Ovejas clonadas por transferencia nuclear desde una lnea celular cultivada

La transferencia nuclear se ha utilizado en mamferos como una valiosa herramienta en estudios

embriolgicos y como un mtodo para la multiplicacin de embriones de "lite". Los
descendientes slo han sido reportados cuando embriones tempranos, o clulas derivadas de
embriones durante el cultivo primario, fueron usados como donantes nucleares. Aqu se
proporciona el primer informe, a nuestro conocimiento, de los descendientes de mamferos vivos
despus de la transferencia nuclear de una lnea celular establecida. Los corderos nacieron
despus de que las clulas derivadas de embriones de ovejas, que haban sido cultivadas durante 6
a 13 pases, fueron inducidas a pararse por inactividad de suero antes de la transferencia de sus
ncleos a oocitos enucleados. La induccin de la quiescencia en las clulas donantes puede
modificar la estructura de la cromatina del donante para ayudar a la reprogramacin nuclear y
permitir el desarrollo. Este enfoque proporcionar las mismas poderosas oportunidades para el
anlisis y la modificacin de la funcin gnica en las especies de ganado que estn disponibles en
el ratn a travs del uso de clulas madre embrionarias.

Las clulas utilizadas en estos experimentos se aislaron por microdiseccin y explicacin del disco
embrionario (ED) de los embriones de oveja 'montaa galesa' producidos in vivo del da 9. La lnea
se estableci a partir de colonias de paso temprano con una morfologa como la de las clulas
embrionarias del tallo (ES). En el segundo y tercer pasajes, las clulas haban asumido una
morfologa ms epitelial, aplastada (Fig. La) que se mantuvo en el cultivo adicional (al menos en el
paso 25). En el paso 6, a diferencia de las clulas ES murinas, expresaron citoqueratina, y
laminacin nuclear A / C que son marcadores asociados con la diferenciacin '. Esta lnea de
clulas epiteliales derivadas de embriones ha sido designada TNT4 (para totipotente para
transferencia nuclear).

El desarrollo de embriones reconstruidos mediante transferencia nuclear depende de las

interacciones entre el ncleo donante y el citoplasma receptor. Hemos informado previamente de
los efectos de la actividad cinasa citoplasmtica, maduracin / mitosis / factor promotor de la
meiosis (MPF), sobre la incidencia de dao cromosmico y aneuploida en embriones
reconstruidos y estableci dos medios para prevenir tales daos . En primer lugar, los efectos de
la etapa del ciclo celular del donante se pueden superar mediante la transferencia de ncleos
despus de la desaparicin de la actividad MPF mediante la activacin previa del MI enucleado
receptor. oocyte910. Utilizando este enfoque obtuvimos el nacimiento de corderos mediante
transferencia nuclear durante el establecimiento de la lnea celular (hasta e incluyendo el paso 3).

En el cultivo posterior (pasajes 6 y 11) no se obtuvo ningn desarrollo a trmino (vase la Tabla 1).
De estos nmeros no podemos concluir que el desarrollo a trmino no se obtendr utilizando este
mtodo. Se cree que la falta de desarrollo de algunos embriones de control se relaciona con una
infeccin en el oviducto de la oveja receptora temporal de la que se recuperaron 6.
Un medio alternativo para evitar el dao debido a la actividad de MPF es transferir ncleos
diploides en oocitos de metafase II que tienen un alto nivel de actividad de MPF. La disponibilidad
de clulas TNT4 permite utilizar este enfoque. En este estudio se produjo una poblacin sincrnica
de ncleos de donantes diploides induciendo a las clulas a salir del ciclo de crecimiento y
detencin en GO en estado de inactividad. En presencia de un alto nivel de actividad MPF, el
ncleo transferido sufre descomposicin de la membrana nuclear y condensacin cromosmica.
Se ha argumentado que "el potencial de desarrollo de los embriones reconstruidos depende de la"
reprogramacin de la expresin gnica "por la accin de factores citoplsmicos y que esto podra
ser potenciado por la prolongacin de este perodo de exposicin.Para evaluar estos efectos las
clulas donantes (1) 4-8 h antes de la activacin 'post-activada' o (2) en el momento de la
activacin 'fusin y activacin' o (3) a los oocitos preactivados `preactivados '.

Durante estos estudios in vivo los ovocitos de la metafase ovulada detenidos (MII) se eliminaron
del oviducto de las ovejas 'blackface' escocesa. La metodologa utilizada fue la descrita con
anterioridad, con las siguientes excepciones: los ovocitos fueron recuperados 28-33 h despus de
la inyeccin de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), libre de calcio / magnesio PBS
conteniendo 1,0% de FCS se utiliz para todos los enjuague, y los ovocitos recuperados fueron
transferidos a calcio libre M2 medium12 conteniendo 10% FCS y se mantuvieron a 37 C en CO2 al
5% en aire hasta su uso. Tan pronto como fue posible despus de la recuperacin ovocitos fueron
enucleados y los embriones reconstruidos. A las 50-54 h