicos nele presentes (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a).
4.9 EMPREGO DO HIDROLISADO CELULSICO DE BAGAO DE MALTE COMO

MEIO DE FERMENTAO PARA PRODUO DE CIDO LCTICO
4.9.1 Aspectos gerais do processo fermentativo
O hidrolisado obtido por hidrlise enzimtica da polpa celulsica do bagao de malte

foi empregado como meio de fermentao para a produo de cido lctico pela bactria
Lactobacillus delbrueckii. No entanto, como era de interesse utilizar um hidrolisado contendo
cerca de 50 g/l de glicose, este foi produzido nas condies otimizadas de hidrlise, porm,
utilizando uma concentrao de substrato de 8% p/v. Anlises da composio qumica do
hidrolisado assim obtido revelou a presena de glicose e celobiose nas concentraes de
129
57,8 g/l e 7,5 g/l, respectivamente.

Quando cultivada neste hidrolisado, a bactria Lactobacillus delbrueckii foi capaz de
consumir a glicose presente e produzir cido lctico, o qual foi detectado apenas na forma
isomrica L. Embora o cido lctico se apresente sob duas formas isomricas, D e L, de
acordo com Hofvendahl e Hahn-Hgerdal (2000) normalmente a maioria das bactrias cido
lcticas produzem apenas a forma isomrica L deste cido.
A celobiose presente no hidrolisado no foi consumida pelo microrganismo durante o
tempo de fermentao considerado (48 h) e a presena de subprodutos da reao, incluindo
etanol, cido actico e cido frmico, tambm no foi verificada no hidrolisado fermentado.
Este resultado interessante, pois para que a produo de cido lctico em escala industrial
ocorra de forma eficiente, a formao de subprodutos deve ser evitada ou mantida em um
mnimo (HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL, 2000).
4.9.2 Efeito do nvel de inculo na produo de cido lctico
A produo de cido lctico por microrganismos influenciada por vrios fatores, os

quais incluem pH, agitao, fonte de carbono, temperatura, suplementao nutricional e nvel
do inculo (HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL, 2000; SILVA; MANCILHA, 1991).
Para avaliar o efeito da concentrao inicial do inculo na produo de cido lctico por
Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado celulsico de bagao de malte, foram
realizados alguns ensaios empregando valores de concentrao celular inicial de 0,5, 0,75 e
1,0 g/l. Os resultados obtidos revelaram que aps 48 h de fermentao, o pH inicial de todos
os ensaios havia sido reduzido de 5,95 (pH inicial) para aproximadamente 4,5, devido a
formao e liberao de cido lctico no meio reacional. Porm, o consumo de glicose e a
produo de cido lctico variaram para cada nvel de inculo utilizado. A eficincia destas
fermentaes foi avaliada atravs dos valores dos parmetros: produtividade volumtrica
(QP), fator de converso de glicose em cido lctico (YP/S) e fator de rendimento de cido
lctico por clula (YP/X). Os resultados obtidos esto apresentados na Figura 4.17.
Nota-se na Figura 4.17 que os valores de YP/S aumentaram com o aumento do nvel de
inculo de 0,5 para 1,0 g/l, atingindo o valor mximo de 0,73 g/g (73% de eficincia) quando
se utilizou 1,0 g/l de clulas no incio da fermentao. Por outro lado, quando o nvel de
inculo foi dobrado, os valores de YP/X foram reduzidos pela metade, sugerindo que o
aumento da quantidade de clulas no incio da fermentao exerceu um efeito negativo sobre
130
a capacidade do microrganismo em converter glicose a cido lctico. Tal efeito pode estar
relacionado com a presena de nutrientes no meio de fermentao. O hidrolisado celulsico
de bagao de malte foi utilizado como meio de fermentao na forma em que foi produzido,
isto , sem suplementao adicional de nutrientes. Como a polpa de celulose que foi
hidrolisada enzimaticamente continha uma pequena frao (0,3% p/p) composta por protenas
e minerais, possvel que parte destas substncias tenham sido solubilizadas durante o
processo de hidrlise enzimtica, proporcionando desta forma alguma fonte nutricional para o
desenvolvimento do microrganismo. No entanto, esta quantidade de nutrientes solubilizada
pode no ter sido suficiente para os microrganismos quando o nvel de inculo foi aumentado.
Isto teria afetado o desempenho das clulas em converter glicose a cido lctico, justificando
a queda observada nos valores de YP/X.
0,8
10
QP (g/l.h)
0,7
0,6 8
YP/X (g/g)
0,5
6
0,4
YP/S (g/g);
0,3 4
0,2
2
0,1
0,0 0
0 10,5 2 3 40,75 5 6 71,0 8
Concentrao inicial de inculo (g/l)
Figura 4.17 - Efeito da concentrao inicial de inculo nos parmetros fermentativos da produo de
cido lctico por Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado celulsico de bagao
de malte.
Por outro lado, quanto maior o nvel de inculo utilizado, maior a quantidade de clulas
disponveis para realizar este processo de bioconverso. Por esta razo, o aumento da carga do
inculo de 0,5 para 1,0 g/l foi capaz de mascarar esta menor capacidade da clula em
converter glicose a cido lctico, uma vez que o fator de rendimento do processo (YP/S) foi
aumentado em 20%. Conclui-se ento com estes resultados que, quando se utilizou um
131
inculo com 1 g/l de clulas, o fator de rendimento em cido lctico por substrato consumido
foi maior do que nos outros experimentos devido ao maior nmero de clulas presentes no
meio de fermentao. Durante a produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii a
partir de resduo de abacaxi, Idris e Suzana (2006) tambm verificaram uma relao entre a
concentrao de clulas e a produo de cido lctico, de forma que a produo deste cido
foi favorecida quando a concentrao celular utilizada foi aumentada. O aumento do nvel de
inculo de 104 para 106 esporos/ml tambm favoreceu a produo de cido lctico por uma
espcie mutante do fungo Rhizopus (MIURA et al., 2003).
Em relao produtividade volumtrica em cido lctico (QP) observa-se na Figura
4.17 que o valor deste parmetro foi idntico em todos os experimentos. Isto significa que em
um tempo de fermentao de 48 h as clulas produziram a mesma quantidade de cido lctico
em todos os meios avaliados. Um comportamento similar foi observado por Gomez e Goma
(1986) durante a fermentao para produo de cido lctico a partir de glicose empregando
diferentes nveis de inculo (0,4, 2,5 e 3,6 g/l). De acordo com estes autores, um tempo de
fermentao de 50 h foi suficiente para que todos os meios de fermentao atingissem a
mesma concentrao final de cido lctico, devido queda do pH do meio de fermentao.
Durante a fermentao para produo de cido lctico, na medida em que o cido lctico
formado e excretado para fora da clula, o pH do meio de fermentao diminui causando uma
inibio no crescimento do microrganismo, reduzindo ento o rendimento de formao de
produto (SILVA; MANCILHA, 1991). Logo, no presente trabalho, um tempo de 48 h foi
longo o suficiente para permitir que as clulas produzissem, em todos os meios de
fermentao, a mesma quantidade de cido lctico capaz de proporcionar a queda do pH at
este valor limite onde o metabolismo do microrganismo foi afetado. Por este motivo, todas as
fermentaes apresentaram valores similares de pH final e de produtividade volumtrica. De
acordo com Hofvendahl e Hahn-Hgerdal (2000), o pH timo para produo de cido lctico
varia entre 5,0 e 7,0. Valores abaixo deste limite afetam negativamente o desempenho do
microrganismo, determinando o final da fermentao.
132
4.10 EFEITO DO pH E DA SUPLEMENTAO NUTRICIONAL DO HIDROLISADO

CELULSICO DE BAGAO DE MALTE NA PRODUO DE CIDO LCTICO POR
Lactobacillus delbrueckii
Nos experimentos anteriores foi verificado que o hidrolisado celulsico de bagao de

malte apresenta caractersticas favorveis para ser utilizado como meio de fermentao para a
produo de cido lctico. Porm, o desempenho da fermentao foi afetado pela queda do
pH ocorrida em decorrncia da formao deste cido. Por este motivo, os experimentos
realizados nesta etapa foram conduzidos com e sem o controle do pH de fermentao, para
avaliar a influncia desta varivel no processo de bioconverso. Alm disso, alguns ensaios
foram tambm realizados empregando o hidrolisado suplementado com nutrientes, para
verificar a possibilidade de melhorar os valores dos parmetros fermentativos obtidos
anteriormente.
4.10.1 Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico
A adio de nutrientes ao meio de fermentao empregado para a produo de cido

lctico tem sido investigada em um grande nmero de trabalhos envolvendo como substrato
sacarose, glicose, lactose, soro de queijo, hidrolisados hemicelulsicos, entre outros. Nestes
estudos, os principais nutrientes adicionados aos meios de fermentao incluem o extrato de
levedura e os componentes presentes na formulao do meio MRS caldo (meio empregado
para crescimento de bactrias) (HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL, 2000). A Figura 4.18
mostra que a adio de extrato de levedura ao hidrolisado celulsico de bagao de malte
favoreceu o consumo de glicose e a produo de cido lctico pelo microrganismo; no
entanto, o desempenho da fermentao foi ainda melhor quando o hidrolisado foi enriquecido
com os nutrientes do meio MRS.
De fato, as bactrias cido lcticas so considerados microrganismos de grande
exigncia nutricional, pois apresentam uma capacidade limitada em biosintetizar vitaminas do
complexo B e aminocidos (FITZPATRICK; OKEEFFE, 2001; OH et al., 2005). Logo, para
garantir boas condies de crescimento e atividade biolgica destas bactrias, o meio de
cultivo deve conter minerais, vitaminas do complexo B, aminocidos, bases purinas e
pirimidinas (HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL, 2000; KWON et al., 2000; PAULI;
FITZPATRICK, 2002).
133
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
(A) 55 55 (B) 15 15
50 50
12 12
45 45
9
Glicose (g/l)
cido lctico (g/l)

40 40
35 35 6 6
30 30
3 3
25 25
0 0
20 20
15 15 -3 -3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
(C) 2,5 2,5
(D) 6,0 6,0
5,5 5,5
2,0 2,0
5,0 5,0
Clulas (g/l)
1,5 1,5 4,5 4,5

pH
4,0 4,0
1,0 1,0
3,5 3,5
0,5 0,5 3,0 3,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Figura 4.18 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de malte no

consumo de glicose (A), produo de cido lctico (B), crescimento celular (C) e pH da
fermentao (D) por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1 (): hidrolisado no
suplementado; Meio 2 (): hidrolisado suplementado com extrato de levedura; Meio 3
(): hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS; Meio 4 (): MRS
com a mesma concentrao inicial de glicose do hidrolisado.
A necessidade de suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de

malte justificvel uma vez que o material submetido hidrlise enzimtica (polpa
celulsica) j havia sido pr-tratado duas vezes, com cido diludo e com soluo de
hidrxido de sdio. Por esta razo, importantes componentes nutricionais, tais como minerais
(presentes nas cinzas) e protenas existentes no material original, j haviam sido quase
totalmente solubilizados durante estas etapas. Mesmo assim, observa-se na Figura 4.18B que
houve produo de cido lctico a partir do hidrolisado sem suplementao nutricional, o que
sugere a presena de alguma fonte de nutrientes neste meio. A necessidade de suplementao
nutricional do hidrolisado para a produo de cido lctico j foi verificada tambm em
hidrolisados obtidos a partir de outros materiais lignocelulsicos, tais como palha de trigo
134
(GARDE et al., 2002), madeira (PARAJ; ALONSO; SANTOS, 1996; WEE et al., 2006),
bagao de mandioca e bagao de cana-de-acar (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2006).
A adio de extrato de levedura ao hidrolisado de bagao de malte proporcionou um
aumento de 27% na produo de cido lctico. Por outro lado, quando o hidrolisado foi
suplementado com os nutrientes do meio MRS, o aumento na produo de cido lctico foi de
67%. Resultados similares a estes foram tambm observados em outros trabalhos sobre
produo de cido lctico, conforme relatado por Hofvendahl e Hahn-Hgerdal (2000). Estes
autores compararam diversos estudos sobre a produo de cido lctico onde os meios de
fermentao foram suplementados com diferentes tipos de nutrientes. Alm de observar um
efeito positivo da suplementao nutricional na produo deste cido, eles tambm
verificaram que a adio dos nutrientes do meio MRS tem proporcionado melhores resultados
de fermentao do que a adio de extrato de levedura apenas. Isto poderia ser explicado pelo
fato de que o meio MRS uma mistura mais completa de nutrientes, pois tambm contm
extrato de levedura e ainda acrescido de extrato de carne, peptona entre outros nutrientes.
De acordo com Kwon et al. (2000), quanto mais completa a mistura de nutrientes adicionada
ao meio de fermentao, maior ser a produtividade volumtrica em cido lctico.
Um fato interessante observado foi que os resultados de consumo de glicose e produo
de cido lctico a partir do hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS foram
superiores queles obtidos no prprio meio MRS (Figuras 4.18A e B). Isto sugere que o
hidrolisado celulsico de bagao de malte apresenta algum componente em sua composio
que no foi identificado, mas que atuou sinergisticamente com os nutrientes do meio MRS
favorecendo a produo de cido lctico.
O crescimento celular tambm foi favorecido em meios suplementados com nutrientes,
porm, neste caso, os resultados foram similares em ambos os hidrolisados suplementados,
com extrato de levedura ou com os nutrientes do meio MRS (Figura 4.18C). A partir dos
meios suplementados, o crescimento do microrganismo foi inicialmente rpido, mas
praticamente cessou aps 12 h de fermentao. Por outro lado, no meio no suplementado, o
crescimento do microrganismo foi muito pequeno, no havendo uma fase inicial exponencial,
como aquela observada nos outros meios.
importante ressaltar que todos estes ensaios foram realizados sem controle do pH do
meio de fermentao, o que claramente afetou o desempenho do processo. A Figura 4.18D
mostra que durante as primeiras 12 h de fermentao houve uma forte queda do pH (de 6,0
para 4,4) em todos os meios, devido produo de cido lctico. Conseqentemente, o
135
metabolismo do microrganismo foi afetado e nas 12 h seguintes de fermentao, o consumo

de glicose foi pequeno em todos os meios, prejudicando a produo de cido lctico e o
crescimento celular. Mesmo assim, ainda houve uma pequena formao de cido lctico
durante este perodo, causando uma queda do pH para 4,2, o que praticamente determinou o
final de todas as fermentaes. Observa-se na Figura 4.18 que aps 24 h de fermentao, o pH
de todos os meios permaneceu praticamente estvel em 4,2 e no foi mais verificado consumo
de glicose, produo de cido lctico e crescimento celular. Comportamento similar foi
observado durante a fermentao para a produo de cido lctico por Lactococcus lactis, a
partir do hidrolisado de farinha de trigo, onde a queda do pH inicial (5,85) para 3,2, durante as
primeiras 24 h do processo, determinou o final da fermentao (HOFVENDAHL; HAHN-
HGERDAL, 1997).
Com base nestes resultados, os parmetros fermentativos da produo de cido lctico
foram calculados apenas para os tempos de fermentao de 12 e 24 h (Figura 4.19). Observa-
se que com 12 h de fermentao, todos os meios formulados a partir do hidrolisado de bagao
de malte apresentaram valores similares de fator de rendimento em cido lctico (YP/S), os
quais foram superiores ao valor obtido no meio MRS. Porm, a produtividade volumtrica foi
maior nos meios suplementados com nutrientes, atingindo um valor mximo de 0,79 g/l.h no
hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS (meio 3). Considerando 24 h como
tempo final de fermentao (tempo a partir do qual no foi mais observado consumo de
glicose e produo de cido lctico) observa-se que os valores de fator de rendimento
permaneceram na faixa de 0,7 g/g para os meios MRS e hidrolisado no suplementado. No
entanto, estes valores aumentaram cerca de 10% nos meios onde o hidrolisado foi
suplementado com nutrientes, mostrando que a adio de nutrientes ao hidrolisado favoreceu
a produo de cido lctico pelo microrganismo.
Ao contrrio do fator de rendimento, a produtividade volumtrica em cido lctico foi
bastante diferente considerando os tempos de 12 ou 24 h como final da fermentao (Figura
4.19). Com 12 h de processo, quando o microrganismo ainda estava em condies de pH
favorveis ao seu desenvolvimento, as produtividades obtidas em todos os meios foram 40%
maiores do que os valores observados aps 24 h de fermentao. Esta queda nos valores de
produtividade volumtrica indica que a produo de cido lctico entre 12 e 24 h de
fermentao foi menor do que a produo obtida entre 0 e 12 h, ou seja, entre 12 e 24 h de
processo o microrganismo no conseguiu produzir cido lctico com a mesma eficincia que
produziu durante as 12 h iniciais.
136
0,9 0,9
Meio 1 Meio 1
0,8 Meio 2 0,8 Meio 2
Meio 3 Meio 3
Yp/s (g/g); Qp (g/l.h)
Yp/s (g/g); Qp (g/l.h)

0,7 Meio 4 0,7 Meio 4
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
0,2 0,2
0,1 0,1
0,0 0,0
Yp/s Qp Yp/s Qp
Parmetros fermentativos para 12 h de processo Parmetros fermentativos para 24 h de processo
Figura 4.19 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de malte nos
parmetros fermentativos (YP/S e QP) da produo de cido lctico por Lactobacillus
delbrueckii. Meio 1: hidrolisado no suplementado; Meio 2: hidrolisado suplementado
com extrato de levedura; Meio 3: hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio
MRS; Meio 4: MRS com a mesma concentrao inicial de glicose do hidrolisado.
Estes resultados permitem concluir que a produo de cido lctico por Lactobacillus
delbrueckii em hidrolisado celulsico de bagao de malte pode ser realizada com elevados
valores de rendimento (0,70 g/g) e produtividade volumtrica (0,79 g/l.h) quando o
hidrolisado suplementado com nutrientes. Porm, como o pH de fermentao no foi
controlado, uma grande quantidade de glicose (33 a 43 g/l) permaneceu nos meios,
comprometendo a produtividade do processo e a posterior purificao do caldo fermentado.
4.10.2 Efeito do pH
O pH considerado um dos principais fatores que interferem na produo de cido

lctico por fermentao, pois a atividade metablica dos microrganismos depende do pH
extracelular (SILVA; MANCILHA, 1991). De acordo com Hofvendahl e Hahn-Hgerdal
(2000), o pH timo para a produo de cido lctico varia entre 5 e 7, dependendo da espcie
utilizada. Para a bactria Lactobacillus delbrueckii, valores de pH na faixa de 5,5 a 7,5 foram
considerados adequados para proporcionar um bom crescimento e produo de cido lctico
(IDRIS; SUZANA, 2006), por isso, no presente trabalho, todas as fermentaes iniciaram
com um valor de pH igual a 6,0.
137
A Figura 4.20 apresenta os perfis de consumo de glicose e produo de cido lctico nas
fermentaes realizadas com e sem o controle do pH. Observa-se que durante as primeiras
12 h de processo, ambas as fermentaes, com e sem controle de pH, apresentaram resultados
bastante similares. Isto ocorreu tanto em hidrolisado como no meio MRS. Porm, a partir
deste tempo o consumo de glicose e a produo de cido lctico foram influenciados pelo pH
do meio de fermentao. Quando o pH foi mantido em 6,0, as fermentaes prosseguiram at
o tempo final considerado (60 h); enquanto que quando o pH no foi controlado, as
fermentaes praticamente terminaram aps 12 h de processo, devido queda do pH para um
valor de aproximadamente 4,6. De acordo com alguns autores, os cidos fracos, como por
exemplo, o cido lctico, so realmente capazes de inibir o crescimento bacteriano
dependendo do pH do meio de fermentao. Na medida em que o cido lctico excretado
para fora da clula, ele diminui o pH externo. Com a queda do pH, este cido, que est
presente na forma no dissociada, tem a sua passagem facilitada atravs da membrana
plasmtica. Desta forma, o cido entra novamente na clula e ao encontrar um pH interno
igual a 7,4, ele se dissocia liberando prtons H+ . A clula passa ento a gastar energia na
forma de ATP para expulsar estes prtons do seu interior. Quanto maior a quantidade de cido
formado, mais o pH externo diminui e uma quantidade maior de cido entra novamente na
clula e se dissocia. Logo, maior ser o gasto de energia da clula para manter sua integridade
fsica. Isto ocorre at certo limite onde a clula no apresenta mais energia suficiente para
bombear os prtons para fora. Ento o crescimento pra e a clula pode chegar morte
(HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL, 1997; KASHKET, 1987).
Na fermentao do hidrolisado no suplementado, com controle de pH, a produo de
cido lctico foi de 12,76 g/l, valor 62% superior ao obtido no final da fermentao sem
controle de pH (7,87 g/l) (Figura 4.20B). Por outro lado, em hidrolisado suplementado e com
controle de pH, a produo de cido lctico atingiu 35,54 g/l, enquanto que a mxima
concentrao obtida neste meio sem controle de pH, foi de 13,02 g/l. Estes valores
representam um aumento de 170% na produo de cido lctico quando o pH do hidrolisado
suplementado foi controlado. Comparando as fermentaes em hidrolisado, fica claro
novamente que a suplementao nutricional promoveu um aumento na eficincia de
converso da glicose a cido lctico.
Os parmetros fermentativos obtidos nestas fermentaes esto apresentados na Tabela
4.27. Observa-se nesta tabela que houve uma grande quantidade de glicose residual em todos
os meios sem controle de pH, o que demonstra que o consumo de glicose pelo microrganismo
138
foi afetado nestes meios. O controle do pH de fermentao favoreceu o consumo desta

hexose, principalmente a partir do hidrolisado suplementado, proporcionando, como
conseqncia, uma maior formao de cido lctico. Devido maior formao deste cido, a
produtividade volumtrica (QP) neste meio foi a mais elevada dentre todos os meios
avaliados, atingindo 0,59 g/l.h ao final da fermentao, mas com um pico de 0,82 g/l.h com
12 h de processo.
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
55 55 40 40
50
(A) 50 35
(B) 35
45 45 30 30
cido lctico (g/l)

Glicose (g/l)
40 40 25 25
35 35 20 20
30 30 15 15
25 25 10 10
20 20 5 5
15 15 0 0
10 10 -5 -5
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Figura 4.20 - Efeito do controle de pH no consumo de glicose (A) e produo de cido lctico (B) por
Lactobacillus delbrueckii em meios: Hidrolisado no suplementado () sem controle de
pH e () com controle de pH; Hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio
MRS () sem controle de pH e (U) com controle de pH; Meio MRS com a mesma
concentrao inicial de glicose do hidrolisado () sem controle de pH e () com
controle de pH.
Tabela 4.27 - Parmetros fermentativos e concentrao de glicose nos meios de fermentao para a
produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii.
Hidrolisado no Hidrolisado MRS
suplementado suplementado
Sem Com Sem Com Sem Com
controle controle controle controle controle controle
de pH de pH de pH de pH de pH de pH
Glicose inicial (g/l) 50,86 51,05 50,97 51,14 50,13 52,09

Glicose final (g/l) 41,23 38,00 37,84 15,58 40,02 28,58
cido lctico (g/l) 7,87 12,76 13,02 35,54 8,33 23,46
YP/S (g/g) 0,82 0,98 0,99 0,99 0,82 0,99
QP (g/l.h) 0,13 0,21 0,22 0,59 0,14 0,39
YP/X (g/g) 8,94 16,57 8,57 17,95 6,31 18,62
YP/S = fator de rendimento de cido lctico por glicose consumida (g/g); QP = produtividade
volumtrica em cido lctico (g/l.h); YP/X = fator de rendimento de cido lctico por clula (g/g).
139
Os valores de fator de rendimento em cido lctico (YP/S) foram elevados (0,82 g/g)
em todos os experimentos (Tabela 4.27), sugerindo que o microrganismo foi capaz de
converter quase toda a glicose consumida em cido lctico, independente do meio de
fermentao utilizado. Os valores mais baixos foram observados nos meios sem controle de
pH. Em hidrolisado suplementado, os valores de YP/S obtidos foram similares em ambos os
meios, com e sem o controle do pH de fermentao, embora a produo de cido lctico tenha
sido quase trs vezes maior no meio onde o pH foi controlado. Isto significa que a produo
de cido lctico foi afetada no meio sem controle de pH porque o consumo de glicose pelo
microrganismo foi prejudicado. Com relao produo de cido lctico por grama de clula,
os valores de YP/X mostram claramente que o controle de pH foi fundamental para que
houvesse uma maior formao de produto por clula.

BAGAO DE MALTE
Alm de ser utilizada como matria-prima para obteno de glicose por hidrlise
enzimtica, a polpa de celulose obtida na condio otimizada de hidrlise alcalina foi tambm
submetida a um processo de branqueamento para verificar sua possibilidade de emprego na
produo de papel ou de derivados de celulose. Para comparao, uma polpa de celulose foi
tambm produzida a partir do bagao de malte original e submetida ao mesmo procedimento
de branqueamento, visando avaliar o efeito do pr-tratamento cido na qualidade da polpa
branqueada.
4.11.1 Caractersticas das polpas obtidas
A composio qumica das duas polpas de celulose utilizadas nestes experimentos est
apresentada na Tabela 4.28. Nota-se nesta tabela que as polpas apresentaram composies
qumicas diferentes em funo dos tratamentos a que foram submetidas.
De acordo com alguns autores, para se produzir papis de alta qualidade necessrio
promover uma elevada remoo da hemicelulose e da lignina do material (sem interferir na
estrutura da celulose), pois a presena destas fraes diminui a qualidade dos papis, sendo
que a lignina interfere ainda na etapa de fabricao (CHEN et al., 2001; GRACE; LEOPOLD;
140
MALCOLM, 1996). O processo de hidrlise alcalina utilizado no presente trabalho, foi capaz
de remover seletivamente as fraes de hemicelulose e lignina, a partir dos dois materiais
utilizados. Quando aplicado ao material original, a remoo destas fraes foi superior a 78%
p/p enquanto que a celulose praticamente no foi atacada (remoo de 3,0% p/p). Como
conseqncia, o teor de celulose neste material foi aumentado em 3,2 vezes aps a polpao,
atingindo 54,3% p/p. Quando o processo de hidrlise alcalina foi aplicado ao material pr-
tratado, obteve-se um aumento similar no teor de celulose (2,7 vezes) devido tambm
elevada remoo de hemicelulose e de lignina (>94% p/p) e baixa remoo de celulose
( 10% p/p). No entanto, como o material pr-tratado apresentava um teor de celulose
(34% p/p) quase duas vezes maior do que o do bagao de malte original (16,8% p/p), sua
polpa tambm atingiu um teor de celulose aproximadamente duas vezes maior do que o da
polpa do bagao de malte original (Tabela 4.28).
Tabela 4.28 - Rendimento e caractersticas das polpas de celulose obtidas por hidrlise alcalina do
bagao de malte nas formas original e pr-tratado com cido sulfrico diludo.
Caractersticas Polpa do bagao de malte Polpa do bagao de malte
original pr-tratado
No Branqueada No Branqueada
branqueada branqueada
Celulose (% p/p) 54,3 60,8 90,5 95,7
Hemicelulose (% p/p) 20,4 13,7 1,0 0
Lignina (% p/p) 14,4 12,6 8,1 3,4
Cinzas (% p/p) 3,1 1,4 0,4 0,3
Rendimentoa (%) 30,1 78,8 33,5 88,9
Nmero kappa 48,4 40,2 27,9 11,2
Viscosidade (cp) 13,7 10,9 12,5 3,1
Alvura (%) 27,2 39,1 33,8 71,3
a
calculado para cada processo individualmente.
Alm da composio qumica, a Tabela 4.28 tambm apresenta outras caractersticas

das polpas obtidas a partir do bagao de malte original (BMO) e pr-tratado (BMP), incluindo
o rendimento, nmero kappa, viscosidade e alvura. Nota-se que o rendimento da hidrlise
alcalina foi similar para ambas as polpas (30,1% p/p e 33,5% p/p, para BMO e BMP,
respectivamente). Porm, como o material pr-tratado havia sido recuperado com um
rendimento de 48,6% p/p, a massa total de polpa obtida para cada 100 g de bagao de malte
original foi de apenas 16,3 g, ou seja, aproximadamente metade do rendimento da polpa
141
obtida por hidrlise alcalina do bagao de malte original (30,1 g/100 g). Apesar do maior
rendimento, a polpa de BMO apresentou uma qualidade inferior da polpa de BMP, uma vez
que seu nmero kappa foi mais elevado e sua alvura foi menor (Tabela 4.28). Um rendimento
similar de polpa (27,9%) foi encontrado por Khristova, Kordsachia e Khider (2005) aps a
hidrlise alcalina das folhas de tamareira. Nesse caso, os autores atriburam o baixo
rendimento de polpao ao baixo teor de celulose (30,3% p/p) e aos elevados teores de lignina
(31,2% p/p) e extrativos (21,2% p/p) presentes na matria-prima. Considerando este fato, os
baixos rendimentos obtidos para as polpas de bagao de malte tambm so justificveis, uma
vez que os materiais submetidos hidrlise alcalina tambm apresentavam baixo teor de
celulose (16,8% p/p e 34% p/p para BMO e BMP, respectivamente), e elevado teor de lignina
(27,8% p/p e 49,2% p/p para BMO e BMP, respectivamente).
4.11.2 Branqueamento das polpas de celulose do bagao de malte
A etapa de branqueamento modificou as caractersticas de ambas as polpas, porm a

diferena entre elas foi notvel (Tabela 4.28), demonstrando que o tratamento do material
com cido diludo prvio ao processo de polpao interferiu nas caractersticas das polpas
produzidas. O teor de lignina e a viscosidade da polpa de BMP branqueada foram menores do
que os da polpa de BMO branqueada, enquanto que o teor de celulose e a alvura foram
maiores.
O nmero kappa (um indicador do contedo de lignina na amostra) da polpa de BMP
branqueada foi baixo (11,0), indicando que a maior parte da lignina presente nesta polpa foi
removida utilizando esta seqncia de branqueamento livre de cloro. Por outro lado, a polpa
de BMO branqueada apresentou um nmero kappa elevado, aproximadamente 4 vezes maior
do que o da polpa de BMP (Tabela 4.28). Provavelmente a presena de extrativos nesta polpa
afetou negativamente o processo de branqueamento. Essa frao composta por resinas,
ceras, gorduras gomas, amidos, taninos, leos essenciais entre outros constituintes (KUHAD;
SINGH, 1993) e de acordo com Fengel e Wegener (1989) ela deve ser removida antes da
separao da lignina para evitar a formao de produtos de condensao com a lignina,
durante o processo de polpao. Tais produtos de condensao diminuem a solubilidade da
lignina residual interferindo na posterior remoo dessa frao (ARGYROPOULOS et al.,
2001). De fato, foi observada a formao de uma espcie de cola durante a hidrlise
alcalina do BMO, a qual proporcionou uma forte unio entre as fibras de celulose (Figura
142
4.21B). O branqueamento dessa polpa no foi eficiente, pois as fibras permaneceram

fortemente unidas entre si (Figura 4.21C) e a polpa branqueada apresentou uma cor amarela
(Figura 4.22C) devido ao elevado teor de lignina presente (12,6% p/p), correspondendo a uma
alvura de apenas 39,1%.
Os resultados obtidos no branqueamento da polpa de BMP foram melhores do que os
da polpa de BMO, provavelmente devido ausncia de extrativos nesta polpa e elevada
remoo de hemicelulose ocorrida durante o pr-tratamento cido. Como conseqncia, o
material tornou-se mais susceptvel ao ataque alcalino e a degradao de lignina ocorreu de
forma mais eficiente, liberando as fibras de celulose, conforme pode ser observado na Figura
4.21E. Alm disso, a polpa de celulose foi branqueada mais facilmente atingindo uma alvura
de 71,3% (Figura 4.22F).
Uma alvura de 71,3% um bom valor considerando a simplicidade do processo de
branqueamento empregado e o uso de uma seqncia livre de cloro. Tanaka et al. (2004)
produziram uma polpa a partir de resduos de dendezeiro, com alvura de 73-74% aps o
branqueamento com uma seqncia realizada em quatro etapas, utilizando O2, cido, O3 e
H2O2. Tutus (2004) obteve uma alvura de 68,34% em uma polpa de palha de arroz utilizando
um procedimento de branqueamento de apenas uma etapa, empregando H2O2 em mistura com
uma soluo de NaOH 2,25% p/v, concentrao quase 10 vezes maior do que a utilizada no
presente trabalho (0,28% p/v).
A viscosidade da polpa de BMP foi fortemente reduzida aps o branqueamento (de 12,5
para 3,1 cp, Tabela 4.28), indicando que o grau de polimerizao da celulose foi diminudo,
uma vez que a perda de viscosidade ocorre devido clivagem aleatria das ligaes
glicosdicas dessa cadeia polissacardica (VU; PAKKANEN; ALN, 2004). De fato, Abrantes
et al. (2007) relataram que, embora o perxido de hidrognio seja um eficiente agente de
branqueamento, ele realmente apresenta pouca seletividade, o que reflete em grandes perdas
de viscosidade. Como a degradao da celulose pelo uso de perxido ocorre devido
decomposio deste agente qumico, uma possibilidade para minimizar esse problema seria
utilizar sulfato de magnsio juntamente com o H2O2, pois este sal reduz a velocidade de
decomposio do perxido e desta forma, poderia impedir as reaes de degradao dos
carboidratos (LAPIERRE; BERRY; BOUCHARD, 2003).
143
A D
B E
C F
Figura 4.21 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das amostras de
bagao de malte original (A), polpa do bagao original no branqueada (B), polpa do
bagao original branqueada (C); bagao de malte pr-tratado (D), polpa do bagao
pr-tratado no branqueada (E), polpa do bagao pr-tratado branqueada (F).
Ampliao: 300 vezes.
144
A D
B E
C F
Figura 4.22 - Aparncia das amostras de bagao de malte original (A), polpa do bagao original no
branqueada (B), polpa do bagao original branqueada (C); bagao de malte pr-tratado
(D), polpa do bagao pr-tratado no branqueada (E), polpa do bagao pr-tratado
branqueada (F).
Durante o branqueamento da polpa de BMO tambm foi observada uma perda da

viscosidade, mas em menor extenso, diminuindo de 13,7 para 10,9 cp (Tabela 4.28). Isso
provavelmente ocorreu devido resistncia proporcionada pela cola formada pelos
produtos de condensao com a lignina, a qual teria impedido o ataque do agente de
branqueamento. Por este motivo, o grau de polimerizao da celulose foi preservado, mas os
teores de lignina e hemicelulose tambm foram pouco reduzidos, o que levou gerao de
uma polpa com menor qualidade do que aquela obtida a partir de BMP.
145
Estes resultados sugerem, portanto, que apenas a polpa de celulose obtida a partir do
bagao de malte pr-tratado apresenta potencial para aplicao em processos industriais,
podendo ser utilizada, por exemplo, para a produo de derivados de celulose, tais como
viscose, acetato de celulose e celofane. Isto porque, de acordo com Caraschi, Filho e Curvelo
(1996), polpas branqueadas de baixo rendimento (30 a 35%), com um alto contedo de
celulose pura (>85%) e baixo contedo de poliose (1 a 10%) e lignina (<0,05%) so
adequadas para esta finalidade. Por outro lado, a realizao de alguns testes adicionais de
resistncia trao, resistncia ao rasgo, entre outros, seria til para verificar a possibilidade
de emprego desta polpa na produo de papis.
4.12 RECUPERAO DA LIGNINA A PARTIR DO LICAR ALCALINO E SUA

UTILIZAO NA PRODUO DE CARVO ATIVADO
4.12.1 Influncia do pH na precipitao da lignina a partir do licor alcalino
No processo de hidrlise alcalina, realizado nas condies otimizadas para produo de

polpa de celulose a partir do bagao de malte pr-tratado, 95,3% p/p da lignina presente no
material foi removida e solubilizada no licor, correspondendo a uma concentrao de
12,44 g/l. De acordo com Fengel e Wegener (1989) a lignina altamente solvel em meio
alcalino, mas sua solubilidade diminui na medida em que o pH reduzido. No entanto, como
a natureza da lignina varia para cada espcie de planta (HON, 1996), o perfil da sua
precipitao com a reduo do pH tambm pode variar de acordo com a matria-prima
utilizada. No presente trabalho, a adio de cido sulfrico para reduo do pH do licor,
causou a precipitao da lignina solubilizada, de forma que, quanto menor o pH, maior a
massa de lignina recuperada (Tabela 4.29).
interessante observar que a queda de pH at o valor de 7,71 (amostra 4) praticamente
no influenciou na precipitao da lignina, que foi removida a partir do licor em apenas
0,32% (Tabela 4.29). No entanto, a reduo do pH para um valor prximo de 6 j passou a
influenciar na precipitao desta frao, aumentando a remoo para 15,67%. Este valor foi
aumentado em 4,4 vezes quando o pH foi reduzido de 5,98 para 4,3. A Figura 4.23 mostra
claramente que o maior aumento na massa de lignina precipitada ocorreu na faixa de pH entre
7,71 e 4,3, atingindo um valor de remoo de 68,49%. Para valores de pH menores que 4,3,
146
foi observado um acrscimo de 13% na massa de lignina removida, porm, este incremento na
remoo foi cerca de 5 vezes menor quando comparado ao aumento observado na faixa de
pH entre 7,71 e 4,3.
Tabela 4.29 - Volume de cido sulfrico adicionado nas amostras do licor alcalino de bagao de malte,
caracterizao do licor obtido e quantificao da massa de lignina precipitada.
Amostra VH2SO4 98% pH Lignina Remoo de Massa
(ml) solvel (g/l) lignina (%) precipitada (g)
1 original - 12,56 12,44 - 0,0301
2 0,14 10,61 12,42 0,16 0,0361
3 0,16 9,90 12,40 0,32 0,0373
4 0,18 7,71 12,40 0,32 0,0383
5 0,20 5,98 10,49 15,67 0,0909
6 0,22 4,30 3,92 68,49 0,2939
7 0,24 3,23 2,63 78,86 0,3100
8 0,26 2,62 2,45 80,30 0,3202
9 0,28 2,48 2,33 81,27 0,3209
10 0,30 2,15 2,31 81,43 0,3208
0,35 90
massa precipitada
0,30 remoo de lignina 75
Massa precipitada (g)
Remoo de lignina (%)
0,25
60
0,20
45
0,15
30
0,10
15
0,05
0
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
pH
Figura 4.23 - Massa precipitada e remoo de lignina em funo da reduo do pH do licor alcalino de
bagao de malte.
147
No mais baixo valor de pH avaliado (2,15), 81,43% da lignina solubilizada no licor foi
recuperada (Tabela 4.29). Um rendimento similar de recuperao de lignina (87,8%) foi
obtido por Santos e Curvelo (2001) quando reduziram de 13,6 para 3,0, o pH do licor alcalino
de madeira de eucalipto. No entanto, este valor de remoo 10% superior ao obtido no
presente trabalho para o valor de pH de 3,23 (78,86% de recuperao). De acordo com
Rohella et al. (1996), a composio da lignina solubilizada varia de uma biomassa para outra
e tambm com o processo de polpao utilizado. Isto explicaria as diferenas observadas entre
os resultados do presente trabalho e aqueles obtidos por Santos e Curvelo (2001), uma vez
que alm de terem sido utilizadas matrias-primas diferentes, o licor alcalino de bagao de
malte foi obtido por polpao soda (hidrlise alcalina) enquanto que o licor obtido por estes
autores foi obtido pelo processo de polpao Kraft.
Segundo Villar, Caperos e Garca-Ochoa (2001), o emprego de cidos para precipitao
da lignina o mtodo mais utilizado para recuperar a lignina Kraft a partir do licor de
polpao, sendo capaz de proporcionar 100% de recuperao quando o pH reduzido para
uma faixa de valores entre 2,0 e 3,0. No presente trabalho, a lignina solubilizada no licor
obtido por polpao soda do bagao de malte no foi totalmente recuperada quando o pH foi
acidificado at 2,15, confirmando que realmente o processo de polpao utilizado pode
influenciar na posterior recuperao da lignina a partir do licor.
Embora a lignina no tenha sido totalmente recuperada, o valor de remoo obtido em
pH 2,15 (81,43%) foi elevado e pode ser comparado com outros j descritos na literatura. Por
exemplo, Sun, Tomkinson e Bolton (1999) utilizaram H3PO4 (9,68 N) para reduzir o pH do
licor alcalino obtido a partir do bagao de dend. Neste processo eles observaram que com a
reduo do pH de 13,8 para 2,0 foi possvel recuperar 1 g de lignina para cada 100 ml de licor
acidificado. Entretanto, alm de lignina o precipitado continha produtos provenientes da
degradao de polissacardeos uma vez que o material submetido polpao no havia sido
pr-tratado. No presente trabalho, o rendimento de massa recuperada em pH 2,15 foi de 1,6
g/100 ml de licor acidificado, e esta massa foi composta basicamente pela lignina, pois a
frao hemicelulsica do material j havia sido quase totalmente solubilizada durante o pr-
tratamento cido e a celulose praticamente no foi atacada durante o processo de hidrlise
alcalina. Considerando estes fatos, a massa de lignina recuperada no presente trabalho foi
quase duas vezes maior do que a obtida por Sun, Tomkinson e Bolton (1999), o que
justificvel dado que o bagao de malte contm 27,8% p/p de lignina enquanto que o bagao
de dend contm apenas 14,2% p/p. Portanto, estes resultados sugerem que a eficincia de
148
recuperao da lignina solubilizada no licor alcalino foi similar quando se utilizou cido
sulfrico concentrado (presente trabalho) ou cido fosfrico 9,68 N (SUN; TOMKINSON;
BOLTON, 1999).
Como conseqncia da remoo da lignina, observou-se uma forte alterao na cor do
licor. Nota-se na Figura 4.24 que o licor na sua forma original (1) apresentava uma cor
marrom escura e medida que o pH foi reduzido, sua cor passou a se tornar mais clara, de
forma que no mais baixo valor de pH avaliado (2,15 amostra 10), o licor apresentou uma cor
amarela clara. Segundo Fengel e Wegener (1989), a cor escura do licor alcalino proveniente
dos grupos funcionais cromforos (quinonas, fenlicos, entre outros) gerados a partir da
degradao da lignina, os quais so solveis em meio alcalino, mas no em meio cido.
Figura 4.24 - Efeito da reduo do pH (de 12,56 - amostra 1, para 2,15 - amostra 10) na cor do licor
alcalino de bagao de malte.
Nota-se tambm na Figura 4.24 que apesar de na amostra 5 (pH 5,98) j ter ocorrido
uma remoo de 15,67% da lignina, a cor do licor ainda no tinha sido alterada, sendo to
escura quanto na amostra original (amostra 1). Provavelmente, os compostos que conferem
cor ao licor ainda no tinham sido precipitados nesta faixa pH (entre 12,56 e 5,98). Na
amostra 6 (pH 4,30), 68,49% da lignina foi precipitada, causando alterao na cor do licor. A
queda do pH de 4,3 para 3,23 (amostra 7) tambm influenciou na cor do licor, que se tornou
amarela e pouco se alterou com a posterior reduo do pH para 2,15 (amostra 10). Estes
resultados sugerem, portanto, que os grupos cromforos que conferem cor ao licor alcalino,
foram removidos principalmente na faixa de pH entre 5,98 (amostra 5) e 3,23 (amostra 7).
149
4.12.2 Produo de carvo ativado a partir da lignina e sua utilizao na adsoro de

metais e compostos fenlicos
Depois de recuperada do licor alcalino, a lignina foi utilizada como matria-prima para
a produo de carvo ativado. O processo de ativao foi realizado empregando diferentes
relaes entre H3PO4/lignina e temperaturas de carbonizao, de acordo com um
planejamento fatorial completo 22. Os carves obtidos nestas condies foram utilizados para
destoxificao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte, uma vez que este contm
uma srie de metais e compostos fenlicos e permitiria, portanto, avaliar o desempenho dos
carves na remoo de diversos componentes. Os resultados obtidos nestes experimentos de
destoxificao esto apresentados na Tabela 4.30. Observa-se nesta tabela que todos os
carves produzidos foram capazes de remover metais e compostos fenlicos a partir do
hidrolisado, sendo que dentre os metais, nquel, ferro, cromo e silcio foram os mais
removidos. No entanto, a capacidade de adsoro variou para cada carvo. A remoo de
nquel, por exemplo, foi total quando se utilizou o carvo produzido na mais alta temperatura,
empregando a maior relao cido/lignina (amostra 4). Por outro lado, este mesmo carvo foi
pouco eficiente para a remoo de magnsio e silcio.
Tabela 4.30 - Remoo de metais, cor e compostos fenlicos a partir do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte, por adsoro nos carves ativados preparados a partir da lignina.
Amostra Variveisa Remoo (%)
A/L T Metais Cor Fenlicos
Ni Ca Mg Zn Fe Cr Al Si
1 1 300 65,1 0,2 1,3 4,5 53,9 54,7 10,6 31,6 60,4 22,6
2 3 300 65,9 21,1 7,8 1,1 39,5 35,6 7,6 38,1 61,4 15,7
3 1 600 3,2 27,9 4,6 0,1 61,5 17,3 16,3 33,5 61,5 12,0
4 3 600 100,0 29,3 1,9 14,9 70,7 39,7 30,5 16,3 64,4 33,3
5 2 450 61,2 15,9 4,3 7,5 66,9 21,2 12,1 38,8 62,9 25,5
6 2 450 65,1 23,3 3,0 9,3 67,7 20,5 21,2 38,0 61,1 25,5
Comercial 0,0 26,5 0,3 3,6 77,6 10,8 19,5 1,1 70,3 50,8
a
A/L = relao cido/lignina (g/g); T = temperatura de carbonizao (C)
Uma anlise estatstica foi realizada para os compostos removidos em maior quantidade
a partir do hidrolisado (nquel, ferro, cromo e silcio). De acordo com esta anlise, a remoo
de nquel foi influenciada principalmente pela relao cido/lignina empregada no processo
150
de ativao, sendo que o efeito desta varivel foi positivo e significativo a 99% de confiana.
Isto significa que a remoo deste composto foi maior nos carves produzidos com a mais alta
relao cido/lignina. No entanto, esta varivel no apresentou efeito principal significativo
para nenhuma das outras respostas avaliadas (Tabela 4.31).
Tabela 4.31 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a remoo de
nquel, ferro, cromo e silcio a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte, por adsoro nos carves ativados preparados a partir da lignina.
Variveis Remoo de Nquel (%) Remoo de Ferro (%)
independentes e
Curvatura 9,200 4,776 1,926 21,800 0,980 22,249**
X1 48,800 2,758 17,696*** -2,600 0,566 -4,596
X2 -13,900 2,758 -5,040 19,400 0,566 34,295**
X1X2 48,000 2,758 17,406*** 11,800 0,566 20,860**
Variveis Remoo de Cromo (%) Remoo de Silcio (%)

independentes e
Curvatura -31,950 0,857 -37,267** 17,050 0,980 17,402**
X1 1,650 0,495 3,333 -5,350 0,566 -9,458
X2 -16,650 0,495 -33,638** -9,950 0,566 -17,589**
X1X2 20,750 0,495 41,921** -11,850 0,566 -20,948**
*** Valor significativo a 99% de confiana; **Valor significativo a 95% de confiana.
X1 = relao cido/lignina; X2 = temperatura de carbonizao. R2 = 0,999 para todas as respostas.
A temperatura de carbonizao apresentou um efeito principal significativo a 95% de

confiana para as respostas de remoo de ferro, cromo e silcio. Porm, para cromo e silcio
o efeito desta varivel foi negativo, indicando que a remoo destes metais foi maior quando
se utilizou carves produzidos na menor temperatura (300C). Por outro lado, o efeito da
temperatura na remoo de ferro foi positivo, indicando que a remoo deste metal foi maior
quando se utilizou carves produzidos na maior temperatura (600C) (Tabela 4.31).
Embora a capacidade do carvo em adsorver compostos tenha variado de acordo com as
condies em que este foi produzido, interessante observar na Tabela 4.30 que, em vrios
casos, o carvo produzido apresentou uma capacidade de remoo superior do carvo
comercial. A remoo de nquel, magnsio, cromo e silcio, por exemplo, foi maior em todos
os carves produzidos do que no carvo comercial. Por outro lado, o carvo comercial foi
151
mais eficiente para a remoo de ferro, cor e fenlicos. No entanto, de uma forma geral, os
carves produzidos apresentaram um poder de adsoro comparvel ou at mesmo superior
ao do carvo comercial, demonstrando que eles apresentam potencial para serem utilizados
em substituio aos carves encontrados no mercado.
152
5 CONCLUSES
Os resultados experimentais obtidos neste trabalho permitiram concluir que:
O bagao de malte um material rico em carboidratos e compostos fenlicos, sendo a

frao hemicelulsica o seu principal constituinte polimrico (28,4 g/100 g de bagao).
A arabinana do bagao de malte hidrolisada mais facilmente com cido diludo do que a
xilana. Para todas as condies avaliadas, tanto no processo em autoclave como em reator,
as eficincias de hidrlise desta molcula foram superiores a 93%.
A eficincia de hidrlise da xilana e da hemicelulose em autoclave, a 120C, foi

influenciada pela relao slido:lquido e pela concentrao de cido sulfrico empregada,
sendo que os maiores valores, 67% e 76,2%, respectivamente, foram obtidos utilizando
uma relao slido:lquido de 1:10 g:g, concentrao de cido sulfrico de 120 mg/g de
matria seca e um tempo de reao de 27 minutos.
Para todos os hidrolisados obtidos em autoclave, as concentraes de cido actico,

furfural e hidroximetilfurfural observadas foram abaixo dos nveis normalmente
reportados por causar inibio dos microrganismos, sugerindo que o hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte constitui um meio de cultivo adequado para uso em
processos fermentativos.
Em reator, a eficincia de hidrlise da hemicelulose foi elevada (>88%) para todas as

condies avaliadas e todos os hidrolisados produzidos apresentaram caractersticas
favorveis para o crescimento e produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii.
A fermentabilidade dos hidrolisados hemicelulsicos obtidos em reator variou devido a

diferenas em suas composies. O hidrolisado que mais favoreceu a produo de xilitol
(YP/S = 0,70 g/g e QP = 0,45 g/l.h) foi produzido empregando uma relao slido:lquido
de 1:8 g:g, 100 mg de cido sulfrico/g de matria seca, 17 minutos de reao, a 120C.
153
A produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii a partir do hidrolisado

hemicelulsico de bagao de malte contendo 85 g/l de xilose foi fortemente influenciada
pela concentrao dos compostos txicos presentes (YP/S = 0,37 g/g e QP = 0,13 g/l.h), o
que sugere a necessidade de tratamentos de destoxificao visando a reduo dos nveis
dos compostos inibidores do metabolismo microbiano presentes neste hidrolisado.
A hidrlise alcalina do bagao de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo foi um
procedimento altamente eficiente para solubilizar a lignina do material, sendo til tanto
para a produo de polpa de celulose, como para a liberao de cidos fenlicos.
Os melhores resultados de hidrlise alcalina foram obtidos quando o processo foi

conduzido a uma temperatura de 120C durante 90 minutos, com uma concentrao de
NaOH 2% p/v. Nestas condies, a polpa do bagao de malte obtida apresentou um
elevado teor de celulose (72,1% p/p) e um baixo teor de lignina residual (10,4% p/p);
enquanto que o licor alcalino gerado era rico em cidos fenlicos, principalmente em
cido ferlico e p-cumrico.
A hidrlise enzimtica da polpa celulsica do bagao de malte, empregando o extrato

celuloltico comercial Celluclast 1.5L (Novozymes), pode ser realizada com elevada
eficincia de converso, uma vez que nas condies otimizadas de hidrlise (relao
enzima/substrato de 45 FPU/g, concentrao de substrato de 2% p/v, 100 rpm, 45C) foi
possvel obter um rendimento de converso da celulose em glicose de 93,12%, e um
rendimento total de hidrlise (converso da celulose em glicose + celobiose) de 99,42%.
A hidrlise enzimtica utilizando uma concentrao de substrato de 8% p/v, relao

enzima/substrato de 45 FPU/g, a 45C e 100 rpm, a condio mais adequada para
liberao de glicose do bagao de malte pr-tratado visando a posterior utilizao do
hidrolisado como meio de fermentao.
A produo de cido lctico pela bactria Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado

celulsico de bagao de malte foi influenciada pela concentrao de inculo,
suplementao nutricional do hidrolisado e pelo controle do pH do meio de fermentao.
154
Os melhores resultados do processo de bioconverso de glicose em cido lctico foram

obtidos utilizando o hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS caldo,
inoculado com 1 g/l de clulas e mantendo o pH de fermentao controlado em 6,0.
Nestas condies foi possvel obter valores de YP/S e QP de 0,99 g/g e 0,59 g/l.h,
respectivamente, com um pico mximo de produtividade de 0,82 g/l.h nas 12 h iniciais do
processo (onde YP/S = 0,96 g/g).
A polpa de celulose branqueada por uma seqncia empregando hidrxido de sdio e

perxido de hidrognio apresentou caractersticas adequadas para uso na produo de
derivados de celulose (alto teor de celulose = 95,7% p/p; baixo teor de lignina = 3,4% p/p;
e baixo rendimento de recuperao = 33,5% p/p), permitindo mais uma possvel aplicao
para este material alm do uso como substrato em processos enzimticos.
Os carves obtidos por ativao qumica da lignina do bagao de malte apresentaram

elevada eficincia para remoo de metais, principalmente nquel, ferro, cromo e silcio, a
qual foi superior obtida para um carvo comercial, sugerindo que estes carves
poderiam ser utilizados com sucesso em processos de destoxificao, em substituio aos
carves encontrados no mercado.
De uma forma geral, conclui-se que o bagao de malte um subproduto industrial com
grande potencial para aproveitamento como matria-prima em processos qumicos e
biotecnolgicos.
155
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172
ANEXOS
ANEXO A Trabalhos que j foram publicados em peridicos cientficos a partir dos

resultados obtidos nesta tese.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROBERTO, I.C. Brewer's Spent Grain: Generation,
Characteristics and Potential Applications. Journal of Cereal Science, v.43, p.1-14, 2006.
MUSSATTO, S.I., ROBERTO, I.C. Chemical Characterization and Liberation of Pentose

Sugars from Brewer's Spent Grain. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,
v.81, p.268-274, 2006.
MUSSATTO, S.I., ROBERTO, I.C. Acid Hydrolysis and Fermentation of Brewer's Spent
Grain to Produce Xylitol. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.85, p.2453-
2460, 2005.
MUSSATTO, S. I., DRAGONE, G., ROBERTO, I. C. Kinetic Behavior of Candida

guilliermondii Yeast during Xylitol Production from Brewer's Spent Grain Hemicellulosic
Hydrolysate. Biotechnology Progress, v.21, p.1352-1356, 2005.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROBERTO, I.C. Influence of the Toxic Compounds
Present in Brewer's Spent Grain Hemicellulosic Hydrolysate on Xylose-to-Xylitol
Bioconversion by Candida guilliermondii. Process Biochemistry, v.40, p.3801-3806, 2005.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROCHA, G.J.M., ROBERTO, I.C. Optimum Operating
Conditions for Brewer's Spent Grain Soda Pulping. Carbohydrate Polymers, v.64, p.22-28,
2006.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROBERTO, I.C. Ferulic and p-Coumaric Acids
Extraction by Alkaline Hydrolysis of Brewer's Spent Grain. Industrial Crops and Products,
v.25, p.231-237, 2007.
MUSSATTO, S.I., FERNANDES, M., ROBERTO, I.C. Lignin Recovery from Brewer's
Spent Grain Black Liquor. Carbohydrate Polymers, in press.
MUSSATTO, S.I., FERNANDES, M., DRAGONE, G., MANCILHA, I.M., ROBERTO, I.C.
Brewers Spent Grain as Raw Material for Lactic Acid Production by Lactobacillus
delbrueckii UFV H2B20. Biotechnology Letters, (aceito).
173
ANEXO B Recomendaes para trabalhos futuros.
Para complementar este estudo, dando continuidade aos processos qumicos e biotecnolgicos
avaliados para aproveitamento integral do bagao de malte, so dadas as seguintes sugestes:
Realizar uma anlise dos custos envolvidos envolvidos na fermentao para produo de
xilitol a partir do hidrolisado hemicelulsico nas formas diluda e concentrada, para avaliar o
que seria mais vantajoso: utilizar o hidrolisado diludo como meio de fermentao e obter
uma concentrao menor de xilitol, ou, utilizar o hidrolisado concentrado como meio de
fermentao, porm, devendo realizar uma etapa de destoxificao prvia fermentao para
poder obter uma concentrao mais elevada de xilitol.
Avaliar a fermentabilidade do hidrolisado hemicelulsico para a produo de etanol.
Avaliar o emprego de fontes nutricionais mais econmicas para suplementao do hidrolisado

celulsico de bagao de malte visando a produo de cido lctico.
Realizar testes mecnicos na polpa de celulose branqueada para verificar sua possibilidade de
emprego na produo de papis.
Avaliar outras seqncias para branqueamento da polpa celulsica de forma a se obter um

maior grau de alvura, sem reduzir a viscosidade.
Avaliar outras variveis do processo para produo de carvo ativado visando melhorar a
capacidade de remoo de compostos fenlicos e de alguns metais que foram removidos em
pequena proporo, tais como clcio, magnsio, zinco e alumnio.

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

SOLANGE INS MUSSATTO DRAGONE

Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em processos qumicos e

Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em processos qumicos e

Tese apresentada Escola de Engenharia de

rea de Concentrao: Converso de biomassa

Dragone, Solange Ins Mussatto

Tese (Doutorado Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia Industrial.

1. Bagao de malte 2. Hidrlise 3. Xilitol 4. cido lctico 5. Carvo ativado 6.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), pela bolsa de

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) e ao Conselho

Novozymes, pela doao das enzimas.

A todos os colegas e funcionrios da EEL-USP que de alguma forma contriburam para a

Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP) e aos professores do Programa de Ps-

MUSSATTO, S.I. Aproveitamento integral de subproduto da indstria cervejeira em

O objetivo deste trabalho foi avaliar a possibilidade de aproveitamento integral do bagao de

MUSSATTO, S.I. Integral use of brewery by-product in chemical and biotechnological

Figura 2.1 - Gros de cevada. ................................................................................................... 21

Figura 2.2 - Representao esquemtica do processo de obteno do bagao de malte a

Figura 2.3 - Bagao de malte.................................................................................................... 24

Figura 2.4 - Microscopia eletrnica de varredura de partculas do bagao de malte. (A)

Figura 2.5 - Representao esquemtica da ao das enzimas celulolticas na estrutura da

Figura 2.6 - Estrutura da lignina proposta por ADLER (1977)................................................ 37

Figura 3.1 - Representao esquemtica do trabalho proposto para aproveitamento

Figura 3.2 - Reator utilizado nos experimentos de hidrlise cida. ......................................... 45

Figura 4.2 - Cromatograma do hidrolisado obtido em autoclave, nas condies de relao

Figura 4.3 - Crescimento da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado

Figura 4.4 - Consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado

Figura 4.5 - Produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado

Figura 4.6 - Desempenho da levedura Candida guilliermondii em meio semidefinido

Figura 4.8 - Superfcies de resposta para os teores de lignina residual e de celulose (%

Figura 4.9 - Micrografia eletrnica de varredura (ampliao: 45 vezes) e aspecto visual

Figura 4.13 - Perfil da liberao de glicose durante a hidrlise enzimtica do bagao de

Figura 4.14 - Efeito da relao enzima/substrato nos rendimentos de hidrlise da celulose

Figura 4.16 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das

Figura 4.18 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de

Figura 4.19 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de

Figura 4.20 - Efeito do controle de pH no consumo de glicose (A) e produo de cido

Figura 4.21 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das

Figura 4.23 - Massa precipitada e remoo de lignina em funo da reduo do pH do

Tabela 3.1 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de hidrlise

Tabela 3.2 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise

Tabela 3.3 - Composio do meio semidefinido utilizado para crescimento do inculo da

Tabela 3.4 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise

Tabela 3.5 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise

Tabela 3.6 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de produo de

Tabela 4.1 - Composio qumica do bagao de malte. ........................................................... 69

Tabela 4.2 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de

Tabela 4.3 - Eficincia de hidrlise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana +

Tabela 4.4 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de

Tabela 4.5 - Eficincia de hidrlise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana +

Tabela 4.7 - Consumo de xilose, crescimento celular e produo de xilitol nos

Tabela 4.10 - Composio qumica do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte nas

Tabela 4.11 - Parmetros fermentativos obtidos durante o cultivo da levedura Candida

Tabela 4.13 - Parmetros fermentativos e concentrao final de clulas obtidas durante a

Tabela 4.14 - Concentrao de alguns compostos fenlicos identificados nos hidrolisados

Tabela 4.19 - Porcentagem de lignina solubilizada e concentrao de cidos fenlicos no

Tabela 4.21 - Rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise

Tabela 4.25 - Composio qumica das amostras de bagao de malte empregadas no

Tabela 4.26 - Composio de carboidratos nos hidrolisados enzimticos produzidos a

Tabela 4.27 - Parmetros fermentativos e concentrao de glicose nos meios de

Tabela 4.30 - Remoo de metais, cor e compostos fenlicos a partir do hidrolisado

ATP Adenosina Trifosfato

% lignina insolvel = PR10000/(PAPSA) equao 1

% celulose = Gli5000FcFph/(PAPSA) equao 2

% lignina solvel = (4,187x10-2(Ahid280-Apd280)-3,279x10-4)200 equao 4

Apd280 = (CfurfEfurf)/200+(CHMFEHMF)/200 equao 5