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GUA No 3
EXTRACCIN DE ADN BACTERIANO
1. INTRODUCCIN
Los mtodos de laboratorio tradicionales para identificar bacterias incluyen las pruebas de
diferenciacin por tinciones como la tincin de Gram, el crecimiento en cultivos
enriquecidos o diferenciales y el uso de kits de pruebas bioqumicas (Xua et al., 2004). No
obstante, actualmente se dispone de una serie de tcnicas que permiten la caracterizacin e
identificacin de especies y explicar patrones y procesos ecolgico-evolutivos utilizando
marcadores moleculares. Estos marcadores se obtienen con tcnicas como la PCR (por las
siglas en ingls de Polymerase Chain Reaction, en espaol Reaccin en Cadena de la
Polimerasa) y secuenciacin, que hacen posible analizar la variacin en la molcula del
ADN con un detalle sin precedentes (Schltterer, 2004). Un paso fundamental para
continuar con la aplicacin de cualquiera de estas tcnicas es la obtencin de un ADN de
buena calidad. Uno de los mtodos que se utilizan para extraer ADN es mediante el uso de
Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), sustancia adecuada para procesar tejidos con
una alta concentracin de polisacridos y polifenoles. Este protocolo fue desarrollado por
Murray y Thompson en 1980 y publicado hasta 1987 por Wagner y sus colaboradores
(Wagner et al., 1987). Se ha utilizado de manera efectiva en plantas, bacterias, hongos,
lquenes e insectos. En la actualidad algunos laboratorios que procesan un alto nmero de
muestras, se sigue utilizando ya que permite obtener ADN de alta calidad eliminando los
inhibidores que afectan la PCR; adems de ser un mtodo econmico y fcil de estandarizar
(Velzquez, Aragn, & Romero, 2008).
2. OBJETIVOS
2.1 General
2.2 Especficos
1
Elaborada por: Ivn Daro Otero, Bilogo, C.M.Sc. Adaptado de: Manual de Biologa Molecular
procedimientos bsicos. Universidad de Nario.
Adquirir destreza en la manipulacin de equipos y reactivos para la extraccin de
ADN bacteriano
3. MATERIALES Y EQUIPOS
Incubadora
pHmetro
Centrifuga
Vortex
Micropipetas de diversos volmenes
Balanza analtica
Plancha de calentamiento
Estufa de secado o desecador
Cmara de electroforesis
Fuente de poder
Hielo picado o cajitas refrigerantes
Bao serolgico a 37C
Bao serolgico a 65C
Fotodocumentador o transiluminador
Puntas nuevas y estriles de diferentes volmenes
Tubos eppendorf (3 por grupo)
Tubo falcon de 15 mL (1 por grupo)
Medios de cultivo: 1 tubo por grupo con 10 mL de caldo TSB o LB
Reactivos: (SDS 10%, NaCl 5M, CTAB, cloroformo-alcohol isoamlico 24:1,
alcohol isoproplico 99%, etanol 70%, tampn TE 1X, tampn TAE 1X, agarosa)
Enzimas: (Proteinasa K 20 mg/mL, RNAsa 20 mg/mL)
Agua grado molecular
Mscara y gorro de proteccin
Guantes de nitrilo
Frascos de descarte
Libreta de notas
Lpiz marcador
Flotadores para incubacin en bao serolgico
Jabn antibacterial
Papel toalla
4. METODOLOGA
B. Solucin de NaCl 5M
Disolver 292.2 g de NaCl en 1000 mL de agua destilada. Alicuotar en volmenes no
mayores a 100 mL y autoclavar a 121 C por 15 minutos.
4.2 PROCEDIMIENTO
Depositar los residuos qumicos en el recipiente asignado para esta prctica y los residuos o
materiales sobrantes debern ser entregados al tutor de la prctica previamente rotulados.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Alejos, P., Aragn, C., & Cornejo, A. (2008). Extraccin y purificacin de ADN.
Herramientas Moleculaes Aplicadas En Ecologa, 126.
https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
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Allard, R. W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines and
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Xua J., Smytha C., Buchanana, J., Dolana, A., Rooneya, P., Millara, C., Goldsmitha, C.,
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identify culturable environmental eubacteria in a tertiary referral hospital. Public Health
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