ENCB BioQ Bioquimica de Plummer

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Exactitud en el laboratorio
La exactitud puede definirse como el grado de sujecin a la verdad. El cientfi

co debe, por consiguiente, ser exacto tanto en las m ediciones como en la in te r
pretacin y presentacin de los resultados de sus experim entos. En este
p rim er captulo se estudiarn estos temas, ya que el trabajo de laboratorio
tendr valor para el estudiante y para quienes lean sus trabajos slo si se
cum plen esos criterios. Sin em bargo, antes de referirnos a estos puntos debe
mos considerar las unidades y cantidades em pleadas u sualm ente en los expe
rim entos bioqumicos.
UNIDADES Y CANTIDADES
Las unidades usadas en este libro son unidades SI (Systm e Internacional

dUnits) basadas en el sistem a m trico decimal. Estas unidades fueron apro
badas en 1960 por la C onferencia G eneral de Pesos y M edidas y han sido
adoptadas por laboratorios cientficos en todo el mundo. C onstituyen un
sistem a coherente, ya que si dos cantidades expresadas en dichas unidades se
m ultiplican o dividen, se obtiene u n a cantidad n u m ricam en te distinta pero
con las mism as unidades. En esta form a se reduce el n m ero de m ltiplos y
subm ltiplos de unidades actualm ente en uso.
Unidades bsicas
Las unidades fundam entales, sobre las cuales se basan todas las dem s son
siete y aparecen en la tabla 1.1.
1
2 Bioqumica prctica
Tabla 1.1 Unidades bsicas SI
Cantidad fsica Nombre Smbolo

longitud metro m
masa kilogrmo kg
tiempo segundo s
cantidad de sustancia mol mol
tem peratura term odinm ica K elvin K
corriente elctrica amperio A
intensidad lum inosa candela cd
/
Unidades derivadas
Adems de las an terio rm e n te citadas, existe tam bin un n m ero de unidades
SI obtenidas m ediante la adecuada com binacin de las unidades bsicas. Por
conveniencia se dan nom bres especiales a estas unidades derivadas. Ejemplos
de aquellas encontradas con ms frecuencia en el trabajo cientfico aparecen
en la tabla 1.2.
Prefijos
Algunas veces las unidades son m uy grandes o m uy pequeas en cuyo caso,
para evitar escribir m uchos ceros, se coloca un prefijo antes del smbolo de la
unidad. Los m ltiplos o fracciones de unidad recom endados cam bian por
factores de 1000 cada vez (tabla 1.3). Por ejem plo, 0.000 015 mol se escribe como
15 gmol y 13 400 m se expresan como 13.4 km.
Tabla 1.2 Nom bres especiales y smbolos de algunas unidades SI derivadas
D efinicin en trm inos

de unidades
N om bre de
Cantidad fsica la unidad Sm bolo Bsica Derivada
frecuencia hertz Hz s -1
fuerza new ton N kg m s~2 J m '1
energa joule J kg m2 s ' 2 Nm
presin pascal Pa kg m _1 s ' 2 N m '2
potencia watt W kg m2s ' 3 Js" 1
carga elctrica coulom b C As
potencial elctrico volt V kg m2 s 3 A ' 1 W A '1
resistencia elctrica ohm n kg m2 s ' 3 A -2 V A '1
capacitancia elctrica farad F 2 s4 k g '1 m '2 A s V '1
temperatura am biente grado Celsius c C = K - 273.15
Ninguna de estas unidades tien e plural; as pues, 5 voltios se escribe 5 V y no 5 Vs y 2

metros se escribe 2 m y no 2 ms.
Exactitud en el laboratorio 3
; i
Tabla 1.3 Prefijos comunes para unidades SI usualmente encontrados .
en trabajos bioqumicos
Mltiplos Fracciones
Factor Prefijo Smbolo Factor Prefijo Smbolo
106 mega M io -3 mili m
103 kilo k 10' 6 micro u
io - 9 nano n
lO '12 pico p
La combinacin de un prefijo y un smbolo se considera como un nuevo

smbolo; as, m m 3 quiere decir (1 0 3 m )3y n o lO -3 m 3. Por lo tanto no debe
haber espacio o punto en tre el smbolo y sus prefijos, y p ara m ayor claridad se
debe usar un punto en tre los dos smbolos colocados encim a de la lnea cuando
se quiere indicar m ultiplicacin. Por ejemplo:
ms = milisegundo (1 0 -3 s),
m ientras que
m . s = m etro x segundo (m x s)
Otras unidades usadas adems de las SI

En bioqumica existen otras unidades que por su conveniencia y uso generali
zado es probable que se continen em pleando por m ucho tiem po j unto con las
unidades SI.
Litro (l). La unidad de volum en del sistem a SI es el m etro cbico (m 3), pero
esta unidad es relativam ente grande y en trabajos bioqumicos se acepta
actualm ente el litro como unidad de volum en.
El litro es exactam ente igual a un decm etro cbico (1 decm etro = 10 m =
1 dm) as que:
1000 litros 1 m etro cbico 1m3

1 litro (1) 1 dm 3 1CT3 m 3
1 m ililitro (mi) 1 cm 3 10 _6 m 3
1 m icrolitro (pl) 1mm3 lO '9 m 3.
Los trm inos m ililitro y m icrolitro sern ev en tu alm en te reem plazados pero
probablem ente slo despus de que este texto haya perdido vigencia.
Gramo (g). El gram o se seguir usando como una unidad elem ental y
asociada con prefijos (pg, mg) hasta cuando se adopte una nueva unidad
bsica de masa, la cual hoy se conoce como kilogramo.
4 Bioqumica prctica
Tiempo. La unidad bsica SI de tiem po es el segundo, pero las unidades de

tiem po com nm ente en uso (m inuto, hora, ao) pueden em plearse cuando
se crea necesario.
Molaridad, moles y concentracin

Segn mi experiencia, los estudiantes en cu en tran dificultad en los clculos de
moles y m olaridades y en la conversin de m olaridades a m ilim oles o micro-
moles para u n volum en dado. Por lo tanto, se sugiere que el estudiante com
prenda esta seccin antes de in ten tar cualquier experim ento que requiera
clculos.
Mole (mol). La unidad bsica SI de cantidad es el mol, que expresa la cantidad.
de una sustancia contenida en u n recipiente o tubo de ensayo, independien
te de su volum en. El mol se define como el peso m olecular de u n compuesto
expresado en gramos.
1 mol = peso m olecular en gramos = 6 x 1023 m olculas (n m ero de
Avogadro).
El trm ino mol se aplica no slo a las molculas, sino tam bin a otras
partculas de composicin definida, tales como tomos, iones o radicales
libres:
1 mol de glucosa (peso m olecular 180) = 180 g
1 mol de albm ina (peso m olecular 68 000) = 68 000 g 68 kg.
Molaridad (m ol/l). La concentracin de u n a sustancia es la cantidad de la
m ism a en la presente unidad de volum en de solucin. En trabajos bioqu
micos la unidad de cantidad es el mol y la unidad de volum en el litro. Por
lo tanto, u na solucin m olar se define como 1 mol de u n com puesto dado por
litro.
1 m ol/l = peso m olecular en gram os por litro de solucin.
Las m olaridades se h an representado usando la letra M (0.15 M NaCl) pero
segn las recom endaciones del SI este smbolo debe ser reem plazado por
m ol/l (NaCl 0.15 m ol/l).
Concentracin en trm inos de masa. En ocasiones se hacen m ediciones de
sustancias que no tien en u n a composicin definida, tales como concentra
cin de protena o cido nucleico presente en un extracto. En estos casos la
concentracin se expresa en trm inos de peso por unidad de volum en y no en
moles. Lo mismo sucede cuando el peso m olecular del com puesto biolgica
m ente activo que querem os m edir no est definido como en los casos de la
vitam ina B12 y de las inm unoglobulinas del suero. Como se anotaba arriba, la
unidad de volum en es el litro; por lo tanto, la concentracin deber expresar
se como g/1, mg/1, jug/1, etc. y no en base a 100 mi. El trm ino por ciento (%) se
usa com nm ente pero es am biguo y su uso debe descontinuarse a m enos que
Exactitud en al laboratorio 5
se defina claram ente. Por ejem plo, una solucin de cido actico al 2% podra
significar:
2 g de cido actico por 100 g de agua (peso/peso)
2 g de cido actico por 100 mi de agua (peso/volum en)
2 mi de cido actico por 100 mi de agua (volum en/volum en)
Conversin de molaridad a m oles por mililitro. En m uchas reacciones
bioqumicas se necesita conocer el n m ero de moles de u n a sustancia p re
sente en una m u estra y esto puede hacerse fcilm ente a p a rtir de la mola
ridad de la solucin y el volum en de la mism a. P rim ero se calcula el nm ero
de moles presente en 1 mi y luego se m ultiplica por el volum en total de la
solucin. Es conveniente m em orizar y usar con facilidad las relaciones que se
describen a continuacin, las cuales se obtienen dism inuyendo tanto la canti
dad como el volum en por un factor de 103.
Solucin 1 m olar 1 mol/1
1 m m ol/m l
1 p m o l/p l
y una solucin m ilim olar 1 mmol/1
1 jumol/ml
Verifique si ha entendido suficientem ente estas ideas desarrollando los
siguientes ejercicios; las respuestas se dan en el apndice.
1. Cuntos gram os de glucosa se necesitan para p rep arar 100 mi de una
solucin molar? (Glucosa, peso mol. = 180.)
2. Cuntos m ilim oles o micromoles por m ililitro estn presentes en las
siguientes soluciones: (a) 6 mol/1 rea; (b) 0.15 mol/1 NaCl; (c) 12 mmol/1
fructosa; (d) 0.2 mmol/1 ATP?
3. Cuntos gramos de glicina hay en 10 mi de una solucin que contiene
20 mmol/1? (Glicina, peso mol. = 75.)
EXACTITUD EN LAS MEDICIONES
Fuentes de error
Todos los trabajos de laboratorio req u ieren alguna form a de medicin y dado
que todas las m edidas son susceptibles de erro r, es conveniente fam iliarizarse
con los que m s com nm ente se com eten al hacerlas.
Errores humanos. P ueden deberse al m al diseo del experim ento y al
control deficiente del mismo. P or ejemplo, en m uchos experim entos biolgi
cos la tem p eratu ra e ilum inacin del medio am biente pueden causar efectos
profundos en el sistem a y, a m enos que stos se controlen cuidadosam ente, los
resultados obtenidos no sern confiables. El experim ento debe disearse
en forma tal que slo uno de estos factores cam bie m ien tras los otros
perm anecen constantes.
6 Bioqumica prctica
Una fuente com n de e rro r es la inadecuada lectura de escalas o meniscos

debido a errores de paralaje. Por esta razn, las escalas de muchos in stru m en
tos llevan un espejo detrs de la aguja en form a tal que slo se obtiene la
lectura correcta cuando no se observa el reflejo de la aguja en el espejo (hay
superposicin). Algunos fabricantes de equipos obvian este problem a usando
lecturas digitales en vez de la escala de deflexin. Sin em b arg o , todava no se
han fabricado pipetas de lectura digital y el e rro r en la lectura de los
meniscos de las pipetas es quizs uno de los problem as que se en cu en tran con
ms frecuencia en los experim entos bioqumicos (figura 1.1). E rrores como
stos pueden corregirse y elim inarse por completo si se trab aja cuidadosa
m ente.
Limitaciones de los aparatos. G en eralm en te los lm ites de precisin de un
equipo son conocidos y el posible e rro r que esto introduce debe ten erse en
cuenta por el experim entador. P or ejemplo, el e rro r en una pipeta graduada
de 10 mi puede ser 0.2%, en cuyo caso la pipeta puede usarse para volm enes
grandes con cierta precisin, por ejemplo, 9.2 m i;pero si se tra ta de m edir 0.1
m i con la m ism a pipeta, el e rro r puede ser hasta del 20%. Como se ve, estos
errores se conocen y pueden m inim izarse.
Patrones y blancos. P ara obtener valores bastante precisos en las mediciones

es necesario reducir al m nim o los errores. Esto puede conseguirse
trabajando cuidadosam ente y usando patrones adecuados. P ara cada experi
m ento se deben incluir patrones de la sustancia que se quiere m edir, aun
cuando se estn usando instrum entos calibrados y reactivos de ptima
calidad. El uso de patrones perm ite verificar la exactitud del mtodo, pues los
valores encontrados en diferentes mediciones deben caer dentro de aquellos
que se consideran estadsticam ente aceptables. Idealm ente los patrones
deben tratarse en form a idntica a las m uestras. Con los datos obtenidos para
los patrones se construye una grfica que m uestre la variacin en las cantida
des medidas con respecto a la concentracin; las cantidades obtenidas para las
m uestras deben estar dentro de los valores lm ites hallados para los patrones,
en forma tal que los valores de las m uestras puedan ser calculados en la
grfica patrn. Sin embargo, en ocasiones se incluye slo un patrn, especial
m ente cuando se trata de anlisis volum tricos o cuando se ha construido
previam ente una curva patrn que se estim a confiable y reproducible.
En cada ensayo se deben incluir una o ms soluciones blanco, es decir,
aquellas en las cuales las sustancias que se q u ieren m edir son sustituidas
por un volum en igual de agua. Los blancos deben ser tratados en form a
idntica a los patrones y a las m uestras. Los valores obtenidos para los blancos
se restan de los valores obtenidos para patrones y m uestras, pues el valor del
blanco es debido a la contribucin de los reactivos usados y no a la sustancia
que querem os m edir. El uso prctico de los blancos y patrones est
am pliam ente ilustrado en las mediciones colorim tricas que se en cu en tran
en este libro. En las determ inaciones enzim ticas se deben usar varios blancos
y controles, pero estos puntos se tratan por separado posteriorm ente en la
seccin dedicada a enzimas.
Errores fortuitos. F inalm ente, hay erro res que no se pueden predecir, como
cuando la m ism a persona realiza varias determ inaciones en las mismas
condiciones y obtiene resultados ligeram ente diferentes en cada oportunidad.
Estos errores pueden ser m inim izados tom ando un gran n m ero de m edidas
y calculando el valor prom edio (tabla 1.4). En algunos casos, basta con hacer
las determ inaciones en duplicado siem pre y cuando los dos valores obteni
dos den resultados sim ilares; por ejemplo, en la construccin de curvas
patrones, las determ inaciones de los patrones se hacen u sualm ente por
duplicado. La reproducibilidad de los valores obtenidos en varias medidas de
una misma m uestra se llam a precisin. Precisin no im plica necesariam ente
exactitud, pues las medidas pueden ser reproducibles pero inexactas, debido a
errores instrum entales o tcnicos.
En muchos casos la precisin no es tan buena como la encontrada en el
ejemplo de la tabla 1.4 y hay u n a gran variacin en los resultados. En la
presentacin de los datos obtenidos es conveniente d ar una idea de la
precisin de los mismos y para ello se necesita conocer ciertos fundam entos de
estadstica que se presentan a continuacin.
8 Bioqumica prctica
Tabla 1.4 D eterm inacin de cloruro srico
(Cloruro-mmol/1)
N m ero de
determ ina Valor Valor
ciones Experim ental Promedio
1 102 102
2 104 103
3 106 104
4 104 104
5 103 104
6 105 104
Por conveniencia se dan algunas ecuaciones usadas en estadstica, para

que sean em pleadas por el estudiante como h erram ien tas de trabajo sin que
entrem os en consideraciones sobre su derivacin.
Curva de la distribucin normal

Si tenemos un nm ero considerable de m ediciones de una cantidad (x),
podemos construir una grfica del nm ero de mediciones en funcin de los
valores obtenidos para x (figura 1.2). Esta curva de distribucin norm al,
llamada curva de Gauss, presenta las siguientes caractersticas:
1. El valor que aparece m ayor nm ero de veces se denom ina la media, x, la
curva es sim trica y su m xim o es precisam ente este valor.
Figura 1.2 Distribucin gaussiana o normal de las lecturas

2. El punto de inflexin est dado por x + a y x - a, en form a tal que el 68%

de todos los valores se encuentra en la porcin cuadriculada en el rango
x a.
3. El 95% de los valores de la curva estarn en el rango x 2a y el 99% en el
rango x 3a .
Desviacin estndar (tpica) (DS). El valor de a es la desviacin estndar y
mide la dispersin de los resultados con respecto a la media; puede calcularse
a partir de los resultados individuales ( x u x 2, x 3, x n), el n m ero de
mediciones tom adas (n) y la m edia (x).
() x = (xi + x 2 + x 3 + . . . + x)/n = x /n.
Si la desviacin de cada valor con respecto a la m edia se rep resen ta por

d, tenemos:
d i = X! x,
d2 - x 2 x,
d3 = x 3 x,
dn = x x.
La sum a de las desviaciones elevadas al cuadrado se llam a desvianza y

cuando este nm ero se divide por el nm ero de mediciones, se obtiene la
varianza (a2 ).
a2 = (d\ + d2 + . . . + d 2 )/n
La raz cuadrada de la varianza da entonces la desviacin estndar (a).

La m edia (x) y la desviacin estndar ( ct) no se pueden conocer con
precisin a m enos que se tom e un nm ero infinito de mediciones. Empero, en
la prctica slo es posible hacer un nm ero lim itado de medidas y para hallar
una varianza ms o menos exacta a p artir de un nm ero lim itado de valores,
se divide la desvianza por el nm ero de grados de libertad, es decir, el total de
mediciones menos uno (n - 1) y no por el nm ero total de valores (n).
Calcular la desviacin estndar de cada valor a p a rtir de la m edia y la
varianza es dispendioso, pero se puede hacer con m ayor facilidad a p a rtir de la
sum a de los valores de x, (2 x ) y la sum a de los valores de x 2(2 x 2 ), usando la
frm ula siguiente:
, 2 x 2 (E x)2/n
a = --------------------
n 1
10 Bioqumica prctica
Error estndar de la media. A p artir de u n a serie de m ediciones se puede

generalm ente calcular un promedio. En ocasiones lo que interesa es conocer
qu tanta diferencia existe en tre el prom edio obtenido y la m edia descono
cida de la poblacin total, en vez de averiguar sim plem ente la dispersin de
los resultados. El e rro r estn d ar de la m edia (o m)es u n estim ativo del e rro r
probable que resu lta al d eterm in a r la m edia de la poblacin a p a rtir de un
nm ero finito de m uestras.
am = a/y/t
De lo anterior se puede deducir que en tre m ayor sea el n m ero de m uestras,

m enor ser el e rro r estn d ar de la m edia y m ayor ser la probabilidad de
aproxim arnos a la m edia v e rd ad e ra de un n m ero infinito de m uestras.
Variacin biolgica ,
Es posible cuantificar en el laboratorio propiedades fsicas, tales como la
densidad o viscosidad de un lquido y com parar los valores obtenidos con los
reales. G eneralm en te se observarn variaciones que no se ajustan a ningn
patrn, pero, teniendo m ucho cuidado, estas variaciones sern pequeas y por
tanto se necesitar hacer slo unas pocas m ediciones para calcular la
media. Sin em bargo, ste no es el caso en m uchas de las m ediciones biolgi
cas para las que frecu en tem en te no existe un valor absoluto nico sino
un intervalo de valores llam ados norm ales. En m uchas mediciones se
halla una curva sim trica tpica de distribucin n o rm al y entonces se pueden
usar los principios simples de estadstica. En este caso, el intervalo norm al se
tom a usualm ente como el que se extiende e n tre (x - 2a) y (x + 2a), que
constituye el 95% de todos los valores (figura 1.2). En ocasiones se en cu en tra
una distribucin asim trica lo que req u iere un tratam ien to m atem tico ms
complicado.
El test t de Student. En algunos experim entos bioqumicos es im portante

saber si el procedim iento experim ental ha causado cambios significativos en
las cantidades m edidas, o si por el contrario, las diferencias encontradas son
debidas al azar. Un estadgrafo ingls, quien firm aba con el seudnim o de
S tu d en t, dise un mtodo sim ple para d eterm in a r la probabilidad de que
una m uestra pertenezca o no a una poblacin dada por medio del anlisis de la
dispersin de los resultados obtenidos.
Hemos visto que si se hace un n m ero m uy grande de m ediciones el e rro r
estndar de la m edia se aproxim a al de la poblacin (X am). Sin em bargo,
la mayora de los experim entos incluyen slo un n m ero reducido de
Exactitud an al lat>oratorio 11
m uestras y en este caso la m edia de u n a m u estra (m) se relaciona con la m edia

verdadera as:
m = x t am
o,
m = x t * o/^/rT,
donde o es la desviacin estn d ar de la m u estra y n el n m ero de mediciones.

Se han preparado tablas estadsticas en las cuales se puede buscar la
probabilidad correspondiente a t usando el n m ero de grados de libertad
(n - 1). Una probabilidad de 0.05 significa que hay un 5% de probabilidad de
que la diferencia de valores encontrados sea debida al azar, es decir, que la
m uestra sea realm en te igual a la poblacin. Si el valor de t es de 0.01, esto
significa que hay u n 1% de probabilidad de que la m u e stra y la poblacin total
sean iguales. Estos dos niveles de probabilidad se usan g en eralm en te como
lm ites de confianza en biologa. Los resultados se consideran significativos
si el valor es cercano a 0.05 y altam ente significativo si el valor obtenido es 0.01.
Dos m uestras, de las cuales se ha tom ado un nm ero lim itado de
mediciones, pueden ser com paradas d irectam en te y se puede ob ten er el valor
t usando la ecuacin:
t = (*i x 2)
{ni l)si + (n2 1)82/ 1 i 1 ) j 1/ 2
ni + n2 2 \ni n2 J i
Si se ha hecho el mismo n m ero de m ediciones para las dos m uestras

(nj = n 2), entonces la ecuacin sim plificada es:
t= (Xi X2 )/{( s2 + si )/n} 1/2
Material volumtrico de vidrio

Lim pieza del m aterial de vidrio. Si pretendem os obtener datos exactos es
necesario que el m aterial de vidrio sea lavado escrupulosam ente. Los
m ateriales se lavan despus de usarse con agua caliente y jabn o detergente;
luego se enjuagan cuidadosam ente en agua co rrien te y agua destilada. Se
deben evitar los residuos de detergente porque pueden alterar algunos
experim entos. Los aparatos de vidrio se pueden lim piar quitando prim ero la
grasa con un trapo hum edecido en cloroformo o benceno y luego dejndolos
de un da para otro en cido crmico. Los aparatos que se hallen m uy sucios y
para los cuales el cido crmico no es efectivo, pueden lim piarse sum ergin
dolos en u na m ezcla de cidos ntrico y sulfrico concentrados. Toda traza de
mezcla usada para lim piar debe ser elim inada escrupulosam ente lavando
varias veces con agua co rrien te y enjuagando repetid am en te con agua
destilada. El m aterial de vidrio com n se seca luego en un horno, pero el de

tipo volum trico no se debe calentar sino enjuagar con pequeos volm enes
de alcohol, ter y por ltim o debe ser secado en una corriente de aire.
Tipos de pipetas. Las pipetas se clasifican en A o B segn su exactitud. Las
pipetas clase A son m s exactas y sus lm ites de tolerancia son bien definidos;
por ejemplo: 0.01, 0.02 y 0.04 mi para aquellas de 2,25 y 50 mi respectiva
mente. Las pipetas clase A, con certificado de tolerancia de calibracin
National Physical L aboratory, son las ms exactas de todas. Las pipetas
clase B son menos exactas, pero son suficientem ente satisfactorias para la
mayora de los usos, especialm ente cuando el usuario mism o las calibra. La
calibracin puede efectuarse fcilm ente llenando la pipeta con agua destilada
a tem peratura am biente y luego vertiendo su contenido en un frasco pesado.
Se tapa el frasco y se pesa nuevam ente anotando cuidadosam ente la
tem peratura del agua. La capacidad de la pipeta se puede luego calcular a
p artir del peso de volm enes conocidos de agua a varias tem p eratu ras (ver
Vogel, A. I. Textbook o f Q uantitative Inorganic analysis). O bviam ente, se
obtendrn errores apreciables si la tem p eratu ra del lquido pipeteado difiere
considerablem ente de la tem p eratu ra de calibracin. La tem p eratu ra
com nm ente usada para calibracin es 20 C y se en cu en tra m arcada en la
pipeta.
Pipetas volumtricas. Estas pipetas estn m arcadas con u n a D (para trasla
dar) y tienen un bulbo (figura 1.3(a)). La pipeta se enjuaga varias veces con la
solucin que se est usando, luego se llena por encim a de la m arca, se deja
deslizar el lquido hasta la m arca y se seca la pu n ta cuidadosam ente con un
papel de filtro. Se deja d ren ar el contenido de la pipeta en el recipiente
apropiado, perm itiendo que la punta toque las paredes del mismo. Cuando el
flujo del lquido haya cesado, se toca la pared del recipiente con el extrem o de
la pipeta durante 15 s, y se retira. En el caso de pipetas exactas, el tiem po de
drenaje es fijo y se indica en el bulbo de la pipeta. Una pequea porcin de
lquido queda siem pre en el extrem o y no debe soplarse.
B '
10 ml D 2 0 C ,
(a) Pipeta de bulbo (volumtrica)
B
"X_
lllll H " ""I"" I 1111M11 ""|,m , 4 " , IiI! llHI imjiiti IIMIIIM lllljllll
ID 0 O) tn U N o ml D 2 0 C
(b) Pipeta graduada
Figura 1.3 Pipetas analticas

Pipetas graduadas. C onsisten de un tubo de vidrio de dim etro uniform e

marcado a intervalos regulares. Los intervalos en tre las m arcas de calibracin
dependen del tam ao de la pipeta (figura 1.3(b)). En bioqum ica se usan
com nm ente para m edir cantidades variables. El lquido se m ide dejando
caer el menisco de una m arca a otra. Se pueden m ed ir volm enes con
bastante exactitud si se procede con suficiente cuidado. Por ejem plo, para
m edir 0.9 mi se debe usar una pipeta de 1 mi en vez de u n a de 10 mi. M uchas de
estas pipetas han sido calibradas en form a tal que quede un poco de lquido en
la punta; y lo mism o que en el caso de las pipetas volum tricas, no debe
soplarse para expulsarla. Sin em bargo, algunas pipetas serolgicas tienen un
anillo m arcado en el extrem o de succin para indicar que en este caso s debe
soplarse la ltim a gota para obtener una m edida exacta. O tra clase de pipeta
posee slo dos m arcas cuidadosam ente grabadas, a m enudo a lado y lado de un
bulbo (figura 1.4(a)).
Ex 2 0 c
(a) Pipeta de O stw a ld -V a n Slyke ca lib rad a para d isp e n sar
2 0 C 0 .5 mi ^
(b) Pipeta de O stw a ld -F o lin para soplar
In 2 0 C 0 .5 mi
)
(c) Pipeta de O stw a ld -F o lin ca lib rad a para c o n te n e r
0.1 0 .2 ml in 2 0 C
(d) Pipeta se rol g ica calib rad a en 0.1 y 0 .2 mi
0.02 mi C 20 C
(e) Pipeta con co n stricci n , ca lib rad a para co n te n e r
F ig u ra 1.4 Micropipetas
Micropipetas. Se usan a m enudo en m ediciones bioqum icas y en casos en que

slo se dispone de pequeas cantidades de m aterial. C uando se tra ta de m ed ir
sangre, suero o lquidos viscosos es conveniente u sar u n a pipeta Ostwald-
Folin, ya que tienen m en o r superficie por unidad de volum en que las pipetas
comunes y no presen tan ngulos o extrem os m uy estrechos que reta rd en el
drenaje. En las pipetas ordinarias la sangre se ad h iere a las paredes y al
extremo, as que se dispensa m enos lquido del debido. P ara cantidades del
orden de 0.1 ml el e rro r al usar pipetas com unes es considerable, pero puede
evitarse hasta cierto punto usando una pipeta O stwald-Folin de soplar (figura
1.4(b)). Tienen la m arca B que quiere decir soplar (blow out), lo que se
indica tam bin por la presencia de una banda esm erilada en su extrem idad
superior. No deben confundirse con las de la clase B, calibradas p ara con
tener.
La sangre y otros lquidos viscosos se m iden m s frecu en tem en te con
pipetas calibradas para contener. Estas llevan una m arca (In o C) que quiere
decir para co n ten er y su aspecto se asem eja a las de Ostwald-Folin para
soplar (figura 1.4(c)). Una pipeta con in terio r recto (figura 1.4(d)) es p referi
ble a una con bulbos, pues en la segunda pueden q u ed ar atrapadas b u rbujas
de aire en el bulbo cuando el lquido llega a la p arte recta de la pipeta. La
pipeta se calibra para 0.1 y 0.2 mi y con frecuencia lleva p in tu ra blanca en la
parte posterior. En la actualidad se usan frecu en tem e n te pipetas con cero
automtico (figura 1.4(e)). Estas pipetas poseen una constriccin en form a tal
que una vez llenada, el lquido d ren ar hasta la constriccin pero no pasar de
all; este tipo de pipetas es ideal para m edir cantidades de m icrolitros. Los tres
tipos se usan en form a sim ilar. Se llenan en la form a usual y luego de secar
cuidadosam ente el exterior, se drena el contenido en una cantidad conocida
de reactivo, se enjuaga repetidam ente succionando y, por ltim o, soplando
cualquier rem anente.
Se debe ten er cuidado, pues algunas pipetas O stwald-Folin estn
calibradas para dispensar y tien en una m arca EX o D. Debe evitarse el
Confundirlas con aquellas descritas an terio rm e n te (figura 1.4(b), (c)).
En trabajos bioqumicos se usan tam bin m icrojeringas p ara m edir
pequeas cantidades de lquidos.
Buretas. Se usan para m edir en form a exacta cantidades variables de
lquidos. Las m s usadas en bioqum ica son las de 1, 2 y 5 m i y se pueden
calibrar en form a parecida a las pipetas. Las buretas tien en un extrem o m uy
fino en tal form a que cada gota rep resen ta u n a cantidad m uy pequea. Un
e rro r de 2 gotas (0.1 m i) en una titulacin volum trica de 20 mi no es m uy
grande, pero en una de 1 mi es bastante considerable. Las m icroburetas tienen
un dim etro in tern o m uy estrecho y debe cuidarse de que el menisco del
lquido est a ras con la m arca deseada antes de hacer la lectu ra correspon
diente. Como en el caso de las pipetas, el lquido que perm anece en la punta de
la bureta se puede rem o v er tocando la pu n ta suavem ente contra el recipiente.
Probetas. Las probetas g eneralm ente se usan m al en el laboratorio y han

ganado el nom bre de la pipeta del estudiante perezoso. No se pueden usar en
vez de las pipetas o b uretas puesto que solam ente m iden, pero no dispensan, el
volum en determ inado. Sin em bargo, se pueden u sar p ara volm enes grandes
cuando la exactitud del experim ento no es m uy im portante.
Matraces volum tricos. Los m atraces volum tricos estn calibrados para con
te n er el volum en especificado a una te m p eratu ra dada, gen eralm en te 20C.
Un buen m atraz te n d r un cuello estrecho y un anillo fino, pero bien visible.
Esto perm ite aju star bien el menisco con el anillo de graduacin y evitar as
errores de paralaje. El m atraz se calibra pesando el frasco vaco, llenndolo
con agua destilada a tem p eratu ra am biente, y pesndolo nuevam ente. El
volum en contenido en el m atraz se calcula en la form a sealada previam ente.
Las gotas de lquido que queden por encim a del menisco deben ser rem ovidas
para evitar errores.
Cuando se p rep ara una solucin es im portante asegurarse de que los
slidos estn com pletam ente disueltos antes de llenar el m atraz hasta la
marca. Si se presentan dificultades p ara disolver los compuestos, la
suspensin debe calentarse en un vaso de precipitado y dejarse en friar hasta
alcanzar la tem p eratu ra am biente antes de tran sferirse al m atraz. Si un
m atraz se calienta, deja de ser un aparato volum trico para convertirse
sim plem ente en un recipiente de vidrio; por esta razn tampoco deben
secarse en el horno.
INFORME DEL EXPERIMENTO

La obtencin de datos confiables no es un fin en s mismo. La m eta en el
trabajo de laboratorio es el com unicar los resultados y las ideas en form a tal
que sean com prensibles y tiles para otros. El hacer reportes escritos de los
ejercicios de laboratorio constituye un buen en tren am ien to p ara la exigente
labor
*
de producir un artculo cientfico (Booth, 1975).
Registro de los resultados

Libro de prcticas. Lo m s conveniente es utilizar u n cuaderno grande con
pasta dura, aun cuando las hojas archivadas en un folder pueden constituir
una buena alternativa. En el ltim o caso, h ay la v en taja de que se pueden
in sertar dibujos o grficos, pero tien e el inconveniente de que se pueden
p erd er hojas. Los cuadernos se ex travan de vez en cuando, as que es acon
sejable escribir claram ente el nom bre y la direccin del dueo en la p rim era
pgina. Mis auxiliares de laboratorio tam bin anotan en sus libros que se
ofrece una recom pensa adecuada a quien devuelva esos papeles si se
extravan; los estudiantes pueden hacer lo mism o para facilitar su recu p era
cin.
Se debe indicar tam bin el curso y el departam ento, y despus de esto se

dejan algunas pginas p ara la lista de contenidos o ndice, en las cuales se
anotan fecha, ttulo y pgina del experim ento.
Hay varias form as de p resen tar un experim ento por escrito y los ttulos de
las secciones que se indican a continuacin son aquellos que se en cu en tran en
la mayora de los artculos bioqumicos que se publican. En algunos experi
mentos puede ser til agrupar dos secciones bajo el mismo ttulo, tales como
mtodos y resultados o resultados y discusin, pero esto depende de cada
trabajo.
Introduccin. Todos los experim entos llevan un ttulo que debe aparecer en
la parte superior de la pgina j unto con la fecha. El ttulo debe ser conciso pero
completo, en tal form a, que se entienda claram ente el objeto del experi
mento.
Enuncie los objetivos. Esta frase debe estar grabada en la m ente de todo
estudiante. Al planear un experim ento el estudiante debe hacer un breve
recuento de lo que pretende m ostrar al llevarlo a cabo.
Materiales y aparatos. Se debe hacer una lista de los reactivos y equipos
necesarios, junto con el diagram a de los equipos especializados. En el caso de
reactivos deben evitarse nom bres triviales o de fbrica.
Experim ento o mtodo. En esta seccin se describe exactam ente lo que usted
hizo, en el mismo orden y evitando que sea slo una copia de un libro de
prcticas. Debe usarse tiem po pasado y form a im personal. En un libro pueden
aparecer las siguientes instrucciones:
En un tubo de ensayo tom e 2 ml del reactivo de B enedict y agregue 5
gotas de la solucin, caliente en un bao de agua hirviendo d u ran te
5 minutos. O bserve el cambio de color y el precipitado que se fo rm a.
Estas instrucciones no se deben copiar al pie de la letra, sino que se deben
presentar en la form a siguiente:
En un tubo de ensayo se aadieron 5 gotas de la solucin a 2 ml del
reactivo de Benedict. La solucin se calent por 5 m inutos en un bao de
agua en ebullicin y se observ el cambio de color y la formacin de
precipitado.
La descripcin del experim ento debe ser concisa pero debe sum inistrar
suficiente inform acin p ara que otros puedan reproducir lo que usted ha
hecho.
Resultados. A continuacin se presentan los resultados obtenidos en el
experim ento. Los resultados deben sealar lo que usted vio, no lo que los
libros dicen que usted ha debido observar. Se deben dar datos completos de
sus resultados. No es suficiente escribir que se form un precipitado amarillo,
sino el color exacto del precipitado, am arillo brillante, am arillo anaranjado.
Exactitud an el laboratorio 17
etc. Es el precipitado pasado, liviano, gelatinoso o granuloso? Cundo se

form el precipitado: inm ediatam ente, len tam en te, a qu tem p eratu ra? Estos
puntos pueden parecer obvios, pero no siem pre se tien en en cuenta. Si el
estudiante pretende hacer investigacin m s tarde, es fu n d am en tal e n tre
narse en la form a de com unicar exactam ente lo que en realidad sucede en un
experim ento. En investigacin, las observaciones inesperadas son aqullas
que frecuentem en te producen m s frutos y gen eralm en te se necesita un
reporte minucioso de las m ism as para que el trabajo pueda ser reproducido.
Un reporte que diga: Se m at una rata y se le ex trajo el hgado, es
totalm ente inadecuado. Se debe indicar adem s la raza, el sexo, la edad y el
peso. Se someti a ayuno o se le sum inistr agua y alim ento? Se le hizo algn
tratam iento previo? Cmo se mat? El conocim iento de estos factores puede
ser esencial en la in terpretacin de los resultados y debe ser consignado por
escrito.
Discusin y conclusin. La discusin no debe se r una repeticin de los
resultados sino un argum ento lgico basado en los mismos. Con frecuencia es
conveniente form u lar un in terro g an te al comienzo del experim ento para
anotar en la discusin qu tanto se avanz en la consecucin de la respuesta.
Siem pre se debe sacar una conclusin y debe ser concisa y precisa.
Tablas e ilustraciones
Tablas. Los resultados experim entales pueden ser fcilm ente resum idos en
form a de una grfica o tabla, dependiendo del tipo de datos. Las tablas deben
en u m erarse consecutivam ente y deben llevar u n ttulo inform ativo. En al
gunos casos es til dar m s detalles en la leyenda que va in m ed iatam en te
bajo el ttulo. Las unidades en las cuales se expresan los resultados deben
colocarse encim a de cada colum na de n m eros y no deben rep etirse en cada
rengln de la tabla. Se deben aju star las unidades en form a tal que aparezca
un nm ero conveniente de dgitos. Una concentracin de 0.0072 mol/1 se
'p u ed e expresar m ejor como 7.2 bajo el ttulo (mmol/1) o como 72 bajo el ttulo
104 x concentracin (mol/1).
Ilustraciones. Un dibujo esquem tico de los aparatos usados puede ser m uy
til en el reporte. As, una ilustracin que m u estre los resultados obtenidos en
crom atografa o electroforesis, o u n diagram a de flujo del procedim iento de
purificacin de una sustancia pueden su m in istrar m s inform acin que una
larga explicacin. G eneralm en te hablando, los hallazgos se pueden p resen tar
m ejor en form a de grficos ya que en ellos se puede m o strar un m ayor
nm ero de observaciones que en u n a tabla. Es tam bin m s fcil apreciar los
datos en un grfico que en una tabla. Por ejem plo, la form a como los puntos se
distribuyen en un grfico da u n a idea de lo erro res fortuitos en el
experim ento. Adems un grfico m u estra fcilm ente faltas de continuidad en
las mediciones, lo cual puede no ser m uy ap aren te en u n a tabla de nm eros.
18 Bioqumica practica
Grficas con lneas rectas. Si y se relaciona con x en una form a sim ilar a la
ecuacin:
y = m x + c,
entonces un grfico de y en funcin de x dar u n a lnea recta. La pendiente de

la lnea ser m y el intercepto del eje de las y ser c (figura 1.5).
En muchos casos la relacin en tre y y x rio es lineal y entonces es
conveniente hacer las transform aciones adecuadas p ara ob ten er u n a grfica
lineal. Algunos ejem plos de la form a como se pueden tran sfo rm ar los datos
para dar una lnea recta se dan en este libro: la ley de B eer-L am bert en el
captulo 4 y la seccin de cintica enzim tica en el captulo 9.
Cmo presentar un grfico. En m uchos experim entos se vara sistem tica
m ente una cantidad tal como concentracin, pH o te m p e ra tu ra y se m ide el
efecto de esta variacin sobre o tra cantidad. La cantidad conocida se llam a
variable independiente y la cantidad desconocida o cantidad m edida se llam a
variable dependiente. C uando se traza u n a grfica se acostum bra colocar la
variable independiente en la abscisa (eje de x ) y la variable dependiente en la
ordenada (eje de y). A continuacin se dan indicaciones de cmo p resen tar un
grfico.
1. P ara m ayor claridad, ajuste las escalas en form a tal que la lnea que
resulte form e u n ngulo de aproxim adam ente 45p con la abscisa.
F ig u ra 1.5 Grfico de una lnea recta (y = mx + c)

2. D un ttulo conciso y claro, m arq u e claram ente la cantidad y unidades

en cada,eje.
3. Use nm eros enteros simples en las escalas (ejemplo: debe usarse 10
mmol/1 en vez de 0.01 mol/1 10 000 mol/1).
4. Use smbolos bien definidos ( o a , a ) para m o strar la posicin
de los puntos determ inados experim entalm ente. No use x, +, o un punto
()
5. En la m edida de lo posible tra te de que los puntos queden a igual distan
cia, no agrupe m ucho los resultados ni deje dem asiado espacio en tre
ellos. %
6. Una los puntos m ediante una curva continua arm nica o una lnea
recta.
7. El tam ao del smbolo debe indicar la m agnitud del erro r probable.
Como usualm ente se conoce la variable independiente exactam ente, los
resultados pueden m ostrarse como una lnea vertical o una b arra cuyo
tam ao depende del e rro r en la variable dependiente.
F inalm ente, la figura 1.6 m u estra cmo no se debe hacer un grfico.

Usando las indicaciones dadas y su propio razonam iento, trate de identificar
los 16 errores del grfico y com pare con la lista dada en el apndice.
S u b stra to
A ctivid a d de AChE
Figura 1.6 Form a incorrecta de presentar un grfico

Bibliografa
Booth, V., W riting a Scientific P ap er, Biochem. Soc. Trans. 3, 1-26, 1975.
Campbell, R. C., Statistics fo r Biologists, 2a ed., Cam bridge, Cam bridge
U niversity Press, 1975.
Quantities, Units, and Sym bols, Londres, The Royal Society, 1975.
The Handling of Eocperimental Data, Milton Keynes, Open U niversity Press,
1970.
Vogel, A. I., Textbook o f Q uantitative Inorganic Analysis, 3a ed., Londres,
Longmans, 1961.
2
pH y soluciones amortiguadoras
ACIDOS Y BASES
Definiciones
Acidos y bases. El concepto m oderno de cidos y bases desarrollado por
Bronsted, Lowry y otros define un cido como un donador de protones y una
base como un aceptador de protones. Por lo tanto, cada cido tiene una base
conjugada.
Acido . * Base + H+
Alcali. El trm ino lcali se reserva para aquellos compuestos que al
disociarse generan iones hidrxilo.
KOH -------* K+ + O H -
Anflitos. Algunas especies inicas pueden actu ar como cidos y bases (tabla
2.1) y se conocen como anflitos o se dice que son anfotricos.
Tabla 2.1 Algunos ejem plos de cidos
y bases
Acido Base conjugada
HCl->H+ + C r
CH3 COOH ^ H+ + CH3COO
NH4 + H+ + NH3
H2 C 03 t H+ + HC03 "
HCCV-f? H+ + C 03~"
H2O ^ H + + O H '
h 3 o +? h + + h 2 o
A un cuando es conveniente escribir el equilibrio cido-base en la form a

indicada arriba, el protn no existe como tal sino que est solvatado. Por
ejemplo, en medio acuoso el hidrogenin existe como in hidronio (H30 +).
H+ + H2O ;= ? H30 +.
Fuerza inica
Acidos o bases fuertes. En solucin, estos compuestos estn com pletam ente
ionizados en form a tal que la concentracin de H + O H - es la m ism a que la
concentracin de cido o base.
Acido fu erte (cido ntrico) HNO3 -------* H+ + N 0 3

Base fu erte (Hidrxido de sodio) NaOH ------ Na+ + OH
Acidos o bases dbiles. Estos compuestos se disocian slo parcialm ente y la

concentracin de H +y O H depende de los valores de sus constantes de diso
ciacin.
Acido dbil (cido frmico) HCOOH < H+ + HCOO-

Base dbil (anilina) C6H5NH2 + H + C6H s NH;
La capacidad del solvente de com binarse con el hidrogenin afecta la

capacidad de disociacin de un cido o base y as, un mismo com puesto puede
actuar como cido dbil en un solvente y como cido fu erte en otro. Por
ejemplo, el cido actico es un cido dbil en medio acuoso, pero fu erte en
amonaco lquido, debido a que sus protones se com binan m s fcilm ente con
este ltim o solvente. La fuerza inica de u n cido depende de qu tan fu erte
sea su base conjugada, as como de la constante dielctrica del medio. Sin
embargo, los sistem as biolgicos funcionan en u n medio acuoso y en este libro
la fuerza del cido se calcula tom ando el agua como solvente.
CONCENTRACION DE HIDROGENIONES Y pH
Definicin de pH
La concentracin de hidrogeniones en la m ayora de las soluciones es
dem asiado baja y p ara ev itar el uso de nm eros con varias cifras decim ales
S0renson introdujo en 1909 el trm ino pH como una form a m uy adecuada
para expresar la concentracin de hidrogeniones. El pH se define como el
logaritm o negativo de la actividad de hidrogeniones, pero en la prctica se
tom a generalm ente la concentracin de hidrogeniones ya que la concentra
pH y soluciones amortiguadoras 23
cin y actividad son p rcticam ente las mism as, excepto en soluciones fu erte
m ente cidas.
Esto puede ilustrarse usando como ejem plo sangre hum ana. La sangre
tiene norm alm ente una concentracin de hidrogeniones de 0.000 000 025
mol/1, lo cual puede expresarse en form a m s conveniente como pH 7.4
Plasm a [H+] = 0.000 000 025 = 2.5 x 10-7 mol/1,
.'. pH del plasm a = log(2.5 x 10-7 ) = 7.4.
Disociacin del agua

Derivacin de Kw . Por medio de m edidas de conductividad se ha dem ostrado
que el agua se ioniza dbilm ente y a 25 C la concentracin de hidrogeniones
es de slo 10-7 mol/1.
h 2o ;= t H+ + OH"
La constante de equilibrio p ara la disociacin del agua est dada por
[H+] [OH"]
[H jO ]
Puesto que la concentracin del agua es para todos los propsitos prcticos
constante, se puede escribir:
K w ~ [H+] [OH- ] .
El producto inico del agua a 25 C es 10 "14, as que el pH del agua p u ra a 25 C
es 7.
[H+] = [OH- ] = 10-7,
pH = - l o gl o [H+] = 7.
Tem peratura y Kw . El pH n eu tro no es 7 a cualquier tem p eratu ra, puesto
que Kw cambia con la te m p eratu ra (tabla 2.2). Un pequeo cambio en la
tem peratura, por ejem plo de 37 a 40 C, causa un increm ento de 8% en
T abla 2.2 El producto inico del agua y pH de neutralidad a

diferentes tem peraturas
pH de
c Kw neutralidad
0 0.12 x 10 14 = 1 0 ~ 14'94 7.97

25 1.03 x 10- 1 4 - 10- , 4 O 7.00
37 2.51 x 1 0 14 = 10 13'60 6.80
40 2.95 x 10 14 = 10 13 5 3 6.77
75 16.9 x 10 14 = 10 12'77 6.39
100 48.00 x l 0 14 = 1 0 " 12-32 6.16
hidrogeniones y en iones hidrxilo. As pues, u n a pequea elevacin o

descenso de tem p eratu ra puede producir un cambio biolgico profundo en
organismos vivos sensibles a la concentracin de hidrogeniones.
Mediciones exactas del pH

El mtodo ms conveniente y confiable para m edir pH es m ediante el uso de
un m edidor de pH com nm ente denom inado potencim etro, que m ide la
fuerza electrom otriz (f.e.m.) de una celda form ada por un electrodo de
referencia, la solucin problem a, y un electrodo de vidrio sensible a hidro
geniones.
Electrodo de vidrio. C onsta de un tubo de vidrio grueso y resistente.en cuyo
extrem o posee un pequeo orificio de aproxim adam ente 0.1 m m de dim etro.
Dentro del bulbo hay u n a solucin de cido clorhdrico (0.1 mol/1) conecta
da a un alam bre de platino por un electrodo de plata-cloruro de plata re v e r
sible en presencia de hidrogeniones (figura 2.2). Al su m erg ir el bulbo en
la solucin se genera u n a diferencia de potencial a travs de la delgada pared
de vidrio del bulbo proporcional al pH de la solucin en la que est sumergido.
Este potencial no es fcilm ente alterado por sales, protenas o agentes xido-
reductores y por lo tanto el aparato puede ser usado en muchos medios
diferentes.
El electrodo de vidrio y la solucin problem a form an m edia celda y el
circuito se com pleta con un electrodo de referencia que no es sensible a
hidrogeniones.
Electrodo de Calomel. El electrodo de referencia que se em plea con m s fre
cuencia es el electrodo de Calomel sem ejante al que se m u estra en la figura
2.2. El electrodo de Calom el es estable, fcil de construir y su potencial con
respecto a un electrodo patrn de hidrgeno se conoce con precisin.
Medidor de pH
Un potencimetro
para medir f.e.m.
I I
Ag.AgCI HCI (0.1 m ol/l) | Vidrio Solucin II KCI (sat.) | Hg2CI2- Hg
i________________________________ I problema l___________________ J
Electrodo de vidrio Electrodo de referencia de
Calomel
Figura 2.1 Celda voltaica formada durante la medicin del pH

Figura 2.2 Sistem a de electrodos para m edicin de pH
Medidor de pH. La f.e.m. de la celda com pleta (E) form ada al conectar los dos
electrodos es:
E E ref E v id rio >

donde E ref es el potencial del electrodo de referencia o Calomel, (el cual a
tem p eratu ra am biente es + 0.250 V) y Evidrio es el potencial del electrodo de
vidrio que depende del pH de la solucin problem a (pH s).
E vidrio= 0.342 - 0 .0 5 8 PHS.

As
E = 0.250 - (0.342 - 0.058 pHs)
= -0 .0 9 2 + 0.058 pHs.
Esta relacin puede v aria r debido a la presencia de otros potenciales en la

celda, que, sin em bargo, son usualm ente constantes y pueden corregirse al
calibrar el instrum ento.
El electrodo de vidrio tiene una resistencia m uy alta (106 - 108 2), por lo
tanto se necesita u n potencim etro de vlvula con una im pedancia de entrada
alta para m edir el potencial. Ms adelante en este captulo se dan algunas
instrucciones sobre el cuidado y la operacin de un m edidor de pH.
Algunos m edidores de pH tienen electrodos de vidrio y electrodos de
referencia combinados en una sola unidad y no estn separados como se
m uestra en la figura 2.2.
Indicadores de pH
Teora. Si se quiere te n er una idea aproxim ada del pH de una solucin se
pueden usar indicadores. Estos son compuestos orgnicos de origen n atu ral o
sinttico cuyo color depende del pH de la solucin. Los indicadores son
generalm ente cidos dbiles que se disocian en solucin.
Indicador = Indicador + H +.
Si se usa la ecuacin de H endersonHasselbalch, entonces,
[Indicador ]
pH = pKIn + log jo
[Indicador]
Las dos form as del indicador tienen colores diferentes y como aparecer
claro al observar la ltim a ecuacin, el color de la solucin depender del pK i n
y del pH. El m ayor cambio de color se obtiene alrededor del pK Iny ste es el
intervalo de pH donde el indicador es ms til.,Por ejemplo, si una solucin
tiene un pH de aproxim adam ente 6, entonces el p rp u ra de bromocresol, que
tiene un pK j n de 6.2, es el m ejor indicador para el caso. Sin em bargo, debido a
que el cambio de color ocurre en un rango amplio de pH, los indicadores dan
tan slo una m edida aproxim ada del pH. O tra desventaja de los indicadores
consiste en que son afectados por agentes oxidantes, agentes reductores,
concentraciones de sal y de protena, y, por lo tanto, estos factores se deben
ten er en cuenta cuando se em pleen indicadores. Adems, al usarlos, se debe
te n e r precaucin de agregar slo pequeas cantidades a la solucin que se
exam ina, o de lo contrario, el equilibrio cido-base de la m u estra puede
desplazarse y el pH cam biar.
El uso ms im portante de los indicadores es quizs la determ inacin del
punto final de una titulacin. Algunos de los indicadores usados com nm ente
se dan en la tabla 2.5, la cual hace parte de las instrucciones de un experim ento
para determ inacin de pH por medio de indicadores (experim ento 2.1).
En las titulaciones, se selecciona un indicador que cam bie de color en el
punto de equivalencia, el cual, por supuesto, depende de la titulacin que se
est efectuando. P or ejemplo, cuando se titula cido actico con hidrxido de

sodio, el cido es transform ado com pletam ente en sal alrededor de pH 9; por lo
tanto debe usarse fenolftalena como indicador. En la m ism a form a, el rojo de
m etilo se usa cuando se titula amonaco con cido clorhdrico, puesto que el
punto final de titulacin es aproxim adam ente pH 5. Este aspecto se ilustra
ms detalladam ente en el experim ento 2.2, el cual incluye la titulacin de u n a
mezcla de un cido fu erte y un cido dbil.
DISOCIACION DE ACIDOS Y BASES
Acidos fuertes
Son com puestos que se disocian com pletam ente en hidrogeniones y en sus
bases conjugadas; por lo tanto, la concentracin de hidrogeniones ser la
mism a que la del cido. El pH de estas soluciones se puede calcular fcilm ente
en la siguiente forma:
(a) 0.01 mol/1 HC1, pH = -lo g ! o (10-2) = 2;

(b) 0.1 mol/1 HC1, pH = log10(10_1) = l ;
K 10_14
(c) 0.01 mol/1 NaOH, [H+] = ---- = - - = 10* 2 ,
[OH- ] 10' 2
PH = logj o (10_12 ) = 12.
Acidos dbiles
Ecuacin de Henderson-Hasselbalch. Los cidos dbiles en solucin se ioni
zan slo ligeram ente y se obtiene por tanto u n verdadero equilibrio e n tre el
cido y la base conjugada. Si HA rep resen ta un cido dbil, entonces:
HA H+ + A".
De acuerdo con la ley de accin de masas, la constante de disociacin K se

define como:
[H*] [A"]
[HA]
y,
g ,[H A ]
[H+]
[A '] '
Sacando los logaritm os negativos,

/ [HA] \
log, o [H ] = - l o g l 0 K a + ^ log, o |
o,
p H - PK , + log10^ - .
En trm inos generales,

[Base conjugada]
pH = p K a + log
[Acido]
Las actividades de A y HA no son siempre, conocidas y por lo tanto es

conveniente expresar A" y HA en trm inos de concentraciones. As,
pH = p Ka + log"~ + l o g ^ - ,
L ha / ha
donde / a" y / h a son los coeficientes de actividad de A y HA respectivam en

te. Toda vez que log ( fjc h a ) es constante para un cido dado, estos coefi
cientes de actividad pueden incorporarse al trm ino p K a para dar una
constante de disociacin aparente, pK^.
pH = pK + l o g ^ - .
cha
Esta relacin se conoce con el nom bre de ecuacin de H enderson-H asselbalch

y es vlida para un intervalo de pH en tre 4 y 10 en el que los hidrogeniones y
los hidrxilos no contribuyen significativam ente a la concentracin inica
total.
p K 3. Tal como se defini previam ente, el pK a es el logaritm o negativo de la
constante de disociacin de un cido dbil. O tra form a de definir p Ja sera el
pH al cual la concentracin del cido y su base conjugada son iguales o el pH al
cual se ha titulado la m itad del cido.
pH = p K a + log 1
o,
pH = p K a.
Debe recordarse que el pK'a es la constante de disociacin aparente que

est relacionada con la constante term odinm ica de disociacin p K a as:
PK = Pâ + log(/W/HA)-
Por lo tanto el pKl podr ser afectado hasta cierto punto por la fuerza inica de
la solucin (7) que se define como 7 = 2 c,z,2 , donde z es la carga del in i y c
es su concentracin.
Curvas de titulacin
Cuando se mezcla una base fu erte con una solucin de un cido y se mide el
pH, se puede hacer un grfico del pH obtenido en funcin de la cantidad de
base aadida y esto se conoce con el nom bre de curva de titulacin. En la
figura 2.3 se ilu stran varias de estas curvas y como puede observarse todas
tienen la m ism a form a con excepcin de la del cido fu erte HC1.
Curvas sem ejantes pueden obtenerse cuando se titula u n a base con cido
fuerte.
Acido fu erte y base fuerte. Al ir aadiendo base se producen tan slo
pequeos cambios en el valor de pH hasta cuando se obtiene la neutralizacin
completa; pero en este punto u n ligero exceso de base causa u n cambio brusco
en el pH. En efecto, el cido fu erte est im pidiendo el cam bio en el pH o,
puesto de otra form a, est actuando como una solucin am ortiguadora.
Ejemplo 1. Supongam os que se titulan 10 m i de HCl 0.1 m o l/l con NaOH 0.1
m ol/l.
(a) Valor inicial del pH
[H+] = 0.1 = 1 x 10_1 mol/l

pH = 1.
(b) Despus de agregar 5 mi de NaOH 0.1 m ol/l.

Al agregar 5 mi de base fu erte se n eu tralizan 5 m i de la solucin de HCl
quedando 5 mi de HCl 0.1 m o l/l en un volum en total de 15 mi.
Molaridad del HC1= (5/15) x 0.1 = 3.33 x 10~2,

pH = log! o (3.33 x 10~2)
= - [ l o g 10 3.33 + ( - 2 ) ]
= -(0 .5 2 3 - 2)
= 1.48.
M ililitro s de NaOH 0.1 m o l/ l
Figura 2.3 Curvas de titulacin para 20 mi de soluciones de algunos

cidos 0.1 m o l/l
(c) Despus de agregar 9.9 mi de NaOH 0,1 m ol/l.

Al agregar 9.9 mi de la base fuerte se neutralizan 9.9 mi de la solucin de
HC1 quedando 0.1 mi de HC1 0.1 m ol/l en un volum en total de 19.9 mi.
Molaridad del HC1= (0.1/19.9) x 0.1 = 5.03 x 10-4 ,

pH = -lo g ! o (5.03 x 10~4 )
= - [ lo g , o 5.03 + (-4 )]
= -(0 .7 0 2 - 4 ) '
= 3.30.
(d) Despus de agregar 10.1 mi de NaOH 0.1 m ol/l.

Al agregar 10.1 mi de base fuerte, se neutraliza todo el HC1 dejando 0.1 mi
de NaOH 0.1 m o l/l en un volum en total de 20.1 mi.
M olaridad del NaOH= (0.1/20.1) x 0.1 = 4.98 x 1 0 '4 ,

[O H '] = 4.98 x 1 0 '4 ,
Kw 1 0 '14
[H+] = ...- = ------------- = 2.00 x 10 -1 1
[OH] 4.98 x 1 0 '4
pH = log! o (2.00 x 1 0 '11)
= - [ l o g 10 2.00 + (-1 1 )]
= -(0 .3 0 2 - 1 1 )
= 10.70.
Usando este procedim iento se puede hacer la curva de titulacin y sta

debe ser com parable con los valores obtenidos en la prctica.
Acido dbil y base fuerte. Todas las curvas de titulacin de bases o cidos
dbiles titulados con bases o cidos fuertes son sim ilares. La razn es, que en
este caso tenem os soluciones am ortiguadoras cuyo pH cam bia segn la
ecuacin de H enderson-H asselbalch. Los valores de PK a son diferentes para
cada cido, pero la form a general de la curva es la m ism a en todos los casos.
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
Teora
Solucin am ortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando
se agrega cido o lcali. Tales soluciones se usan en m uchos experim entos
bioqumicos en los cuales se necesita controlar exactam ente el pH.
De la ecuacin de H enderson-H asselbalch se puede deducir que el pH de
una solucin am ortiguadora depende de dos factores; uno es el valor delplây
el otro es la proporcin de sal a cido. Esta proporcin se considera igual a las
cantidades de sal y cido mezcladas en el intervalo de pH e n tre 4 y 10 donde la
concentracin de hidrogeniones e hidrxilos es m uy baja y se puede ignorar.
Tomemos por ejem plo los am ortiguadores de acetato que estn compuestos
de una mezcla de cido actico y acetato de sodio.
c h 3c o o h c h 3c o o ' + h +,
CH3 COONa ------- CH3 COO + Na+.
Puesto que el cido actico est tan slo dbilm ente disociado, la concentra
cin de cido ser casi la m ism a que se agreg a la mezcla; en la m ism a forma
la concentracin de iones acetato puede ser considerada como igual a la
concentracin de acetato de sodio aadido a la mezcla, ya que la sal estar

com pletam ente disociada.
Ejemplo 2. Cul es el pH de una mezcla de 5 m i de acetato de sodio O .lmol/l
y 4 m i de cido actico 0.1 m ol/l?
Concentracin de CH3 COO- = f x 0.1 mol/1,

C oncentracin deCH3COOH = $ x 0.1 mol/1,
pK a del cido actico a 25 C = 4.76.
Por lo tanto,
pH = 4.76 + log |
= 4.76 + (+0.097)
= 4.86.
Ejemplo 3. Cul es el cambio que ocurre en el pH al agregar a la mezcla

anterior 1 m i de HCl 0.1 m ol/l?
La adicin de HCl sum inistra H + que se combina con los iones acetato para
producir cido actico. Esto reduce la cantidad de iones acetato presentes, e
increm enta la cantidad de cido actico no asociado, originando un cambio en
la proporcin de sal a cido y por lo tanto un cambio en el pH.
Concentracin de CH3 COO = -pg x 0.1 x 0.1 = 0.04 mol/1,

Concentracin deC H 3COOH = x 0.1 + ^ x 0.1 = 0.05 mol/1,
PK.d = 4.76.
Por lo tanto,
0.04
pH = 4.76 + lo g -----
0.05
= 4.76 + (-0 .0 9 7 )
= 4.66.
El pH de la solucin ha dism inuido de 4.86 a 4.66, un cambio de slo 0.2 u n i

dades, m ientras que.si se hubiese agregado HCl al agua destilada, el pH
obtenido sera de 2. La solucin ha actuado por lo tanto como un am o rti
guador, resistiendo los cambios de pH producidos por la adicin del cido.
Valor amortiguador (3. Las soluciones am ortiguadoras difieren en su capa
cidad para resistir los cambios en el pH, por lo que Van Slyke introdujo el
trm ino valor am ortiguador para com parar diferentes soluciones am ortigua-
doras. Cuando se agrega un lcali o un cido a una solucin am ortiguadora se

obtiene una curva de titulacin (figura 2.3). La pendiente de esta curva est
dada por dB /d(p'H ) donde dB es el increm ento de cido o base fu erte agre
gados en mol/1 y d(pH ) es el increm ento en el pH. Esta pendiente es el
valor am ortiguador (3 que es siem pre positivo, puesto que dB es negativo.
Esto ltim o se debe a que cuando se agrega cido producir un cambio
negativo en el pH. Tal como puede apreciarse en las curvas de titulacin que
se m uestran en (figura 2.3), el valor am ortiguador es m xim o en el pfa y en la
prctica las soluciones am ortiguadoras se usan en un intervalo de pH de 1
alrededor del valor delpTa.
Amortiguadores usados en biologa

Algunas de las soluciones am ortiguadoras que se usan ms frecuentem ente
en el laboratorio se m u estran en la tabla 2.3. Como se dijo an terio rm en te, el
intervalo til para la m ayora de los am ortiguadores es de u n a unidad de pH
por encim a o por debajo del valor delp-Kg.
El am ortiguador que se escoja para un experim ento dado debe selec
cionarse con cuidado, ya que los resultados experim entales pueden deberse a
efectos especficos de los iones utilizados y no al pH. Algunos am ortiguadores
que producen reacciones desfavorables son: borato, citrato, fosfato y tris.
Borato. Por ejem plo, este com puesto form a complejos con diferentes
sustancias tales como azcares.
Citrato. Este in se com bina fcilm ente con calcio y por lo tanto no se debe
usar en presencia de C a++.
En muchos experim entos biolgicos el pH debe m an ten erse e n tre 6-8, pero
slo pocos am ortiguadores son efectivos en este intervalo, especialm ente
alrededor de pH 7.4.
Tabla 2.3 Amortiguadores usados en investigaciones biolgicas
Acido o base pKa pKa pKa
cido fosfrico 2.1 7.2 12.3

cido ctrico 3.1 4.8 5.4
cido carbnico 6.4 10.3
glicil glicina 3.1 8.1

cido actico 4.8
cido barbitrico 3.4
tris * 8.3
HEPES f 7.6
* Tris = Ai-tris (hidroximetil) aminometano

f HEPES = Sulfonato de Ai-2-hidroxietilpiperazina-AT-2-etano.
Fosfato. Puede actu ar como un inhibidor enzim tico, o en algunos experi

mentos como m etabolite. Los m etales pesados se precipitan fcilm ente como
fosfatos y por lo tanto este am ortiguador tiene poca capacidad por encim a del
pH 7.5.
Tris. Este am ortiguador se puede usar con m etales pesados, pero puede
actuar como inhibidor en algunos sistemas. Su m ayor desventaja consiste en
que vara con la tem p eratu ra, factor que con frecuencia no se tiene en
cuenta. Un am ortiguador de tris cuyo pH a te m p eratu ra am biente es de 7.8,
tiene un pH de 8.4 a 4o C y de 7.4 a 37 C. Por lo tanto la concentracin de
hidrogeniones au m en ta 10 veces cuando el reactivo se p rep ara a 4o C y luego
se mide el pH a 37 C. El tris tiene una capacidad am ortiguadora m uy pequea
por debajo del pH 7.5.
Am ortiguadores Zw itterion. Otros am ortiguadores biolgicos tales como el
HEPES han sido discutidos por Good y colaboradores, quienes han fijado los
criterios para el uso efectivo de am ortiguadores cercanos a la neutralidad
(Good y otros., 1966).
EL pH Y LA VIDA
La m ayora de las clulas pueden funcionar nicam ente d entro de lm ites
estrechos de pH y req u ieren por lo tanto sistem as am ortiguadores que se
opongan a los cambios de pH que de otra form a o cu rriran a causa del
metabolismo. Los tres principales sistem as am ortiguadores en los m ateriales
vivos son las protenas, el bicarbonato y el fosfato (figura 2.4). La im portancia
relativa de cada uno depende del tipo de clula y del organismo.
Animales
El sistem a am ortiguador m s im portante en el plasm a de los m am feros es el
bicarbonato:
H2C 0 3 ------ * H C 03 + H+.
Sistema pK a
protena HPr H* + Pr - 7.4

bicarbonato h2co 3 H+ + hco; 6.1
fosfato h2po; H* + hpo4- 7.2
Figura 2.4 Principales sistemas amortiguadores en mam

feros
Segn la ecuacin de H enderson-Hasselbalch,
[HCO3-]
pH = pTa + logj o
[H2C 0 3 ]
Por lo tanto, el pH del plasm a depende de la relacin de bicarbonato a cido

carbnico y no de sus concentraciones absolutas. C ualquier tendencia a
cam biar el pH es am ortigada y se puede corregir ajustando esta relacin. Por
ejemplo, los cidos formados d u ran te el metabolism o norm al reaccionan con
el bicarbonato para form ar cido carbnico dbilm ente disociado, en form a
tal que los hidrogeniones son prcticam ente removidos. Al mism o tiempo, el
cido carbnico es elim inado en los pulm ones en form a de dixido de carbono,
m anteniendo constante el pH del plasma. Los riones tam bin juegan un
papel im portante en el m antenim iento del balance cido-base, regulando la
excrecin de cido o base en la orina, y por esto en los hum anos el pH de la
orina varia norm alm ente de 4.8 a 7.5.
El fluido extracelular es por lo general ligeram ente alcalino (pH 7.4),
m ientras que el pH citoplasmtic prom edio de m uchas clulas anim ales es
aproxim adam ente 6.8 que a 37C es neu tro (tabla 2.2). Es casi seguro que el
pH en las organelas es diferente a 6.8 y el pH en la superficie de la m ayora de
las m em branas es ms bajo debido a la absorcin de H + sobre la superficie
cargada negativam ente.
pH H+ (p m ol/l)
8.2 6
7.8 16
7.4 Variaciones normales en personas sanas - 40
7.0 100
6.6 - 250
Figura 2.5 Lmites del pH en el plasma sanguneo humano

La im p o r ta n c ia d e co n tro la r el pH se ilu str a m u y b ien e n el caso d e la

sa n g r e h u m a n a q u e d e b e m a n te n e r s e d e n tr o d e lm ite s m u y e str e c h o s para
q u e s e c o n s e r v e la v id a y a n m s e s tr e c h o s para m a n te n e r la sa lu d (fig u ra
2.5).
Plantas
El pH cito p la sm tic o p r o m e d io d e las p la n ta s es s e m e ja n te al de los a n im a le s,
p er o el c o n te n id o c e lu la r d e la m a y o r a d e las p la n ta s te r r e str e s e s cido y su
pH est e n tr e 5.2 y 6.5. A lg u n o s ju g o s d e p la n ta s son m u y cid os (n a ra n ja y
toro n ja ). p H 3, p ero e l cid o p a r e c e esta r c o n fin a d o a las v a c u o la s y por lo tan to
est sep a ra d o d el r e sto d el cito p la sm a .
Bacterias
El pH d e las b a c te r ia s e stu d ia d a s p a r e c e se r a p r o x im a d a m e n te n eu tro; sin
em b a rg o , m u c h a s e s p e c ie s c r e c e n b ien a u n pH 6 9, q u e im p lica u n a
d ife r e n c ia d e tr e s r d e n e s d e m a g n itu d e n la c o n c e n tr a c i n d e h id r o g e n io n e s.
Los tio b a cilo s c r e c e n a u n pH 0, lo cu a l c o r r e sp o n d e a cido su lf r ic o 1 m ol/1;
en ca m b io a lg u n o s h o n g o s c r e c e n a un pH 11. C o m o e s de esp era r, la m a y o ra
d e los o r g a n ism o s p a to g n ic o s para el h o m b r e p r e se n ta n un pH p tim o para
su c r e c im ie n to e n tr e 7.2 7.6. A p esa r d e q u e u n o r g a n ism o p u ed a c r e c er
d en tr o d e lm ite s a m p lio s d e pH , f r e c u e n t e m e n te d esa rro lla e n z im a s adapta-
tiv a s q u e tra ta r n d e d ir ig ir el pH e x te r n o h a cia v a lo r e s c e r c a n o s a la n e u tr a
lidad . P o r e je m p lo , es p o sib le d e a m in a r a m in o c id o s para p ro d u cir el
c o r r e s p o n d ie n te cid o c a r b o x lic o , o d e c a r b o x ila r lo s para p ro d u cir la a m in a .
Si se c u ltiv a E. coli a u n pH e n tr e 7 y 8, se s in te tiz a u n a d e a m in a sa q u e p rod u ce
cido, m ie n tr a s q u e a u n p H 4,5 y 6 p r e d o m in a u n a d eca rb o x ila sa , lo q u e da
com o r e su lta d o la p ro d u c c i n d e base.
A s p u es, p a r e c e cla ro q u e las fo rm a s m s sim p le s d e v id a p u e d e n s o b r e v i
v ir e n m e d io s e x te r n o s c u y o ra n g o de pH p u e d e v a ria r a m p lia m e n te sin q u e
el pH in te r n o su fr a v a r ia c io n e s.
EJERCICIOS PRACTICOS
Cuidado y uso del medidor de pH

El m to d o de o p e r a c i n d e u n m e d id o r de pH d e p e n d e d el m o d elo , as q u e en
e ste lib ro n o se dan in s tr u c c io n e s d e ta lla d a s para el efe c to . S in em b a rg o , se da
u n a id ea g e n e r a l d el u so y cu id a d o d e los e le c tr o d o s por co n sid e r a r lo de
b a sta n te u tilid a d .
1. E le c tro d o s n u e v o s de v id r io . Los e le c tr o d o s n u e v o s d e b e n r e m o ja r se en
HC1 0.1 m o l/1 o e n ag u a d e stila d a d u r a n te v a ria s h o ras a n te s d e u sarse.
pH y solucionea am ortiguadora* 37
2. Mezcla. La solucin debe agitarse vigorosam ente antes de m ed ir el pH y

esto idealm ente se puede hacer pasando a travs de ella una corriente de
nitrgeno puro. Sin em bargo, un agitador m agntico es quizs una form a ms .
conveniente para el trabajo de laboratorio, pero esto produce corrientes en los
electrodos, especialm ente en el com pensador de tem p eratu ra. No se deben
usar varillas de agitar, pues se corre el riesgo de ro m p er los electrodos que son
bastante frgiles.
3. Tem peratura. La te m p eratu ra del recipiente debe estar controlada,
puesto que el K w, el pK y el pH de la solucin patrn varan con la
tem peratura. El com pensador de te m p eratu ra que tiene el in stru m en to no
corrige esos factores, sino nicam ente los cambios en f.e.m. producidos por las
variaciones de tem p eratu ras en la unidad de los electrodos.
4. Contaminacin de los electrodos. Los electrodos deben lavarse con agua
destilada antes y despus de usarse y no se deben tocar con la mano. Deben ser
lavados cuidadosam ente, especialm ente despus de m edir el pH de una
solucin con una concentracin alta de m acrom olculas biolgicas, ya que
stas se adhieren al vidrio y alteran posteriores mediciones de pH a menos
de que s rem uevan com pletam ente.
5. Estandarizacin. El m edidor de pH se calibra antes de usarse con una
solucin patrn. En el Reino Unido se recom ienda el uso de un patrn de
ftalato potsico monobsico; a 15 C una solucin 0.05 mol/1 tiene un pH de
4.000. El pH a otras tem p eratu ras (0 a 60 C) puede obtenerse de la ecuacin
siguiente:
pH = 4.000 + i -------
\ 100
El m edidor debe calibrarse con una solucin cuyo pH sea cercano al de la

m uestra. En la tabla 2.4 se dan varios de los patrones que pueden usarse para
el efecto.
6. Medicin de valores extrem os de pH. La exactitud del electrodo de vidrio
se m antiene hasta valores de pH m uy bajos, pero en lcali fu erte el pH medido
Tabla 2.4 Patrones primarios para calibracin de un m edidor de pH
pH
25 C 37 C
1. Ftalato monobsico de potasio 0.05 mol/1 4.01 4.02
2. Fosfato de potasio monobsico 0.025 mol/1
Fosfato de sodio dibsico 0.025 mol/1 6.86 6.84
3. Tetraborato sdico 0,01 mol/1 9.18 9.06
es con frecuencia m s bajo que el real, debido a la in terferen cia de otros

iones, especialm ente el sodio. Por ejemplo, en una solucin que contieneNa*
0,1 mol/1 el e rro r alcalino es aproxim adam ente de -0.4 de unidad a pH 12.
Cuando se usa vidrio de litio, este e rro r se reduce considera blem ente, pero los
electrodos de vidrio ordinario no se pueden usar por encim a de pH 10. Cuando
se titula a valores de pH altos, lo m ejor es usar KOH y no NaOH, y se reco
m ienda usar una b u reta que tenga una tram pa de hidrxido de calcio para
absorber el C 0 2.
7. Conservacin del aparato. Cuando el m edidor de pH no est en uso, el
botn de pH debe estar en cero, pero el in terru p to r del aparato debe estar
prendido. Luego de usarse, los electrodos deben m an ten erse en agua destilada
y nunca se debe p erm itir que se seque. Si esto ocurre, los electrodos deben
sum ergirse en agua y calibrarse varias veces antes de proceder a hacer las
mediciones.
Curvas de titulacin
Lm ites prcticos de las curvas de titulacin. Si en la titulacin se usan cidos
fuertes o, bases fuertes 0.1 mol/1, las curvas se aproxim an asintticam ente al
pH 1 o pH 13, despus de producirse la neutralizacin completa. En form a
similar, los lm ites para las soluciones 0.01 mol/1 sern pH 2 o pH 12, y por lo
tanto valores de pXa por debaj o de 2 o por encim a de 12 no pueden ser d eterm i
nados usando soluciones 0.01 mol/1.
Correccin por solvente. Se deben corregir las curvas experim entales de
titulacin para tom ar en cuenta la cantidad de cido o base usados en la
titulacin del solvente, que generalm ente es agua destilada. Esto se hace en la
form a siguiente:
1. D ibuje las curvas de titulacin para los mismos volm enes de m u estra y
de agua.
2. Seleccione un valor cualquiera de pH en la curva p ara la m uestra y
anote el volum en de cido o base usada; denom ine esto X mi. En la
m ism a form a, anote la cantidad de cido o base consum ida p ara llevar el
agua al mismo valor de pH; denom ine esto Y mi.
3. La cantidad n eta de cido consumida en la titulacin de la m uestra est
dada por ( X Y ) mi. Repita esto para varios valores de pH y haga la
curva correcta de titulacin.
Determ inacin de p K a. Los valores de pXa pueden obtenerse de los datos de
titulacin por tres m todos diferentes:
1. El pH en el punto de inflexin es el valor de pXa y se puede leer directa
m ente. U na form a m s conveniente consiste en h acer el grfico de dB /
d(pH), que es el valor am ortiguador en funcin del pH y cuando se
obtiene un mximo, ste corresponde al pXa .
2. Por definicin, el valor de pK a es igual al pH en el que se ha titulado la

m itad del cido. El pK a puede, por lo tanto, obtenerse conociendo el
punto final de la titulacin.
3. El cociente sal/cido puede calcularse ex p erim en talm en te y se puede
hacer un grfico de log10sal/cido en funcin de pH. El intercepto sobre
el eje es el valor de pKa.
EXPERIMENTO 2.1 Determ inacin del pH m ediante el uso de indicadores

Materiales 100
1. Indicadores (soluciones en etanol acuoso de los indica
dores de la tabla 2.5. Estos se consiguen en el comercio) 100 mi
2. M uestras (saliva, jugo de n aranja, lim onada, clara de
huevo) diluidas 1 a 10. 11
Mtodo
En un tubo de ensayo pipetee 12 m i de cada m uestra, agregue dos gotas de
indicador de rojo de m etilo y observe el color. Repita el experim ento con otros
indicadores hasta obtener el pH aproxim ado com parando los colores de las
m uestras con las form as cida, interm edia y bsica del indicador (tabla 2.5).
En un tubo de ensayo pipetee 2 mi de agua destilada y determ in e el pH
usando los indicadores tal como se describi previam ente.
Por qu el pH es m ucho m enor que 7?
Qu sucede al pH cuando se hace b u rb u jear aire expirado en el agua?
Explique sus observaciones.
EXPERIMENTO 2.2 Titulacin de una mezcla de un cido fu e rte y un cido

dbil
Fundamento
El jugo gstrico consta de una m ezcla de HC1 libre y cidos dbiles, tales como
fosfato, protena y cidos orgnicos. Una prueba cuantitativa de ambos tipos
Tabla 2.5 Cambios de color y lm ites tiles de pH para algunos indicadores de uso
corriente
Color del indicador

Indicador Acido Base Pâ Lm ite til de pH
azul de timol rojo amarillo 1.7 1 .2 - 2.8

azul de bromofenol amarillo azul 4.0 3 .0 - 5.0
rojo de m etilo rojo amarillo 5.0 4 .3 - 6.1
prpura de bromocresol amarillo prpura 6.3 5 .5 - 7.0
rojo de fenol amarillo rojo 7.9 6 .8 - 8.2
fenolftalena incolora rojo 9.7 8.3 -1 0 .0
de acidez puede ser de gran valor en el diagnstico clnico. Las cantidades

relativas de HC1 y de cidos dbiles se d eterm in an por titulacin usando un
indicador que tenga dos lm ites de pH tal como el azul de timol. Los lm ites de
pH y los cambios de color que los acom paan para el azul de tim ol son:
pH 1.22.8 rojon a ra n ja am arillo,

pH 8.09.6 am arillov erd eazul.
Cuando se titula hasta obtener el p rim er cambio de color, ste indica la

cantidad de HC1 libre, m ien tras que titulando hasta pH 9.6 se determ in a la
acidez total.
Si no se puede conseguir jugo gstrico, se puede p rep arar una m uestra
sim ulada mezclando cidos clorhdrico y actico.
Materiales 100
1. Jugo gstrico o m u estra sim ulada prep arad a m ezclando
40 mi de cido clorhdrico 0.1mol/l, 15 m i de cido
actico 0,1 mol/1 y 45 m i de agua. 2.5 1
2. Hidrxido de potasio (0.1 mol/1). 2.5 1
3. Azul de tim ol (0.1% p /v en etanol 20% v/v). 100 mi
4. M icroburetas 10 mi. 100
Mtodo
En un tubo cnico pequeo coloque 10 mi de la m uestra, aada cuatro gotas de
indicador de azul de timol, titu le con hidrxido de potasio 0.1 mol/1, hasta
que el color rojizo-naranja cam bie a naranja-am arillo; anote cuidadosam ente
el volum en de hidrxido de potasio usado. C ontine la titulacin hasta que se
form e un color azul estable y anote de nuevo el volum en de lcali usado.
Calcule el HC1 lib re y la acidez total de la m u estra en trm inos de mi de 0.1
mol/1 de cido/100 mi de la m uestra.
Los valores norm ales para jugo gstrico son:
HC1 libre 20 30 mi 0,1 mol/1 de cido/100 mi.
Acidez total 30 70 mi 0.1 mol/1 de cido/100 mi.
Com pare los resultados obtenidos en la m u estra sim ulada con los
esperados segn los clculos tericos.
EXPERIMENTO 2.3 T itu la c i n d e u n cid o f u e r t e c o n u n a b a se f u e r t e
Materiales -AiL
1. Acido clorhdrico (0.1 mol/1). 500 mi
2. Hidrxido de potasio (0.1 mol/1). 500 mi
3. B uretas de 25 mi. 10
4. M edidores de pH. 5
Mtodo
En un vaso de precipitado de 100 mi pipetee 20 mi de HC1 0.1 mol/1 y m ida el
pH. Titule esta solucin con KOH 0.1 mol/1 y m ida el pH despus de agregar
alcuotas de lcali de 1 mi. Cuando se aproxim e al punto final de titulacin,
reduzca la cantidad de lcali agregada, hasta obtener un cambio razonable en
el pH.
Haga la curva de titulacin y com prela con los valores tericos obtenidos
como se describi anteriorm ente.
EXPERIMENTO 2.4 Titulacin de un cido dbil con una base fu e rte

Materiales 10
1. Acido actico (0.1 mol/1 y 0.01 mol/1). 500 mi
2. Hidrxido de potasio (0.1 mol/1 y 0.01 mol/1). 11
Mtodo
Titule 20 mi de cido actico 0.1 mol/1 como se indic an terio rm en te. Haga la
curva de titulacin y deduzca el valor de p K usando los mtodos descritos.
Repita la titulacin usando cido actico 0.01 mol/1 y com pare ambos grficos
con la curva terica obtenida de la ecuacin:
[S a l]
pH = pK + log! o
[Acido]
Cules son las diferencias en tre estas curvas y por qu?
EXPERIMENTO 2.5 La determ inacin de p K 3

Materiales 10
1. Soluciones de los siguientes cidos (1.4 g/1): 250 m i (cal
culando dos
cidos por
estudiante)
Acido Peso mol. PK

actico 60.05 4.8
benzoico 122 .12 4.2
hiprico 179.17 3.6
imidazol 68.08 7.0
lctico 90.08 3.9
p-nitrofenol 13 9 .11 7.1
Se sugiere que estos cidos se codifiquen con un nm ero

conocido nicam ente por el instructor.
2. Hidrxido de potasio (0.02 mol/1). 11
3. B uretas 25 mi. 10
4. Medidores de pH. 5
Mtodo
Titule la solucin desconocida con patrn de lcali y deduzca su peso equiva
lente. A otra porcin de la m ism a solucin desconocida agregue la m itad de
la cantidad de alcali necesaria p ara su neutralizacin com pleta y mida el pH
de la solucin obtenida; ste es el pK del cido. Usando los datos sum inis
trados en la lista an terio r, identifique el cido hasta donde sea posible.
EXPERIMENTO 2.6 Valores de pK 3de u n cido dicarboxlico

Materiales JJ>
1. Solucin de cido dicarboxlico (0.1 mol/1). 250 mi (cal
culando dos
cidos por
estudiante)
Acido pKi pk 2
mlico 3.5 5.0
oxlico 1.3 4.3
succnico 4.2 5.6
tartrico 3.0 4.4
(Lo mism o que en el experim ento anterior, el estudiante no

debe conocer el cido con el cual est trabajando.)
Mtodo
P repare una curva de titulacin del cido dado e identifquelo a p artir de los
valores pK obtenidos.
EXPERIMENTO 2.7 Mezcla de cido ctrico-citrato de potasio, como solucin

amortiguadora
Materiales 10
1. Acido ctrico (0.2 mol/1). 500 mi
Mtodo
En un vaso de precipitado de 100 mi, coloque 20 m i de cido ctrico 0.2 mol/1 y
titule con lcali; anote el pH y haga la curva de titulacin. Usando sus resu lta
dos, m ida el valor am ortiguador /? a diferentes valores de pH y calcule el
intervalo de capacidad am ortiguadora til.
Am inocidos y protenas. La titulacin de los aminocidos se considerar
conjuntam ente con las otras propiedades qum icas de dichos com puestos en el
captulo 5.
Bibliografa
Bates, R. G., D eterm ination of pH: Theory and Practice 2a. ed. Nueva York,
Jo h n Wiley and Sons, 1973.
B ittar, E. E., Cell pH, Londres, B utterw orths, 1964.
Good, N. E., Winget, G. D., W inter, W., Connolly, T. N., Izawa, S. and Singh,
R. M. M. Biochem istry 5, 467, 1966.
M orris, J. G., A Biologists Physical C hem istry, 2a. ed. Londres, Edw ard
Arnold, 1974.
Robinson, J. R., F undam entals o f Acid-Base Regulation, 5a. ed. Oxford,
Blackwell Scientific Publications, 1975.
Mtodos de separacin
INTRODUCCION GENERAL
La separacin de m olculas a p artir de m ateriales biolgicos es una parte

im portante del trabajo bioqumico, que frecu en tem en te im plica el aislam ien
to de especies m oleculares de una mezcla de com puestos que tien en propieda
des m uy sim ilares. P or lo tanto, los m todos usualm ente em pleados en
qum ica orgnica no son adecuados y es necesario utilizar tcnicas fsicas que
separen m olculas sobre la base de diferencias m u y pequeas en sus
propiedades. En trm inos generales, cuando se tra ta de molculas de m ateria
viva, deben evitarse extrem os de pH y tem p eratu ra, solventes orgnicos, y el
uso de agentes xido-reductores, pues se corre el riesgo de p erd er la actividad
biolgica debido a desnaturalizacin. Las tcnicas experim entales descritas
en este captulo em plean condiciones suaves y aprovechan diferencias bsicas
en las propiedades fsicas de las molculas tales como tam ao, form a, m asa y
carga as como solubilidad y adsorcin. Los mtodos ilustrados, im plican
diferentes grados de interaccin en tre tres com ponentes: la m ezcla que debe
ser separada, una fase slida y u n solvente (figura 3.1, tabla 3.1). La m agnitud
de estas interacciones depende del mtodo, y en algunos casos puede ser
m uy pequea. P or ejem plo, la interaccin soluto-slido es dom inante en
crom atografa de intercam bio inico, m ien tras que la interaccin solvente-
soluto es dom inante en crom atografa de particin y no hay interaccin
especfica o es m uy pequea e n tre el soluto y la fase slida en dilisis.
En este libro se da una pequea introduccin a la teora y prctica de esas
tcnicas, pero no todos los compuestos se com portan exactam ente como se
predice en teora y con frecuencia se tienen que en co n trar experim ental
m ente las m ejores condiciones para una d eterm in ad a separacin.
44
Mtodos d* separacin 45^
Solvente
(fase mvil en cromatografa)
Soluto
(molculas que van a ser
separadas)
O
Figura 3.1 Bases de los mtodos de separacin en bioqumica cuando

se tienen tres componentes
Tabla 3.1 Tcnicas comunes de separacin
propiedades de los
solutos utilizados
tcnica para la separacin fase slida solvente
dilisis forma y tamao membrana semi agua
permeable
filtracin en gel tamao y forma genhidratado usualmente acuoso
cromatografa de adsorcin adsorbente usual no polar
adsorcin mente material
inorgnico
cromatografa de solubilidad soporte inerte mezcla de solventes
particin polares y no polares
cromatografa de ionizacin matriz que contiene amortiguador
intercambi inico grupos ionizados acuoso
electroforesis en carga elctrica soporte inerte amortiguador
acetato de celulosa acuoso <
electroforesis en carga elctrica soporte inerte con amortiguador
gel de poliacri- poros acuoso
lamida
DIALISIS
La dilisis se usa para separar las molculas grandes de las pequeas y se basa
en el hecho de que una membrana sem iperm eable perm ite pasar pequeas
i
Figura 3.2 Dilisis de una mezcla que contiene molculas grandes ()

y pequeas () i
molculas a travs de ella, pero previene el paso de molculas grandes. En la

prctica, se coloca una mezcla de molculas grandes y pequeas en un tubo de
dilisis y se sumerge en un volumen grande de solvente acuoso. Las molculas
pequeas pasan a travs de la membrana al fluido externo hasta que se
alcanza el equilibrio (figura 3.2). La mezcla puede liberarse casi completa
mente de molculas pequeas dializando en contra de agua o cambiando
repetidamente el solvente. La velocidad de dilisis depende de un nmero de
factores que se van a considerar brevemente a continuacin.
La membrana
E l celofn es el material que se usa ms com nm ente para
M a teria le s.
dilisis, y el tubo recomendado para los experimentos es fabricado por la
Divisin Visking de la Unin Carbide.
P r e p a r a c i n . Se selecciona un tubo de longitud y tamao apropiado y se
remoja en agua. La membrana contiene trazas de compuestos azufrados,
iones metlicos y algunas enzimas y por lo tanto se recomienda hervir el tubo
por 30 minutos e n EDTA alcalina (Na2C 0 3, 10 g/1: EDTA, 1 mmol/1) con el
fin de evitar la prdida de actividad de las molculas dializadas. Despus de
hervir el tubo se lava con agua destilada, se hace un nudo en un extremo, se
llena con el material objeto de investigacin y se ata el otro extremo. La di
lisis debe hacerse preferiblemente con tubo recin preparado, puesto que
una vez humedecido ste, se hace muy susceptible al ataque de microorga
nismos. Si hay que almacenar el tubo se debe guardar en una solucin que
contenga trazas de cido benzoico.
Mtodos do MfMracto 47
P e r m e a b i l i d a d . La permeabilidad lmite del tubo Visking depende dl

tamao y tambin del tratamiento previo, pero efi trminos generales se
puede decir que la membrana es permeable a compuestos cuyo peso
molecular est por debajo de 30 000 cuando la dilisis se efecta de un da para
otro. En la prctica no hay un lmite definido y es posible que las molculas
ms grandes difundan a travs de la membrana si se prolonga la dilisis.
Hay, sin embargo, un buen nmero de materiales comerciales que presentan
alta velocidad de difusin y lmites bien definidos de permeabilidad que
pueden ser usados para separaciones en que se requiere mayor precisin.
Solvente
S o l u c i n a c u o s a . En general la velocidad de dilisis es mayor en agua
destilada; sin embargo, para estabilizar las molculas objeto de investigacin
es necesario utilizar soluciones acuosas de pH y fuerza inica definidas.
S o l u c i n d e u n a m a c r o m o l c u l a . Durante la dilisis, penetra agua en el saco
por osmosis; por lo tanto el tubo debe llenarse completamente con el fin de
evitar la dilucin excesiva del contenido. Sin embargo, si se usa una solucin
concentrada de un compuesto inerte de alto peso molecular como solvente en
vez de la solucin acuosa, entonces el agua pasa por osmosis hacia el exterior
del tubo y en esta forma una solucin de 200 mi puede reducirse en unos pocos
mililitros de un da para otro.
Condiciones fsicas
T e m p e r a t u r a . La velocidad de dilisis depende de la temperatura; entre ms
alta sea, la velocidad ser mayor. A temperaturas elevadas, la viscosidad del
solvente es menor y la velocidad de difusin aumenta. De otra parte, muchas
macromolculas son sensibles a la temperatura, motivo por el cual la dilisis
de protenas, etc., se hace ordinariamente en fro.
P r e s i n . La separacin de molculas grandes y pequeas puede hacerse
tambin por medio de un gradiente de presin a travs de la membrana. Esto
se puede efectuar convenientem ente colocando el tubo dentro de un recipien
te al vaco y dejando un extremo del tubo abierto a la atmsfera. El agua y las
molculas pequeas saldrn del tubo de dilisis y formarn un ultrafiltrado,
mientrs que las molculas grandes permanecern dentro del tubo. Este
proceso se conoce, como u l t r a f i l t r a c i n .
Equilibrio de Oonnan en membranas o efecto de Donnan

Cuando se coloca una mezcla de molculas tales como protenas en solucin
salina en contacto con una membrana semipermeable, la protena cargada no
puede pasar a travs de la membrana, pero sus contraiones pequeos tienden ,
i - : fiv ; r. =";
a hacerlo. Como resultado se origina una distribucin dispareja de iones y

una diferencia de potencial,elctrico a travs de la membrana. Esto se conoce
como efecto de Donnan y constituye la base de algunos fenmenos elctricos
observados en fisiologa. Sin embargo, este efecto es no conveniente si la
dilisis se efecta contra agua destilada debido a los cambios de pH que
ocurren. Por ejemplo, si una protena cargada negativamente en solucin
salina se dializa en contra de agua destilada, la protena no puede pasar a
travs del tubo de dilisis, pero los contraiones (Na+) s pueden hacerlo. Esto
originara un exceso de cationes n el medio circundante, y por lo tanto para
mantener la neutralidad elctrica el agua se disocia y los hidrogeniones mi-
gran hacia el interior del tubo de dilisis. El pH en el compartimiento que
contiene la protena baja y el de la seccin acuosa sube (figura 3.3). Por el con
trario, si la protena est cargada positivamente entonces los cambios en el pH
sern en el sentido opuesto. Tales cambios no son convenientes y pueden
originar la precipitacin o desnaturalizacin de la protena.
La desigual distribucin de los iones puede ser tambin indeseable y por
esto para minimizar el efecto de Donnan, la dilisis se hace generalmente en
contra de concentraciones bajas de sal (>0.1 mol/1).
EXPERIMENTO 3.1 Paso de molculas a travs de una m embrana de dilisis

Fundamento
El almidn consta de dos molculas grandes: amilosa, de peso molecular cerca
de 50 000 y amilopectina de un peso molecular 1 x 106, ninguna de las cuales
Membrana
semipermeable
Figura 3.3 El efecto Donnan observado cuando una protena

en solucin salina es dializada n contra de agua destilada
Mtodos do separacin 48
puede atravesar la m em b ran a de dilisis. La am ilasa de la saliva convierte el

alm idn en maltosa, de peso m olecular 360, que si puede difu n d ir al ex terio r
del tubo de dilisis. *
Materiales 100
1. Tubo de celofn Visking.
2. C loruro de sodio (1 g/1 am ortiguado con fosfato de
sodio 0.02 mol/1, pH 6.8). 12 1
3. Almidn soluble (20 g/1). 11
4. Saliva.
5. Solucin de yodo (5 mmol/1 en yoduro de potasio 30 g/1). 200 mi
6. Solucin de Benedict. 21
Mtodo
P rep are 2 tubos de dilisis que contengan 5 m i de solucin de alm idn y 4 mi de
solucin salina am ortiguada. A ada 1 m i de saliva al tubo de p ru e b a y 1 mi
de agua al de co n tro l y coloque los tubos en dos vasos de precipitados que
contengan 100 m i de solucin am ortiguadora agitando m ecnicam ente.
Tapone con algodn las boquillas de las pipetas que se usan p ara ev itar que el
de control se contam ine accidentalm ente con saliva. S epare porciones de
dializado a intervalos de tierrpo conveniente. D eterm in e la presencia de
maltosa utilizando solucin de B enedict y la de alm idn por la p ru eb a de yodo
en la form a como se indica en el captulo 6. Al final del experim ento, rem ueva
los contenidos de los tubos de dilisis y haga la p ru eb a p ara alm idn y maltosa.
EXPERIMENTO 3.2 D e m o stra c i n d e l eq u ilib rio d e D on n an .
Materiales 100
1. Tubos de dilisis.
2. Solucin de gelatina (20 g/1). 31
3. Indicador de azul de tim ol (2 g/1 en 20% v /v de alcohol). 100 m i
4. Acido clorhdrico (0.1 mol/1). 500 m i
5. Hidrxido de sodio (0.1 mol/1). 500 mi
Mtodo
Mezcle dos gotas del indicador con 20 m i de gelatina y aada hidrxido de sodio
gota a gota hasta o b ten er u n color verd e (pH ap ro x im ad am en te 9). En la
m ism a form a, agregue a 20 m i de agua dos gotas de indicador y lcali hasta
ob ten er la m ism a tonalidad de verde. Coloque la gelatina en u n tubo d
dilisis de tam ao adecuado y suspenda el tubo en el m edio acuoso. Djelo un
rato y observe el cam bio en el color de la solucin den tro y fu era del tubo de
dilisis. Repita el experim ento, pero ajuste el pH inicial d la gelatina y del
agua a 2 hasta ob ten er u n color am arillo-rosado. E xplique los cambios de color
observados en am bos casos.
SO Bioqumica prctica
N o ta . Punto isoelctrico de la gelatina: pH 4.8

Cambios de color para el azul de timol
pH 1 .2 -2 .8 rojo - naranja - amarillo
pH 8.0 - 9.6 amarillo - verde - azul
i
FILTRACION EN GEL (CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION)
Las molculas pueden ser separadas tambin en base a las diferencias en sus
tamaos si se pasan a travs de una columna que contiene partculas hidrata
das de geles muy especiales. Se encuentra en el mercado un buen nmero de
materiales para estos fines y su composicin y porosidad son controladas
cuidadosamente, as que aun molculas cuyo tamao es relativamente
parecido pueden ser separadas mediante la adecuada seleccin del gel. El
principio de filtracin por gel puede ilustrarse usando Sephadex, uno de los
varios materiales disponibles en el comercio. Este consta de partculas
pequeas de substancia hidroflica e insoluble, obtenidas al entrecruzar el
polisacrido dextran, hasta formar una red tridimensional de cadenas
polisacardicas. La molcula es altamente polar debido a su alto contenido de
grupos hidrxilo y se hincha considerablemente cuando se coloca en gua. Las
molculas pequeas pueden penetrar dentro del gel, pero las grandes son
excluidas de la red de malla entrecruzada (figura 3.4). Esto significa que el
volumen de solvente accesible es mucho menor para molculas totalmente
Malla de partculas
entrecruzadas en un
gel hidratado
Las partculas pequeas

pueden penetrar
"
Las molculas grandes

no pueden penetrar
(Totalmente excluidas)
F ig u ra 3 .4 Principio de filtracin por gel

Mtodo* de separacin *1
excluidas del gel que para molculas que pueden penetrar libremente en l
(figura 3.5). La separacin de molculas por filtracin en gel se ilustra en el
9
(a) Las molculas grandes (b) Las molculas pequeas

no pueden penetrar pueden fcilmente
el gl penetrar el gel
Volumen
efluente y. + y 0
i
Figura 3.5 Volumen de una columna de filtracin en gel disponible
a las molculas. El rea sombreada representa el agua accesible
:-Sl
o oo|
OOOOo
Oo O o %%>?%%:
Oo0o5o ooSo
oOo-o
o 0
? o qo,

'o o O
'JO
(a) (b) (C)
O Partculas de Sephadex
Molculas grandes
Molculas pequeas
F ig u ra 3 .6 Fundam ento de la tcnica de filtracin en gel

diagrama (figura 3.6). Primro, la mezcla de molculas grandes () y

pequeas () se coloca sobre la superficie libre superior del gel (figura 3.6(a)).
A medida que la muestra A scien d e en la columna, las molculas pequeas
difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino ms largo mientras
que las molculas grandes son completamente excluidas de las partculas del
gel (figura 3.6(b)). Eventualmente, se-obtiene una separacin completa ya
que las molculas grandes salen de la columna primero y por ltimo vienen
las molculas ms pequeas (figura 3.6(c)). Este mtodo se conoce tambin
con el nombre de tamiz molecular; sin embargo, este nombre puede dar una
impresin errnea, puesto que cuando se tamizan partculas grandes, las
partculas ms pequeas salen primero y las grandes son retenidas, exacta
mente al contrario de lo que sucede en la filtracin por gel. Finalmente, el
mtodo tiene un ligero inconveniente consistente en que durante la
separacin ocurre dilucin del soluto, pero esto tambin sucede en la mayora
de las otras tcnicas cromatogrficas.
X
Teora
El volumen total de una columna de gel (VT )es la suma del volumen de la
matriz del gel ( V g ), el volumen del agua dentro de las partculas de gel (V) y el
volumen de agua fuera de los granos de gel ( Vq):
V T = V 0 + Vi + Vg.
V q se conoce como volumen de exclusin y corresponde a la cantidad de

lquido necesaria para eluir compuestos que son completamente excluidos de
los granos del gel.
V i puede calcularse sabiendo el peso del gel seco (a) y el agua necesaria
para hidratar el gel (Wr):
Vi =aWt.
El volumen de elucin (Ve) de un compuesto es el volumen que se necesita

para eluir un compuesto de la columna:
Ve = V 0 + K dVi.
K d indica la fraccin del volumen interior accesible a un compuesto especfico

y es independiente de la geometra de la columna:
Mtodos de separacin 53
Si una molcula es completamente excluida del gel, entonces K d = 0 y

V e =V0 ; mientras qie si la molcula penetra completamente en el gel,
entonces K d = 1 y Ve = V0 + y. Por consiguiente, las molculas normal
m ente tienen valores de K d entre 0 y 1. Si K d es mayor que 1, entonces ha
tenido lugar la adsorcin del compuesto sobre el gel.
Supongamos que hay dos sustancias con valores de K d representados por
K d y K d y los volm enes de elucin difieren en un valor V s, entonces:
Vs = Ve1 - Ve2
= ( V 0 + K d1 V i ) - ( V 0 + K d2 V i)
= (K d' - K d2 ) V .
Para obtener una separacin completa, el volum en de la muestra no debe

ser mayor que Vs . En la prctica el volumen de la muestra debe ser menor
que Vs ya que las curvas de elucin se extienden por fuera de los lmites
ideales debido a la difusin y a irregularidades en el flujo de la columna.
Materiales para filtracin en gel

La compaa Pharmacia fbrica dextan entrecruzados (Sephadex), agarosa
(Sepharose) y agarosa entrecruzada (Sepharose CL) y Sephacryl, mientras
que los laboratorios Bio-Rad fabrican poliacrilamida (Biogel P), agarosa
(Biogel A), vidrio poroso (Bio-Glas) y poliestireno (Bio-Beads). Se puede
controlar cuidadosamente el grado de entrecruzamiento hasta obtener un gel
capaz de fraccionar molculas dentro de lmites relativamente especficos de
tamao. Esto se ilustra en el caso de Sephadex (tabla 3.2) y Sepharosa (tabla 3.3).
Tabla 3.2 Propiedades de algunos geles de Sephadex

Volumen de
Peso molecular, lmites de fraccionamiento Agua retenida resina hidratad
Tipo Polisacridos Pptidos y protenas (g/g gel seco) (ml/g gel seco)
G10 hasta 700 hasta 700 1.0 2

G15 hasta 1500 hasta 1500 1.5 3
G25* 100- 5000 1000- 5000 2.5 5
G50 500- 10 000 1500- 30 000 5.0 10
G75 1000- 50 000 3000- 80 000 7.5 12-15
G100 1000-100 000 4000-150 000 10.0 15-20
G150 1000-150 000 5000-400 000 15.0 20-30
G200 1000-200 000 5000-800 000 20.0 30-40
*G25-> 200 Se venden tambin en grado superfino. Reproducido con permiso de

Pharmacia.
54 Bioqumica prctica ' ,
Sin embargo, el intervalo de fraccionamiento es nicamente aproximado,

puesto que la separacin depende adems del tamao de las molculas, de
su forma y en menor grado de su carga. El Sephadex G25 y el G50 son
fabricados en partculas de diferentes tamaos: grueso, fino, mediano y
tambin superfino. El Sephadex fino es adecuado para la mayora de los
trabajos de laboratorio que requieren alto grado de resolucin, mientras que
el material grueso es conveniente para trabajos preparativos en columnas
grandes, ya que da velocidades de flujo bastante altas.
El Sephadex es un material estable, y no es modificado por cidos y bases
dbiles, pero se deben evitar soluciones concentradas de cidos fuertes,
puesto que hidrolizan los enlaces glicosdicos: la hidrlisis es proporcional al
tiempo, as, el Sephadex es estable por 6 meses en HC10.02 mol/1, pero slo lo
es 1-2 horas en HC1 0.01 mol/1. El Sephadex se altera fcilmente por agentes
oxidantes, por tanto no deben usarse con esta resina. Para evitar contami
nacin por bacterias cuando un gel se almacena hmedo, se debe agregar un
poco de preservativo. El tolueno, el fenol y el cloroformo son sustancias muy
usadas para tal efecto. Otra ventaja del Sephadex es que se puede usar varias
veces. Luego de usarse, la resina debe lavarse repetidas veces con agua, y as
se puede almacenar en el refrigerador o.cuarto fro por un tiempo relativa
m ente largo.
La sepharosa es estable entre pH 4 y 10 y se puede usar a temperaturas
entpe 0 y 30 C; la sepharosa CL es estable a valores de pH entre 3 y 14 a
terriperaturas hasta de 70 C. Estos geles que son un poco ms porosos se usan
para fraccionar molculas muy grandes tales como cidos nucleicos y virus.
EXPERIMENTO 3.3 Separacin de hemoglobina y cido 2,4-dinitrofenilaspr-

tico en Sephadex G25
Fundamento
En este experimento se ilustra la separacin de dos molculas basadas en
diferencias de tamao. La teora ha Sido discutida en detalle, as como las
precauciones generales que se deben tener durante la preparacin de las
columnas para cromatografa; lo referente a la aplicacin de la muestra se
trata eft la pgina 58.
Tabla 3.3 Tipos de Sepharosa
Lmites de exclusin (peso mol. x 106)

Concentracin de
Tipo agarosa (%) Polisacridos Protenas
2B + 2B CL 2 20 40
4B + 4B CL 4 5 20
6B + 6B CL 6 1 4
Reproducido con permiso de Pharmacia.
M todo* de spW-*cJn $S
Materiales
1. Sephadex G25. 25 g
2. Columnas de cromatografa (20 cm x 1 cm). 5
3. Hemoglobina, peso mol. 66 000. (Separe clulas rojas del
plasma y aada a las clulas un volumen igual de agua
para hemolizarlas, remuva las clulas no hemolizadas y
las membranas por centrifugacin).
4. Acido 2,4- dinitrofenilasprtico, peso mol. 299. 5g
5. Cloruro de sodio (10 g/1). 11
Mtodo
Suspenda 4 g de Sephadex G25 en la solucin de cloruro de sodio y djelo
hinchar por 3 horas. Durante este tiempo, agite la solucin y remueva las
pequeas partculas flotantes por decantacin. Vierta la suspensin del gel en
una columna (18 cm x 1 cm) y djela sedimentar completamente pdr accin de
la gravedad manteniendo al tiempo un flujo lento a travs de la columna. Use
un volumen de solvente grande en comparacin con la cantidad del gel para
evitar que queden burbujas de aire en la columna.
Prepare 0.5 mi de una mezcla de hemoglobina y cido 2,4-dinitrofenilas
prtico, neutralice y aplquela sobre la superficie superior del gel; y eluya con
10 g/1 de cloruro de sodio. Recoja fracciones de 3 mi hasta que todo el cido 2,4-
dinitrofenilasprtico haya salido de la columna. Mida la extincin de cada
tubo a 400 nm y a 555 nra y luego haga un grfico de sus resultados.
1. Explique los resultados!
2. Cul es el volumen de exclusin de su columna?
3. Cul es la relacin entre el valor obtenido y el valor que usted esperara
tericamente?
EXPERIMENTO 3.4 D e sa lin iza c i n d e u n a so lu c i n p r o te ic a
Fundamento
Las protenas estn completamente excluidas del Sephadex G25 y G50 y por lo
tanto K tiene un valor de 0. En cambio, las sales pueden penetrar el gel y por
lo tanto tiene un valor de 1. Esta propiedad puede usarse para remover la
sal de algunas solucione^ de protena y se puede usar en lugar de dilisis. El
mtodo es rpido y es ideal para protenas lbiles que pueden desnaturali
zarse por dilisis. La separacin de materiales que poseen valores extremos de
K d permite el uso de volm enes grandes con muy poca dilucin de la muestra.
Materiales _10
1. Sephadex G25. 25 g
2. Columna de cromatografa (20 x 1 cm). 5
3. Hemoglobina (prepararla como en el experimento 3.3). 20 mi
4. Cloruro de sodio (10 g/1). 50 mi
r
Mtodo
A una columna de Sephadex G25, preparada como se describi, aplique 4 mi
de hemoglobina en solucin salina. Deje que la muestra penetre en la resina;
eluya entonces con agua destilada. Mantenga un volumen constante de
lquido sobre el gel y recoj a fracciones de 3 mi hasta que haya salido toda la he
moglobina. Determ ine el contenido de hemoglobina de los tubos siguiendo la
extincin a 555 nm y la concentracin de cloruro de sodio, midiendo bien sea
Na+ o Cl por uno de los mtodos comnmente usados.
Filtracin en gel de capa fina

El Sephadex puede usarse para determinar un peso molecular desconocido,
eluyendo la molcula de una columna y conociendo el Ve / V0 de la muestra y
el Ve/V 0 de varias protenas patrones. Si con los valores obtenidos para los
patrones se hace un grfico de V e / VBen funcin del logaritmo del peso mole
cular debe dar una lnea recta dentro del intervalo de separacin til del gel.
Sin embargo, un mtodo ms rpido para estimar el peso molecular consiste
en usar filtracin en gel de capa fina. Para esto se usa un gel especial de grado
superfino. El gel se deja hinchar por 72 horas a 0C; luego se extiende una capa
de aproximadamente 0.20.9 mm sobre una placa limpia de vidrio usando el
equipo para cromatografa de capa fina. Las lminas pueden almacenarse en
una cmara hmeda hasta el momento de usarse; luego se equilibran por
varias horas, tal como se indica (figura 3.7). Se colocan las muestras sobre el
gel aproximadamente a 3 cm de distancia del borde permitiendo mientras
tanto que el solvente contine pasando. La velocidad de flujo a travs del gel
depende del ngulo que la lmina forme con la mesa, as, una velocidad de
1 2 cm /h puede obtenerse con ngulos de 10 20.
Los compuestos se transfieren a un papel de filtro colocado sobre el gel
como se indica en la figura 3.7 y luego se colorean de acuerd a la sustancia.
Un grfico de la distancia migrada en funcin del logaritmo del peso
molecular es lineal para protenas esfricas dentro de los lmites tiles para el
gel de Sephadex usado.
F ig u ra 3 .7 Filtracin en gel de capa fina

>
Las ventajas de la filtracin en capa fina sobre la filtracin en colum na
son: 1) la m u estra puede correrse al m ism o tiem po que los patrones y 2) se
necesitan slo pequeas cantidades de m aterial.
EXPERIMENTO 3.5 D eterm inacin del peso m olecular de quim otripsina por
filtracin en gel de capa fin a usando Sephadex G200
Materiales 10
1. Placas para capa fina (200 m m x 200 m m x 0.9 m m ) de
Sephadex G200 grado superfino. 10
2. Solucin salina am ortiguada (cloruro de sodio O.f mol/1.)
en am ortiguador de fosfato de sodio, 0.02 mol/1, pH 7.0. 51
3. Soluciones saturadas de patrones de protena en am or
tiguador salino. 2 mi
4. Solucin saturad a de quim otripsina en am ortiguador
salino. 2 mi
5. Ponceau S (2 g/1 en cido tricloroactico 100 g/1). 11
6. Acido actico (2% v /v). 21
7. Papel para crom atografa W hatm an 3 MM. 10 hojas
8. Recipientes para el solvente y tanques de crom atografa
como se indica en la figura 3.7. 5
9. Pipetas o tubos capilares. 10
Mtodo
Con una pipeta o un tubo de vidrio capilar aplique cuidadosam ente las
soluciones patrones y de quim otripsina sobre el gel, dejando que el solvente
fluya m ientras d u ra la aplicacin. P rocure no d a ar la superficie del gel y
tenga cuidado de que los puntos de aplicacin sean bien pequeos con un
dim etro m xim o de 4 mm .
D ej que el solvente fluya a travs del gel hasta que el dex tran azul llegue
cerca del extrem o del gel (35 h). R etire luego la placa del tan q u e y tran sfiera
las protenas a papel W hatm an 3 MM, oprim iendo cuidadosam ente el papel
contra el gel y dejndolo as por cerca de 10 m in. S epare el papel del gel y tia
d u ran te 10 m inutos con u n a solucin de Ponceau S para localiza/ las
protenas. Lave el papel varias veces en una solucin de cido actico al 2% v /v
Patrn Peso mol. Log peso mol,

citocromo c 12 400 4.09
mioglobina (esperma de
ballena) 17 800 4.25
ovoalbmina 45 000 4.65
albmina srica bovina 67 000 4.83
/globulina 160 000 5.20
tiroglobulina 670 000 5.83
\
hasta que desaparezca la coloracin de fondo y haga un grfico de la distancia

relativa de migracin de la protena en milmetros, en funcin del logaritmo
del peso molecular. Mida la distancia de migracin de la quimotripsina y
determine su peso molecular usando una curva patrn.
CROMATOGRAFIA
Prctica de la cromatografa en columna

La separacin de compuestos por cromatografa en columna es una de las
tcnicas ms ampliamente usadas en trabajos bioqumicos. Es por lo tanto
importante considerar algunas de las precauciones generales que deben
tenerse en cuenta al preparar y usar columnas antes de pasar a discutir los
varios tipos de separaciones cromatogrficas.
Columnas. Las columnas usadas en cromatografa son generalmente de
vidrio. Las columnas largas usualmente proporcionan una buena resolucin
de los componentes, pero las columnas anchas son mejores cundo se usan
grandes cantidades de material. Los aspectos esenciales de la cromatografa
en columna se muestran en la figura 3.8.
Preparacin del material. En las separaciones cromatogrficas se usa gran
nmero de materiales y todos deben ser equilibrados con solvente antes de
preparar la columna. Adems, algunas veces se requiere cierta forma de
tratamiento previo; por ejemplo, unos materiales para filtracin en gel
necesitan hidratarse, los adsorbentes deben per activados por tratamiento de
calor o de cido y las resinas de intercambio inico se obtienen en la forma
ionizada requerida a travs del lavado previo.
Durante la eq ulibracin con el solvente, se rem ueven por decantacin las
partculas finas de resina que flotan sobre la suspensin (figura 3.9(a)). Si esto
no se hace, el flujo de la columna puede reducirse considerablemente debido
al taponamiento ocasionado por estas partculas.
Cmo empacar la columna. Para empacar la columna cromatogrfica se

llena con solvente hasta aproximadamente 1/3 de su volumen y luego se
agrega lentam ente la suspensin que contiene el material cromatogrfico.
Esto se hace con la ayuda de una varilla de vidrio, tal como se indica en la
(figura 3.9(b)), para evitar la formacin de burbujas de aire. Se espera hasta
que la suspensin sedim ente y se deja pasar el exceso de solvente. Para evitar
la formacin decapas disparejas, debe agitarse con una varilla de vidrio la
superficie del material que se ha empacado antes de agregar ms material.
Este proceso se repite hasta lograr la altura indicada. Despus de lavar varias
veces la columna con solvente, se deja que el nivel del lquido baje hasta casi
tocar la superficie del material pero sin permitir que se seque la superficie
i
Mtodos do separacin $9
Recipiente para el solvente

comunicado con un aparato de
presin constante
Eluente
Disco de papehde filtro para.

evitar perturbaciones en la
superficie
Material de cromatografa
Tela de nylon o lana de vidrio

usado como tapn
Espacio muerto pequeo para
evitar la mezcla de los picos
despus de la separacin
Tubo para re c o g e r la s m u e s tr a s
dispuesto en un colector de
fracciones
Aparatos para cromatografa en columna

60 Bioqumica prdica
Bureta con una suspensin

de gel en sedimentacin
*
a
Figura 3.9 Preparacin de una cromatografa en columna
superior. Finalmente, se coloca un disco de papel de filtro encima dla resina

para evitar perturbar la superficie cuando se aplique la muestra.
La muestra se disuelve primero en el solvente o se
A p lic a c i n d e la m u e s tr a .
dializa en contra del amortiguador de elucin antes de ser aplicada sobr la
columna. Idealmente esto debe hacerse bombeando la solucin a travs de un
aditamento especialmente diseado para extender uniformemente la
solucin sobre la superficie de la columna. En el mercado se encuentran
adaptadores para el efecto pero son generalmente caros y es posible que no
estn disponibles para laboratorios de estudiantes. Por lo tanto en la mayora
M todo* do toparctAn S1
de los experimentos, la muestra es colocada cuidadosamente sobre el papel de

filtro dejando abierto el extremo inferior de la columna hasta cuando el
menisco se encuentre apenas tocando la superficie de la resina. Luego se
conecta el recipiente del solvente, manteniendo un volumen constante de
lquido a fin de asegurar que la presin sobre la columna sea uniforme.
Elucin. El siguiente paso es eluir en orden los materiales de la columna con

un solvente apropiado. En la resolucin por desplazamiento, el solvente
interacta ms fuertemente con el material de cromatografa que con el
compuesto unido a la columna, desplazando por lo tanto las molculas que se
encuentran ligadas al material. Una columna dada tiene lmites con respecto
al material que puede ligar. En el caso de la resolucin por desplazamiento, se
pueden poner muestras hasta del 50% del total de la capacidad de la columna y
la separacin es generalmente buena, pero para mejor resolucin de los picos
se prefiere la resolucin por elucin. En este caso no se aplica a la columna
ms del 10% de su capacidad total. El solvente interacta con la resina ms,
dbilmente que con las molculas del soluto solubilizndolas y eluyndolas
gradualmente de la columna. Esta es quizs la forma ms usada y se pueden
remover las molculas de la columna cambiando el pH, la concentracin
inica o la polaridad del solvente. Esto se puede efectuar simplemente
cambiando el solvente cada vez que uno de los compuestos sale de la columna,
y en este caso, el mtodo se conoce con el nombre de elucin por etapas. Otro
mtodo' consiste en cambiar gradualmente las propiedades del solvente en
forma tal que los compuestos eluyen debido a un incremento en la fuerza
inica, pH o polaridad. Este mtodo se denomina gradiente de elucin y una
de sus ventajas es que se minimiza la estela de los picos (este fenmeno se
discute en la parte correspondiente a la cromatografa de adsorcin). El
gradiente puede hacerse lineal, cncavo o convexo, sim plem ente cambiando
los dimetros de los recipientes (figura 3.10).
Recoleccin y anlisis de las fracciones. El lquido que sale de la columna se

recoge en una serie de tubos, bien sea manualmente o usando un colector
automtico de fracciones (este aparato sirve para recoger automticamente
volmenes o nmero de.gotas iguales en todos los tubos). Se analiza luego
cada fraccin para determinar los compuestos estudiados y se hace un perfil
de elucin colocando en la ordenada la cantidad de compuesto y en la abscisa
el volumen de elucin. El contenido de protena o cido nucleico en cada frac
cin puede medirse continuamente pasando el efluente a travs de la celdilla
de flujo de un espectrofotmetro que mida la absor banda a 280 6 260 nm.
Cromatografa de adsorcin
Es la forma de cromatografa ms antigua que se conoce y fue usada por.
primera vez en 1908 por el botnico ruso, Tswett para la separacin de
Agitador
Bioqumica prctica
Agua
A la columna
NaCI (m ol/I)
Figura 3.10 Elucin de una columna cromatogrfica con un gradiente de concentracin salina creciente
pigmentos vegetales. La tcnica se ech al olvido por muchos aos hasta que
Kuhn y Lederer la usaron para la separacin de cantidades apreciables de
carotenos y xantofilas. Desde entonces la tcnica fue adoptada y usada por los
qumicos.
Los compuestos son adsorbidos en la columna establecindose un
equilibrio entre las molculas unidas al material y aquellas libres en solucin.
La cantidad de molculas unidas depende de la carga, de las fuerzas de Van
der Waals, de las interacciones entre dipolos, de los enlaces hidrgeno, de
factores estricos y tambin de la estructura de los compuestos. La masa de
soluto adsorbido por unidad de peso de adsorbente ( m ) depende de la con
centracin del soluto (c). Langmuir deriv una ecuacin basado en: (a) slo
una monocapa es adsorbida, y (b) slo es adsorbida una proporcin de las
molculas que colisionan. Esto se conoce cmo el isotermo de adsorcin de
Langmuir:
1 + K 2c
K, es el nmero de sitios activos de adsorcin por unidad de peso de

adsorbente y depende d la clase de adsorbente. K 2 mide la afinidad del soluto
por el adsorbente y depende de todos los otros componentes del sistema.
Langmuir supuso slo un sitio de unin, pero en la prctica hay varios en la
superficie del adsorbente, cada uno con diferente afinidad, originando series
de isotermos de Langmuir. Pof esto, Hinshelwood sugiri que la ecuacin
m = _y - - - =
K t K 2c
1 + K 2c
es ms exacta y en verdad se ajusta ms al isotermo de adsorcin de

Freundlich hallado experimentalmente:
m =K c x .
K y x son constantes que dependen del sistema usado.

La diferencia entre estos dos isotermos se ilustra en el grfico (figura3.11).
La mezcla de sitios de unin de diferentes afinidades causa la e s t e l a
observada en el perfil de elucin de los compuestos (figura 3.12). Esta estela
puede evitarse eluyendo con un gradiente adecuado de pH, de fuerza inica o
polaridad, ya que en esos casos las concentraciones bajas de soluto desplazan
las molculas dbilmente unidas y las concentraciones altas las fuertem ente
unidas.
Figura 3.11 Isotermos de adsorcin de Freundlich y de

Langmuir
EXPERIMENTO 3.6 Separacin de pigmentos vegetales en carbonato de calcio

Fundamento
El principio de la cromatografa de adsorcin puede demostrarse sencilla
m ente mediante la separacin de pigmentos vegetales, usando una columna
de carbonato de calcio. Los pigmentos son extrados de pasto mediante
solventes orgnicos y un volumen pequeo del extracto se coloca en un vaso
de precipitados. Luego se coloca verticalm ente en el extracto una barra de tiza
blanca. El lquido sube por la tiza mediante accin capilar y los pigmentos
vegetales aparecen como diversas bandas coloreadas sobre la tiza. La clorofila
es verde, la xantofila amarilla, y los carotenos anaranjados.
Figura 3.12 Estela observada en el perfil de elucin de un

compuesto en una columna de adsorcin
1. Pasto. _ -;v'
2. Morteros con sus manos. 5
3. Tizas blancas. 5
4. Vasos de precipitados (50 mi). 5
5. Acetona o etanol. 100 mi
Mtodo
Con unas tijeras corte el pasto en pequeos pedazos, extraiga luego los
pigmentos moliendo las hojas en un mortero con acetona o etanol. Para
obtener un ipejor resultado prepare un extracto tan concentrado comb sea
posible. Centrifuge o filtre luego el extracto y coloque 5 ml del lquido verd
oscuro en un vaso de precipitados y coloque luego la tiza verticalmente en el
centro. Despus de un intervalo de tiempo adecuado haga un diagrama de la
separacin e identifique las bandas por su color.
EXPERIMENTO 3.7 Separacin de pigmentos de hojas por cromatografa d

adsorcin ,
Fundamento
El principio es semejante al del experimento anterior. El benceno es
altamente txico y debe manejarse ep un extractor de gases y no abierta-
m ente en el laboratorio.
Materiales 10
1. Columnas cromatogrficas (20 cm x 1 cm). 5
2. Hojas de espinacas frescas.
3. Almina. 100 g
4. Carbonato de calcio. 200 g
5. Sacarosa (puede usarse azcar refinada), 200 g
6. Sulfato de sodio (anhidro). 100 g
7. Eter de petrleo (p.e. 60 - 80C). 11
8. Metanol, 500 mi
9. Benceno. 500 mi
10. Licuadoras. 5
Mtodo
Extraccin. Homogenice las hojas en la licuadora, extraiga luego el
homogenizado agitndolo con una mezcla de ter de petrleo, metanol y
benceno (45:15:5). Separe el residuo por filtracin y lave el filtrado cuatro
veces con agua para remover el metanol. Evite agitar vigorosamente, puesto
que se formar una emulsin. Remueva los remanentes de agua aadiendo
sulfato de sodio anhidro, filtre para separar los slidos y concentre el extracto,
mediante evaporacin cuidadosa en un extractor de gases, hasta reducir el
volumen a unos pocos mililitros.
Preparacin de la columna. Humedezca el material de la columna en ter de

petrleo y empaque la columna con almina (5 cm), carbonato de calcio
(7 cm), y sacarosa (7 cm). Coloque un disco de papel de filtro entre cada adsor*
bente. Se puede aplicar succin en el extremo inferior de la columna para
aligerar l empacado. Lave la columna con varios volmenes del amorti
guador usado para la elucin, una mezcla de benceno y ter de petrleo (1:4).
Separacin y elucin de los pigmentos. Cuando el amortiguador haya salido
de la columna y la parte superior de la resina se halle casi completamente
seca, agregue el extracto y elyalo con solvente. Si el flujo es muy lento,
aplique ligera presin sobre la columna. Recoja las fracciones y haga un
grfico del espectro de absorcin de cada pico coloreado.
Cromatografa de intercambio inico

La cromatografa de intercambio inico puede definirse en trminos genera
les como la separacin de compuestos sobre una matriz insoluble que con
tiene iones fcilmente intercambiables con iones del medi que lo rodea.
Matriz de intercambio inico. Adams y Holmes fabricaron el primer
material de intercambio inico en el ao de 1935 condensando fenol, cido sul-
fnico, y formaldehdo hasta obtener una resina insoluble. Posteriormente
se ha preparado n gran nmero de resinas (principalmente a partir de
compuestos aromticos). Un ejemplo de estas matrices es el material que se
obtiene polimerizando divinilbenceno y estireno (figura 3.13). Despus se
introducen los grupos ionizables ligndolos a los anillos aromticos por
medio de una reaccin qumica apropiada. Las cantidades rlativas de divinil
benceno y estireno controlan el grado de entrecruzamiento de las cadenas de
poliestireno y ste, a su vez, determina l capacidad de hidratacin de las
resinas. Todas las resinas de intercambio inico se hinchan cuando se colocan
en contacto con el agua en forma tal que a mayor grado de entrecruzamiertto
de las cadenas, menor es la cantidad de agua recuperada por la resina. El
- C H - C H 2- C H - C H 2- C H - C H 2- C H - C H 2- C H - C H 2-
- c h - c h 2- c h - c h 2- ch- c h 2- chch 2- ch- c h 2-
Flgura 3.13 Matriz de intercambio inico, poliestireno

entrecruzado con divinilbenceno
entrecruzamient puede controlarse cuidadosamente hasta lograr que el

material acte tambin como un tamiz para las molculas que se quieren
separar.
Las resinas de intercambio inico. Son materiales ideales para la sepa
racin de molculas pequeas, tales como aminocidos, pero no son apro
piadas para molculas grandes, tales como protenas, que no pueden penetrar
la estructura finam ente entrecruzada de la resina. Por esta razn, las
macromolculas se separan en celulosas y dextranes sustituidos. Estos son
materiales fibrosos que tienen la mayora de sus grupos funcionales sobre la
superficie.
Grupos ionizables. Los materiales de intercambio inico pueden ser
aninicos o catinicos, dependiendo de su afinidad por los iones negativos o
positivos. Por ejemplo, los materiales de intercambio catinico intercambian
iones positivos; por lo tanto la Carga que poseen los iones intercambiables es la
que decide si un material es aninico o catinico y no la carga que posee la
matriz (figura 3.14).
Estos dos tipos pueden subdividirse en materiales que contienen grupos
+
fuertem ente ionizados, tales como - S 0 3H y - N R 3, y grupos dbilmente
ionizados, tales como -COOH, -O H , y -N H 2. Las resinas de intercambio
inico fuerte se encuentran completamente ionizadas y existen en forma
cargada, excepto en valores extremos de pH: '
- S O 3H + = * - S O 3- + H+
- N R 3OH NR3 + O H '
In te r c a m b ia d o r a m n ic o In te r c a m b ia d o r c a ti n ic o
Iones fijos contra Iones fijos contra

Iones mviles Iones mviles O
O
Figura 3.14 Materiales de intercambio aninico y catinico
'* T T *5 *7-""<- i**-. - " V ? * 3.353*" L.
*.v
^ ' S i
Bioqumica prctica
to # '
Tabla 3.4 Grupos ionizables de algunas celulosas sustituidas
Frmula Grupo ionizable Abreviacin pK

intercom biadores
amnicos
sulfometil SM 2.5
-CH j -SO j H carboximetil GM 1 3.5
- ch 2- cooh fosfo P 6.0
- po 3h 2
intercambiadores
catinicos
/C 2Hs
OILCH2N. dietilaminoetil DEAE 9.5
; nc2h 5 \
/ c 'H5
trietilaminoetil TEAE 10.0
- ch 2- ch 2- n - c2h 5
\ h5
.. Los materiales de intercambio inico dbil, contienen grupos cuya

,,, ionizacin depende del pH, y slo pueden usarse a capacidad mxima en
intervalos estrechos de pH.
COOH + = * -COO + H +
NH3+ 5 = 2 - NH2 + H+
i Como gua general se puede decir que las resinas que contienen grupos
carboxilos tienen una capacidad mxima por encima del pH 6, mientras que
las que poseen grupos amino son efectivas por debajo del pH 6.
Las celulosas de intercambio inico contienen grupos dbilmente
ionizados sustituidos en los OH del polmero. La densidad de estos gru-
pos es baja, puesto qu, de lo contrario, una alta sustitucin dara como
resultado que la celulosa- se hiciera soluble. Los grupos ionizables que se
encuentran com nm nte se dan en la tabla 3.4 con sus abreviaturas
corrientes.
La baja densidad en cuanto a sitios dbilm ente ionizados es conveniente,
ya que materiales de alto peso molecular se unen dbilm ente a ellos y pueden
por lo tanto ser separados sin tener que recurrir a condiciones extremas.
En el ejem plo 3.15 se ilustr la forma tpica
E q u ilib r io d e in te r c a m b i i n ic o .
de funcionamiento de un material de intercambio inico, usando una resina
de intercambio aninico que contiene grupos aminos para separar dos iones
cargados negativam ente X - y Y~ (figura 3.15).
Mtodos de separac i * W
Z ////
. Matriz ' NH. No posee carga a pH atto
'////A
a pH por debajo de 6
Al comienzo Completamente cargado

' 0 - NH: O H- a valores de pH bajos
con OH' dbilmente
asociados actuando
Agregue la mezcla como contraiones
que se va a separar
X" e Y-
Adsorcin
Liga iones mviles X con
NHJX' preferencia sobre los
V iones Y"
Eluya con Cl'
Elucin X' es desplazado por

C f proveniente de
solucin salina
concentrada
Regenere
con lcali
Regeneracin
OH- La resina es regenerada
con lcali
'A
Figura 3.15 Etapas de la cromatografa de intercambio aninico
La Qoncentracin de grupos ionizables presentes en una resina puede ser

hasta de 6 a 10 mol/1; por lo tanto estos materiales tienen una capacidad muy
alta de intercambio.
A pesar de que se cree com nm ente que los materiales de intercambio
inico son monofuncionales, es decir, que slo acta en la separacin el
proceso de intercambio inico, en la prctica ocurre simultneamente algn
efecto de tamiz molecular y de adsorcin. La adsorcin es pequea, pero
algunas veces se puede usar para separar molculas qu poseen propiedades
bastante semejantes.
E l u c i n d e l o s i o n e s l i g a d o s . Los iones que se han unido pueden ser removidos
cambiando el pH del amortiguador. Por ejemplo, a medida qe el pH de una
protena se proxima al punto isoelctrico, la carga total disminuye y la
macromolcula se desliga de la resina. Este proceso permite la separacin de
las macromolculas ya que otras protenas cargadas permanecern unidas a
la resina. Alternativamente, los iones se pueden remover aumentando la

fuerza inica; en este mtodo, las concentraciones altas de iones presentes en
el solvente desplazan los iones unidos a la resina al aumentar la competencia
para los grupos cargados de la misma. El pH o la fuerza inica pueden ser
variados drsticamente cambiando el amortiguador de elucin, o en forma
gradual, usando un gradiente como se indic anteriormente.
Es importante observar que la unin entre iones no es un fenmeno de
todo o nada, sino que implica un equilibrio entre los iones firmemente ligados
a los materiales y aquellos libres en solucin. El grdo de ligamento depende
de la naturaleza de la resina, de la temperatura, de la fuerza inica y de la
composicin del solvente. Para el caso de resinas dbilmente ionizadas, la
captacin de iones depende tambin del grado de ionizacin de la resina y de
los materiales que se quieren separar.
Los cidos y bases dbiles forman sales inestables con resinas de
intercambio inico dbiles, y sales estables con resinas fuertem ente cidas o
bsicas. En la prctica, no son recomendables ninguno de estos dos extremos
puesto que, aun cuando es bueno conseguir que los compuestos se unan a la
resina de intercambio inicd, esto no sera de gran beneficio si no se pueden
separar de ella. Los iones de valencia alta se unen fuertem ente y son los ms
difciles de remover. A continuacin se da el orden de fuerza de unin de
algunos iones: H+< Na+< Mg++ < Al+++ < Th++++. Se usan soluciones diluidas
cuando se quiere reemplazar un ion unido a la resina por uno de mayor
valencia; y soluciones concentradas cuando se introducen iones de menor
valencia.
Preparacin de m ateriales de intercam bio inico. Las resinas y polisacridos
sustituidos se dejan hinchar primero en agua destilada y las partculas
pequeas que flotan se rem ueven tal como se describi anteriormente, las
resinas comerciales, especialmente los intercambiadores catinicos, pueden
contener hierro u otros metales pesados los cuales deben removerse lavando
con cido clorhdrico (2-4 mol/1). -
Los materiales de intercambio inico pueden obtenerse en la forma inica
requerida lavando con la solucin apropiada. Por ejemplo, la forma H+de una
resina de intercambio catinico se obtiene lavando el material con cido
clorhdrico, luego con agua hasta que los lavados tengan un pH neutro.
Igualmente la forma Na+ se prepara lavando la resina con cloruro de sodio o
hidrxido de sodio y luego con agua como se indic anteriormente.
La etapa final antes de preparar la columna consiste en equilibrar por
agitacin el material con el amortiguador que se usa para la elucin. Obvia
mente, el ion presente en el amortiguador no debe tener capacidad de unirse a
la resina.
EXPERIMENTO 3.8 Retencin de cloruro de sodio por una resina de intercam

bio catinico
Mtodos d sparacln 71
Materiales 10
1. Resina fuertem ente cida. 30g
2. Resina dbilmente cida. 30g
3. Cloruro de sodio (10 g/1). 100 mi
4. Hidrxido de sodio (0.1 mol/1). 200 mi
5. Columnas de cromatografa (20 cm x 1 cm). 10
Mtodo
Prepare una columna que contenga 5 g de una resina fuertem ente cida en su
forma hidrogeninica y lave con agua destilada hasta que el pH del efluente
sea el mismo que el del agua destilada. Cuando la parte superior de la resina se
halle casi seca, agregue 10 mi de cloruro de sodio 10 g/1 y deje que la solucin
penetre en la resina. Cuando el menisco se encuentre justam ente encima de
la resina, eluya con agua hasta que se haya recogido un efluente de 50 mi.
Titule el efluente con hidrxido de sodio 0.1 mol/1 y calcule el porcentaje de
iones de sodio intercambiados.
Repita el experimento usando una resina de intercambio inico dbil y
comente sus resultados.
EXPERIMENTO 3.9 Separacin de aminocidos por cromatografa de in ter

cambio inico
Materiales _10
1. Columnas para cromatografa (20 cm x 1.5 cm). 5
2. Resina fuertem ente cida. 30 g
3. Acido clorhdrico (4 mol/1). 11
4. Acido clorhdrico (0.1 mol/1). 41
5. Lana de vidrio.
6. Mezcla de aminocidos. (Disuelva cido asprtico, 10 mg
histidina y lisina en HC1 0.1 mol/1 hasta una con- de cada uno
centracin final de 2 m g/m l),
7. Amortiguador de Tris-HCl (0.2 mol/1, pH 8.5). 3 1
8. Hidrxido de sodio (0.1 mol/1). 21
9. Embudos de separacin (500 mi). 10
10. Amortiguador de acetato (4 mol/1, pH 5.5). 250 mi
11. Reactivo de ninhidrina. (Disuelva 20 g de ninhidrina y j i
3gde hidrindantina en 750 mi de metil celoslve y aada
250 mi de amortiguador de acetato). Preprese fresco y
gurdese en una botella oscura.
12. Metil celosolve. (Etileno glicol monometil ter). 11
13 Etanol (50% v/v). 11
14. Ninhidrina (2 g/1 en acetona). 100 mi
15. Horno a 105 C. 1
I
Mtodo
Preparacin de la columna. Agite suavem ente la resina en HC14 mol/1 hasta
que se hidrate completamente (1530 m l/g de resina seca). Deje sedimentar
la resina y decante el cido. Repita el lavado con HG10.1 mol/1, resuspenda en
esta solucin y prepare la columna como se describi anteriormente.
Elucin de aminocidos. Aplique cuidadosamente 0.2 mi de la mezcla de los
aminocidos en la cima de la columna. Abra el extremo inferior de la colum
na y permita que la mezcla penetre en la resina. Agregue 0.2 mi de HC1 0.1
mol/1, deje que penetre en la resina y repita el proceso dos veces. Finalmente,
aplique 2 mi de HC1 0.1 mol/1 encima de la resina y conecte la columna a un
recipiente que contenga 500 mi de HC1 0.1 mol/1. Ajuste la altura del
recipiente hasta obtener un flujo de aproximadamente 1 m l/m in y recoja un
total de 40 fracciones de 2 mi. Determ ine si hay aminocidos presentes
ensayando grupos de cinco tubos por vez, poniendo una muestra pequea de
cada tubo sobre un papel de filtro, sumrjalo en la solucin de ninhidrina en
acetona y caliente en un horno a 105 C. La presencia de aminocidos se mani
fiesta en forma de manchas azulosas sobre el papel de filtro. Cuando haya
eluido el primer aminocido, remueva el recipiente de HC1 0.1 mol/1 y deje
que el nivel del cido baje justamente hasta la superficie de la resina. Pase 2
mi de amortiguador tris-HCl 0.2 mol/1 (pH 8.5), luego conecte la columna a un
recipiente que contenga este amortiguador y contine la elucin hasta que el
tercr aminocido salga de la columna.
Deteccin de aminocidos. Ajuste el pH de cada tubo a 5, aadiendo upas
pocas gotas de cido o lcali. Agregue 2 ml del reactivo de ninhidrina en
amortiguador y caliente durante 15 min en un bao de agua hirviendo. Enfre
los tubos a temperatura ambiente, agregue 2 mi de 50% v /v de etanol y lea la
extincin a 570 nm despus de dejar reposar los tubos por 10 minutos a
temperatura ambiente. Incluya los blancos y patrones apropiados y haga un
grfico de la cantidad de aminocidos en cada fraccin en funcin del
volumen de elucin.
En qu orden se eluyen los aminocidos y por qu? (tabla 3.5).
Cromatografa de particin
La separacin de compuestos que son fcilmente solubles en lquidos
orgnicos y solo ligeramente solubles en agua se efecta por cromatografa de
Tabla 3.5 Valores de pK y pH a los que s encuentra carga cero para tres aminocidos
Aminocido pK. pK2 P^3 Punto isoinico

cido asprtico 2.0 3.9 10.0 2.9
histidina 1.8 6.0 9.2 7.6
lisina 2.2 9.2 . 10.8 10.0
Mtodo* d Mparacln 73
adsorcin , mientras que los compuestos ionizables hidrosolubles se separan

mejor por cromatografa de intercam bio inico. La cromatografa d e
particin es intermedia entre cromatografa de adsorcin y de intercambio
inico y los compuestos que son a la vez hidrosolubles y solubles en solventes
orgnicos, s separan fcilmente por mtodos de particin.
Cuando se agita un compuesto con dos solventes que no se mezclan, ste s
distribuye en las dos fases; y, en equilibrio, la razn de la concentracin del
compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como el coeficiente de
particin ( a ) .
Concentracin de x en el solvente 1
o = --------------------------------------------------
Concentracin de x en el solvente 2
En la cromatografa de particin uno de los solventes, usualmente el agua,
permanece en la fase estacionaria que consiste en una columna o pelcula de
material inerte. La otra fase consiste en un lquido orgnico mvil, saturado
con agua, que fluye ert relacin con la fase estacionaria. Los componentes de
una mezcla se separan si los coeficientes de particin entre los solventes son
suficientemente diferentes (figura 3.16).
Teora de la cromatografa en papel. La celulosa en forma de hojas de papel
constituye un medio de soporte m uy til, donde el agua es adsorbida entre las
fibras de celulosa y forma la fase hidroflica estacionaria. El uso de papel de
filtro como base de soporte fue demostrado por Consden, Gordon y Martin en
1941 y desde entonces han aparecido numerosos artculos y libros acerca de la
tcnica de la cromatografa en papel.
Figura 3.16 Fundamento de la cromatografa de particin lquido-lquido

La mezcla se aplica sobre el papel, se seca y luego se desarrolla el

crom atogram a dejando que el solvente fluya a lo largo de la hoja. Se m arca el
frente del solvente y despus de secar el papel se visualiza la posicin de los
compuestos presentes en la mezcla m ediante u n a reaccin coloreada. La
razn en tre la distancia que ha migrado un com puesto y la distancia recorrida
por el solvente, se conoce como el valor i2f y es m s o m enos constante para
u n com puesto, sistem a de solventes y clase de papel determ inados bajo
condiciones cuidadosam ente controladas de concentracin de soluto, tem pe
ratu ra y pH (figura 3.17).
El R j est relacionado con el coeficiente de particin a , as:
4, es el rea de la seccin transversal de la fase lquida y A s es igual al rea de

la seccin tranversal de la fase estacionaria.
P ara una serie homologa, un grfico de R m en funcin del nm ero
homlogo da una lnea recta.
Se presentan excepciones a estas ecuaciones cuando la fase estacionaria no

es com pletam ente in erte, pues es posible que ju n to con la particin ocurra
adsorcin y probablem ente intercam bio inico.
Preparacin de la m uestra. Cuando se estn investigando m ateriales
biolgicos es conveniente desalinizar la m u estra antes de la crom atografa y
esto puede hacerse eficientem ente por electrlisis o electrodilisis. El exceso
Figura 3.17 Significado del valor Rt de la crom atografa

en papel
M todo* de separacin 75
de sal origina cromatogramas coi manchas de bordes difusos y cambios en

los valores de R f . Puede tambin afectar la reaccin qumica que se emplea
para detectar los compuestos en la mezcla. Las protenas deben ser removidas
antes de la cromatografa por ultrafitracin o con Sephadex. Se aplica luego
la muestra (10-20 p l) al papel usando una micropipeta.
Seleccin dpi papel. El papel ms frecuentem ente usado para efectos
analticos es el Whatman No. 1. El Whatman 3 MM es un papel grueso y se
emplea preferencialmente para separar grandes cantidades de material; sin
embargo, la resolucin es inferior a la obtenida con Whatman No. 1. Para una
separacin rpida, se recomiendan los papeles Whatman Nos. 4 y 5, aunque en
este caso las manchas no son tan definidas. En cualquiera de los casos, el flujo
es ms rpido en la direccin de la mquina, la cual se anota normalmente en
la caja que contiene el papel. El papel puede impregnarse con una solucin
amortiguadora antes de usarse o puede ser modificado qutnicamente por
acetilacin. Tambin se encuentran en el comercio papeles de intercambio
inico.
Para la separacin de lpidos y otras molculas hidrofbicas, se venden
papeles impregnados en silica.
Seleccin del solvente. La seleccin del solvente, como sucede con la
seleccin del papel, es bastante emprica y depende de la mezcla que se quiere
investigar. Si los compuestos migran hasta muy cerca al frente del solvente A,
es porque son muy solubles, mientras que si se agrupan alrededor del origen
en el solvente B, entonces no son suficientem ente solubles. Se requiere, por lo
tanto, buscar las proporciones adecuadas de A y B para que los R { de los
componentes de la mezcla se distribuyan a todo lo largo del papel. El pH puede
ser tambin importante en una separacin dada, y muchos solventes
contienen cido actico o amonaco para producir un medio fuertemente
cido o bsico.
Revelado. Esencialmente, el aparato consiste en una hoja de papel sostenida
en un marco de tal manera que uno de los extremos est en contacto con un
recipiente que contiene el solvente. Para cromatografa ascendente, el papel
se enrolla en forma de cilindro sostenido con un gancho de oficina (clip) y
luego se introduce verticalmente en el solvente. El conjunto se m ete a un
tanque hermticamente cerrado en el cual se ha colocado papel saturado con
el solvente para producir una atmsfera constante, y el proceso se lleva a cabo
en un cuarto de temperatura constante. Las variaciones en la temperatura
producen migracin dispareja del solvente y pueden alterar los valores R f
(figura 3.18).
La cromatografa descendente. Es conveniente para aquellos compuestos
que tienen un valor de R f semejante, pues el solvente escurre en la parte
inferior del papel produciendo as una m ejor separacin. Es obvio que en
este caso no se pueden medir los valores de R t y las sustancias tienen que
Ascendente Descendente
Figura 3.18 Papel de cromatografa ascendente y descendente
compararse con la migracin de un compuesto patrn tal como glucosa, por

ejemplo, en el caso de los azcares:
Distancia de migracin del compuesto x
R e --------------------------------------
------------------
Distancia de migracin de la glucosa
La cromatografa ascendente. Se usa ms frecuentem ente y tiene la ven
taja de que la separcin puede hacerse en dos dimensiones. La mezcla se
separa con el primer solvente, que debe ser voltil, luego se deja secar, se
gira el papel 90 y se hace la separacin con el segundo solvente. Despus de
localizar los compuestos se obtiene un mapa y los componentes se identifican
comparando su posicin con la de un mapa de compuestos conocidos dsarro-
llados en las mismas condiciones (figura 3.19).
Deteccin de los compuestos. La mayora de los compuestos son incoloros y
slo se pueden visualizar mediante la ayuda d reactivos especficos. El
reactivo de coloracin se disuelve en un solvente voltil y se aplica rociando el
papel o sumergindolo rpidamente en la solucin. Tambin se usa la luz
Ultravioleta para visualizar algunos compuestos ya que unos la absorben
fuertemente, y por lo tanto aparecen como manchas oscuras, mientras otros
muestran una fluorescencia caracterstica bajo su irradiacin.
EXPERIMENTO 3.10 Identificacin de azcar en la leche por cromatografa de

papel
Fundamento
La leche es desproteinizada con cido tricloroactico, centrifugada y el sobre
nadante se usa para cromatografa. La mezcla anilina-difenilamina usada
Mtodo de epwctn tt
Solvente 1
A p liq u e la m u estra
Figura 3.19 Separacin de una mezcla por cromatografa de papel en

dos dimensiones
para detectar azcares, da diversos colores con la m ayora de ellos, lo cual
perm ite su identificacin.
Materiales 10
1. Equipos para crom atografa descendente. 5
2. Papel de crom atografa W hatm an No. 1. 10 hojas
3. Solvente para crom atografa (isopropanohagua, 4:1). 31 - . '
4. Reactivo de identificacin aniina-difenilam ina. (P rep
rese fresco mezclando 5 volm enes de anilina 10 g/1 y 5
yolm entes de difenilam ina 10 g/1 en acetona con un
volum en de cido fosfrico 85%. Cuidado: txico!).
5. Hornos a 100 Q. . . . 3
6. Soluciones patrones de azcares (10 g/1 en isopropanol 10 mi
10% v/v). Ramnosa, lactosa, ribosa, cido glucurnico,
xilosa, glucosamina, fructosa, glucosa.
7. Secadores de pelo o abanicos industrales. 5
8. Atomizadores. 3
9. Leche. / 50 mi
10. Acido tricloroactico (100 g/1). 50.mi
Mtodo
Desproteinizacin. Mezcle 2 mi de leche y 3 mi de agua destilada, agite
fuertemente, agregue 5 mi de cido tricloroactico (100 g/1) y mezcle. Deje
reposar durante unos pocos minutos, remueva el precipitado por centrifuga
cin y use el sobrenadante para cromatografa.
Cromatografa. Tome dos hojas de papel de cromatografa Whatman No. 1 y
trace una raya de aproximadamente 8 cm del borde del papel. A una de
las hdjas aplique sobre la lnea las siguientes muestras a intervalos de aproxi
madamente 4 cm y djelas secar bajo una corriente de aire caliente.
1. 5 jul lactosa.
2. 10 julde extracto de leche.
3. lOjullactosa (10 g/1).
4. 10 pide extracto de leche + 5 pl de lactosa (10 g/1).
5. 5 pl glucosa (10 g/1).
6. 5 pl galactosa (10 g/1).
Aplique soluciones patrones sobre la otra hoja y corte los extremos del
papel en forma dentada para facilitar que el solvente escurra de la hoja
(figura 3.18). Deje que el solvente fluya de un da para otro a lo largo del papel
y a la maana siguiente colquelo en una cmara extractora de gases, squelo
con una corriente de aire fro y visualice las manchas atomizando el papel con
una solucin de anilina-difenilamina recientemente preparada. Retrelo de la
cmara y calintelo brevemente a 100 C. Mida las distancias de migracin de
los azcares a partir del origen y determine los valores de R g.
Adems, se sugiere incluir una mezcla problema de dos o tres azcares
junto con el extracto de leche.
EXPERIMENTO 3.11 Separacin de aminocidos por cromatografa de papel en

dos dim ensiones
Fundamento
Para los experimentos siguientes con aminocidos y protenas se prepara un
mapa en dos dimensiones de las soluciones patrones de aminocidos. La
ninhidrina reacciona con todos los a-aminocidos dando un color prpura.
Algunos otros compuestos tambin reaccionan y entre ellos se encuentran
las aminas alifticas primarias y secundarias y algunos compuestos no
aromticos heterocclicos de nitrgeno. Los aminocidos, prolina e hidroxi-
prolina reaccionan dando una coloracin amarilla.
Materiales JO
1. Equipos-para cromatografa en dos dimensiones. 5
2. Papel de cromatografa Whatman No. 1 (20 cm x 20 cm). 30
3. Solvente 1. (Butanol:cido actico glacialragua, 12:3:5). 41
4. Solvente 2. (Fenol-agua). En un frasco mezcle 500 g de 2500 g
fenol con 125 mi de agua, tape y deje reposar de un da

para otro. Precaucin: el fenol produce quemaduras en la
piel. Antes de usarse agregue al solvente unas pocas gotas
de amonaco 0.88 y mezcle bien.
5. Reactivo de ninhidrina (disuelva 0.2 g en 100 mi de
acetona antes de usarse).
6. Hornos a 105 C. 5
7. Patrones de aminocidos. Prepare volmenes pequeos 10 mi
de soluciones de 10 g/1 en isopropanol 10% v/v. Algunas
veces se necesita una gota de cido o lcali para disolver
el compuesto. Alanina, cido asprtico, cistena-HCl,
cistina, cido glutmico, glicina, histidina-HCl, hidroxi-
prolina, leucina, isoleucina, lisina-HCl, metlonina,
ornitina-HCl, fenilalanina, prolina, serina, treonina,
triptfano, tirosina y valina.
Mtodo
Examine el mapa de aminocidos suministrado (figura 3.20), escoja cuatro
cuyo valor R { difiera bstante, y en un extremo de la hoja de papel de
cromatografa Whatman No. 1 aplique 20 pl de cada uno. Seque las manchas
en una corriente de aire y coloque la hoja en el soporte metlico. Repita este
Leu
O lleu
Val
o Fen ala
Met
O 1'
O Tir
O Aia
Glu o Tre
o Pro
O Hid pro
^ 9o
Asp 0^5
Gly
o Acido cisteico
His
-------- Fepol/agua/amonaco
Figura 3.20 Separacin en dos dimensiones de una mezcla

de aminocidos usando papel Whatman No. 1
i'
' enKwar"
V
' 1\
procedimiento en hojas diferentes hasta que se hayan aplicado todos los

aminocidos y finalm ente aplique una mezcla de todos ellos en otro papl.
Cada aminocido debe incluirse en dos mezclas, diferentes para confirmar su
identidad.
Sumerja en el solvente el extremo del papel adyacente a la m anchad la
mezcla y deje correr la cromatografa durante la mayor parte del da. Por la
tarde saque el soporte, colquelo en el extractor de gases y seque el papel er
una corriente de aire fro. Gire el soporte 90 en forma tal que el otro borde
cercano a la muestra se sumerja en el segundo solvente y deje correr el
cromatograma de un da para otro (figura 3.19). Seque los papeles como se
indic y seprelos del soporte. Rpidamente sumerja cada papel en reactivo
de nirthidrina y culguelos en el extractor de gases para dejar evaporar la
acetona. Desarrolle los colores calentando a 105 C durante 2-3 minutos.
Construya un mapa de aminocidos y comprelo con el de la figura 3.20.
Cromatografa en capa fina

Izmailov y Schraiber describieron en 1938 la separacin de extractos de
plantas por cromatografa de capa fina en almina. Pero solamente 20 aos
despus se comenz a vender el equipo para la preparacin de las placas.
La separacin de los compuestos en capa fina es sem ejante eh muchos
aspectos a la cromatografa en papel, pero tiene la ventaja adicional que se
pueden usar medios diferentes de soporte y an mezclas de los mismos. Se
pueden tambin incluir reactivos fluorescentes en el medio para ayudar a la
identificacin de las manchas. La separacin puede hacerse por adsorcin,
intercambio inico, cromatografa de particin o filtracin en gel, dependien
do de la naturaleza del medio empleado. El mtodo es rpido y se pueden
completar varias separaciones en una hora. Las manchas obtenidas son muy
compactas y es posible por lo tanto detectar compuestos en concentraciones
ms bajas que sobre papel. Adems los compuestos separados por cromato
grafa en capa fina pueden detectarse usando materiales corrosivos y elevadas
temperaturas, lo cual no es posible con papel.
P r e p a r a c i n d e l a s l m i n a s d e c a p a f i n a . Para la mayora de las separaciones
se considera apropiado que la capa tenga un espesor de 250 jum. Espesores por
debajo de 200 p m afectan el valor R { . En el comercio se encuentran aparatos
para preparar las lminas que si se usan cuidadosamente pueden producir
capas muy parejas, del espesor deseado. Algunas veces se incluye sulfato de
calcio en el adsorbente para fijar la capa a la lmina de vidrio y en este caso se
aconseja trabajar rpidamente una vez que el adsorbente se mezcle con agua.
El material de capa fina depende de la mezcla qu se estudie, pero se ha
comprobado que el gel de silica es muy til para la separacin de una .gran
cantidad de compuestos.
D e s a r r o l l o . Es necesario que la atmsfera de la cmara de. separacin est
completamente saturada. De otra forma los valores R f cambian considera-
blemente de un tanque a otro. Esto puede hacerse Usando un tanque tan

pequeo como sea posible y cubriendo las paredes con papel empapado en el
solvente. El desarrollo de la placa se hace generalmente por la tcnica ascen
dente y es muy rpido.
Localizacin. Los compuestos se localizan tal como en el caso de la cromato
grafa de papel por atomizacin con el reactivo apropiado o mediante rastreo
(scanning), en el caso de las sustancias radioactivas.
EXPERIMENTO 3.12 Identificacin de azcares en jugos de frutas usando

cromatografa de capa fina
Materiales 10
1. Lmina de silica gel G para capa fina(prepare una 10
suspensin de silica gel G en acetato de sodio 0.02 mol/1
y prepare las lminas de 250 jum de espesor. Actvelas
antes de usarlas calentndolas a 105 C por 30 min).
2. Cmaras de separacin. 5
3. Solvente (acetato de etilo:isopropanol:agua:piridina, 5 veces el
26:14:7:2). volumen
del tanque
4. Jugos de frutas frescas(limn, naranja, toronja, pia). 5mi
5. Alcohol absoluto. 100mi
6. Reactivo de identificacin como en el experimento 3.10.
7. Hornos a 105 C. , 3
8. Secadores de pelo. 5
9. Atomizadores. 5
10. Soluciones patrones de azcares como en el experi-
ment 3.10.
Mtodo
A 1 mi de jugo de fruta agregue 3 mi de etanol y centrifugue para remover la
protena desnaturalizada. Aplique cuidadosamente alcuotas m uy pequeas
del sobrenadante sobre una lmina de cromatografa junto con algunas de las
soluciones patrones de azcares. Coloque la lmina en una cmara que
contenga solvente en el fondo y que haya sido saturada previamente;
desarrolle la lmina hasta cuando el frente del solvente haya migrado casi
hasta el extremo. Marque con una lnea de lado a lado el frente de migracin
del solvente, seque la lmina en una corriente de aire seco y localice los
azcares tal como en el experim ento 3.10. Observe el color de cada patrn y v
selo junto con el valor R g para identificar los azcares presentes en los jugos
de frutas.
-V ................... \ **ytr*9y , ., , V
\tn n
EXPERIMENTO 3.13 Separacin de lpidos por cromatografa en capa fina

Fundamento
Los lpidos en los materiales biolgicos se hallan formando una mezcla
compleja y deben primero fraccionarse mediante extracciones con solventes.
La separacin de los compuestos presentes en cada grupo puede hacerse por
cromatografa en capa fina. El solvente se selecciona de acuerdo a los lpidos
que se investigan, pero, generalm ente, los lpidos neutros se separan con
solventes no polares y los lpidos cargados con solventes-polares. Existen
varios medios de soporte para el fraccionamiento de los lpidos y la
escogencia del adsorbente depende del grupo de lpido y del solvente que se
emplee. El gel de silica se ha usado extensam ente y la- separacin en este,
material se efecta no solo por adsorcin sino por particin.
En los experimentos siguientes se separan los lpidos en varios grupos de
acuerdo a su polaridad y de cada grupo se incluyen ejemplos como patrones
representativos. Algunos aceites y grasas de comn ocurrencia en la natura
leza son estudiados para examinar si contienen las clases de lpidos considera
dos.
Materiales 10
1. Lminas de silica gel G para capa fina. 10
2. Cmaras de separacin. 5
3. Solvente (ter de petrleo, p.e. 60-70 C:dietilter: 5 veces la
cido actico glacial, 80:20:1). capacidad
del tanque
4. Hidrocarburos (n-hexadecano y n-octadecano). 5 mi
5. Esteres de colesterol (acetato de colesterl, oleato de 5 mi
colesterol y estearato de colesterol).
6. Esteres de vitamina A (palmitato de vitamina A) 5 mi
7. Triacilgliceroles (trioleato de glicerol, triestearato de 5 mi
glicerol y tripalmitato de glicerol).
8. Acidos grasos libres (cido oleico, cido palmtico y 5 mi
cido esterico).
9. Esterles (colesterol). 5 mi
10. Aceites naturales (aceite de oliva y aceite de hgado 5 mi
de bacalao.)
11. 2', 7'-Diclrofluorescena (2 g/1 en 95% etanol v/v). 200 mi
12. Acido sulfrico (50% v/v). 200 mi
13. Hornos a 110 C. 3
14. Lmparas ultravioletas. 3
Mtodo
Limpie las lminas de vidrio con etanol, luego extienda el gel hasta obtener
una superficie de 250 Mm de espesor. Active las lminas calentando a 110 C
por 1 h y deje enfriar. Teniendo cuidado que las manchas no se extiendan
*v;
* | * * , ,
-
f <
v ,
Mtodos de separacin 83 -
mucho, coloque 20-50 jul de una solucin de cada lpido aproximadamente 1%

p /v, y deje que el solvente corra a lo largo de la placa como se indic anterior
mente. Deje secar, localice los lpidos por atomizacin con la solucin de
diclorofluorescena y exam ine las placas bajo la lmpara de luz ultravioleta
(270 nm). Los lpidos aparecen como manchas verdes fluorescentes mientras
que el resto de la placa permanece oscura. Las manchas pueden tambin
visualizarse rociando las placas con cido sulfrico 50% v /v y calentando el
horno a 110 C durante 10 min. Debe tenerse mucho cuidado con el cido
sulfrico.
En qu orden se separan los lpidos y por qu?
'
ELECTROFORESIS
Teora
Muchas molculas biolgicas poseen carga elctrica, la magnitud de la cual
depende de la molcula, del pH y de la composicin del medio en que se halle.
Si a una solucin de molculas cargadas se le aplica un campo elctrico, las
molculas migran a los electrodos de polaridad opuesta. Este principio se usa
en electroforesis para separar molculas que poseen cargas diferentes.
Si una molcula de carga q se encuentra en un campo elctrico de fuerza x ,
entonces la fuerza que causa la aceleracin de la partcula es q x . Esta fuerza
es contrarrestada por la resistencia friccional / dando una velocidad total v :
q x = fv .
Aplicando las leyes de Stokes para una molcula esfrica de radio r que se
mueve a travs de un medio de viscosidad r , tenemos,
f = Q ir r r .
A partir de estas ecuaciones se obtiene:

q x = & tr r r v .
La movilidad electrofortica v de una molcula se define como la migra

cin por unidad de campo de fuerza, as que,
v = v /x = q /G n r jr ,
Por consiguiente, la movilidad de las molculas depende de la viscosidad

del medio ( V ), del tamao, de la forma ( r ) y de la carga de la molcula (q).
La movilidad electrofortica depende principalmente de los grupos
ionizables presentes en la superficie de la partcula, y el signo y la magnitud de
la carga que poseen los grupos ionizables dependen de la fuerza inica y del
pH del medio. Por lo tanto la separacin ptima de las molculas se puede
efectuar seleccionando condiciones apropiadas:
Prctica
Electroforesis de fren te mvil. Esta tcnica fue usada por primera vez hace
aproximadamente 40 aos por el bioqumico sueco Tiselius. La solucin de
protena es dializada primero en contra de una solucin amortiguadora y
luego se coloca en un tubo en U cubriendo cuidadosamente ambas ramas con
amortiguador en forma tal que la interfase entre el amortiguador y la
solucin de protena quede perfectamente definida. Se lleva a cabo la
lectroforesis y se sigue el movimiento de las protenas hacia las dos interfases
examinando el ndice de refraccin de la solucin. El mtodo de Tiselius es
especialmente valioso cuando se trata de examinar las diferencias en
movilidad de las protenas, producidas por cambios en las propiedades fsicas
del medio, pero no se puede obtener separacin completa de las protenas
puesto que la migracin de las bandas se ve afectada por la conveccin y por la
gravedad.
Electroforesis de zona. El efecto de conveccin puede reducirse a un mnimo
si la electroforesis se efecta usando un medio de soporte impregnado con
solucin amortiguadora. Con este mtodo se puede obtener separacin
completa de una mezcla en zonas bien definidas y por lo tanto esta tcnica ha
reemplazado al mtodo clsico de electroforesis libre. Algunos de los medios
de soporte ms usados se consideran a continuacin.
Papel. El papel de filtro es barato y fcil de usar y constituye un medio
aceptable para esta clase de experimentos. Fue el primer material usado, pero
ha sido ampliamente reemplazado por otros mtodos de soporte. La principal
desventaja del papel es que la celulosa puede adsorber las molculas produ
ciendo bandas no definidas.
Acetato de celulosa. Este material presenta adsorcin mnima y permite
una clara separacin de las bandas; por lo tanto, los compuestos pueden
eluirse de las tiras con una recuperacin bastante alta. Se necesitan muy
pocas cantidades de material para la separacin y esta puede hacerse en solo
una hora comparada con ms de doce horas necesarias para electroferesis de
papel. El acetato de celulosa es, sin embargo, un poco ms caro que el papel.
Gel de Agar. Este medio es transparente, por lo cual puede usarse cuando se
requieren determinaciones fotomtricas. El agar es el material preferido
para inmunoelectroforesis, y en este caso se prepara en lminas de microsco
pio. el agar es barato y fcil de conseguir.
Gel de almidn. Los granos de almidn se hinchan en agua al calentarlos y se
hidrolizan parcialmente formando un gel. El tamao del gel depende de la
forma de preparacin, del almidn, del pH y de la clase de solucin

amortiguadora. El dimetro de los poros del gel de almidn es tal que las
molculas se separan no slo en base a su carga, sino a su tamao. Este efecto
de ultrafiltracin permite una mejor separacin de mezclas complejas hasta
el punto tal, que las protenas del plasma pueden separarse en gran nmero
de bandas. Sin embargo, se usan cantidades ms grandes de gel que en el caso
del agar y la preparacin de un buen gel requiere cierta prctica. Para obtener
resultados reproducibles, es conveniente preparar el gel a partir de almidn
parcialmente hidrolizado el cual puede obtenerse comercialmente. (Starch-
hydrolized, Connaught Laboratories, Toronto.) Sin embargo, si se usa este
material es muy difcil eluir los compuestos y las bandas deben localizarse
tiendo cortes del gel.
Granos de almidn. Este medio se prepara usando un molde en el cual se
comprimen granos completos de almidn en solucin amortiguadora. Por
este medio pueden ser separadas molculas grandes que no migran en el gel
de almidn. Este mtodo de electroforesis es ideal para trabajos en que la
muestra es muy grande como en la separacin y purificacin de isoenzimas.
Gel de poliacrilamida. Recientemente se ha popularizado el uso de este
material para electroforesis. Tiene la ventaja sobre el gel de almidn de ser
transparente y por lo tanto puede examinarse por medio de luz visible o ultra
violeta. Adems, dado que es posible controlar el tamao de los poros, la
separacin se hace en base no solo a la carga sino al tamao y la forma de las
molculas y as se puede obtener una mejor resolucin.
Solucin amortiguadora. El medio de suspensin debe seleccionarse cuida
dosamente pues algunos iones de la solucin amortiguadora reaccionan con
los compuestos que se estudian; por ejemplo el borato forma complejos con los
azcares.
La seleccin del pH depende de la sustancia a investigarse, pero usual
m ente se obtiene mxima separacin en el punto isoelctrico de uno de los
compuestos. El pH escogido no debe ocasionar cambios qumicos o desnatu
ralizacin de las molculas que se estudian.
La fuerza inica del amortiguador debe estar en el intervalo de 0.05-0.15 y
es una transaccin entre dos extremos. A fuerzas inicas bajas hay migracin
rpida y poca produccin de calor pero ocurre marcada difusin. Por otra
parte, a fuerzas inicas altas se obtienen bandas bien definidas, pero hay una
mayor produccin de calor y la migracin es menor.
Campo elctrico. Se necesita una fuente de poder que origine un voltaje o
corriente constante. Un campo elctrico de 2 a 8 V /cm de longitud se considera
adecuado para la mayora de las separaciones a temperatura ambiente. Si la
fuerza del campo es may or de 10 V/cm , el efecto del calor es tal, que se produ
ce una evaporacin excesiva de agua. Por consiguiente, habr un flujo del
amortiguador del tanque para reemplazar el agua perdida, originando un
desplazamiento de las bandas. Si el calor es excesivo, los compuestos pueden

desnaturalizarse. Existen mtodos para enfriamiento del medio de separa
cin que permiten usar hasta 100 V/cm; pero para trabajar a voltajes tan altos
se necesita un equipo especial con aditamentos a prueba de errores. La
ventaja de la electroforesis de alto voltaje es que la separacin se efecta muy
rpido. Ordinariamente los compuestos de peso molecular bajo adolecen de
un exceso de difusin y el mejor medio de separarlos es por electroforesis de
alto voltaje. Los aminocidos y pptidos de hidrolizados de protena pueden
separarse rpidamente bajo estas condiciones obtenindose manchas com
pactas comparables con las que se logran en papel.
Aparato de electroforesis. El aparato de electroforesis consta de un medio de
separacin conectado por un papel de filtro o un pedazo de gasa a dos tanques
que contienen los electrodos. Los tanques estn separados en dos comparti
mientos conectados por lana de algodn o pabilos de asbesto; una parte
contiene el electrodo de platino y la otra est en contacto con el medio de
electroforesis. En la regin de los electrodos ocurren cambios en el pH aun
usando soluciones amortiguadoras, y la divisin de los tanques en los dos
compartimientos minimiza los cambios en la fase contigua a la del soporte. La
conexin entre esta fase y la solucin amortiguadora se hace por varias capas
de papel Whatman 3 MM o gasa de hospital saturada con solucin amortigua
dora. La conexin debe hacerse en forma tal, que se produzca una cada de
potencial mnima a travs de ella. En la figura 3.21 se muestra un diagrama de
un tanque modelo para separacin horizontal.
EXPERIMENTO 3.14 Separacin de aminocidos por electroforesis en papel

Fundamento
La carga de una molcula depende del pH del medio y esto se demuestra para
el caso de tres aminocidos: cido asprtico, histidina y lisina. Debido a la
difusin que se produce, la electroforesis a bajo voltaje no se usa generalmen
te para separar compuestos de bajo peso molecular, pero la usamos aqu, pues
Figura 3.21 Aparato para electroforesis en un plano

horizontal
Mtodos do separacin 97
es ms fcil ilustrar la relacin entre carga y pH con aminocidos que con;

protenas u otras macromolculas.
A pH 7.6 la histidina tiene carga 'total cero, el cido asprtico estar
cargado negativamente y la lisina tendr una carga positiva (tabla 3.5).
nh ;
1-------j-CH2-CH-COCT COO" NH+
3
j
HNv^N ch 2 ( h 2)4
j
ch - n h ; CH-NH3
OO' OO"
Aminocido: histidina Acido asprtico Lisina
Carga a pH 7.6: 0 +
Por lo tanto estos tres aminocidos pueden ser separados fcilmente por
electroforesis. En la mezcla se incluye una molcula no cargada tal como
glucosa para verificar si hay movimiento de molculas debido a electro-
osmosis.
Materiales O
1. Aparatos de electroforesis horizontal. 5
2. Fuentes de poder. 5
3. Aminocidos (cido asprtico, histidina, lisina, y una 10 mi
mezcla de los tres en amortiguador de tris-acetato que
contenga 10 g/1 de glucosa).
4. Amortiguador de tris-acetato (0.07 mol/1, pH 7.6). 5 veces la
capacidad
del tanque
5. Reactivo de ninhidrina. (Disuelva 0.2 g en 100 mi de
acetona antes de usarse.)
6. Tiras de papel (10 cm x 2.5 cm). 60
7. Reactivo de anilina-difenilamina tal como en el experi-
ment 3.10.
8. Amortiguador de citrato (0.07 mol/1, pH 3.0). 5 veces la
capacidad
del tanque
9. Hornos a 110 C. 5
Mtodo
Llene hasta el mismo nivel las dos partes de los compartimientos de los
electrodos con solucin amortiguadora; verifique si estn nivelados comuni
cndolos mediante un sifn. Remueva el sifn, coloque 5 tiras de papel de
filtro como se muestra en la figura 3.21 y a dos de ellas aplique
cuidadosamente en una banda delgada un poco de la mezcla de aminocidos
evitando tocar el borde del papel. Aplique a cada una de las otras tres tiras de
papel una solucin diferente de un aminocido y proceda a efectuar la
electroforesis para las cinco tiras juntas. Moje los extremos de las tiras de
papel y deje que el resto se humedezca por accin capilar. Inmediatamente
conecte la corriente. En esta forma la muestra no se extiende mucho. Deje
transcurrir la electroforesis durante 3 h a 8 V/cm , retire las tiras y seque en un
horno a 110 C. Coloree una de las tiras que contiene glucosa en la forma
indicada en el experimento 3.10 y sumerja rpidamente las cuatro tiras
restantes en solucin de ninhidrina fresca. Deje que se evapore al aire la
acetona y caliente en el horno durante 10 minutos hasta que aparezca el color.
Identifique los aminocidos examinando si se ha producido electro-osmosis.
Repita el experimento con amortiguador de citrato 0.07 mol/1, pH 3.0 y
explique los resultados usando los datos que se han dado en la tabla 3.5.
EXPERIMENTO 3.15 Separacin de protenas sricas por electroforesis en

acetato de celulosa.
Fundamento
La electroforesis es muy usada en medicina y bioqumica clnica, especial
mente para medir cambior ocurridos en las protenas sricas a causa de las
enfermedades. La electroforesis en acetato de celulosa, que se ilustra en el
siguiente experimento, es un mtodo rpido y apropiado para el efecto.
Materiales 10
1. Aparatos para electroforesis horizontal. 5
2. Fuentes de poder. 5
3. Amortiguadores de barbitona (0.07 mol/1, pH 8.6). 5 veces la
capacidad
del tanque
4. Colorante para protena Ponceau S (2 g/1 en TCA 21
30 g/1).
5. Acido actico (5% v/v). 21
6. Suero. 5 mi
7. Tiras de acetato de celulosa (Oxoid Ltd.) 10
8. Papel Whatman 3 MM. ^ 10
9. Metanolragua (3:2). 50 mi
10. Amortiguador de citrato (0.1 mol/1, pH 6.8). 20 mi
Mtodo
Humedezca una tira de acetato de celulosa (10 cm x 2.5 cm) dejndola flotar
sobre la superficie del amortiguador y permitiendo que el amortiguador sea
absorbido por debajo. Sumerja completamente la tira agitando suavemente
el recipiente del amortiguador. Retrela usando forceps. Seque ligeramente la
tira, colquela en el aparato cuidando de que sus extremos se hallen dentro
del amortiguador y que ste cubra los electrodos. Si la tira no se halla com
pletamente sumergida, conctela al compartimiento del amortiguador por
medio de un trozo de papel de filtro. Deje circular la corriente durante 10 mi
nutos y aj stela a 0.4 mA por centmetro de ancho de la tira. Desconecte la
corriente y usando una pipeta graduada en microlitros, o un tubo capilar,
aplique sobre la tira una franja de suero a 3 cm del extremo del ctodo. La
forma ms fcil de hacerlo es guiando la pipeta o el tubo con una regla
colocada encima del tanque. Vuelva a conectar el aparato.
Efecte la electroforesis durante 1V2 2 h, retire las tiras, talas con
Ponceau S por 10 min. No es necesario calentar las tiras previamente puesto
que el TCA fija las protenas para su coloracin. Retire el exceso de colorante
lavando varias veces las tiras con cido actico 5% v/v. Compare su patrn
electrofortico con el que se muestra en la figura 3.22.
Repita el experimento despus de precipitar algunas de las protenas con
metanol helado. Todos los pasos deben efectuarse a 0o C. En un tubo de
centrfuga mezcle 2 mi de plasma con 1 mi de amortiguador de citrato.
Agregue lentamente 7 mi de la mezcla metanol-agua helada agitando perma
nentemente. Deje la mezcla sobre hielo durante 30 minutos y luego centrifu
gue a 3000 g durante 10 m inutos en una centrifuga refrigerada. Separe el
sobrenadante y disuelva el precipitado en 1-2 mi de solucin salina. Haga la
electroforesis del precipitado disuelto y del sobrenadante y analice sus
resultados.
EXPERIMENTO 3.16 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Fundamento
Poliacrilamida. El gel se prepara polimerizando acrilamida (CH2 = CH*CO*
NH2) y una pequea cantidad de reactivo de entrecruzamiento, metilenobi-
sacrilamida (CH2 = CH CO NH2) CH2, en presencia del catalizador,
persulfato de amonio. Se incluye tambin tetrametiletilenodiamina (TE
MED) para iniciar y controlar la polimerizacin. Se deja polimerizar la
Origen
Albmina i Globulinas . ....... \

ai j 0, P2 y
Figura 3.22 Separacin de protenas sricas humanas por
electroforesis en acetato de celulosa a pH 8.6
4
mezcla en un tubo sellado en su extremo inferior por n tapn de caucho.

Luego se coloca un poco de agua encima del gel para asegurar la obtencin de
una superficie plana y tambin para excluir el oxgeno que inhibe la polime
rizacin.
El tamao del poro del gel puede variarse de acuerdo a la concentracin
del monmero en la solucin. ,Las protenas pueden separarse conveniente
mente en acrilamida, 7.5%, pero molculas ms grandes como las del cido
nucleico ribosomal requieren n gel ms poroso de acrilamida al 2.5%.
A p a r a t o . En la figura 3.23 se muestra una representacin esquemtica del
aparato usado para electroforesis en barras de gel de poliacrilamida; para
efectos de claridad se muestran solo dos barras. El gel de empaquetamiento
es de un tamao de poro grande para concentrar la muestra, la cual queda
entre el gel de separacin formando una banda compacta. JSn el gel de separa
cin, la movilidad electrofortica del in glicinato es bastante menor que l
del in cloruro, por lo tanto se m antiene un lm ite definido entre estos dos
iones y las protenas de movilidad intermedia se encuentran atrapadas entre
los dos. Este lmite se m antiene a travs de la electroforesis al pH del gel de
separacin (pH 8.9), la movilidad de la glicina es mayor que la de la protena y
por tanto el frente del amortiguador migra siempre ms rpido que las
molculas que se separan. E uno de los geles se incluye azul de bromofenol
como marcador y este colorante indica el lm ite entre los iones glicinato y
Amortiguador del
electrodo tris-glicina
Q C Q / h ^ V pH 8.3
Gel de empaquetamiento
o espaciador
Gel de separacin
preparado en
amortiguador tris-HCI
pH 8.9
Superficie del
amortiguador del
electrodo
Extremo inferior del

gel polimerizado
Figura 3.23 Aparato para electroforesis en barras de gel de

poliacrilamida
Mtodos d separacin 91
cloruro. Por lo tanto, el sistema amortiguador es discontinuo y ha dado lugar a

que este mtodo se llame tambin electroforesis de disco. Este mtodo de
electroforesis origina bandas muy definidas, tal como se puede apreciar en el
experimento siguiente.
Toxicidad. Como se indica en las botellas la acrilamida es txica y debe

manejarse con cuidado, evitando especialmente el contacto con la piel.
Materiales 10
Soluciones primarias. Prepare todas las soluciones excepto A
y B en matraces volumtricas de 100 mi con agua destilada,
filtre y almacene en botellas oscuras a 4o C.
A. Amortiguador tris (solucin primaria), tris, 6 g; glicina, 11
28.8 g; complete con agua hasta 1 l(pH 8.3).
B. Amortiguador tris: (Solucin de trabajo), diluya la 41
solucin primaria 1 a 10 con agua destilada.
C. Tris 36.6 g; 48 mi de HC11 mol/1, TEMED, 0.23 mi y 100 mi
agua hasta 100 ml (pH 8.9).
D. Tris, 6.0 g; 48 mi de HC1 1 mol/1; TEMED, 0.46 mi; 100 mi
complete con agua hasta 100 mi (ajuste el pH a 6.7
usando HC1 si es necesario).
E. Acrilamida, 28 g; bis, 0.74 g; complete con agua hasta , 100 mi
100 mi.
F. Acrilamida, 10 g; bis, 2.5 g y agua hasta 100 mi. . 100 mi
G. Riboflavina, 4 g, complete con agua hasta 100 mi. 100 mi
H. Sacarosa (40 g/100 m i). 100 mi
J. Persulfato de amorjio (0.14 g/100 mi). 100 mi
Soluciones de trabajo. Prepare estas soluciones mezclando las
anteriores en las siguientes proporciones:
(i) Solucin para poros pequeos: 1 parte de A, 2 partes de D 40 mi
y 1 parte de agua, pH 8.9.
(ii) Solucin para poro grande: 1 parte de C, 2 partes de E, 16 mi
1 parte de F y 4 partes de G, pH 6.7.
Muestras.
Suero: albmina 5 mg/ml; 7-globulina, 2 m g/m l 2 mi cada
transferrina, 2 m g/m l. uno
Colorantes.
Negro de amido, 1 g/1 en cido actico 7% v /v . 500 mi
Azul de Coomassie 2.5 g /l en 200 g/1 TCA. 500 mi
Acido actico 7% v /v . ' 3 1
Colorante marcador (azul de bromofenol, 0.1 g/1).
E q u ip o .
Aparatos de electroforesis en gel para cilindros de poliacri- 5
lamida.
Lmpara de luz fluorescente. 5
Jeringas y agujas. 5
Mtodo
Coloque tapones de caucho en el extremo inferior de tubos de vidrio huecos y
prepare los geles como se indic anteriormente.
G e l d e s e p a r a c i n (7% de poliacrilamida). Mezcle volm enes iguales de la
solucin del catalizador de persulfato de amonio (J) y la solucin para poros
pequeos (i) y transfiera 0.9 ml a cada tubo. Coloque cuidadosamente una
capa de agua sobre la superficie y deje reposar los geles durante 2540 mi:
utos.
(empaquetamiento) (2.5% poliacrilamida). Cuando se haya
G e l e s p a c ia d o r
formado el gel retire con un papel absorbente el agua que queda sobre la
superficie y luego aada 0.15 mi de la solucin para poros grandes. Cubra con
agua y coloque los tubos bajo una luz fluorescente hasta que se haya formado
completamente el gel (20-50 minutos). Finalm ente cubra el gel con una capa
de amortiguador de tris diluido, pH 8.3 (B).
Mezcle las muestras con un poco de sacarosa 40%
A p lic a c i n d e la m u e s t r a .
p /v (H) para obtener una solucin densa que forme una capa encima del gel y
por debajo del amortiguador. A una de las muestras de suero agregue azul de
bromofenol como indicador para marcar el frente de migracin de los iones.
--------------------------------------------------------------------------------- ,---------------------------------
Tubo No. Muestra

1y 2 50 p 1 de suero
3y 4 50 p 1 de albmina (5 mg/ml)
5y 6 50 u 1 de 7 -glubulina (2 mg/ml)
7y 8 50 p 1 de transferrina (2 mg/ml)
E l e c t r o f o r e s i s . Quite los tapones de caucho del extremo inferior de los tubos.

Conecte las cmaras de amortiguadores y deje pasar una corriente de 5
mA/tubo hasta que el azul de bromofenol haya migrado casi al final del tubo.
C o l o r a c i n . Desconecte la corriente. Saque los geles de los tubos introducien
do una aguja entre el gel y la pared del tubo e inyectando cuidadosamente
agua mientras se rota ligeram ente el tubo. Recoja los geles en tubos de ensayo,
coloree con negro de amido o azul de Coomassie. Decolore los geles lavndolos
repetidamente en cido actico 7% v /v hasta que la parte del gel que no
contiene bandas est completamente clara. Haga un dibujo esquemtico de la
separacin y compare los resultados obtenidos para el suero con los de la

electroforesis en acetato de celulosa del experimento 3.15.
Bibliografa
Bier, M., Electrophoresis: Theory, M ethods and Application, Nueva York,
Academic Press, Vol. 1 1958, Vol. 2 1967.
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Stahl, E., T hin L ayer Chromatography: A Laboratory Handbook, 2a. ed. 1969.
Londres, Longmans.
Shaw, D. J., Electrophoresis, Nueva York, Academic Press, 1969.
4
Colorimetra y espectrofotometra
COLORIMETRIA
Muchos de los experimentos bioqumicos incluyen la medicin de un
compuesto o un grupo de compuestos que hacen parte de una mezcla. Quizs
la tcnica ms usada para determinar la concentracin de dichos compuestos
es la colorimetra. El fundamento de la tcnica consiste en que si se pasa luz
blanca a travs de una solucin coloreada, algunas longitudes de onda se ab
sorben con preferencia sobre las otras (figura 4.1). Muchos compuestos no son
coloreados, pero pueden absorber luz en la regin visible si se someten a la
accin de un reactivo apropiado. Estas reacciones son a menudo especficas y
muy sensibles, hasta el punto de poder medir cantidades de material en con
centraciones de milimol por litro. La mayor ventaja consiste en que no es
necesario el aislamiento del compuesto y que se pueden determinar los cons
tituyentes de una mezcla compleja tal como sangre, sin que se requiera
mucho tratamiento previo. Tal como se discute a continuacin, la intensidad
del color es proporcional a la concentracin del compuesto que se mide, m ien
tras que la cantidad de luz absorbida es proporcional a la intensidad del color y
por lo tanto a la concentracin.
Ley de Beer-Lambert
Cuando se pasa un rayo de luz monocromtica de intensidad inicial I0a travs
de una solucin en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de
manera que la intensidad de la luz transmitida I es menor que I 0 . Ocurre
alguna disminucin en la intensidad de la luz por dispersin de las partculas
o reflexin en las interfases, pero principalmente por absorcin de la solucin
(figura 4.2). La relacin entre I e I 0 depende de la longitud del medio
94
Colorim etria y espectrofotom etra 95
L u z in c id e n t e L u z a b s o r b id a p o r Luz e m e rg e n te y por
( b la n c a ) la s o lu c i n c o lo r e a d a c o n s ig u ie n t e c o lo r d e
(ro ja ) la s o lu c i n ( v e r d e )
A m a r i ll o
V e rd e
-- A zul
Figura 4.1 Por qu son coloreadas las soluciones

absorbente, l, y de la concentracin de la solucin absorbente, c. Estos factores
se hallan relacionados en la Ley de L am bert y B eer (figura 4.2).
Ley de Lambert. C uando u n rayo de luz m onocrom tica pasa a travs de un
medio absorbente, su intensidad dism inuye exponencialm ente a m edida que
la longitud del m edio absorbente aum enta.
Ley d e L a m b e rt: / =/e~k,l

)
Ley de Beer. Cuando u n rayo de luz m onocrom tica pasa a travs de un
medio absorbente, su intensidad dism inuye exponencialm ente a m edida que
la concentracin del m edio absorbente aum enta.
L ey d e B e e r: / - / 0e * 2<"
Estas dos leyes se com binan en la ley de Beer-Lam bert:
/ = /o e - k *cl
S o lu c i n a b s o r b e n t e ,
c o n c e n t r a c i nc
L u z m o n o c r o m tic a
Figura 4.2 Absorcin de la luz por una solucin

El cociente de las intensidades se conoce como la transm itancia y se

expresa como un porcentaje:
T = I/I0 = e ~ k 3 cl.
Sacando logaritmos:
loge I0/ l = k 3C,
log! o I q/I = 2.303 k 3 el,
o
logio I0/ I =kcl .
La expresin log10/ o/J se conoce como la extincin E, o absorbancia. La

extincin se designa algunas veces como densidad ptica, pero este nombre no
se recomienda actualmente. Por lo tanto,
E = kcl.
Si se sigue la Ley de Beer-Lambert y se m antiene constante, un grfico

de la extincin en funcin de la concentracin da una lnea recta que pasa por
el origen; en tanto que un grfico del porcentaje de transmitancia en funcin
de la concentracin da una curva negativa exponencial (figura 4.3).
Algunos colormetros y espectrofotmetros tienen dos escalas, una lineal
de porcentaje de transmitancia y otra logartmica de extincin. Esta ltima
escala es la que est linealm ente relacionada con la concentracin y se usa en
C o n c e n t r a c i n
Figura 4.3 Relacin entre la absorcin de la luz y la concentracin de una

solucin absorbente
Colorimetra y espectrofotometra 97
las curvas patrones de concentracin (figura 4.4). Con la ayuda de tales curvas
se puede d eterm in a r fcilm ente la concentracin de una m uestra problem a
conociendo su extincin.
Coeficiente m olar de extincin. Si es 1 cm y c es 1 m ol/1, la absorbancia ser

igual al coeficiente m olar de extincin k, el cual es caracterstico para un
compuesto dado. El coeficiente m olar de extincin k, es, por lo tanto, la
extincin producida por 1 mol/1 en un recorrido de luz de 1 cm y general
m ente se escribe E } 1/ ' ; y se expresa en 1 m ol-1 cm -1 .
Coeficiente de extincin especfica. No se puede conocer fcilm ente el peso
m olecular de algunos compuestos tales como protenas y cidos nucleicos
presentes en una mezcla y en este caso se usa el coeficiente de extincin
especfica. Este se define como la extincin de 10 g/1 (antes conocido como 1%
p /v ) del com puesto en un recorrido de luz de 1 cm, E ] ^
Limitaciones de la Ley de Beer-Lam bert. Algunas veces no son lineales ls

grficos de la extincin en funcin de la concentracin y esto probablem ente
se debe a que no se cum ple alguna de las siguientes condiciones:
1. La luz debe ser preferib lem en te m onocrom tica o la longitud de onda

debe estar en tre lm ites m uy estrechos.
2. La longitud de onda de la luz em pleada debe coincidir con el m xim o de
absorcin de la solucin. Esto perm ite tam bin conseguir la sensibilidad
ptima.
3. No debe haber ionizacin, asocicin, disociacin o solvata(n del
soluto con respecto a la concentracin o al tiempo.
4. La solucin es m uy concentrada, originando un color m uy intenso. La
ley slo se cum ple hasta cierto lm ite m xim o de concentracin, carac
terstico para cada sustancia.
Escala logartmica de la extincin
Figura 4.4 Relacin entre el porcentaje de transmitancia y la extincin

Medicin de la extincin
Los prim eros colorm etros se calibraban a ojo com parando el color de una
solucin con los de una serie de discos coloreados. Los resultados obtenidos
eran muy subjetivos y no m uy exactos. Los colorm etros visuales slo tienen
ahora un inters histrico y no se describen en este libro. La clula fotoelctri
ca tiene la ventaja sobre el ojo hum ano de poder d eterm in ar el grado de
absorcin de un color y de ser m ucho m s objetiva.
El colormetro fotoelctrico. En la figura 4.5 se presenta un diagram a de las

partes bsicas de un colorm etro tpico. La luz blanca de u n a lmpara de
tungsteno pasa a travs de una rendija, luego a travs de u n lente condensa
dor, hasta obtener un rayo paralelo qe incide sobre la solucin que se
investiga, la cual se ha colocado en una celda de absorcin o cubeta. La cubeta
es generalm ente de vidrio y las paredes a travs de las cuales pasa el haz de luz
son paralelas. En muchos casos, las cubetas tienen una base de 1 cm cuadrado
y pueden contener fcilm ente 3 mi de lquido.
Despus de la cubeta se en cuentra el filtro, el cual se selecciona para
perm itir la transm isin m xim a del color no absorbido. Si se q u iere exam i
n ar una solucin azul, entonces se absorbe el rojo y por lo tanto se selecciona
un filtro rojo. El color del filtro es, pues, com plem entario a la solucin que se
estudia (tabla 4.1). En algunos instrum entos el filtro se en cu en tra antes de la
cubeta. El filtro produce bandas angostas de transm isin y, por lo tanto, da
luz aproxim adam ente monocrom tica. Los filtros Ilford son los m s com unes
y algunas de sus propiedades se dan en la tabla 4.2.
Los filtros se seleccionan en form a tal que cum plan la Ley de Beer.
G a lv a n m e tr o
tungsteno
Figura 4.5 Diagrama de un fotocolormetro

ColoriiMtra y Mpactrolotometra 99
Tabla 4.1 Relacin entre el color de la

solucin estudiada y el filtro escogido para el
anlisis colorimtrico
Color de la solucin Filtro

rojo-naranja azul-azul verdoso
azul rojo
verde rojo
prpura verde
amarillo violeta
A continuacin la luz llega a una fotoclula que genera una corriente

elctrica en proporcin directa a la intensidad de la luz incidente. Esta seal
elctrica pequea se in crem enta m ediante un amplificador, y la seal
amplificada pasa a un galvanmetro calibrado en una escala logartm ica que
da directam ente m edidas de absorbancia. Las fotoclulas usadas en colorm e
tros no m uy finos tienen una precisin de aproxim adam ente 0.5%. La solucin
blanco se coloca prim ero en el colorm etro y se ajusta el galvanm etro a una
absorbancia de cero. Luego se coloca la m uestra y se lee directam ente la
absorbancia.
Un mtodo m ejor consiste en dividir el haz de luz en dos partes, u n a de las
cuales pasa a travs de la m ezcla y otra a travs del blanco; los circuitos se
equilibran hasta que no se m ueva la aguja del galvanm etro. La extincin
est dada por la lectura del potencim etro cuando el circuito queda en
equilibrio.
Tabla 4.2 Transmisin mxima para filtros Ilford
Nmero del Transmisin

filtro Ilford Color mxima (nm)
600 violeta intenso 420

601 violeta 430
602 azul 470
603 azul verdoso 490
604 verde 520
605 amarillo verdoso 550
606 amarillo 580
607 naranja 600
608 rojo 680
609 rojo fuerte 700
Con permiso de Ilford Ltd.

ESPECTROFOTOMETRIA
Anlisis por medicin de la absorcin

Un espectrofotm etro es u n colorm etro m s sofisticado en el cual la luz
monocrom tica se obtiene m ediante una rejilla o prism a. La banda de
longitudes de onda de la luz que pasa a travs de u n filtro es bastante ancha y
por lo tanto, puede ser difcil distinguir e n tre dos com puestos que posean
absorcin parecida usando un colorm etro. En estos casos se necesita u n es
pectrofotm etro, ya que ste perm ite sep arar los dos picos de absorcin
usando el m onocrom ador.
Algunos com puestos absorben fu ertem en te en la regin ultravioleta y su
concentracin se puede d eterm in ar lo mismo que en el caso de los
colormetros usando un espectrofotm etro m s am plio que pueda funcio-
, n a r hasta longitudes de onda de 190 nm . P o r ejem plo, la concentracin
de ciqlo rico puede ser determ inada m idiendo la extincin de la solucin a
293 nm antes y despus de habrsele tratado con un exceso de la enzim a
uricasa. El cido rico es oxidado por la uricasa a pH 9 dando alantoina la cual
* no absorbe a esta longitud de onda.
La longitud de onda usada m s com nm ente en la regin del ultravioleta
es quizs 340 nm . A esta longitud de onda las form as reducidas de los
nucletidos de piridina, NADH2y NADPH2absorben fuertem en te, m ientras
que las form as oxidadas de estas coenzimas no lo hacen, (figura 4.6). El NAD
tiene la estru ctu ra tpica de los dinucletidos:
Figura 4.6 Espectro de absorcin de las formas

reducidas y oxidadas de NAD y NADP
Colorimetra y espectrofotometrfa 101
H H H
1
H C ^ C x C CONH, H C ''C " C CONH, H C ^ C^ C CONH
1 || 5 + 2H II II II II.
H C ^C H
X
o
o
HC^^CH
z
/
\
1 1 1
R R H R
Figura 4.7 Reduccin de la nicotinamida-adenina-dinucletido
Nicotinamidaribosafosfato
I
Adeninaribosafosfato
El NADP tiene la m ism a estructura, excepto que posee un fosfato en la
posicin 2 de la ribosa de la adenina. Los dos H reaccionan con la
nicotinam ida, pero al pH fisiolgico uno de los H se disocia tal como se m uestra
en la figura 4.7.
La form a reducida tiene u n a estru ctu ra quinoide, y es la responsable de
la absorcin a 340 nm.
El progreso de una reaccin catalizada por enzim as que utilicen estas
coenzimas, puede ser medido fcilm ente siguiendo la velocidad de aparicin o
desaparicin del NADH2 a p a rtir de su extincin a 340 nm . El m todo es m uy
sensible ya que el coeficiente de extincin m olar del NADH2a 340 nm es 6.3 x
103 m o l-1 cm*1. Esto significa que la conversin de un pm ol de su b strato /m l
produce un cambio de 6.3 en la absorbancia. P or lo tanto es posible m edir
reacciones catalizadas por enzim as que involucran cambios de solo nanom o
les de substrato por m inuto.
Espectros de absorcin
Muchos compuestos tienen espectros caractersticos de absorcin en la regin
visible y ultravioleta y esto hace posible la identificacin de dichos m ateriales
en una mezcla. Este punto se ilu stra varias veces a travs del texto.
Protenas. Los am inocidos triptfano y tirosina absorben a 280 nm , lo cual
constituye el fundam ento de u n a tcnica m uy sensible p ara d eterm in ar
protenas sin que se destruya la m uestra. Las protenas tam bin absorben en
el ultravioleta lejano, debido a los enlaces peptdicos.
Acidos nucleicos. Los cidos nucleicos y las bases que los componen
presentan una absorcin m xim a en la regin de 260 nm . La m agnitud de
absorcin de estos cidos constituye u n a m edida de su integridad, ya que los
cidos nucleicos parcialm ente degradados absorben m s fu ertem en te que los
m ateriales nativos. Las bases que componen los cidos poseen un espectro de
absorcin suficientem ente diferente, lo cual p erm ite usarlo en su identifica
cin.
Hemoglobinas. C uando se m odifican las hem oglobinas por medio de ciertas
drogas o de monxido de carbono, se presenta un cambio caracterstico en la
absorcin m xim a, y por lo tanto la presencia de estos agentes modificantes

puede ser detectada y medida.
p-Nitrofenilfosfato. Es u n substrato usado en la determ inacin de fosfatasas
las cuales catalizan la hidrlisis del com puesto para d ar p-nitrofenol y fosfato
inorgnico. En solucin alcalina el producto p-nitrofenol da un tpico color
am arillo con una absorcin m xim a a 405 nm . El substrato no absorbe en esta
regin perm itiendo as seguir el progreso de la reaccin en solucin alcalina.
Algunos consejos prcticos. Los detalles de la operacin de un in stru m en to
particular deben ser buscados en el m anual de instrucciones; sin em bargo, a
continuacin se dan algunas reglas generales referen tes al uso y cuidado de
los colorm etros y espectrofotm etros.
1. Lim pieza de las cubetas. Las cubetas se lavan sum ergindolas en cido
ntrico 50% v /v y luego enjuagndolas cuidadosam ente en agua
destilada.
2. Uso de las cubetas. A ntes que todo, llene las cubetas con agua destilada
y com prelas unas con otras para corregir cualquier pequea dife
rencia en las propiedades pticas. Seque siem pre con papel para
lim piar lentes la p arte ex tern a de la cubeta antes de colocarla en la
celdilla y no toque con la m ano las dos paredes de la cubeta a travs de las
cuales pasa el rayo de luz. C uando se h ay an tom ado todas las medidas,
lvelas con agua destilada y djelas en posicin invertida hasta que se
sequen.
3. Absorcin de radiacin por las cubetas. Las cubetas de vidrio son
m ucho m s baratas que las de silica y se usan cuando quiera que sea
posible. Su lim itacin principal est en que el vidrio absorbe radiacin
ultravioleta y no puede usarse por debajo de 360 nm; para estos casos se
em plean cubetas de silica.
Cubetas de vidrio: 360 800 nm.
Cubetas de silica: 200 800 nm.
4. Fuente de luz. Las lm paras de tungsteno producen un espectro amplio
de energa rad ian te hasta de 360 nm . P ara trabaj ar en la regin ultravio
leta del espectro se usan lm paras de deuterio. Si se usa la lm para de
tungsteno en el intervalo 360400 nm , es necesario colocar un filtro azul
en fren te del haz de luz.
5. Fotoclulas. Una fotoclula azul recibe luz em itida hasta 625 nm y una
fotoclula roja recibe luz por encim a de esta longitud de onda. Las
fotoclulas se exponen a la luz slo por el tiem po que sea necesario para
tom ar una lectura evitando as la fatiga de las mismas.
6. Blancos. La extincin de u n a solucin se m ide en contra de un blanco
que contiene todas las sustancias usadas en la prueba, excepto el com
puesto que se q u iere m edir. El blanco se coloca prim ero en el in stru
m ento y se aju sta luego la extincin a cero (100% de transm itancia)
I <
_ Colorimetra y espectrofotometria 103
antes de to m ar las lecturas para la m uestra. A ltern ativ am en te se puede

leer la extincin en contra de agua destilada y a la absorbancia de la
solucin problem a se le resta la del blanco.
7. Duplicados. Es absolutam ente esencial p rep arar en duplicado todas las
soluciones blancos y patrones en form a tal que se pueda construir una
curva patrn exacta. Adems, las m uestras deben p rep ararse tam bin
en duplicado siem pre que sea posible.
EXPERIMENTO 4.1 Curvas de absorbancia de dos colorantes

Fundamento
Los compuestos coloreados presentan espectros de absorcin caracterstica y
la seleccin cuidadosa de las longitudes de onda m xim a p erm ite analizar los
com ponentes de una mezcla de estas sustancias coloreadas.
Materiales 100
1. Colorm etros con una serie de filtros diferentes. 50
2. Azul de bromofenol (10 mg/1). 11
3. A naranjado de metilo (10 mg/1). 11
4. Mezcla problem a de los dos colorantes. 11
Mtodo
D eterm ine la extincin de cada colorante usando los diferentes filtros que
vienen con el colormetro. R ecuerde que cada vez que se cam bie el filtro es
necesario graduar el in stru m en to en cero con agua destilada en la cubeta.
A note cuidadosam ente la longitud de onda de transm isin m xim a (absor
bancia m nim a) para cada filtro y haga un grfico de la absorbancia observada
en funcin de la longitud de onda.
Cul es la longitud de onda que prodcela absorbancia m xim a p ara cada
colorante?
En qu form a la mezcla de los dos colorantes afecta el espectro de
absorcin?
EXPERIMENTO 4.2 Demostracin de la Ley de Beer

Materiales
1. Los mismos del experim ento 4.1.
Mtodo
P repare varias concentraciones de uno de los colorantes disponiendo una
serie de tubos en la siguiente forma:
Azul de bromofenol (10 mg/1) (mi) 1 2 3 4 5
Agua destilada (m i) 4 3 2 1 0
Coloque el filtro que dio la m xim a extincin y grade el colorm etro a
cero con agua destilada. En seguida anote la extincin de cada solucin y haga
un grfico de sta en funcin de la concentracin del colorante en cada tubo

(mg/1 o pg/m l).
1. Repita el experim ento an terio r usando el filtro que dio la m xim a
absorbancia con anaranjado de metilo, haga lo mism o con otro filtro y si
es posible con luz blanca sin filtro. Qu tanto se ajustan a la ley de B eer
las curvas de extincin en funcin de la concentracin?
2. Repit todo el experim ento usando el colorante anaranjado de metilo.
3. Finalm ente, use la inform acin obtenida en estos experim entos para
d eterm inar la concentracin de cada colorante presen te en la m uestra.
EXPERIMENTO 4.3 D e te r m in a c i n c a lo r im tr ic a d e f o s f a to in o r g n ic o
Fundamento
A diferencia de los colorantes anteriores, la m ayora de los compuestos
bioqumicos no tien en coloracin y pueden ser analizados colorim trica-
m en te pero slo despus de som eterlos a la accin de u n reactivo qumico
especfico que origine un producto coloreado. Este aspecto puede ilustrarse
midiendo fsforo inorgnico, que es, probablem ente, u n a de las d eterm in a
ciones m s usuales en los laboratorios de bioqumica. La curva patrn obte
nida ser em pleada en experim entos posteriores.
El fsforo inorgnico reacciona con molibdato de am onio en solucin cida
para form ar cido fosfomolbdico. La adicin de u n agente reductor reduce el
molibdeno presente en el fosfomolibdato produciendo u n color azul, sin
afectar el cido molbdico libre. En este m todo el agente red u cto r es el sulfato
d p-m etilam inofenol. La presencia de cobre en la solucin am ortiguadora
aum enta la velocidad de aparicin del color.
Materiales 100
1. Molibdato de am onio (50 g/1). 11
2. A m ortiguador de acetato de cobre pH 4.0 (Disuelva 21
2.5 g de sulfato de cobre (C u S 0 4 5H20 ),y 46 g de
acetato de sodio (CH3COONa 3H 20 ) en 1 litro de
cido actico 2 mol/1. V erifique el pH y ajstelo a 4.0
si es necesario.)
3. A gente reductor. (Disuelva 20 g de p-m etilam inofenol 11
sulfato en una solucin de sulfito de sodio (N a2S 0 3. 7H 20 )
100 g/1 y com plete hasta 11). G urdelo en un frasco
oscuro hasta cuando se necesite.
4. Acido tricloroactico (TCA), (100 g/1). 250 mi
5. Solucin de fosfato que contenga 100 mg de 100 mi
fsforo/100 mi. (Disuelva 438 mg de fosfato de potasio
monobsico en agua y com plete hasta 100 mi.) G urdela
en el refrigerador.
Colorimetrfa y espectrofotometra 105
6. Solucin de trabajo de fosfato que contenga 1 mg 11

fsforo/100 mi. (D iluya la solucin a n terio r 1 a 100
con TCA 50 g/1).
7. Colormetros.
Mtodo
En varios tubos de ensayo pipetee de 0.1 a 1 mi de la splucin patrn de fosfato
y complete con agua hasta un volum en de 1 m i en los que sea necesario.
Agregue luego 3 m i de am ortiguador de acetato de cobre, 0.5 m i de m olibdato
de amonio y 0.5 m l del agente reductor. Mezcle vigorosam ente despus de
cada adicin. D eje reposar por 10 m inutos y lea la extincin a 880 nm . P rep are
un blanco en el cual se reem plaza el fosfato por 1 m i de TCA 50 g/1.
Haga un grfico de la extincin en funcin de la concentracin de fosfato.
Cuando se m ide la concentracin de fosfato en una solucin que contiene
protena, la m u estra se mezcla con un volum en igual de TCA 20 g/1, luego se
separa el precipitado por centrifugacin y se trata una alcuota del sobrena
dante en la form a como se indic anteriorm ente.
EXPERIMENTO 4.4 Validez de la L ey de Beer en la determ inacin calorim

trica de creatinina
Fundamento
La creatinina en presencia de cido pcrico y en solucin alcalina form a un
tautm ero rojo de picrato de creatinina.
Materiales 100
1. Acido pcrico (solucin acuosa saturada). 21
2. Hidrxido de sodio (1mol/1). 11
3. P atrn de creatinina (2 g/1). 11
4. Colormetros. 50
5. M atraces volum tricos (100 m i). 250
Mtodo
P rep are diferentes soluciones de creatinina diluyendo adecuadam ente el
patrn y cloque 1 m i de cada solucin en un m atraz aforado de 100 mi.
A gregue 1 mi de hidrxido de sodio 1 mol/1 y 2 m i de solucin saturada de
cido pcrico, m ezcle vigorosam ente y dje rep o sar d u ra n te 10 m inutos.
Com plete con agua hasta la m arca y m ida la extincin a 530 nm .
Haga un grfico de la extincin en funcin de la concentracin de
creatinina.
EXPERIMENTO 4.5 Espectro de absorcin del p-nitrofenol

Materiales 10
1. p-nitrofenol (10 mmol/1). 50 mi
2. Acido clorhdrico (10 mmol/1). 11
O
II
II
; n
-O o-
Figura 4.8 Disociacin del p-nitrofenol
3. Hidrxido de sodio (10 mmol/1). 11

4. Espectrofotmetros. 5
5. M atraces volum tricos (100 mi). 10
Mtodo
Diluya la solucin de p-nitrofenol 0.250 ml con (a) HC1 10 mmol/1 y (b)
NaOH 10 mmol/1. D eterm ine el espectro de absorcin de cada solucin en el
intervalo de 250 a 500 nm. Analice las diferencias e n tre los dos espectros y
calcule el coeficiente de extincin m olar a la longitud de onda que d la
absorcin mxim a.
EXPERIMENTO 4.6 D eterm inacin de los valores p del p-nitrofenol

Fundamento
El p-nitrofenol se disocia como se m uestra arrib a (figura 4.8). Como se anot
en el experim ento anterior, la form a no disociada que est presnte en la
solucin rida, no absorbe en la regin visible m ientras que la estru ctu ra
quinoide, presente en la solucin alcalina, absorbe fu ertem en te. El valor de
pK es el pH al cual hay 50% de ionizacin, o, en otras palabras, el pH al cual se
produce la m itad del valor de la absorbancia obtenida en solucin alcalina
suponiendo que en lcali se produce el 100% de ionizacin.
/
Materiales 10
1. Los mismos del experim ento anterior.
2. Soluciones am ortiguadoras 50 mmol/1. 1 1 de cada
(a) A m ortiguador de citrato (pH 3.0). solucin
(b) A m ortiguador de citrato (pH 4.0). am ortiguadora
(c) A m ortiguador de citrato (pH 5.0).
Colorimetra y especlrofotometria 107
(d) A m ortiguador de citrato (pH 6.0).

(e) Tris-HCl (pH 7.0).
(f) Tris-HCl (pH 7.5).
(g) Tris-HCl (pH 8.0).
(h) Tris-HCl (pH 9.0).
(i) Carbonato-bicarbonato (pH 10.0).
(j) Carbonato-bicarbonato (pH 11,0).
Mtodo
Usando las soluciones am ortiguadoras anteriores diluya 0.2 m i de p-nitrofenol
hasta 50 mi y determ in e la extincin de cada solucin a la longitud de onda de
405 nm , en la cual el fenol no disociado no presenta absorcin. D eterm ine los
valores de pK g. Titule 25 mi de p-nitrofenol 10 mmol/1 con NaOH a u n pH de
10.5. C orrija los valores obtenidos despus de titu la r agua destilada y haga una
curva de titulacin. D eterm ine los valores de pK a y com prelos con los
obtenidos anteriorm ente.
EXPERIMENTO 4.7 Curva de progreso del p-nitrofenil fosfatasa

Si se desea puede hacerse u n te rc er experim ento con el fin de m o strar el uso
de las propiedades de absorcin usando p-nitrofenol, p ara m edir la actividad
de la enzim a fosfatasa alcalina. D etalles completos se dan en el experi
m ento 9.2.
EXPERIMENTO 4.8 D eterm inacin de barbituratos m ediante el espectrofot-

m etro ultravioleta
Figura 4.9 Espectro de absorcin caracterstica de

algunos barbituratos en solucin alcalina
Fndamento
Los barbituratos sustituidos en posiciones 5,5' dan u n espectro de absorcin
caracterstico en la regin ultravioleta con un m xim o a 240 n m a pH 10.
A pH 13.4 la absorbancia m xim a se desplaza a 253 nm y se obtiene un m nim o
a 235 nm. P ara detectar la presencia de barbituratos se hace el espectro de una
solucin en el interv alo 220270 nm a pH 10.0 y a pH 13.4 (figura 4.9). Las cu r
vas presentan m xim os y m nim os y se cruzan a 227 n m y 250 nm . Los puntos
de cruce se llam an isosbsticos. Hay tam bin u n a diferencia m xim a en la
absorcin a 260 nm la cual se usa para d eterm in ar la cantidad de barbiturato
presente. La razn para la diferencia en el espectro de absorcin es que estos
compuestos son cidos dibsicos con valores pK de aproxim adam ente 8 y 12,
as que a pH 10 se en cu en tra nicam ente una form a ionizada y a pH 13.4 se
encuentra la form a doblem ente ionizada (figura 4.10).
La deteccin y determ inacin de barbituratos en sangre y orina es m uy
im portante en aquellos casos en que se sospecha en v en en am ien to y el m todo
puede usarse con sangre, plasm a u orina. Los barb itu rato s presentes en los
fluidos corporales se ex traen prim ero en cloroform o y luego en lcali.
Una solucin desconocida de fenobarbitona en plasm a puede ser til para
dem ostrar el mtodo. Las concentraciones plasm ticas que sobrepasen los 100
mg/1 son usualm en te fatales y por tanto es conveniente que la m uestra
desconocida contenga aproxim adam ente 10 a 60 mg/1.
Materiales _10
1. Cloroformo (grado analtico). 11
2. A m ortiguador de fosfato de sodio o potasio (0,4 ml/1, 200 mi
pH 7.4).
3. Hidrxido de sodio (50 mmol/1). 200 mi
4. Solucin de cido brico y cloruro potsico. (37.2 g 100 mi
de cido brico y 45 g de cloruro de potasio en 1 1).
5. P atrn de fenobarbitona (20 mg/1 en NaOH 0.45 mol/1). 100 mi
6. Papel de filtro W hatm an No. 31. 10
7. Embudos de separacin. 20
8. Espectrofotm etros. 5
9. Acido sulfrico (6 mol/1). 10 mi
No ionizadas Ionizada una vez Doblemente ionizada
Figura 4.10 Formas ionizadas de barbituratos substituidos en 5,5'
I
Colorimetria y ecpectrofotometra 109
Mtodo
Extraccin. En u,n em budo de separacin coloque 5-10 m i de fluido y extraiga
3 veces con 30 mi de cloroformo. Combine los extractos y filtre a travs de
papel W hatm an No. 31. Lave el filtro con un poco de cloroformo.
Vuelva a colocar el extracto en un em budo de separacin limpio, lave dos
veces con 5 mi de am ortiguador de fosfato y deschelo. A gregue 10 mi de
hidrxido de sodio 0.45 mol/1 y agite fu ertem en te d u ran te 12 m inutos. Deje
que se separen las fases y centrifugue la capa acuosa.
Determ inacin del barbiturato, 1. A 2 mi de hidrxido de sodio 0.45 mol/1
agregue 2 mi de la capa acuosa y haga un grfico del espectro desde 220 hasta
270 nm , contra un blanco de hidrxido de sodio 0.45 mol/1 (pH 13.4).
A 2 mi de la solucin de cido brico, agregue 2 mi de la capa acuosa. Mida
esta m uestra contra un blanco de 2 m i de hidrxido de sodio 0.45 mol/1 y 2 mi
de cido brico (pH 10.0).
Clculos 1. La extincin de la m u estra es igual a la de la solucin a pH 13.4
m enos la de la solucin a pH 10.0 medidas a 260 nm .
La solucin patrn de fenobarbitona se tra ta lo mism o que la capa acuosa
obtenida despus de ex tra er con cloroform o y la extincin del patrn a 260 nm
se calcula en form a sem ejante a la de la m uestra.
Concentracin de barbiturato en el fluido (mg/1)

extincin de la m uestra
= ------- ; - ------- ;----- x 20.
extincin del patron
Deteccin del barbiturato 2. Registre el espectro a pH 10.0 tal como se indic

anteriorm ente y luego aada 4 gotas de H 2S 0 4 6 mol/1 a la m u estra y a las
cubetas blanco. Registre el espectro de nuevo, pero esta vez a pH 2. Explique
las diferencias observadas y sugiera cules de las form as ionizadas se
encuentran probablem ente presentes a pH 2. T rate la solucin patrn de
fenobarbitona en la m ism a form a y calcule la concentracin de barbiturato
usando la diferencia de extincin en las dos soluciones a 240 nm. Cul de los
dos mtodos es ms sensible?
EXPERIMENTO 4.9 Experim entos con hemoglobina

Fundamento
C uando la hem oglobina se com bina con oxgeno, hay un desplazam iento en el
espectro de absorcin y el color de la sangre vara de oscuro a rojo brillante; un
cambio opuesto sucede cuando la sangre se desoxigena y esto explica la
diferencia de color e n tre la sangre venosa y la arterial. Tanto en la
hem oglobina como en la oxihemoglobina el h ierro se halla presen te en la
form a ferrosa y no es oxidado cuando se oxigena. Si el h ierro ferroso se oxida a
frrico por medio de un agente oxidante tal como el ferricianuro, entonces se

form a m etahem oglobina y la m olcula no se puede com binar luego con ox
geno o monxido de carbono. N orm alm ente la sangre h u m a n a contiene solo
aproxim adam ente 1% de m etahem oglobina, pero esta puede aum en tarse
despus de in g erir ciertas drogas.
La hem oglobina se com bina cn el monxido de carbono aproxim ada
m ente 200 veces m s fcilm ente que con el oxgeno form ando carboxihem o-
globina; la cantidad de hem oglobina disponible para el tran sp o rte de oxgeno
se reduce por lo tanto y si hay suficiente CO p resente se produce la m u erte por
falta de oxgeno en los tejidos. El espectro de absorcin de la carboxihem o-
globina es solo ligeram ente diferente al de la hem oglobina, pero la diferencia
es lo suficientem ente grande para p erm itir la deteccin del com puesto en
sangre y esto puede te n e r implicaciones mdico-legales en casos de m u erte
por envenenam iento producido por el gas de carbn.
Si se agita la sangre al aire, se form a la oxihem oglobina, pero si se le agrega
el reactivo de Stokes, se rem u ev e el oxgeno com pletam ente y se form a
hemoglobina.
Derivado de Absorcin
hemoglobina mxima (nm)
hemoglobina 555 430
oxihemoglobina 577 541 413

carboxihemoglobina 570 535 418
metahemoglobina 630 500 406
Materiales _10
1. Espectrofotm etros ultravioleta. 5
2. Reactivo de Stokes. (Sulfato ferroso 20 g/1 y cido 50 mi
tartrico 30 g/1: in m ed iatam en te antes de usarse agregue
amonaco hasta disolver un ligero precipitado que se
form a al comienzo. Esta es una solucin de ferro ta rtrato
de amonio, un agente reductor).
3. F erricianu ro de potasio (100 g/1). 50 mi
4. Hemoglobina p reparada a p a rtir de glbulos rojos 50 mi
hum anos hemolizados.
5. Cloruro de sodio (0.15 mol/1). 200 mi
6. Espectroscopio de visin directa.
7. F u en te de monxido de carbono. 1
Mtodo
P repare una solucin de hem oglobina en solucin salina a una concentracin
de aproxim adam ente 1 m g/m l y trace el espectro de absorcin en el intervalo
400-700 nm.
Colorimetrfa y espectrofotometra 111
Haga el espectro de absorcin despus de tra ta r la solucin de hem oglobina

como sigue:
1. A 4 mi de solucin de hem oglobina, agregue dos gotas de reactivo de
Stokes preparado recientem ente.
2. Pase monxido de carbono a travs de la solucin de hem oglobina (no se
haga al descubierto en el laboratorio) y selle la parte superior de la
cubeta.
3. Repita (2) despus de agregar dos gotas del reactivo de Stokes.
4. A 4 ml de hem oglobina agregue dos gotas de ferrician u ro potsico
100 g/1.
5. Repita (4) pero agregue el reactivo de Stokes despus del ferricianuro.
Adems, exam ine el espectro visible de las soluciones mencionadas
anteriorm ente usando un espectroscopio de visin directa.
Bibliografa
Florkin, M. y Stotz, E., C o m p r e h e n s i v e B i o c h e m i s t r y , Vol. 3, M e t h o d s f o r th e
S t u d y o f M o le c u le s , A m sterdam , Elsevier, 1962.
Jam es, A. y P richard, M., P r a c t i c a l P h y s ic a l C h e m i s t r y , 3a ed. Londres,
Longmans, 1975.
Van Holde, K. E., P h y s ic a l B io c h e m is try , Englewood Cliffs, N. J., Prentice-
Hall, 1971.
!
Aminocidos y protenas
PROPIEDADES FISICAS Y QUIMICAS
Qumica de los aminocidos

Propiedades cido-bsicas. Tal como su nom bre lo indica, los aminocidos
son compuestos orgnicos que contienen grupos am ino y carboxilo y por lo
tanto poseen propiedades cidas y bsicas. Desde el punto de vista qumico,
sera posible la existencia de u n gran n m ero de aminocidos, sin em bargo,
en la naturaleza se en cu en tra slo una veintena de ellos. De los 22 o ms
aminocidos encontrados en protenas, casi todos son a-am inocidos, es
decir, que el grupo am ino pst presente en el tomo de carbono- 0.
NH2
Un a-aminocido RCCOOH
A
Los aminocidos poseen propiedades diferentes a los compuestos orgnicos de
bajo peso m olecular y sem ejan ms bien sales inorgnicas. En general, son
fcilm ente solubles en medio acuoso, pero solo ligeram ente solubles o
insolubles en solventes orgnicos. Sus puntos de fusin son m uy altos
comparados con los com puestos orgnicos de bajo peso m olecular y la m ayo
ra tienen un punto de fusin por encim a de 200 C. P ara explicar estas
observaciones se supone que, en solucin n eu tra, los aminocidos existen
como iones doblem ente cargados, conocidos como zw itteriones, y no como
molculas no ionizadas.
Los puntos de fusin altos pueden explicarse en trm inos de la alta energa
requerida para ro m p er los enlaces inicos en la red cristalina. Los com
112
Aminocidos y protenas 113
puestos anlogos tales como cidos sustituidos o am inas sustituidas, lo

mismo que steres de aminocidos, son no polares y tien en puntos de fusin
m ucho ms bajos. Algunas otras propiedades fsicas confirm an tam bin que
casi todos los aminocidos alifticos existen como zw itteriones. La fu erte
R R
+H3 NCHCOO h2 n- chcooh
zw itterion form a no cargada
carga positiva en el grupo NH3+ induce una tendencia a que el grupo COOH
pierda un protn, y, por tanto, los am inocidos son cidos fuertes. P or ejem
plo, el p K a de la glicina es m ucho m s bajo que el del cido actico, y otros
aminocidos que contienen u n a cadena lateral aliftica tien en valores de pK
sem ejantes a la glicina.
H H H
1 1
+H3 N -C H -C O O ' HCHCOOH h2 n - ch- h
Glicina Acido actico M etilam ina
Estado fsico a 25 C Slido Lquido Gaseoso

P unto de fusin 232-236 C 17 C -94 C
p K -COOH 2.4 4.8
pK -N H 2 9.7 10.7
Algunos am inocidos contienen grupos ionizables en la cadena lateral R,

lo cual afecta las caractersticas fsicas bien sea que el am inocido se encuen
tre libre en solucin o com binado con otros en una protena. En efecto, la car
ga de las protenas est d eterm in ad a en gran p arte por los grupos ionizables
de las cadenas laterales de los aminocidos. En la tabla 5.1 se dan los grupos
ionizables presentes en la cadena lateral de los aminocidos, ju n to con sus
valores de p K.
Punto isoelctrico. Los am inocidos m igran en un campo elctrico y esta
propiedad constituye la base de uno de los m todos p ara su separacin. La
direccin y m agnitud de la m igracin depende en gran p arte de la forma
inica predom inante del am inocido en solucin, la cual a su vez est
determ inada por el pH del am ortiguador usado p ara electroforesis.
El pH al cual la carga n eta es cero y no o curre m igracin en un campo
elctrico se conoce como el punto isoelctrico. P ara los am inocidos ste es
usualm ente el mismo que el punto isoinico, definido como el pH al cual las
cargas positivas y negativas son iguales, cuando se considera solam ente el
equilibrio de grupos cargados con H+. En el caso de las protenas estos dos
Tabla 5.1 Los valores de p K para grupos ionizables encontrados en la cadena lateral
de algunos aminocidos
Grupos ionizables Aminocidos PK

(3-carboxilo Acido asprtco 3.9
7-carboxilo Acido glutm ico 4.3
-COOH ; = : -COO ~ + H+
Imidazol H istidina 6.0
HN NH N NH + H
Sulfidrilo Cisterna 8.3

-C H 2SH -C H 2 S" + H+
Fenlico Tirosina 10.1
OH O'
+ H+
e-amino Lisina 10.5

NH3+ NH^H*
G uanidino A rginina 12.5
NH2 nh2
= N H 2+ = N H + H
I I
NH NH
puntos no son siem pre los mismos, puesto que a los aminocidos pueden
unirse iones diferentes al H+. P ara aminocidos que contienen solam ente un
grupo COOH y un -N H 2 como grupos ionizables, el punto isoelctrico (pJ) se
en cu en tra en la m itad de los valores de pK para estos grupos. As, pues, para el
caso de la alanina:
p /= i/2(2.4 + 9.7) = 6,1
ch3 ch3 ch3

| 1
Form as ionizadas de HOOCCHNH3 'O O C -C H -N H ; "OOC-CH-NH 2
la alanina
pH al cual existen Acido Isoelctrico Alcalino
Carga + 0 -
Migracin en un
campo elctrico Al ctodo Ninguna Al nodo
Cuando se hallan presentes otros grupos cargados, el clculo del p no es

tan simple, pero como regla general, el punto isoelctrico se en cu en tra en la
m itad de los dos valores de pK correspondientes a grupos sim ilares.
Actividad ptica. El tom o de carbono a es asim trico p ara todos los am ino
cidos excepto la glicina, as que, fu era de sta, todos los aminocidos poseen
actividad ptica. Por sem ejanza con el cido glicrico L(), (compuesto de
referencia para la serie de los azcares L), se puede tom ar la serin a como
compuesto de referen cia para los aminocidos.
COOH COOH COOH
CHj OH CH2OH CHj OH

cido glicrico L () serina L (+) serina D ()
Cuando el -C H 2OH es reem plazado por otros grupos, surgen dos familias de
aminocidos, las series D y L. Todos los am inocidos presentes en las prote
nas tienen configuracin L m ien tras la form a D se en cu en tra en antibiti
cos y en la pared celular de algunas bacterias. P ara u n a m ejo r explicacin de
estos trm inos y m ayor inform acin sobre isom era ptica, puede leerse la
introduccin al captulo 6.
Las letras L y D se refieren a la configuracin absoluta con respecto al
carbono asim trico y no a la actividad ptica. La tem p eratu ra, la presencia de
electrolitos y el pH afectan la rotacin especfica, el signo y la m agnitud de la
rotacin pueden llegar a in v ertirse cam biando el pH.
Algunos aminocidos tales como isoleucina, treonina e hidroxilisina
contienen un segundo tomo de carbono asim trico, y p resen tan m s de dos
configuraciones.
Reacciones generales de los aminocidos. Los aminocidos dan todas las
reacciones tpicas de los compuestos que contienen grupos am ino y carboxilo,
an bajo condiciones en las que la form a zw itterion est p resente slo en
cantidades pequeas.
Composicin de aminocidos en las protenas

Frmulas de los aminocidos. As como los monosacridos son las unidades
bsicas de los polisacridos, los aminocidos son las unidades estructurales de
las protenas, es decir, los ladrillos con los que se construye la casa proteica.
Los polisacridos usualm ente estn hechos de unidades de pocos m onosacri
dos, en cambio las protenas contienen hasta 22 am inocidos diferentes. Los
nom bres y abreviaturas de los am inocidos m s com nm ente encontrados en
las protenas se dan en la tabla 5.2. La frm ula bsica de todos los a -aminoci-
dos es la m ism a y se diferencian nicam ente por la n atu raleza y el tam ao de

la cadena lateral R.
Enlace peptdico. Los am inocidos se en cu en tran unidos en la molcula de
protena por enlaces peptdicos (CONH) que se form an por la condensa
cin del o-COOH de un am inocido con el a -N H 2 de otro. Cuando varios
aminocidos se u n en p ara d ar u n polm ero de bajo peso m olecular 6te se
conoce como polipptido, m ientras que el trm ino protena se usa
generalm ente para polm eros (de aminocidos) de peso m olecular grande (de
varios miles o ms).
n h 2 - c h 2 - c o (o h h'n h - chcooh

- Ah
Glicina A lanina
n h 2 - c h 2 - co - n h - c h - c o o h
Ah ,
G licilalanina (dipptido)
Los tomos - C - N - del enlace peptdico estn todos en el mismo plano del
esqueleto peptdico, en cambio las cadenas laterales de los aminocidos
usualm ente se disponen sobre el esqueleto en posicin trans.
O h H Ra H
i l SU i
Esqueleto peptdico
Estructura de las protenas

Estructura primaria. En las protenas pueden reconocerse varios niveles de
organizacin estru ctu ral, el prim ero de ellos es la estru ctu ra prim aria, que
consiste en la secuencia de los aminocidos en la molcula. Los aminocidos
que conform an una protena p u ra pueden determ in arse fcilm ente separn
dolos por crom atografa o electroforesis despus de hidrolizar los enlaces
peptdicos m edian te procesos qumicos o enzimticos. Se puede obtener una
visin cualitativa de los aminocidos presentes por medio de la crom atografa
en papel y el anlisis cuantitativo com pleto puede hacerse m ediante la
crom atografa de intercam bio inico, procedim iento que se en cu en tra ahora
com pletam ente autom atizado.
Un problem a de m ayor com plejidad se p resenta cuando se qu iere saber,
adem s de la cantidad relativa de aminocidos presentes en una protena
Tabla 5.2 Aminocidos com nm ente encontrados en las protenas.

Grupo N om bre A breviatura R
Aliftico Glicina G li^ H-

A lanina Ala c h 3-
Valina Val ch3
> -
ch3
Leucina Leu ch3
x c h - c h 2-
ch3
Isoleucina lie gh3
\
CH-
/
C2 H5
H idroxlico S erina Ser c h 2o h
I
Treonina Tre ch3
HOH
l
'*jr
A zufrado Cistena Cfs CHjSH
l
Cistina Qis-Qs CH2 -S -S -C H .
I I
M etionina Met ch2 s ch3
I
A cdico Acido asprtico Asp COOH
h2
I
Acido glutm ico G lu COOH
h2
h2
I
y*
Bsico Lisina L/s nh2
(H 2 ) 4
A rginina Arg HN NH2

v
NH
( h 2 ) 3
I
Tabla 5.2 (continuacin)

Grupo Nom bre Abreviatura R
Aromtico y Fenilalanina Fen
heterocclico
Tirosina T/r
Triptfano Trp
Histidina His
Imino cido Prolina Pro
Q'N ' COOH

H
Hidroxiprolina Hipro HO-
COOH
H
com puesta por cientos o m iles de residuos de aminocidos, el orden en el que

se encuentran en la molcula. A fortunadam ente, en la actualidad dispone
mos de m todos qum icos que hacen posible la identificacin de los grupos li
bres COOH y N H 2en protenas y pptidos; y basados en ellos es posible la
determ inacin secuencial de los aminocidos de una cadena peptdica.
Las protenas pueden ser parcialm ente hidrolizadas por cidos, pero este
tipo de hidrlisis no es especfico; en cambio m ediante el uso de enzim as es
posible rom per los enlaces peptdicos en tre residuos de aminocidos
especficos. La hidrlisis produce pptidos que pueden ser separados por
crom atografa o electroforesis y cuya secuencia de aminocidos puede ser
investigada, usando los mtodos para determ inacin de C y N term inales. A
continuacin se tra ta de o rd en ar cada uno de los pptidos en la molcula. Esto
se hace sobreponiendo los aminocidos obtenidos en los diferentes fragm en
tos a la m anera en que se arm an las piezas de un rom pecabezas, hasta obtener
la secuencia total de la molcula.
Estructura secundaria. Pauling y Corey basados en estudios de rayos X,

sugirieron que la cadena peptdica puede existir en la form a de un resorte o
hlice. Dichos investigadores consideraron un buen n m ero de form as
helicoidales, pero enco n traro n que slo la form a a -hlice llna los requisitos
de m xim a estabilidad. El a-hlice tiene 3.6 residuos de aminocidos por
cada vuelta y se levanta a lo largo de un eje central de 0.15 nm por residuo. La
form a de la estru ctu ra se m antiene por enlaces de hidrgeno intram olecula
res en tre el oxgeno del carbonilo y el nitrgeno amido, de dos am inocidos
que se encuentran separados por tres residuos en el esqueleto peptdico.
'S sc = o ~~h - n "/
El enlace de hidrgeno es m uy dbil, pero debido a que un gran n m ero de

ellos participan en la formacin del a-h lice, el conjunto contribuye a d ar
estabilidad a la estructura. Todas las cadenas laterales de am inocidos pueden
acom odarse en un o-hlice debido a que sobresalen hacia afu era del eje,
pero los iminocidos prolina e hidroxiprolina son rgidos y no pueden
acom odarse en el a -hlice norm al, por tanto cuando ellos se en cu en tran
presentes ocurre un cambio en la direccin de la cadena.
La otra form a de estru ctu ra secundaria se conoce como hoja plegada /3, en
la cual los enlaces de hidrgeno se en cu en tran e n tre dos cadenas peptdicas
paralelas cuyos tomos de N estn orientados en la m ism a direccin, o antipa
ralelas, donde slo las cadenas alternas estn orientadas en la m ism a
direccin. La form a j3 se en cu en tra en protenas fibrosas tales como la
qu eratin a del pelo, m ientras que el a -hlice puede estar p resente tanto en
protenas fibrosas como globulares del tipo albm ina y mioglobina.
Estructura terciaria. La e stru ctu ra terciaria de u n a protena es la disposicin
en el espacio de las hlices; o, en otras palabras, la form a tridim ensional de la
m olcula de protena. M uchas de las m olculas de protenas se com portan
como si fueran bastante compactas y por lo tanto se conocen como protenas
globulares. O tras protenas son m s rgidas y form an hilos largos y se conocen
como protenas fibrosas. La e stru ctu ra terciaria se m an tien e por los enlaces
que se m uestran en la pgina siguiente. Los enlaces de hidrgeno son dbiles
pero num erosos y se pueden fo rm ar en tre el nitrgeno am ida y el oxgeno
carbonilo del esqueleto peptdico, as como en grupos presentes en las cadenas
laterales. Las cadenas laterales del cido asprtico, cido glutm ico, tirosina,
histidina, serina y treonina pueden fo rm ar enlaces de hidrgeno.
Cuando un am inocido bsico y uno cido se en cu e n tran cercanos y
cuando ambos estn ionizados, se puede form ar un enlace inico o electrost
tico. Este enlace es im p o rtan te en la unin de protenas bsicas con otras
m acrm olculas cidas tal como ocurre en la form acin de nucleoprotenas.
120 Bioquimlca prctica
Enlaces de hidrgeno Enlace Enlace Enlaces hidrofbicos

inico disulfuro
El enlace disulfuro es un enlace covalente y por lo tanto confiere un cierto

grado de rigidez a la molcula de protena.
An no se ha podido en ten d er com pletam ente la naturaleza de los enlaces
hidrofbicos, pero se sabe que ellos se originan debido a la tendencia de las
cadenas no polares de los aminocidos a asociarse e n tre s. Los grupos hidrof-
licos se asocian con agua y se en cu en tran en la superficie de la molcula de
protena, m ientras que los grupos hidrofbicos se hallan enterrados en el
interior de la molcula. La tendencia a los tipos de asociacin descritos
determ ina la form a de la m olcula y por tanto, es de prim ersim a im portancia
en la form acin de la estru ctu ra terciaria.
Estructura cuaternaria. Algunas protenas poseen subunidades de polippti-
dos, que no se hallan ligados por enlaces covalentes y la asociacin de dichas
subunidades para form ar la molcula com pleta confiere una estru ctu ra
cuaternaria a la protena. Estas subunidades pueden ser idnticas, como en el
caso de las isoenzimas 1 y 5 de la deshidrogenasa lctica, que estn hechas de
cuatro subunidades de peso m olecular 34 000. La isoenzim a 1 est com puesta
de cuatro subunidades H , m ientras que la isoenzim a 5 est form ada por
cuatro subunidades M. Los hbridos contienen proporciones variables de
subunidades H y M, originando las izoenzim as2, 3 y 4. M uchas protenas de
peso m olecular por encim a de 50 000 parecen te n e r estru ctu ra cuaternaria.
Aislamiento de protenas
Lo mismo que cuando se trata de muchos otros m ateriales biolgicos, se deben
evitar condiciones ex trem as cuando se tra ta de aislar protenas y se aconseja
el uso de mtodos fsicos en vez de qumicos para este propsito. En general, se
recom ienda el uso de concentraciones altas de protena, baja tem p eratu ra y
pH alrededor de la neutralidad, pues de lo contrario, la protena puede desna
turalizarse.
Desnaturalizacin. La desnaturalizacin es cualquier proceso por el cual el

ordenam iento espacial de una protena cam bia de la estru ctu ra ordenada de
la molcula nativa a una configuracin tridim ensional m s desordenada.
D urante la desnaturalizacin se rom pen los enlaces de hidrgeno y los
hidrofbicos y hay un increm ento en la entropa o grado de desorden de la
molcula con prdida de la actividad biolgica. La desnaturalizacin puede
ser reversible; por ejemplo, la quim otripsina pierde su actividad al calentarla
pero puede ganarla de nuevo al enfriarla. Sin em bargo, en la m ayora de los
casos no es posible restitu ir la pro tena a su estado nativo luego de h ab er sido
desnaturalizada.
Despus de la desnaturalizacin, la protena se vuelve m enos soluble y
pierde su actividad biolgica, bien sea las propiedades horm onales, la capaci
dad de actuar como antgeno o la actividad enzim tica.
La desnaturalizacin puede o cu rrir debido a u n buen nm ero de causas,
algunas de las cuales se dan a continuacin.
Fsicas. Calor, presin, congelamiento, fuerzas de superficie, rayos X,
rayos ultravioleta, ultrasonido.
Qumicas. Extrem os de pH, solventes orgnicos, am idas y sus derivados.
Biolgicas. Enzimas proteolticas (la desnaturalizacin parece o cu rrir
antes de la hidrlisis).
La propiedad que tienen las protenas de desnaturalizarse, constituye el
fundam ento de uno de los mtodos para su determ inacin. Las protenas
desnaturalizadas tienden a form ar agregados de molculas y precipitarse;
esto se conoce con el nom bre de coagulacin. No todas las protenas son
igualm ente susceptibles a los agentes desnaturalizantes y esta propiedad
puede usarse para rem over ciertas protenas de u n a mezcla por medio de la
coagulacin.
Precipitacin por sal. Cuando se aade sal a una solucin de protena ocurre
u n increm ento en la solubilidad y esto se conoce con el nom bre de solubiliza-
cin por salado (salting in). Este increm ento inicial en la solubilidad se debe a
la estabilizacin de la protena efectuada por un descenso en el coeficiente de
actividad de los grupos ionognicos. A m edida que se au m en ta la fuerza
inica, se obtiene u n m xim o en la solubilidad seguido por u n descenso en la
m ism a que se conoce como insolubilizacin por salado (salting out). D urante
la insolubilizacin por salado, ocurre probablem ente u n a com petencia en tre
la protena y la solucin salina por las m olculas de agua disponibles para su
solvatacin, y entonces las interacciones p rotena-protena se hacen ms
im portantes.
La relacin en tre la solubilidad (S) y la fuerza inica (I) en la regin de la
insolubilizacin por salado es:
log S = K SI.
donde /? es el logaritm o de la solubilidad hipottica cuando I = 0 y K s es el

coeficiente de insolubilizacin. Un pequeo cam bio en I puede, por lo tanto,
causar un cam bio considerable en S. El valor de K s es sem ejante para la
m ayora de las protenas en una solucin salina dada, m ien tras que |3 es
dependiente de cada protena en particular. Por lo tanto, las cuatro protenas
de una mezcla, como se indica en la figura 5.1, pueden ser separadas recogien
do los precipitados que se form an en diferentes intervalos de fuerza inica.
En la prctica, no ocurre la separacin com pleta de las protenas puesto que
hay siem pre alguna superposicin de las curvas de solubilidad de las prote
nas en u na mezcla. Sin em bargo, la precipitacin por sal constituye un m to
do m uy valioso cuando se usa conju n tam en te con otros mtodos.
El sulfato de am onio tiene una solubilidad m uy alta y es la sal que se usa
ms frecuentem ente para el fraccionam iento de protenas. Una solucin
com pletam ente satu rad a de sulfato de am onio a te m p eratu ra am biente se
prepara aadiendo 767 g a 11 de agua; esto se conoce como 100% de saturacin
(NB no 100 g/100 m i) y los lm ites de los intervalos de fraccionam iento se
expresan en relacin a esta concentracin (por ejemplo: la protena x se
precipita a 40-50% de saturacin).
Tem peratura. G eneralm ente, un aum ento en la tem p eratu ra caus un
descenso en la solubilidad; por lo tanto, es im portante anotar si el fracciona
m iento se hizo a 0o C o a tem p eratu ra am biente.
El calentam iento cuidadoso puede usarse para desnaturalizar y separar
protenas indeseadas, pero debe hacerse con cuidado. P or ejemplo, la
0.5
-0 .5
- 1.0
-1 .5
5 10
I
Figura 5.1 Efecto de la fuerza inica sobre la solubilidad
de las protenas
ribonucleasa es estable a 90 C, m ien tras que la m ayora de las otras protenas

se desnaturalizan a esta tem p eratu ra. Si se aade sustrato a u n a enzim a, la
protena puede calentarse hasta 10 C ms que en ausencia de l sin llegar a la
desnaturalizacin.
pH. La solubilidad de u n a protena depende del pH y es m nim a en el punto
isoelctrico. El pH de la solucin debe ser controlado cuidadosam ente puesto
que una protena puede hacerse 10 veces m s soluble con un cam bio de pH de
slo una unidad por encim a o por debajo del punto isoelctrico.
Al igual que con el color, los cambios en el pH pueden usarse para
desnaturalizar protenas indeseadas. P o r ejem plo, al a ju star a 3 el pH de un
extracto de m alta, se d estruye la a -amilasa, pero la /?-amilasa perm anece
intacta.
Solventes orgnicos. M uchas protenas se desnaturalizan por los solventes
orgnicos, especialm ente cuando se usan a te m p eratu ra am biente. P o r esto se
recom ienda que cuando deban usarse en el aislam iento de protenas, se haga
en fro. El alcohol, la acetona y el m etanol son los solventes que se usan ms
frecuentem ente y su calidad puede ser crtica para los resultados obtenidos,
q ue pueden ser totalm ente diferentes con reactivos altam en te puros o m enos
purificados (GPR) y (AR).
Probablem ente los solventes causan precipitacin de protenas bajando la
constante dielctrica y por lo tanto aum entando las interacciones protena-
protena. A diferencia de las sales, es m enos probable que los solventes
orgnicos rem uevan grupos prostticos y por lo tanto, en ciertos casos, pueden
se r m s ventajosos para la separacin de protenas.
La precipitacin con solventes orgnicos debe efectuarse preferencial-
m en te a concentraciones inicas bajas (1 = 0.03 o m enos) de modo que llegue a
se r necesario dializar p rev iam en te la m uestra, pero debe ten erse en cuenta
q ue las protenas no precipitan si los electrolitos son rem ovidos com pleta
m ente.
Adsorcin. Otro mtodo de separacin de protenas es la adsorcin en gel, ya
q ue la captacin de las m olculas puede ser altam en te especfica. Sin
em bargo, las condiciones particu lares p ara separaciones determ inadas
todava tienen que enco n trarse en form a em prica. Los adsorbentes ms
com nm ente usados son la alm ina y el fosfato de calcio, con los cuales la
preparacin del gel es bastante crtica. La adsorcin se efecta u sualm ente en
solucin cida y la elucin se hace con u n am ortiguador ligeram ente alcalino.
Etapas finales de purificacin. D u ran te los varios pasos de purificacin con
frecuencia se necesita concentrar la solucin. Algunos de los m todos usados
p ara este fin se dieron en el captulo 3 en la seccin titulada dilisis.
Luego de que la solucin de p rotena se ha reducido a u n volum en conve
niente, se pueden u sar mtodos de crom atografa y electroforesis para
proseguir la purificacin (captulo 3).
Cristalizacin y alm acenam iento. Siem pre que sea posible, las protenas
puras deben obtenerse en form a cristalizada, pero es difcil dar una
orientacin respecto a este proceso pues el m anejo de la cristalizacin es ms
un art que una ciencia. Es m s fcil obtener cristales si en algn estado de la
purificacin se usan solventes orgnicos y la cristalizacin se efecta
aadiendo len tam en te una solucin de sal a una solucin concentrada de
protena hasta que se observe una ligera turbidez. En algunos casos es
conveniente dializar la m u estra de un da para otro contra una solucin de sal
de concentracin apropiada. Una vez obtenidos los cristales, se buscan las
m ejores condiciones p ara alm acenar la m u estra sin que pierda su actividad
biolgica. Como en el caso de la cristalizacin, las m ejores condiciones para la
conservacin deben encontrarse por el m todo de ensayo y error.
Pruebas de homogeneidad. El que una protena cristalice no siem pre indica
pureza, as que deben hacerse luego ensayos para saber si la m u estra es o no
homognea. Si se obtienen picos nicos en adsorcin, en colum nas de
intercam bio inico, en filtrado m olecular, en electroforesis y ultracentrifuga-
cin bajo diferentes condiciones fsicas, entonces hay una gran probabilidad
de que la protena sea pura. Las propiedades farmacolgicas y la actividad
enzim tica de los cristales pueden ser tiles p ara establecer la hom ogeneidad
de algunas protenas. O tro criterio de hom ogeneidad consiste en la presencia
de am inocidos en proporcin de nm eros enteros.
FUNCIONES DE LAS PROTEINAS EN LOS ORGANISMOS VIVOS
El nom bre protena deriva del griego proteios que significa de prim era
im portancia, nom bre plen am en te justificado. La funcin principal de las
protenas consiste en actu ar como com ponentes esenciales del m aterial
estructural, en contraposicin con los hidratos de carbono y grasas cuyo papel
principal es proporcionar energa. Esto no significa que las protenas sean
compuestos estticos; por el contrario, ellas estn en continuo intercam bio en
cuanto a sntesis y degradacin.
Aminocidos
Los aminocidos encontrados en las protenas provienen principalm ente de la
digestin de las protenas de la dieta. Algunos aminocidos pueden ser sin teti
zados por los anim ales y se conocen con el nom bre de aminocidos no
esenciales, m ientras que los aminocidos esenciales no pueden ser sintetiza
dos y se deben su m in istrar en la dieta.
Los q-aminocidos, adem s de participar en la sntesis de las protenas,
lo hacen tam bin en la sntesis de un gran n m ero de com puestos biolgicos
de im portancia, algunos de los cuales se dan en la tabla 5.3.
Aminocidos y proteinas 12S
Tabla 5.3 Algunos aminocids importantes y sus derivados
Nombre y frmula Funcin y estado natural
0-Alanina Este aminocido se produce durante la degradacin de

COOH pirimidina y forma tambin parte de la molcula de
coenzima A.
CHj
H2NH2
7-Acido aminoburtico Se forma en el cerebro por decarboxilacin del cido

COOH glutmico y puede actuar en dicho tejido como media
dor qumico en la transmisin del impulso nervioso
( h 2)3 entre algunas neuronas.
nh 2
Asparagina Se halla presente en diferentes tejidos vegetales, donde

COOH acta como un depsito de nitrgeno para la sntesis de
protenas durante la germinacin.
hnh 2
h2conh 2
Acido diaminopimlico Este aminocido es un constituyente importante de los

COOH mucopptidos en las paredes de las clulas bacterianas.
HNH2
( h 2)3
chnh 2
OOH
3,4-Dihidroxifenilalanina Abreviadamente se conoce como DOPA; es un precur

CH2CH(NH2)COOH sor del importante pigmento melanina. Este pigmento
es responsable por la coloracin del pelo, la piel y los
ojos.
Cl OH
Histamina La histamina se obtiene por decarboxilacin de la histi-

p = j CH2CH2NH2 dina. Es un vasodilatador y participa en las reacciones
alrgicas y de shock.
HN.
Tabla 5.3 (continuacin)

5-Hidroxitriptamina
(serotonina)
HO 1----- tch 2ch 2nh 2
Este aminocido se sintetiza a partir del triptfano y se

encuentra en el cerebro, en el intestino y en las plaque
tas de la sangre. Estimula la contraccin del msculo
liso y es un vasoconstrictor potente. El nivel de 5-HT en
el cerebro parece afectar el grado de actividad elctrica.
Tiroxina
Esta hormona se forma a partir de tiroxina en la gln

dula tiroides y ayuda a controlar el metabolismo basal;
influye tambin en el crecimiento y en la diferencia
cin.
Pptidos
El trm ino pptido se usa g eneralm ente p ara polm eros que contienen hasta
50 residuos de aminocidos o que poseen un peso m olecular por debajo de
5000. Algunas cadenas peptdicas se en cu en tran ligadas a hidratos de carbono
como en el caso de los peptidoglicanes de la pared celular de las bacterias o las
glicoprotenas halladas en las sustancias de los grupos sanguneos. En el p ri
m er caso m uchos de los aminocidos son de la form a D y no de la configura
cin L encontrada usualm ente.
Un buen n m ero de pptidos pueden tam bin encontrarse en estado libre
y son probablem ente interm ediarios en el recam bio de protenas; sin
embargo, algunos pptidos se sintetizan p ara ejercer funciones biolgicas
especficas (tabla 5.4).
Protenas
En los anim ales superiores es esencial u n a ingestin adecuada de protenas,
puesto que slo las form as sim ples de vida son capaces de sin tetizar su pro te
na a p a rtir de otras fuentes de nitrgeno. Las protenas estn presentes
en todos los tejidos del cuerpo y constituyen una gran p arte de la estru ctu ra
celular. Adems, m uchas de ellas tien en funciones fisiolgicas especializadas.
Tabla 5.4 Algunos ejemplos de pptidos biolgicos importantes

Glutatin Es un tripptido con uno de los enlaces peptdicos for
7-glucisgli mados a travs del carbono 7 en vez del carbono a . El
glutatin es una coenzima para la glioxilasa, pero su
funcin principal es probablemente proteger los grupos
tioles de las molculas y membranas mantenindolos
en la forma reducida. Existe en dos formas: una oxidada
y otra reducida.
2G-SH . G -S-S -G + 2H.

Gramicidins S Este decapptido es un antibitico obtenido de la bacte
ria Bacillus brevis. El pptido es cclico y contiene los
/ L'Pr\ aminocidos poco comunes, D-fenilalanina y L-orniti-
D-Fen L-Val na. Otro buen nmero de antibiticos son tambin
L-Leu L-Orn pptidos.
L-<^m L-jjeu
L-Val D-Fen
L-Pro
Oxitocina Este pptido es una hormona sintetizada en el lbulo
CisTirlie posterior de la pituitaria y produce contraccin uterina
y eyeccin de leche en la hembra de los mamferos.
1
1
S
is-Asp(NH2)-Glu(NH2)
ro-Leu-Gli(NH2)
Vasopresina Otra hormona de la pituitaria posterior es la vasopresi
C is-T irFen na la cual tiene una estructura semejante a la oxitocina.
i Produce una elevacin en la presin sangunea y reten
cin de agua en los riones.
i
1
CisAsp(NH2)Glu(NH2)
roArgG1 (NH2)
El nm ero y tipo de las protenas presentes en la m ateria viva son m uy

am plios y slo podemos considerar brevem ente unos pocos.
Membranas. Las m em branas de todas las clulas y organelas contienen
protenas asociadas con lpidos. Las lipoprotenas de la m em b ran a actan
como una barrera de perm abilidad selectiva y participan en el tran sp o rte de
m ateriales dentro y fuera de la clula y sus com partim ientos.
Muchas enzimas, incluyendo aquellas que participan en la biosntesis de

macromolculas y en la detoxicacin de com puestos extraos, form an p arte
de la m em brana celular de algunos tejidos. Las protenas de m em brana
incluyen tam bin molculas transportadoras que participan en el transporte
a travs de la m em b ran a celular.
Protenas plasmticas. El plasm a sanguneo contiene una gran cantidad de
protenas, cada una de las cuales tiene u n a funcin biolgica especializada. La
albm ina del plasm a, por ejem plo, acta como u n a reserva de aminocidos; es
im portante para m a n te n e r el pH del plasm a y la presin osmtica, y
transporta una gran cantidad de compuestos en la sangre. Las globulinas o y
P participan en el tran sp o rte de los lpidos y las 7 -globulinas estn relacio
nadas con los anticuerpos. El fibringeno es una protena soluble que se
convierte en fibrina insoluble d u ran te la coagulacin sangunea.
Hormonas. M uchas protenas tienen propiedades horm onales. La insulina,
segregada por las clulas /? del pncreas, controla el m etabolism o de los
hidratos de carbono bajando el nivel de azcar en la sangre, m ientras que el
glucagn de las clulas a aum enta el azcar sanguneo. La gastrina estim ula
la secrecin cida en el estmago y la horm ona paratiridea participa en la
regulacin del m etabolism o del calcio y del fsforo.
Enzimas. Todas las enzim as son protenas, y la im portancia y am plia
distribucin' de estos catalizadores biolgicos son bien conocidas. Su alta
especificidad y actividad cataltica con respecto al sustrato se debe a la disposi
cin de los aminocidos en el espacio. La estru ctu ra de un buen n m ero de
enzimas de bajo peso m olecular tales como ribonucleasa y lisozima ha sido
dilucidada por mtodos qum icos y fsicos. Tam bin han sido identificados
los aminocidos que participan en la unin con el sustrato.
PRUEBAS CUALITATIVAS
Propiedades generales de los aminocidos
EXPERIMENTO 5.1 Solubilidad de los aminocidos
Materiales 100
3. Etanol. 11
4. Cloroformo. 11
5. Aminocidos (glicina, cido glutmico, 50 g de
lisina y alanina). cada uno
Mtodo
Exam ine la solubilidad de los anteriores aminocidos en agua, en cido
diluido, en lcali diluido, en etanol y en cloroformo. In terp re te los resultados.
EXPERIMENTO 5.2 R e a c c i n d e la n i n h i d r i n a
Fundamento
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno), un agente oxidante poderoso,
reacciona con todos los a-am inocidos a un pH en tre 4 y 8 para dar un
compuesto de color prpura. Esta reaccin se efecta tam bin con am inas
prim arias y amonaco pero sin desprendim iento de C 0 2. Los Aminocidos
prolina e hidroxiprolina tam bin reaccionan con la ninhidrina, pero en este
caso se obtiene un color am arillo en vez del p rp u ra.
La reaccin es m uy sensible y es la ideal para la deteccin de aminocidos
en crom atogram as y su' determ inacin cuantitativa en fracciones de
columnas.
CO OH NH2
\ / I
(i) C + RCCOOH
/ \ I
CO OH H
Ninhidrina
CO OH
\ /
c + RCHO + C O ,+N H ,
/ \
CO H
Hidrindantina
() + NH,
Hidrindantina Ninhidrina
3H20
Materiales 100
1. Aminocidos (glicina, tirosina y triptfano, 1 g/1). 250 mi
2. N inhidrina (2 g/1. P represe fresco). 100 mi
/
Mtodo
Coloque 1 mi de solucin de aminocido en un tubo de ensayo y ajuste el pH
cerca a la neutralidad; agregue cinco gotas de solucin de nin h id rin a y deje
h e rv ir por 2 m inutos. D eterm in e los lm ites de sensibilidad de la reaccin
haciendo el ensayo en diluciones seriadas de glicina hasta que se obtengan
resultados negativos.
EXPERIMENTO 5.3 R ea cci n x a n to p r o te ic a
Fundamento
Los aminocidos que contienen un ncleo arom tico form an nitroderivados
de color am arillo cuando se calientan con cido ntrico concentrado. Las sales
de estos derivados son de color naranja.
Materiales 100
1. Aminocidos (glicina, tirosina, triptfano y 100 mi
fenilalanina 1 g/1).
2. Fenol (1 g/1). 100 mi
3. Acido ntrico (concentrado). 500 mi
4. Hidrxido de sodio (10 mol/1). 500 rnl
Mtodo
Agregue volm enes iguales de cido ntrico a aproxim adam ente 0.5 mi de
solucin de aminocido, deje en friar y observe el cambio de color. Agregue
suficiente NaOH hasta que la solucin sea fu ertem en te alcalina. El cambio de
coloracin, de am arillo en solucin cida a n a ra n ja brillante en solucin lcali,
constituye un resultado positivo. Repita la p rueba con fenol. La fenilalanina
debe dar una reaccin negativa o dbilm ente positiva.
*
EXPERIMENTO 5.4 R e a c c i n d e M ill n
Fundamento
Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el
reactivo de Milln form ando com puestos rojos. Los nicos aminocidos
fenlicos son la tirosina y sus derivados y solam ente ellos dan u n a reaccin
positiva. El reactivo original de Milln consista en u n a solucin de nitrato
m ercrico en cido ntrico 50% v/v, pero actualm ente se usan modificaciones
menos susceptibles a la in terferen cia de las sales inorgnicas.
Materiales 100
1. Aminocidos (glicina, tirosina y fenilalanina 1 g/1). 200 mi
2. Reactivo de Milln (solucin de sulfato m ercrico 200 mi
150 g/1 en cido sulfrico 15% v/v).
3. Fenol (1 g/1). 200 mi

4. N itrito de sodio (10 g/1). 200 mi
5. Baos de agua hirviendo 100
M to d o
A 1 mi de la m uestra aada cinco gotas del reactivo de Milln y caliente en un
bao de agua hirviendo por 10 m inutos. Deje en friar a te m p eratu ra am biente
y agregue cinco gotas de solucin de nitrito de sodio, la aparicin de u n color
rojo ladrillo indica u n resultado positivo.
i <*C-C.
EXPERIMENTO 5.5 R e a c c i n d e l c id o g lio x ilic o p a r a tr ip t fa n o '
F u n d a m e n to
El grupo indlico del triptfano reacciona con cido glioxilico en presencia del
cido sulfrico concentrado dando un color p rp u ra. El cido actico glacial
que ha sido expuesto a la luz contiene cido glioxilico.
M ateria le s 1Q0
1. Aminocidos (glicina, tirosina y triptfano, 1 g/1). 500 mi
2. Acido actico glacial que ha sido expuesto a la luz. 11
3. Acido sulfrico (concentrado). 11
M to d o
A 2 mi de la m uestra aada 2 mi de cido actico.glacial, luego deje caer len ta
m ente 2 mi de cido sulfrico concentrado por las paredes del tubo hasta que
se form en dos capas. Observe el cambio de color en la interfase. Si se form a un
anillo violeta en la interfase de los dos lquidos, la reaccin se considera
positiva.
EXPERIMENTO 5.6 P r u e b a d e P a u ly
F u n d a m e n to
El cido sulfanlico diazotizado se une con las am inas, fenoles e imidazoles
para dar compuestos azo fu ertem en te coloreados. Los com puestos de diazonio
se form an nicam ente en el fro, as que las soluciones deben en friarse en
hielo antes de la diazotizacin.
M ateria le s
1. Aminocidos (glicina, tirosina, histidina y 500 mi
triptfano, 1 g/1).
2. Acido sulfanlico (10 g/1 en solucin de cido 500 mi
clorhdrico 1 m ol/1).
3. Nitrito de sodio (50 g/1). 500 mi
4. Carbonato de sodio (10 g/1). 11
S 0 3H + HN02 +HC1 CIN, SO3 H + 2H20
Acido sulfanlico Compuestos diazonio
( )
CH2 CH(NH2)COOH
+ C1N2 so 3h
Tirosina Compuesto diazonio Colorante azo

+
HC1
Mtodo
Mezcle 1 mi de cido sulfanlico con 2 mi de la m uestra; enfre en hielo,
agregue 1 mi de solucin de N aN 0 2 y djela al fro d u ran te 3 minutos.
Alcalinice la solucin aadiendo 2 mi de solucin de N a2C 0 3 y anote los
colores que se h an formado.
EXPERIMENTO 5.7 Reactivo de Ehrlich

Fundamento
El reactivo de E hrlich reacciona con u n buen n m ero de compuestos
orgnicos tales como indoles, am inas arom ticas y com puestos ureicos para
dar complejos coloreados.
Materiales 100
1. Reactivo de Ehrlich (p-dim etilam inobenzaldehdo 11
100 g/1 en cido clorhdrico concentrado).
2. Aminocidos (glicina, triptfano e hidroxiprolina 1 g/1). 100 mi
3. U rea (1 g/1). 100 mi
Mtodo
A gregue 2 ml del reactivo de Ehrlich a 0.5 m i de la m u estra y observe los
colores.
-
EXPERIMENTO 5.8 Prueba de nitroprusiato

Fundamento
Los grupos tioles reaccionan con nitroprusiato de sodio (N a2Fe (CN)5NO) en
presencia de un exceso de am onaco p ara d ar u n color rojo.
Materiales 100
1. Aminocidos azufrados (cistena, cistina y 500 mi
m etionina 1 g/1).
2. N itroprusiato de sodio (20 g/1. P represe fresco). 500 mi
3. Hidrxido de amonio. 500 mi
Mtodo
Mezcle 0.5 mi de una solucin fresca de nitroprusiato de sodio con 2 m i de la
m uestra y aada 0.5 mi de hidrxido de amonio.
Repita la prueba con cistina despus de m ezclar volm enes iguales de
cistina y NaCN (venenoso, no pipetee) y deje reposar la solucin d u ran te unos
pocos minutos.
EXPERIMENTO 5.9 Reaccin de Sakaguchi

Fundamento
El nico am inocido que contiene grupos guanidinos es la arginina; sta
reacciona con a -naftol y un agente oxidante tal como agua de brom o dando
un color rojo.
[2N , nh
\ s Grupo guanidino
c
Arginina NH
( h 2)3
c h .n h 2
I
COOH
Materiales 100
1. Aminocidos (glicina y arginina 1 g/1). 500 mi
2. G uanidinas (glicociamina, m etilguanidina y 500 mi
creatinina 1 g/1).
3. Urea (1 g/1). 500 mi
4. Hidrxido de sodio (10 mol/1). 11
5. ol -naftol (10 g/1 en alcohol). 100 mi
6. Agua de bromo. (A ada unas pocas gotas de brom o a 250 mi
100 mi de agua y agite. Hgalo en u n ex tracto r de gases).
Cuidado: el brom o produce quem aduras fu ertes cuando
se pone en contacto con la piel.
Mtodo
Mezcle 1 mi de lcali fu erte con 3 m i de solucin de am inocido y agregue dos
gotas de a -naftol. Mezcle fu erte m en te y aada cuatro o cinco gotas de agua de
bromo. Note el color formado.
Exam ine tam bin una serie de compuestos relacionados para ver qu
grupo es el que produce la reaccin positiva.
H2N NH H2 N NH H2N NH H2 N nh2

\ ^ \ S \ /
C V
I
C
I
C
NH NH N(CH3) &
I
CH2 h3 h2
OOH COOH
G licociam ina M etilguanidina Creatina Urea
Reacciones generales de las protenas
EXPERIMENTO 5.10 P ru e b a d el B iu re t p a ra e n la c e s p e p td ic o s
Fundamento
El sulfato alcalino de cobre reacciona con com puestos que contienen dos o
ms enlaces peptdicos dando un complejo de coloracin violeta. La intensi
dad del color obtenido es una m edida del n m ero de enlaces peptdicos p re
sentes en la protena. El nom bre de la prueba se ha tom ado del com puesto
B iuret que da una reaccin tpicam ente positiva.
CONH2
I
Biuret NH
I
CONH2
La reaccin no es absolutam ente especfica para los enlaces peptdicos, ya

que cualquier com puesto que contenga dos grupos carbonilos unidos por un
tomo de nitrgeno o de carbono da un resultado positivo.
Materiales 100
1. Sulfato de cobre (10 g/1 de C u S 0 4 . 5H 20 ). 250 mi
3. P rotenas (5 g/1 albm ina, casena, gelatina y peptona: ' 500 mi
la casena se disuelve en un poco de NaOH diluido y las
otras protenas en solucin salina).
4. G lutatin (5 g/1). 500 mi
Mtodo
A 2 mi de la m uestra agregue cinco gotas de sulfato de cobre y luego 2 mi de
NaOH; mezcle vigorosam ente y observe los colores formados.
EXPERIMENTO 5.11 D e s n a tu r a liz a c i n p o r c a lo r y p H e x t r e m o s

Materiales 100
1. Protenas, como en el experim ento 5.10. 21
2. Acido clorhdrico (1 mol/1). 500 mi
3. Hidrxido de sodio (1 mol/1). 500 mi
4. Acido ntrico (conc.). 21
5. Baos de agua hirviendo. 50
Mtodo
En tres tubos de ensayo coloque 5 m i de cada u n a de las protenas y agregue 0.5
mi de HC1, 0.5 m i de NaOH y 0.5 m i de agua. Coloque los tubos en el bao d e
agua hirviendo d u ran te 10 m inutos y enfre a te m p eratu ra am biente. A juste
los tubos cidos y alcalinos hasta la neutralidad. C om ente sus observaciones.
A 2 mi de la solucin de protena, agregue len tam en te por las paredes del
tubo 2 mi de H N 0 3 concentrado hasta que se form en dos capas; luego mezcle
cuidadosam ente los dos lquidos. A note sus observaciones.
EXPERIMENTO 5.12 P r e c ip ita c i n p o r m e t a l e s p e s a d o s

Fundamento
A pH 7 y por encim a de l, las protenas estn u su alm en te cargadas negativa
m ente, as que la adicin de m etales cargados positivam ente neutraliza la
carga y la protena se precipita. La precipitacin por m etales pesados es, por lo
tanto, ms efectiva a valores de pH neutros ligeram ente alcalinos, pero la
solucin no puede ser m uy alcalina porque Se corre el riesgo de que se
precipiten hidrxidos de los metales.
El precipitado es frecu en tem en te soluble en un exceso de iones de m etal
pesado ya que tal exceso confiere a las partculas cargas positivas estables.
Materiales , 100
1. Protenas como en el experim ento 5.10. 500 mi
2. Metales pesados (sulfato de cobre, acetato de plomo 21
y nitrato m ercrico 0.1 mol/1).
Mtodo
A 2 m i de la solucin de las protenas, aada unas gotas del m etal pesado. Qu
sucede cuando se aade un exceso del reactivo? ;
i
EXPERIMENTO 5.13 P r e c ip ita c i n p o r r e a c t i v o s a c d ic o s
Fundamento
Algunos compuestos cidos poseen una carga negativa grande que neutraliza
una protena cargada positivam ente form ando una sal insoluble. Los
y>r
reactivos cidos son, por lo tanto, ms efectivos a valores de pH cido en los

que las protenas poseen carga positiva.
Materiales 100
1. Protenas como en el experim ento 5.10. 500 mi
2. Reactivos acdicos (cido sulfosaliclico 20% p /v , cido 200 mi
pcrico saturado, 10% p /v , cido tnico y cido tricloro
actico 20% p /v ).
Mtodo
A 1-2 mi de la solucin de protenas aada cinco gotas del reactivo acdico.
Qu sucede cuando se aade un exceso de reactivo? A gregue len tam en te
NaOH diluido y observe el resultado a m edida que el pH sube.
METODOS DE ENSAYO
EXPERIMENTO 5.14 D e t e r m i n a c i n c u a n t i t a t i v a d e lo s a m in o c id o s u s a n d o la
r e a c c i n d e la n i n h i d r i n a
Fundamento
El aspecto qum ico de la reaccin de la n in h id rin a se ha considerado
previam ente y la p rueba cualitativa puede m odificarse para d ar u n m todo de
ensayo cuantitativo. No todos los am inocidos dan exactam ente la m ism a
intensidad de color y esto debe ten erse en cu en ta p ara los clculos. Los
iminocidos prolina e hidroxiprolina dan u n color am arillo, as que ellos se
leen a 440 nm.
Materiales 100
1. Aminocidos (cido asprtico, arginina, leucina y 11
prolina 0.1 mmol/1).
2. A m ortiguador de acetato (4 mol/1, pH 5.5). 500 mi
3. M etilcelosolve (etileno glicol m onom etil ter), 11
4. Etanol (50% v/v). 21
5. Reactivo de n in hidrina. (Disuelva 0.8 g de n in h id rin a 1.2 1
y 0.12 g de h id rin d an tin a en 30 m i de metilcelosolve,
aada 10 m i de am ortiguador de acetato; preprelo
fresco y alm acnelo en u n a botella oscura).
Mtodo
En u n tubo de ensayo pipetee 2 m i de la solucin de am inocidos, aada 2 mi
de reactivo de n in h id rin a en solucin 5 y caliente en u n bao de agua h ir
viendo por 15 m inutos. D eje en fria r a te m p e ra tu ra am biente, aada 3 mi
de etanol de 50% y lea la extincin a 570 n m (o 440 nm ) despus de 10 m inutos.
P rep are los blancos apropiados y com pare la equivalencia de color de los
am inocidos investigados.
EXPERIMENTO 5.15 Prueba de B iuret
Materiales 100
1. Patrn de protenas (5 mg de alb m in a/m l). P represe 11
fresco.
2. Reactivo de B iuret. (Disuelva 3 g de sulfato de cobre 21
(C u S 0 4 . 5H 20 ) y 9 g de ta rtra to sdico potsico en
500 mi de hidrxido de sodio 0,2 mol/1; aada 5 g de
yoduro potsico y com plete hasta 1 1 con hidrxido
de sodio 0.2 mol/1.)
3. Baos de agua a 37 C. 20
Mtodo
A 2 mi de la solucin de protena, aada 3 ml del reactivo de B iuret, mezcle y
caliente a 37 C d u ran te 10 m inutos. D eje e n fria r y lala extincin a 540 nm.
Elabore un grfico de la extincin en funcin de la concentracin de
albm ina: esta curva patrn le puede servir en otros experim entos.
EXPERIMENTO 5.16 Mtodo de Folin-Low ry para determ inacin de protenas
Fundamento
Las protenas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau para dar un
complejo coloreado. El color que se form a es debido a la reaccin del cobre
alcalino con la protena, tal como sucede en el ensayo del b iu ret y la reduccin
de fosfomolibdato por la tirosina y el triptfano presentes en la protena. La
intensidad del color depende del n m ero de am inocidos aromticos
presentes y cam biar segn la clase de protena.
Materiales 100
1. Solucin alcalina de carbonato de sodio (Na2C 0 3 20 g/1 31
en NaOH 0.1 mol/1).
2. Solucin de sulfato de cobre-tartrato sdico potsico 100 mi
(5 g/1 C u S 0 4 . 5H 20 en ta rtra to sdico potsico 10 g/1).
P rep rese fresco m ezclando las dos soluciones
preparadas por separado.
3. Solucin alcalina. P represe el mismo da m ezclando 31
50 mi de (1) y 1 mi de (2).
4. Reactivo de Folin-Ciocalteau. (Diluya el reactivo 500 mi
com ercial con un volum en igual de agua, el mismo da
que se va a utilizar. Esta es una solucin de tungstato
de sodio y m olibdato de sodio en cido fosfrico y
cido clorhdrico).
5. Patrn de protena (solucin de albm ina 0.2 m g/m l). 11
Mtodo
A 1 mi de la m u estra agregue 5 m i de solucin alcalina. Mezcle
vigorosam ente y deje rep o sar a te m p eratu ra am biente por 10 m inutos o ms.
A gregue 0.5 m i de reactivo diluido de Folin-C iocalteau en f o r m a r p i d a y
m e z c l a n d o i n m e d i a t a m e n t e . D espus de 30 m inutos lea la extincin contra el
blanco apropiado a 750 nm.
D eterm ine la concentracin de protenas de una solucin problem a
despus de p re p a ra r u n a curva patrn.
EXPERIMENTO 5.17 Absorcin u ltr a v io le ta , d e p r o te n a y a m in o c id o s

!
Fundamento
Por debajo de 230 nm , la extincin de u n a solucin de
A b s o r c i n a 210 n m .
protena sube precipitadam ente alcanzando u n m xim o a 190 nm ; esto se debe
principalm ente al enlace peptdico. En la prctica es m s conveniente m edir
la extincin a 210 nm ya que el coeficiente de extincin E%m a esta longitud
de onda es de cerca de 200 p ara la m ayora de las protenas. Todas ellas tienen
una absorcin especfica sim ilar pues el contenido de enlaces peptdicos es
sem ejante.
Un n m ero de com puestos tales como los cidos carboxlicos, am ortigua
dores inicos, alcoholes, bicarbonatos y com puestos arom ticos tam bin
absorben en esta regin, as que debe ten erse cuidado en la in terp retaci n de
los resultados.
La tirosina y el triptfano absorben a 275 n m y a 280 nm:
A b s o r c i n a 280 n m .
por lo tanto las protenas que contienen estos aminocidos pueden tam bin
absorber en esta regin. El coeficiente de extincin especifica vara
de acuerdo a la cantidad de estos aminocidos presentes en la protena dada.
Los valores que se en cu en tran en la prctica van de 6 a 60; sin em bargo,
m uchas protenas tienen un valor m uy cercano a 10; esto qu iere decir que 1
m g /m l de pro tena da u n a extincin a 280 n m de aproxim adam ente 1 cuando
se m ide utilizando u n a trayectoria de luz de 1 cm.
La desventaja de este m todo es que m uchos otros com puestos absorben
en esta regin, particu larm en te los cidos nucleicos que tien en u n pico a 260
nm. Las protenas puras p resentan una razn de absorcin a (280 nm/260 nm )
de cerca de 1.8, m ien tras que p ara los cidos nucleicos esta razn es de 0.5.
Materials JO.
1. P rotenas (albm ina y casena 5 g/1). 50 mi
2. Aminocidos (tirosina, triptfano y fenilalanina en 50 mi
agua 0.1 mmol/1. A juste a pH 7 con HC1 10 m m ol/1 y NaO H 10
mmol/1).
Mtodo
Haga un grfico del espectro de absorcin de los compuestos usados en el
intervalo 190-400 nm . En el extrem o inferior de longitudes de onda, debe
diluirse la solucin de protenas aproxim adam ente 1 en 200. Cules
aminocidos absorben m s fu ertem en te a 280 nm ?
EXPERIMENTO 5.18 Comparacin de diferentes m todos para determ inar

protenas
Investigue los cinco diferentes mtodos para d eterm in a r protenas usando
albm ina, casena, gelatina y lisozima como protenas de referencia.
D eterm ine la estabilidad del color, reproducibilidad y sensibilidad de los
mtodos y seale las ventajas y limitaciones de cada uno.
EXPERIMENTO 5.19 Curvas de titulacin de aminocidos
Fundamento
En el captulo 2 se discuten las precauciones generales que deben tenerse
d u ran te la titulacin cido-bsica, y los clculos de los valores de pK. Las
propiedades cido-bsicas de las protenas se han descrito an terio rm en te en
este captulo.
Materiales 1Q
1. Acido clorhdrico (100 mmol/1). 250 m i
3. Aminocidos (glicina, histidina y lisina 100 mmol/1; 250 mi
cido glutmico, 50 mmol/1).
5. B uretas (10 mi). 10
Mtodo
En un vasb de precipitados de 100 mi pipetee 10 mi de la solucin de
aminocido. E standarice el m edidor de pH y d eterm in e el pH de la solucin.
Usando una bureta agregue poco a poco HC1 100 mmol/1 y determ in e el pH
despus de cada adicin. C ontine agregando cido hasta un pH de
aproxim adam ente 1.3.
Lave los electrodos con agua destilada, estandarice de nuevo el m edidor de
pH y titule otros 10 mi de la solucin con hidrxido de sodio 100 mmol/1, hasta
pH 12.5.
D eterm ine los valores de pK usando las curvas obtenidas y com prelos con
los valores que se dan enseguida. Calcule los puntos isoinicos a p artir de sus
datos.
Aminocido pKi Pk 2 P*3

glicina 2.4 9.7
alanina 2.3 9.9
cido glutmico 2.2 4.3 9.7
histidina 1.8 6.0 9.2
lisina 2.2 9.2 10.8
EXPERIMENTO 5.20 Titulacin de alanina en presencia de form ol

Fundamento
El form aldehdo reacciona con los grupos am ino (N H 2) para fo rm ar los
compuestos m onom etilol y dimetilol:
- N H 2 +HCHO ------ * -N H (C H 2OH),

NH(CH2 OH) + HCHO ------ -N (C H 2OH)2.
El form aldehdo no reacciona con los grupos am ino cargados (N H 3+)ras que
el efecto que se logra al a ad ir form aldehdo es desplazar el pK del grupo
am ino a u n valor m s bajo de pH. Por tanto, el pH del punto final de titulacin
de un am inocido con NaOH dism inuye y puede ser determ inado usando
fenoltalena como indicador. Esto dem uestra que el am inocido existe como
zw itterion ya que en caso de que predom inara la form a no cargada, sera la
parte cida y no la p arte alcalina de la curva de titulacin la que cam biara al
aadirle form aldehdo.
n h 3+ nh2
CCOO + OH' _ R-C O O '

J,
form a zw itterion
nh2 NH3+
-C -C O O H + H+ RCCOOH
forma no cargada
Materiales 10
1. Acido clorhdrico (100 mmol/1). 250 mi
3. A lanina (100 mm ol/1). 250 mi
4. F orm alina (pre-neutralizada con NaOH diluido). 50 mi
Mtodo
D eterm ine la curva de titulacin p ara el am inocido alanina tal como se
describi anteriorm ente; repita luego la titulacin despus de a ad ir 1 mi de
form alina a 10 m i de la solucin d e alanina. Haga el grfico de la curva de
titulacin y com prelo con la curva norm al p ara alanina.
Cul pK es alterado por este tratam ien to y por qu?
Decida cul es el m ejo r pH p ara com enzar y finalizar la titulacin con
formol. '
AISLAMIENTO DE PROTEINAS
En la purificacin y separacin de protenas se usan algunas tcnicas fsicas;
los principios sobre los cuales se basan han sido discutidos p reviam ente en
este captulo.
Algunos de los experim entos descritos en el captulo sobre mtodos de
separacin pueden Ser usados en esta seccin, ya que la m ayora de los
ejemplos seleccionados en ellos involucran protenas.
EXPERIMENTO 5.21 Solu bilidad de protenas en agua destilada y en soluciones

salinas
Fundamento
Las albm inas tales como ovoalbm ina, albm ina srica y lactoalbm ina son
fcilm ente solubles en agua destilada y en soluciones salinas diluidas, las
globulinas son tam bin solubles en soluciones salinas, pero insolubles en agua
destilada. Basados en estas caractersticas, hace algunos aos se hizo la
clasificacin de las protenas en albm inas y globulinas.
Las globulinas son precipitadas en soluciones de sulfato de am onio 50% de
saturacin. Las albm inas se precipitan slo cuando la solucin se satu ra con
sulfato de am onio a u n pH cercano a su punto isoelctrico.
Materiales 10
1. Reactivos y aparatos p ara electroforesis en acetato
de celulosa (experim ento 3.15).
2. Cloruro de sodio (0.15 mol/1). 200 m i
3. Reactivos para la determ inacin de protena por los
mtodos de biuret y Folin-Low ry (experim ento 5.15
y 5.16).
5. Huevos. * 12
6. Leche. 11
7. Sulfato de am onio saturado. (A ada 767 g de sulfato 11
de amonio a 11 de agua).
8. Protenas patrn. (A lbm ina srica bovina y

7 -globulina).
Mtodo
P r e p a r a c i n d e f r a c c i o n e s . En u n vaso de precipitado rom pa un huevo,
separe la yem a y aada 200 m i de agua destilada. Agite rp id am en te hasta que
las globulinas se precipiten m ien tras que las albm inas p erm an ecen en
solucin. C entrifugue la suspensin a 3000 pp o r 10 m inutos y disuelva el p re
cipitado en el m nim o volum en posible de solucin salina. G u ard e las dos
fracciones hasta cuando se necesiten.
Rem ueva la grasa de un poco de leche por centrifugacin y aada
lentam ente un volum en igual de solucin de sulfato de am onio saturado
agitando constantem ente. S epare la solucin de albm ina y disuelva la globu
lina precipitada en el m nim o volum en posible de solucin salina.
D e te r m in a c i n de l a s f r a c c i o n e s p r o t e i c a s . D eterm ine el contenido de
protena de las fracciones de albm ina y globulina de la clara de huevo usando
los mtodos de B iu ret y Folin-Lowry. Em plee albm ina y 7 -globulina como
patrones. C om pare la distribucin de las protenas obtenidas por estos
mtodos y com ente los resultados.
Los m todos colorim tricos para el ensayo de protenas no deben
em plearse en presencia de sulfato de amonio, as que las protenas de la leche
deben determ in arse m idiendo su absorcin a 280 nm. C om pare de nuevo los
resultados usando como patrones albm ina y 7 -globulina.
E l e c t r o f o r e s i s d e l a s a l b m i n a s y l a s g l o b u l i n a s . E xam ine los patrones elec-
troforticos de las soluciones obtenidas en acetato de celulosa y com pare la
distribucin de las protenas.
EXPERIMENTO 5.22 A i s l a m i e n t o d e la c a s e n a d e la le c h e
Fundamento
La casena es la principal protena encontrada en la leche y est p resen te en
u n a concentracin de aproxim adam ente 35 g/1. No es u n com puesto simple
sino una m ezcla heterognea de protenas que contienen fsforo.
La m ayora de las protenas m u estran u n a solubilidad m nim a en su punto
isoelctrico y este principio se usa para sep arar la casena ajustando el pH de
la leche a 4.8, su p u nto isoelctrico. La casena es tam bin insoluble en alcohol
lo cual p erm ite rem o v er la grasa de las preparaciones.
Materiales _10
1. Leche. 11
2. A m ortiguador de acetato sdico (0.2 mol/1, pH 4.6). 11
3. Etanol (95% v/v). 500 mi
4. E ter ( c u i d a d o : m uy inflam able). 500 mi
5. T erm m etros de 0 a 100 C. 5
6. Muselina.
7. Embudo B uch n er y papel de filtro. 5
Mtodo
En un vaso de precipitados de 500ml coloque 100ml de leche y calintelaa 40 C.
C aliente tam bin 100 m i de am ortiguador de acetato y aada len tam en te, agi
tando. El pH final de la m ezcla debe ser aproxim adam ente 4.8 y debe verifi
carse con un m edidor de pH. E nfre la suspensin a te m p e ra tu ra am biente y
djela reposar por 5 m inutos antes de filtrarla a travs de la m uselina.
Lave el precipitado varias veces con un pequeo volum en de agua y luego
suspenda en 30 mi de etanol. F iltre la suspensin a travs de un em budo
B uchner y lave el precipitado por segunda vez con una mezcla de volm enes
iguales de etanol y ter. Por ltim o, lave el precipitado sobre el papel de filtro
con 50 m i de te r y squelo m anteniendo el vaco. R em ueva el polvo form ado
y colquelo en un vidrio de reloj p ara p erm itir la evaporacin del ter.
Pese la casena y calcule el porcentaje de recuperacin de protena. Qu
correlacin hay e n tre el valor que usted ha obtenido y el terico de 3,5 g x 100
mi de leche?
EXPERIMENTO 5.23 Preparacin y propiedades del citocromo c
Fundamento
Cuando se hom ogenizan corazones en cido tricloroactico, la m ayora de las
proteinas.se precipitan, m ien tras que el citocromo c perm an ece en solucin.
Al extracto de cido tricloroactico, se aade sulfato de amonio, el cual
com pleta la precipitacin de la mioglobina, hem oglobina y otras protenas.
M ayor acidificacin con cido tricloroactico precipita el citocrom o c que
puede ser entonces dializado y caracterizado.
Materiales JJL
1. Corazn de cerdo o de buey (1 kg por dos estudiantes). 5 kg
2. M quinas de m oler. 2
3. Muselina.
4. Hidrxido de sodio (100 g/1). 500 mi
5. Sulfato de amonio.
6. Acido tricloroactico (200 g/1). 500 mi
7. Acido tricoloroactico (0.145 mol/1). 61
8. Solucin saturada de sulfato de amonio. 11
9. Tubo de dilisis.
11. Espectrofotmetros. 5
12. Licuadoras. 5
13. - F erricianuro potsico (10 mm ol/1). 50 m i
14. Solucin saturad a de ditionita de sodio. 50 m i
Mtodo
Rem ueva la grasa de los corazones y pselos. M uela 1 kg de corazn y licelo
en 1 1 de cido tricloroactico 0.145 mol/1. D eje la suspensin a te m p eratu ra
am biente por 3 horas, filtre luego a travs de la m uselina. A juste el pH del
fluido lechoso obtenido a 7.3 con NaOH 100 g/1. Mida el volum en total del
lquido y agregue len tam en te sulfato de am onio (500 g ! 1), agitando cons
tantem ente. F iltre el precipitado a travs de u n a hoja grande plizada de papel
de filtro hasta obtener u n filtrado de color rosado. Mida el volum en y agregue
ms sulfato de am onio (50 g/1), agitando. D eje la m ezcla de u n da para otro en
el refrigerador.
Rem ueva cualquier precipitado form ado d u ran te la noche y agregue 25 mi
de cido tricloroactico 200 g/1 al precipitado de citocromo c. C entrifugue
rpidam ente el citocromo c (3000 g por 15 m inutos) y suspenda el precipitado
de color rojo ladrillo en solucin saturada de sulfato de am onio (150 m l/k g del
tejido original). Coloque la suspensin en un tubo de dilisis y dialice contra
agua d u ran te 4 horas. R em ueva por centrifugacin el precipitado carm elito
de citocromo c desnaturalizado y guarde la solucin restan te a 15 C.
El citocromo c puede caracterizarse fcilm ente en solucin o altern ativ a
m ente se puede precipitar m ediante la adicin de 4 volm enes de acetona fra.
Se puede obtener un m ejor producto si se dializa la solucin p ara rem over el
sulfato de am onio y luego se liofiliza.
Anote el volum en final de la solucin de citocromo c (v).
Estandarizacin espectrofotomtrica. La solucin preparada es u n a mezcla

de las form as oxidada y reducida de la molcula. El prxim o paso consiste en
oxidar una parte de la m u estra con ferricianuro, red u cir otra con ditionita, y
anotar las extinciones a 550 nm . Como los coeficientes m olares de extincin se
conocen para cada forma, la pureza del com puesto puede ser fcilm ente
verificada. En caso de que estn presentes otros pigm entos, no es corriente
que ellos m uestren el mismo cambio cuando se convierten de la form a
oxidada a la reducida y viceversa. Los coeficientes m olares de extincin a 550
nm son:
F orm a oxidada, fe! = 0.9 x 104 (1 m ol-1 c m '1)
F orm a reducida, fe2 = 2.77 x 104 (1 m ol-1 cm -1 )
Esto significa que u n a solucin de citocromo c oxidada de concentracin 1

mol/1 o 1 m m ol/m l tiene u n coeficiente de extincin de 0.9 x 104en una trayec
toria de luz de 1 cm.
Forma oxidada. P rep are la siguiente solucin y lea la extincin a 500 nm
contra un blanco de ferrician u ro y am ortiguador.
Com ponente mi
amortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/1, 1.9

pH 7.4)
preparacin convenientem ente diluida de cito- 1.0
cromo c
ferricianuro de potasio (0.01 m ol/1) 0.1
Forma reducida. P rep are la mezcla siguientes y lea la extincin E^contra un

blanco de ditionita y am ortiguador.
Com ponente mi
amortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/1, 1.9

pH 7.4)
preparacin de citocromo c 1.0
solucin saturada de ditionita de sodio 0.1
Use los datos obtenidos p ara calcular la concentracin de citocromo c

presente en la cubeta en m g/m l. Ya que hay 3 mi en la cubeta, m ultiplique
esta cantidad por 3; recu erd e adem s que esta cantidad de citocromo c estaba
presente en 1 m i de preparacin diluida. P or tanto, el ren d im ien to deleito-
cromo c en m iligram os (Y ) est dado por la frm ula:
Y = (Ei / k x) x peso mol. x 3 x dilucin x V mg,
Y = (E2/k 2 ) x peso mol. x 3 x dilucin x V mg
Exprese el resultado final como miligram os de citocromo c por kilogramo

de corazn. El rendim iento calculado para las form as oxidada y reducida debe
ser el mismo si el m aterial es relativam ente puro. Como p rueba final de
pureza, determ ine la cantidad total de protena presente usando uno de los
procedim ientos estndar descritos anteriorm ente.
Espectro de absorcin. Finalm ente, haga el grfico del espectro de absorcin
de las formas oxidada y reducida y determ ine la absorcin m xim a en la
regin visible.
Mximos para la oxidada: 408 nm y 530 nm.

Mximos para la reducida: 415 nm, 520 nm y 550 nm.
146 Bioqumica -prctica
ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS
EXPERIMENTO 5.24 Identificacin del aminocido C -term inal de una pro

tena
Fundamento
La enzim a carboxipeptidasa es u n a exopeptidasa que cataliza la hidrlisis del
enlace peptdico prxim o al am inocido C -term inal. La liberacin de los
aminocidos C -term inales deja al descubierto un nuevo residuo C -term inal,
el cual es luego hidrolizado por la enzima. En esta form a se puede identificar
el aminocido C -term inal as como tam bin la secuencia en que se
encuentran varios de los aminocidos vecinos.
En este experim enta, la carboxipeptidasa es incubada con varias
protenas y, d u ran te la digestin, se separan m uestras y los am inocidos son
identificados por crom atografa en papel.
Materiales 20
1. A m ortiguador tris-H Cl (25 mmol/1, pH 7,5). 50 mi
2. Solucin de p rotena en am ortiguador (m uram idasa y 10 mi
ribonucleasa, 10 m g/m l).
3. Carboxipeptidasa A (1 m g /m l en am ortiguador) 10 mi
5. M icropipetas (50 pl). 10
6. Equipos para crom atografa de aminocidos en papel 5
(experim ento 3.11).
Mtodo
A 0.5 mi de la solucin proteica aada 0.5 mi de carboxipeptidasa A, mezcle
vigorosam ente y coloque en u n bao de agua a 37 C. A intervalos de tiem po
apropiado (0,10, 20, 30 y 60 m inutos) re tire 0.2 m i de la m u e stra y m ezcle con
0.2 mi de cido tricloroactico 10% p /v . C entrifugue el precipitado y aplique
50 p l del sobren ad an te en un papel de crom atografa W hatm an No. 1. Separe
los am inocidos e identifquelos (experim ento 3.11). H aga u n grfico del
nm ero de am inocidos liberados con respecto al tiem po. El experim ento
puede acortarse separando los am inocidos n icam en te en u n a dim ensin;
use butanol/cido actico/agua como solvente, y em plee u n n m ero lim itado
de patrones (alanina, arginina, leucina, serin a y valina).
EXPERIMENTO 5.25 D eterm inacin del grupo am ino term in a l de algunas

protenas ,
Fundamento
El aminocido N -term inal puede identificarse con l-fluoro-2,4-dinitrobence-
no, (FDNB) (reactivo de Sanger), el cual reacciona en solucin dbilm ente
alcalina con l grupo am ino presen te al final de la cadena.
N 02
0 2N - ^ > - F + H-NH-R
FDNB protena protena marcada con DNP
La protena es hidrolizada en solucin cida, ya que el com plejo DNP-

aminocido es resistente al cido perm itiendo as m arcar efectivam ente el
grupo amino term inal. Despus de la hidrlisis, el com plejo am arillo DNP-
aminocido se identifica por cromatografa.
El FDNB puede reaccionar tam bin con los grupos am ino libres, imidazol
y fenol de los. am inocidos a pH n eu tro o alcalino y dan los correspondientes
derivados de DNP-am inocidos, pero afo rtu n ad am en te los DNP- am inoci
dos no polares pueden ser extrados fcilm ente del hidrolizado cido con ter,
dejando los derivados de DNP-aminocidos en la fase acuosa.
Materiales 100
1. Protenas (hemoglobina, m uram idasa y ribonucleasa). 3g
2. Bicarbonato sdico.
3. Acido clorhdrico (conc.). 500 mi
4. Eter (libre de perxido). 21
5. 1 fluoro-2,4-dinitrobenceno (5% v /v en etanol). 11
(Precaucin: causa ampollas).
6. Acido clorhdrico (6 mol/1). 500 mi
7. A m ortiguador de ftalato de sodio (0.1mol/1 pH 4.6). 11
8. Equipo de crom atografa.
9. Papel de crom atografa W hatm an No. 4.
10. Agitadores (capacidad 4 tubos). 25
11. Hornos a 110 C. 10
12. Acetona. 100 mi
13. A m ortiguador de fosfato de sodio (0.75 mol/1, pH 6.0). (De acuerdo
a la capaci
dad del tan
que)
14. Ampollas de vidrio. 150
15. Lm paras ultravioleta. 20
16. Soluciones patrones de los derivados de DNP de glicina,
valina, lisina y fenilalanina. (G urdese en la oscuridad).
Mtodo
Preparacin de los DNP-aminocidos. Pese de 5 a 20 mg de protena (m nim o
0.2 /mol), mezcle con u n peso igual de carbonato sdico y suspenda en 1-2 mi
de agua. Aada dos veces el volum en de la solucin de FDNB y agite por 2
horas a te m p eratu ra am biente. M antenga el pH en la regin de 8-9 aadiendo
m s bicarbonato de sodio si es necesario. Si hay form acin apreciable de
precipitado el pH es m uy bajo. Extraiga la suspensin tres veces con ter libre
de perxidos p ara rem o v er el dinitrofenol form ado por la reaccin del FDNB
con el agua. Usando cido fuerte, ajuste el pH aproxim adam ente a 1 y extraiga
tres veces con un volum en igual de ter libre de perxidos; com bine los
extractos de te r y evapore a sequedad en un ex tracto r de gases. A gregue 0.2
mi de acetona al derivado seco de DNP y tran sfiera a u n a ampolla de
hidrlisis. Evapore la acetona en un chorro de aire y aada 1 mi de HC1 6
mol/1. Selle la am polla con llam a y djela en un horno a 110C por 18 horas.
Despus de d ejar en fria r la am polla a te m p eratu ra am biente, brala
cuidadosam ente, aada 1 m i de agua y extraiga tres veces con 2 mi de ter.
C oncentre los extractos de ter y evapore a sequedad. D isuelva los DNP-
aminocidos en u n poco de acetona y haga crom atografa como se indica
enseguida.
Cromatografa de los DNP-minocidos. A plique 10-20 /ti de la m uestra a

papel W hatm an No. 4 p reviam ente saturado con am ortiguador de ftalato y
repita el procedim iento hasta que las m anchas am arillas sean visibles
claram ente. A plique las soluciones patrones de DNP-am inocido y desarrolle
la crom atografa ascendente con am ortiguador de fosfato 0.75 mol/1, pH 6,0.
EXPERIMENTO 5.26 D eterm inacin de los cambios en la conformacin de

albm ina srica bovina usando m edidas de viscosidad
Fundamento
Altas concentraciones de u rea producen el desdoblam iento de las protenas
m ediante el debilitam iento de los enlaces hidrofbicos que m an tien en la
estru ctu ra terciaria. Este cambio en la conform acin de protena origina una
molcula m enos com pacta y de m ayor viscosidad que la protena nativa.
Dichos cambios en la estru ctu ra terciaria pueden seguirse fcilm ente usando
un viscosm etro de Ostwald (figura 5.2). El viscosm etro consta fun d am en
talm ente de u n tubo capilar en el cual se deja caer por accin de la gravedad
un volum en dado de u n a solucin de protena. El tiem po que gastan en caer
las protenas ( j ) es m edido as como el que gasta el solvente(o ) La viscosidad
relativa est dada por:
Vre I =T?l/T?0 = Ul/o ) X (Pl/Po),

Figura 5.2 El viscosmetro de Ostwald
donde r?i es la viscosidad de la solucin de protena que tiene una densidad P\

y T?0 la viscosidad del solvente de densidad po Si las densidades son iguales,
entonces la expresin se simplifica a:
Vr e1 = t j t 0 .
Einstein m ostr que p ara molculas esfricas la viscosidad relativa

depende de la concentracin de la molcula (c) y el volum en especfico parcial
(y ), el cual es el volum en ocupado por la m olcula y el agua que la rodea.
Prel = 1 + 2.5c V.
Materiales 10
La viscosidad es m uy sensible a la tem p eratu ra y por lo tanto las
soluciones y el viscosm etro deben conservarse en un bao de
agua a 30 C.
1. Viscosmetros de Ostwald. 5
ISO Bioqumica prctica
3. C loruro de potasio (100 mmol/1). 41

4. Solucin de u re a (0.5,1,2,4,6 y 8 mol/1 en KC1100 mm ol/1). 250 mi
5. A lbm ina srica bovina (10 g/1 en KC1 100 mmol/1 y en 250 m i
las soluciones de u rea arrib a indicadas), (4).
6. C ronm etros graduados por lo m enos en 0.1 s. 5
Mtodo
El viscosm etro es u n aparato m uy frgil, por tanto debe m an ejarse con
m ucho cuidado. Lave el viscosm etro con u n a solucin de KC1 y colquelo en
el bao de agua sujetando cuidadosam ente uno de los brazos en u n soporte
metlico. V erifique con u n a plom ada que est com pletam ente vertical y
usando u na jerin g a o pipeta introduzca en el bulbo A exactam ente 20 m i (o el
volum en m arcado en el viscosm etro) de u n a solucin de KC1 a 30C. D eje
equilibrar por 5 m inutos, luego aplique bien sea u n a presin positiva al brazo
ancho (I) o u na leve succin al otro brazo (II) hasta que el menisco ascienda
por encim a de la m arca de graduacin superior B. R etire la presin y m ida el
tiem po (en fracciones de 0.1 s) requerido para que el lquido fluya e n tre las
m arcas B y C. Repita el experim ento hasta cuando los tiem pos de flujo coin
cidan en m enos de 0.2 s y calcule el tiem po prom edio de flujo. Repita todo el
procedim iento con la solucin de u rea sola ( t0) la cual se ha usado como
solvente, y luego con la albm ina srica disuelta en u rea (t). Calcule las
viscosidades relativas a p a rtir de los tiem pos de flujo y p rep are un grfico de
la viscosidad relativa de la albm ina en funcin de la concentracin de urea.
C om ente los resultados. Calcule adem s el volum en especfico parcial de la
albm ina srica bovina en K C110 mm ol/1 y en u rea 8 mol/1 (suponga que las
m olculas se m an tien en en la form a esfrica y por tanto la ecuacin de
E instein es todava vlida).
EXPERIMENTO 5.27 Efecto del pH sobre la conform acin de la albm ina srica
bovina
Materiales _10
1. Los mismos del experim ento 5.26
Mtodo
Usando el viscosm etro de Ostwald, siga los cambios estructurales en la
albm ina disuelta en KC1 100 mmol/1 y agua destilada, a m edida que se
cambia el pH e n tre 2 y 12. Explique los resultados.
Bibliografa
A lexander, P. y L undgren H. P., A Laboratory M anual o f Analytical M ethods
of Protein C hem istry Vols 1-5, Oxford, Pergam on Press, 1966-69,
Bailey, J. L., Techniques in Protein C hem istry, 2a ed. A m sterdam , Elsevier,

1967.
Meister, A., B iochem istry o f the A m in o Acids, 2a ed., Vols 1-2, Nueva York,
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N eurath, H., The Proteins, Vols 1-4, Nueva York, A cadem ic Press, 1964-66.
Van Holde, K. E., Physical Biochem istry, Englewood Cliffs, N. J. Prentice-
Hall, 1971.
6
Carbohidratos
FUNCION DE LOS CARBOHIDRATOS EN LA BIOESFERA

Los hidratos de carbono son compuestos que contienen adem s de carbono,
hidrgeno y oxgeno en proporcin de 2 a 1. Este nom bre tam bin se usa para
algunos de sus derivados en los que la definicin dada no se cum ple estricta
mente.
C*(H2 0 ),
t t
Carbono Agua
Hidrato de carbono
Una fuente de energa

Estos compuestos son de im portancia fu n d am en tal en la bioesfera y se elabo
ran d u ran te la fotosntesis. Por fotosntesis las plantas verdes y las algas
Figura 6.1 Ciclo del carbono en la bioesfera
152
Carbohidratos 153
pueden usar la energa solar p ara sintetizar hidratos de carbono a p a rtir (le
bixido de carbono atm osfrico y agua. M uchas plantas alm acenan grandes
cantidades de hidratos de carbono que en algunos casos, son consum idas por
el hom bre y los anim ales p ara su alim ento. Despus de que los carbohidratos
complejos han sido ingeridos, la m olcula se rom pe en el estmago e intesti
nos dando glucosa la cual es luego oxidada a COz y H 20 , o es alm acenada
tem poralm ente como glicgeno en el hgado y los msculos. D u ran te la
oxidacin de glucosa se libera energa que es em pleada luego por los animales.
En el hom bre m s del 60% de los requerim ientos totales de energa proviene
de la oxidacin de los hidratos de carbono. En esta form a los anim ales, que no
pueden realizar fotosntesis, pueden aprovechar la energa solar (figura 6.1).
Molculas y estructura celular

Los hidratos de carbono son tam bin com ponentes im portantes de algunos de
los m ateriales estructurales de los organism os vivos, como por ejemplo, las
paredes celulares en las plantas, los polisacridos en las cpsulas de las
bacterias y los mucopolisacridos en la piel y el tejido conectivo de los
animales. Adems, los m onosacridos son p arte de com puestos bioqumicos
im portantes como los cidos nucleicos, las coenzimas, las flavoprotenas y las
sustancias antignicas de los grupos sanguneos.
ESTRUCTURA DE LOS CARBOHIDRATOS
Introduccin
Q um icam ente hablando, los carbohidratos son aldehidos o cetonas derivados
de polihidroxy y alcoholes respectivam ente se conocen como aldosas o cetosas.
Las unidades bsicas de los hidratos de carbono son los monosacridos, los
cuales no se pueden subdividir por hidrlisis. Estos m onm eros se nom bran
de acuerdo al nm ero de tomos de carbono que poseen en la cadena: as las
tetrosas contienen 4, las pentosas 5 y las hexosas 6 tomos de carbono.
Estereoqumica
Actividad ptica. M uchas molculas biolgicas, incluyendo los azcares,
poseen uno o m s tomos de carbono asimtricos y pueden, por lo tanto, te
n er estereoismeros. P or ejem plo, el gliceraldehdo, uno de los azcares ms
simples, tiene un carbono asim trico y dos posibilidades de distribucin de los
cuatro grupos unidos a dicho carbono. La frm ula de estos dos ismeros se da
ms abajo; en ella los carbonos asim tricos estn colocados en el centro de un
tetrahedro, y los 4 grupos sustituyentes estn situados en las esquinas. La
lnea interrum pida indica que est debajo del plano del papel. Las dos form as
pueden compararse con las im genes de un espejo o con los guantes derecho
e izquierdo.
Estas dos configuraciones son i s m e r o s p t i c o s o e n a n t i m e r o s y hacen
rotar el plano de la luz polarizada en proporcin igual pero en direcciones
opuestas. Cuando el plano de la luz polarizada rota a la derecha, el compuesto
es d e x t r o r o t a t o r i o y se denomina ( d ) o (+). Cuando el plano de la luz polarizada
rota hacia la izquierda, el compuesto es l e v o r o t t o r i o ( l ) o ().
Espejo
CHO CHO unu
CHO CHO
H-C-OH H HO H
I H O < j> .
ch 2oh ch 2oh CH2OH H20H
(Dextro) (Levo)
d-Gliceraldehdo l-Gliceraldehdo
F o r m a s D y L . Las aldosas se pueden considerar como formadas por adicin

sucesiva de grupos alcohol secundario (CHOH) al compuesto patrn,
gliceraldehdo. Toda vez que el gliceraldehdo puede existir en dos formas, se
originan dos familias de aldosas: aquellas derivadas del d-gliceraldehdo
conocidas como D - a z c a r e s y aquellas provenientes del -gliceraldehdo
denominadas L- a z c a r e s . Las letras D y L no indican actividad ptica, sino
que se refieren a la configuracin alrededor del tomo de carbono vecino al
que se encuentra ms alejado del extremo de la cadena que contiene el grupo
aldehido o cetona. As, pues, un D-azcar puede ser dextrorotatorio (D ( + )) o
levorottorio (D( )) dependiendo de la configuracin de los otros tomos de
carbono presentes.
CHO
Aldosas (HOH)
H2OH
Nmero de
formas
D L
triosas n =1 1 1
tetrosas n =2 2 2
pentosas n =3 4 4
hexosas n =4 8 8
Carbohidratos 155
La ms simple de las cetosas es la triosa dihidroxiacetona, pero este com pues

to no tiene actividad ptica; as que la tetrosa, D -eritrulosa, es el compuesto
m atriz de las D-cetosas
CH2OH
=0
I
D-Eritrulosa H-C-OH
H OH
Las pentosas, hexosas, etc., se form an por la adicin de grupos alcohol

secundario.
Nmero de
formas
D L
> Tetrosas n - 1 1 1
Pentosas n =2 2 2
Hexosas n =3 4 4
N um eracin de los tomos de carbono. Los tomos de carbono se n u m eran a

p artir del extrem o de la cadena que contiene el grupo carbonilo reactivo, as:
1CHO CH2OH
i O
-4-
C4
H -2-OH
j
HO3CI
H HO3Cj
H
H -4 C-OH
| H -4 C-OH
|
H5C-OH
j
h- 5c1 - oh
6CH2OH 6ch 2oh
Glucosa Fructosa
Frmula cclica. Cuando se disuelve D(+)-glucosa en agua, se obtiene una

rotacin especfica de +113 grados, pero esta cam bia len tam en te hasta que a
las 24 horas el valor obtenido es +52,5 grados. Este fenm eno se conoce con el
nom bre de m utarotacin y es caracterstico de algunas pentosas, hexosas y
disacridos reductores. La razn para el cambio de rotacin es que la glucosa
existe en solucin principalm ente en la form a cclica, la cual se obtiene por la
formacin de un hem iacetal intram olecular, como se indica ms abajo.
Esto origina otro carbono asim trico (CO, que da lugar a dos form as cclicas
( a y jS) las cuales se conocen como anmeros.
H \ /0H H\ .OH
CHO C .QH 'i c - ------
H-C-OH H-C-OH, H-C-OH
HOCH +HjO H O --H | \ _H o HO--H
H-C-OH H OHj j H-C-OH
HOH H-C-O H j
ch2 OH CH2OH c h 2 oh
La form a com n de la glucosa, D(+), es la form a a con una rotacin espe

cfica de +113 grados. C uando sta se disuelve en agua, se establece un equili
brio con u na rotacin de + 52.5 grados. Igualm ente, cuando la form a (3 que
tiene una rotacin de +19.7 se disuelve en agua ocu rre m utarrotacin dando
un valor final de + 52.5 grados que es el de la m ezcla en equilibrio. La form a de
cadena abierta se en cu en tra tam bin en equilibrio con las dos formas cclicas
y es sta la responsable de las propiedades reductoras de los azcares. La
frm ula cclica m ostrada arrib a p ara la glucosa es la proyeccin de Fischer, la
cual no es com pletam ente correcta. Una m ejo r representacin de la estru ctu
ra fue dada por Haworth, que m uestra el anillo en un plano con los grupos
hidrxilos orientados por encim a y por debajo de l. P ara efectos de claridad,
generalm ente no se incluyen los tomos de hidrgeno.
CH2 OH CH2 OH CH2 OH
a-D-glucosa Forma de cadena abierta 0-D-glucosa

Mezcla en equilibrio:
36% 0.02% 64%
El anillo form ado en el caso de la glucosa contiene cinco tomos de carbono y

uno de oxgeno y es anlogo al pirano; por lo tanto se dice que la glucosa existe
en forma de piranosa. Muchos de los azcares com unes existen en la form a de
anillo de piranosa, pero algunos existen como anillos de cuatro tomos de
carbono denom inados furanosas, por parecerse al com puesto furano.
Carbohidratos 157
Por ej emplo, la fructosa se p resenta en form a de furanosa en la sacarosa, pero

como anillo de piranosa cuando est libre en solucin. As mismo, la ribosa y la
deoxiribosa m u estran una estru ctu ra de anillo de furano cuando hacen parte
de los cidos nucleicos, pero en el estado libre existen como estru ctu ras de
pirano.
0N o / u
Pirano Furano
Enlace glicosdico
G l i c s i d o s y d i s a c r i d o s . El grupo carbonilo p resente en todos los azcares es
muy reactivo y puede fo rm ar hem iacetales o actales con otros compuestos
hidroxlicos.
1 XOH ; X'011 XOH ^

- O 0Hl < kx
1 Li >ohJ | XOX | X)X
Cetona Hemiacetal Acetal
La formacin de u n a estru ctu ra cclica in tern a se efecta por reaccin del

grupo hidrxilo en el carbono C4 o C 5 con el grupo carbonilo form ando un
hem iacetal intram olecular, donde XOH es el resto de la molcula. El otro
hidrxilo en el carbono C 1; conocido como el h i d r x i l o g l i c o s d i c o , es m uy
reaccionante y form a fcilm ente enlaces glicosdicos con otros grupos
hidroxlicos m ediante la elim inacin de agua. Si el com puesto hidroxlico no
es un azcar, se form a u n g l i c s i d o , tal como sucede en la condensacin de
glucosa y m etanol para d ar m etil glucsido. Sin em bargo, el grupo hidrxilo
frecuentem ente proviene de otro azcar y en este caso se form a u n d i s a c r i d o .
Si el enlace no ocurre e n tre dos tomos C u entonces queda libre u n grupo
cetnico o aldehido en el disacrido y la molcula exhibe todas las reacciones
de estos grupos tales como la m utarotacin.
O l i g o s a c r i d o s y p o l i s a c r i d o s . Este proceso puede repetirse, as que el
segundo monosacrido se une a u n tercero con u n enlace glicosdico para dar
un t r i s a c r i d o y as sucesivam ente hasta obtener un o l i g o s a c r i d o de 2 a 10
unidades, ligadas en una sola cadena. En el caso de los p o l i s a c r i d o s se ju n tan
unidades de 10 hasta varios miles de m onosacridos por enlaces glicosdicos
para form ar molculas m uy grandes. Las unidades m onom ricas no son
siem pre las m ism as y pueden encontrarse ram ificaciones as como sustitu
ciones para dar m olculas bastante complejas.
Derivados simples de ios monosacridos

Productos oxidados. Los grupos aldehido y alcohol prim ario de las aldosas
pueden oxidarse a los correspondientes cidos aldnico y urnico. Si la oxida
cin contina, se originan cidos sacricos. A continuacin se m u estra la
oxidacin de un monosacrido. Los nom bres den tro de los parntesis
representan los productos cuando la hexosa es el m onosacrido glucosa.
CHO
(HOH)
CH2OH
M onosacrido\Br/H 2o
CHO (glucosa) ^ COOH
(Ahoh ) (HOH)
COOH CH2OH
Acido urnico Acido aldnico
(cido glucurnico) (cido glucnico)
H N O , H N O ,
*COOH
(HOH)
COOH
Acido sacrico
(cido glucosacrico)
Reduccin. Los grupos aldehido o cetona pueden reducirse a alcoholes

prim arios o secundarios con am algam a de sodio. P or ejem plo, la fructosa y la
glucosa dan el hexahidroxy alcohol, sorbitol y el gliceraldehdo es reducido a
glicerol.
CHO
j CH2OH
I
HOH - 0 - , CHOH
ch 2oh CH2OH
Gliceraldehdo Glicerol
Esteres. Los azcares form an fcilm ente steres cuando reaccionan con el
cloruro o el anhdrido de un cido en presencia de un catalizador. Los steres
de fosfato de los monosacridos son de fundam ental im portancia en el
metabolism o de los hidratos de carbono. Los steres formados con .grupo
alcohol prim ario del ltim o carbono (glucosa-6-fosfato) son usualm ente los
ms resistentes a la hidrlisis cida. Los hem iacetales que se form an con los
Carbohidratos 159
, grupos reductores son, por el contrario, m uy inestables en cidos (glucosa-1-

fosfato).
D e r i v a d o s a m i n o . El hidrxilo que se en cu en tra en la posicin 2 de m uchos

azcares puede ser reem plazado por un grupo am ino como por ejem plo en
g a l a c t o s a m i n a y g l u c o s a m i n a . Estos compuestos existen tam bin como los
derivados N - acetilo y hacen p arte de la estru ctu ra de m uchos polisacridos.
La presencia de los grupos am ino cerca del enlace glicosdico hace que la
molcula sea m s resistente a la hidrlisis.
CARBOHIDRATOS DE IMPORTANCIA BIOQUIMICA
Azcares simples
Los azcares simples estn am pliam ente distribuidos en la naturaleza y

desarrollan m uchas y variadas funciones. P o r razones de simplicidad, en la
tabla 6.1 slo se presentan algunos azcares sim ples y no se incluyen
derivados de los hidratos de carbono.
Macromolculas
Homopolisaeridos. Son m olculas m uy grandes com puestas nicam ente de

un tipo de monosacrido, a pesar de que varias m acrom olculas diferentes
pueden ser construidas a p artir de la m ism a unidad de monosacrido. Esto se
debe a que las m olculas pueden te n e r tam ao diferente, grados diferentes de
ramificacin y entrecru zam ien to y diferentes enlaces glicosdicos. Esto se
ilustra claram ente para la glucosa, que es el com ponente bsico de varios
polisacridos, en la tabla 6.2.
H e t e r o p o l i s a c r i d o s . Estas m olculas se form an a p a rtir de dos o m s unida

des bsicas y estn frecu en tem en te asociadas con protenas. Dichos com pues
tos se conocen con el nom bre de p r o t e o g l i c a n s o m u c o p r o t e n a s cuando el
com ponente polisacardico predom ina en la molcula. Estos m ateriales, de
naturaleza gelatinosa y viscosa, actan como lubricantes o cem ento intrace-
lular. Los complejos protena-carbohidrato se conocen con el nom bre de
g l i c o p r o t e i n a s cuando el carbohidrato es el com ponente m enor. Las cadenas
cortas de oligosacridos, au n en pequeas cantidades, pueden te n e r una in
fluencia considerable en las propiedades biolgicas de las protenas. Por
ejemplo, las propiedades antignicas de las sustancias de los grupos sangu
neos depende de la n atu raleza qum ica de ests cadenas de carbohidrato. La
estructura y enlace de las unidades no se conocen en m uchos casos, por lo cual
en la tabla 6.3 solo se dan los com ponentes.
T a b la 6.1 Estado natural y funcin de algunos azcares simples
Azcar y frmula
pentosas
hexosas
o>
Bioqumica practica
Origen y funcin
Se halla como pentosanas en resinas vegetales.

No se conoce su funcin en el hombre, aunque
es ferm entada por algunas bacterias. La D-ara-
binosa se encuentra en los glicsidos del bacilo
de la tuberculosis.
Un constituyente im portante del cido desoxi-

ribonucleico (ADN), la m acrom olcula que
forma el m aterial gentico encontrado en los
organismos vivos.
Com ponente esencial del cido ribonucleico

(ARN), m acrom olcula que participa en la sn
tesis de protenas, presente tam bin en las
coenzim as ATP, FAD, NAD, y NADP.
Es el azcar de m s amplia distribucin. La

glucosa es transportada en la sangre y oxidada
en las clulas para producir energa.
Azcar y frm ula
D-fructosa
D-galactosa
disacridos
Lactosa
(/? -D-galactosil-l,4-D-glucosa)
CH,OH CH,OH
H-OH
Origen y funcin
El ms dulce de los azcares se encuentra en las

frutas, la m iel de abeja y el lquido sem inal. Sus
steres de fosfato son com puestos interm edia
rios im portantes en la gliclisis.
Su funcin principal es estructural y se en

cuentra en los glicolpidos del tejido nervioso y
en las m em branas de los cloroplastos. La galac-
tosam ina est presente en las sustancias de los
grupos sanguneos, el cartlago y los tendones.
Se encuentra en la leche de los m am feros y

puede estar presente en la orina durante el
Carbohidrato*
embarazo.
a>
Maltosa
(a -D-glucosil-l,4-D-glucosa)
H-OH
sacarosa
(a-D -glucosil- /3-1,1-D-fructosa)
162 /
Bioqumica prctica
Producida durante la digestin de alm idn por
la a -amilasa; presente en los cereales en ger
m inacin y en la malta.
Es no reductor puesto que el enlace se forma

entre los dos grupos potencialm ente reduc
tores de los monosacridos. Se encuentra en las
plantas y se obtiene principalm ente de la caa
de azcar y la remolacha.
Carbohidratos 163
Tabla 6.2 Propiedades de algunos homopolisacridos
Polisacrido y unidad
monosacardica Estructura Estado natural y funcin
polisacridos de reserva
almidn (a-D -glucosa) Es una m ezcla de am ilosa Es el principal hidrato de
y am ilopectina en una carbono de reserva de algu
proporcin de 1 a 4. nas plantas tales como
papa, cereales y arroz.
amilosa (a-D -glucosa) Cadena lineal de enlaces Presente en la m ayora de

a 1-4, peso m olecular los alm idones hasta en un
aproximado de 50 000. 20%.
amilopectina ( a -D-glu- Cadenas lineales con enla Es el principal com ponente

cosa) ces a 1-4 con ram ifica del alm idn (80% aproxi
ciones de enlaces a 1-6. m adam ente).
Peso m olecular 0.2 x 106 -
1 X 1 0 6
glicgeno Una m olcula en forma Es el polisacrido de reser

( a -D-glucosa) de rbol sem ejante a la va ms am pliam ente di
am ilopectina pero ms fundido en los anim ales,
ramificada, peso mol. 1 x principalm ente en el hga
10 - 3 x 10e do y los m sculos.
inulina (0 -D-fructosa) Unidades de fructosa liga Carbohidrato de reserva en

das por enlaces 0 1-2. m uchas plantas tales como
Peso mol. ~ 5000 dalias y alcachofas.
polisacridos estructurales
celulosa (/3-D-glucosa) Cadenas lineales unidas El principal com ponente de
por enlaces /? 1-4. las paredes celulares de las
Peso mol. ~ 50 000. plantas y de algunas algas y
bacterias.
quitina (/3-D-N-acetil- Cadena lineal con enlace . El principal com ponente

glucosamina) 01-4. del exoesqueleto de insec
tos y crustceos tales como
cangrejos y langostas.
Tabla 6.3 Algunos heteropolisacridos com unes
Polisacrido Unidades monosacardicas Estado natural y funcin
mucopolisacridos
heparina (peso mol. cido D -glucurnico P resente en las paredes
~ 17 000) sulfato de D-glucosamina. arteriales y en los pulmo-
m ones. Es un anticoagu
lante m uy til.
cido hialurnico cido D-glucurnico C em ento extracelular y

(peso mol 1 x 106) V-acetil-D-glucosamina lquido sinovial alrededor
de las articulaciones donde
acta como lubricante.
Sulfatos de condroitina cido-D-glucurnico Muy abundante en el tejido

A y C sulfato de N-acetil-D- cartilaginoso.
galactosam ina
complejos de polisacridos
bacterianos -
Polisacridos La composicin exacta ^sponsable de las propie

de la cpsula depende del tipo de orga dades antignicas de las
nismo. bacterias.
m urena N -acetil-D-glucosam ina, Una gran red tridim ensio

cido-IV-acetilmurmico, nal que hace parte del
cadenas de oligopptido. esqueleto de las paredes
celulares bacterianas.
PROPIEDADES QUIMICAS
Pruebas generales para carbohidratos

Se sugiere hacer las siguientes pruebas en algunos carbohidratos que se
consideran tpicos de cada grupo. P ara te n e r u n a idea de la sensibilidad del
mtodo deben probarse soluciones de 1 g/1 y 10 g/1.
100
Monosacridos: glucosa, fructosa, galactosa 31
(hexosas), arabinosa, xilosa de cada uno.
(pentosas).
Disacridos: lactosa, m altosa, sacarosa.
Polisacridos: celulosa, glicgeno, inulina,
almidn.
Carbohidratos 165
EXPERIMENTO 6.1 Prueba de Molisch

F u n d a m e n to
El cido sulfrico concentrado hidroliza enlaces glicosdicos para dar
monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando fu rfu ral y sus deri
vados. Estos productos se com binan luego co n a-n a fto l sulfonato originando
un complejo prpura.
Esta reaccin es general para los hidratos de carbono pero algunos otros
compuestos orgnicos dan tam bin fu rfu ral con cido sulfrico concentrado.
Materiales 100
1. Acido sulfrico (concentrado). 1500 mi
2. a-naftol (50 g/1 en etanol; preprese fresco) 200 mi
M to d o
Agregue dos gotas de la solucin de a-naftol a 2 m i de la sustancia problem a.
Aada cuidadosam ente por las paredes del tubo aproxim adam ante 1 mi de
H 2S 0 4 concentrado hasta que se form en dos capas. O bserve cuidadosam ente
cualquier cambio de color en la interfase de los dos lquidos. Repita el
procedimiento, usando agua en vez de la solucin de carbohidrato.
Furfural
EXPERIMENTO 6.2 Reaccin de la antrona

Fundamento
La reaccin de la antro n a es otra p rueba general p ara hidratos de carbono. El
fundam ento es el mism o que se describi en el experim ento 6.1, excepto que el
furfural reacciona con an tro n a (10-ceto-9,10-dihidroantraceno) dando un
complejo azul-verdoso).
M ateriale s 100
1. Solucin de an tro n a (2 g/1 en H 2S 0 4 concentrado). 31
Mtodo
A aproxim adam ente 2 ml del reactivo de an tro n a agregue cinco gotas de la
solucin problem a, m ezcle fu erte m en te y observe el cambio de color.
Reacciones de los azcares reductores

Si se calienta una suspensin de hidrxido de cobre en solucin alcalina, se
form a xido cprico de color negro:
Cu(OH)2 -* CuO + H20 .
Sin em bargo, en presencia de sustancias reductoras, se precipita xido cupro-

so de coloracin parda-orn:
2Cu (OH)2 Cu20 + H20 + O.
En la prctica, se usa una solucin alcalina de una sal de cobre y un compuesto

orgnico que contiene un OH alcohlico en vez de la suspensin que se
m enciona arriba. Bajo estas condiciones, el cobre form a un complejo soluble y
el reactivo es estable.
Los hidratos de carbono que poseen un aldehido libre o potencialm ente
libre o un grupo cetnico tienen propiedades reductoras en solucin alcalina.,
Adems, los monosacridos actan como agentes reductores en soluciones
dbilm ente cidas.
EXPERIMENTO 6.3 P ru e b a d e B e n e d ic t
Fundamento
En la modificacin de la prueba de Fehling introducida por Benedict, se usa
nicam ente una solucin, lo cual la hace m ucho ms simple, con la ventaja
adicional de que el reactivo es ms estable que el de Fehling.
Materiales 100
1. Reactivo de Benedict. (Disuelva 173 g de citrato de sodio y 31
100 g de carbonato de sodio en aproxim adam ente 800 mi de
agua caliente. F iltre a travs de papel de filtro en una
probeta de 1000 mi y com plete con agua hasta 850 mi.
M ientras tanto, disuelva 17.3 g de sulfato de cobre en
aproxim adam ente 100 mi de agua y com plete hasta 150
mi. V ierta la p rim era solucin en un vaso de precipitados
de 2 1 y aada len tam en te la solucin de sulfato de cobre
agitando continuam ente.)
Mtodo t
Agregue cinco gotas de la solucin problem a a 2 ml del reactivo de Benedict v
coloque en un bao de agua hirviendo por 5 min. Exam ine la sensibilidad de la
prueba de Benedict usando diluciones crecientes de glucosa.
Carbohidratos 167
EXPERIMENTO 6.4 P ru eb a d e B arfoed
Fundamento
El reactivo de Barfoed es dbilm ente cido y solam ente puede ser reducido
por monosacridos. Si se deja h erv ir por largo tiem po existe la posibilidad de
hidrolizar disacridos dando as reacciones falsam ente positivas. El precipita
do de xido cuproso es m enos denso que en los m todos previos y se
recom ienda dejar el tubo hasta que el precipitado sedim ente. El color del
xido cuproso es tam bin diferente, tendiendo m s a rojo ladrillo que al pardo
naranja obtenido en la prueba de Benedict.
Materiales 1QQ
1. Reactivo de Barfoed. (Disuelva 13.3 g de acetato de cobre 31
en aproxim adam ente 200 mi de agua y agregue 1.8 m i de
cido actico glacial).
Mtodo
A 2 ml del reactivo de Barfoed aada 1 mi de la solucin problem a, hierv a por 1
min y deje reposar.
i
EXPERIMENTO 6.5 P rep a ra ci n d e osazon as
Fundamento
Los compuestos que contienen el grupo COCH OH form an osazonas
cristalinas con fenilhidrazina. Los cristales de osazona tien en form a y puntos
de fusin caractersticos lo cual ayuda a la identificacin de los azcares
reductores. Otros datos que pueden ayudar son el tiem po de form acin de los
cristales y precipitacin de la osazona en fro o en caliente.
La fenilhidrazina reacciona con el grupo carbonilo de los azcares dando la
fenilhidrazona que a su vez reacciona con dos m olculas m s de fenilhidra
zina para form ar la osazona. A continuacin se describe la form acin de una
osazona a p a rtir de u n a aldosa; sin em bargo, el m ecanism o de la reaccin es
ms complejo de lo que aqu se m uestra. La reaccin de u n a cetosa es bastante
sim ilar.
CHO C H = N -N H -C 6H5
CHOH + H2N -N H -C 6H5 > CHOH + H20
R
Aldosa Fenilhidrazina Fenilhidrazona
ch= n - n h - c 6h s c h = n - n h - c 6h s
CHOH + H2N -N H -C 6H5 * c = n - n h - c 6h 5 + c 6 h 5 n h 2 + n h 3

1 i
R
Fenilhidrazona Osazona
Glucosazona Galactosazona
(agujas o plumas) (aplanada)
Arabinosazona Lactosazona
(agujas agrupadas en bolas (agujas finas agrupadas en bolas)
no muy densas)
Xilosazona
(agujas largas y finas)
Figura 6.2 Apariencia cristalina de las osazonas como se observan en e!

microscopio a baja potencia.
Tanto la glucosa, como la fructosa y la m aosa form an la m ism a osazona,

puesto que la configuracin de los tomos de carbono 3, 4, 5 y 6 es la m ism a
para los tres azcares. La m aosa form a cristales blancos de fenilhidrazona a
te m p eratu ra am biente, y la osazona de color am arillo se separa al calentarla.
Materiales 100
1. Acido actico (glacial). 11
2. Solucin de fenilhidrazina. 200 mi
3. A cetato de sodio. 500 g
4. Microscopios. 20
Mtodo
Acidifique 5 m i de la solucin de los azcares con 10 gotas de cido actico gla
cial, agregue tre s gotas de la solucin de fenilhidrazina y u n poco de acetato de
sodio slido (en la p u n ta de u n cuchillo). C aliente en u n bao de agua d u ran te
5 m in agitando ocasionalm ente, filtre y caliente el filtrado en u n bao de agua
por 20 min. D eje e n fria r m u y len tam en te y exam ine bajo el microscopio los
cristales de osazona: com pare sus form as con los dibujos de la figura 6.2.
Carbohidratos 169
Anote cuidadosam ente el tiem po al cual precipita cada osazona y tam bin
si se forma en solucin fra o caliente (ver apndice).
Pruebas para carbohidratos individuales
EXPERIMENTO 6.6 Prueba de Bial para las pentosas

Fundamento
Cuando se calientan pentosas con HC1 conc. se form a fu rfu ral que se condensa
con orcinol en presencia de iones frricos p ara d ar un color verde azuloso. La
reaccin no es absolutam ente especfica p ara las pentosas, ya que el calenta
m iento prolongado de algunas hexosas produce hidroxim etil fu rfu ral que
tam bin reacciona con orcinol dando complejos coloreados.
Materiales 100
1. Reactivo de Bial. (Disuelva 1.5 g de orcinol en 500 m i de 41
HC1 conc. y aada 20 gotas de solucin de F eC l3 00 g/1).
2. Alcohol amlico. 41
Mtodo
En un tubo de ensayo agregue aproxim adam ente 1 m i de la m u estra a 2.5 mi
de reactivo y caliente hasta que em piece a h erv ir. La aparicin de una
coloracin azul verdosa indica resultados positivos. E nfre el tubo, luego
agregue 2-3 m i de alcohol amlico y agite.
ch3
Orcinol (3,5-dihidroxitolueno)
EXPERIMENTO 6.7 Prueba de Seliwanoff para las cetosas

Fundamento
Las cetosas se deshidratan m s rp id am en te que las aldosas dando derivados
de fu rfu ral que se condensan con resorcinol p ara fo rm ar u n com plejo rojo;
por lo tanto, debe evitarse u n calentam iento prolongado de la m u estra que se
est estudiando.
OH
Resorcinol (m -dihidroxibenceno)
Materiales 100
1. Reactivo de Seliwanoff (resorcinol 0.5 g/1 en HC1 31
3 mol/1).
Mtodo
A 2 ml del reactivo de Seliwanoff agregue dos gotas de solucin de carbohidra
to y caliente d u ran te 1 m in en un bao de agua hirviendo. Observe la
aparicin de un color rojo intenso.
EXPERIMENTO 6.8 Pruebas para sacarosa

Fundamento
La sacarosa es el nico disacrido com n no reductor y por lo tanto no reduce
las soluciones alcalinas de cobre ni form a osazonas. La sacarosa es hidrolizada
en solucin cida y luego se ensayan la glucosa y fructosa resultantes.
Materiales 100
1. Solucin de sacarosa (1 g/1 y 10 g/1). 11
4. Reactivos como en los experim entos 6.3, 6.4, 6.5 y 6.7.
Mtodo
A 5 mi de solucin de sacarosa agregue cinco gotas de HC1 conc., caliente
d u ran te 5 m in en un bao de agua hirviendo, enfre y agregue NaOH hasta
que la solucin sea n e u tra o dbilm ente alcalina. Con la solucin hidrolizada
realice las pruebas para azcares reductores y la de Seliwanoff. P rep are la
osazona usando el hidrolizado e identifique los monosacridos constituyentes
por medio de la crom atografa de capa delgada (experim ento 3.12).
EXPERIMENTO 6.9 Prueba del Yodo

Fundamento
El yodo form a complejos coloreados de adsorcin con los polisacridos; el
almidn da un color azul con yodo, m ientras que el glicgeno y el almidn
parcialm ente hidrolizado reaccionan dando una coloracin pardo rojiza.
Materiales 100
1. Solucin de yodo (5 mmol/1 en KI (30 g/1)). 100 mi
2. Celulosa, glicgeno, alm idn e in ulina (10 g/1). 200 mi
Mtodo
Acidifique la m u estra con HC1 diluido, agregue luego dos gotas de yodo y
com pare los colores obtenidos con los de yodo en agua.
EXPERIMENTO 6.10 Hidtlisis de los polisacridos

Fundamento
Los polisacridos contienen slo u n grupo reductor por varios cientos o m s de
residuos, as que, en la prctica no son reductores. La hidrlisis cida libera
los monosacridos constituyentes que pueden ser luego ensayados.
Carbohidratos 171
Materiales 100
1. Polisacridos como en el experim ento 6.9. 200 mi
3. Hidrxido de sodio (5 mol/1). 500 mi
4. Solucin de yodo (aprox. 5 mol/1 en K I (30 g/1)). 100 mi
5. Reactivos como en el experim ento 6.3, 6.5 y 6.7.
Mtodo
Coloque en un tubo 10 m i de solucin de polisacridos, aada 10 gotas de HC1
conc. y hierva cuidadosam ente. Con u n a pipeta de P asteu r rem u ev a una gota
de la solucin cada m inuto y m zclela con u n a gota de yodo en u n a baldosa
blanca. Al m ism o tiem po, re tire 3 gotas de la solucin, colquelas en u n tubo
de ensayo, neutralice con NaOH y agregue 5 m i de la solucin de Benedict.
Contine sacando m uestras d u ran te 6 m in o m s si lo cree apropiado; luego
coloque los tubos que contienen la solucin de B enedict en u n bao de agua
hirviendo d u ran te 3 m inutos y deje enfriar. Explique los resultados.
N eutralice con lcali el resto de la solucin e identifique el azcar o los
azcares presentes hasta donde sea posible.
Protocolo para la identificacin de un carbohidrato desconocido

Luego de que todas las pruebas anteriores hayan sido realizadas satisfacto
riam ente, disee u n protocolo p ara la identificacin de u n a solucin de
carbohidratos. C om pare su protocolo con el que se da en el apndice. Todas las
identificaciones deben ser confirm adas m ediante crom atografa de papel o de
capa delgada.
En este punto se aconseja identificar, hasta donde sea posible, m uestras
desconocidas de carbohidratos.
Polarimetra
El polarmetro. Tal como se discuti previam ente, la m ayora de los azcares
contienen uno o m s tomos de carbono asim trico y poseen actividad ptica.
La rotacin del plano de la luz polarizada puede dem ostrarse y m edirse con un
polarm etro (figura 6.3). La luz m onocrom tica atraviesa un prism a de Nicol y
sale polarizada en un plano. El haz de luz polarizada pasa a travs de la m ues
tra de azcar, que hace ro ta r el plano de la luz. Se hace entonces g irar el
segundo prism a de Nicol hasta cuando su plano de polarizacin se en cu en tre
en ngulo recto con el p rim er prism a, y por consiguiente, el rayo de luz no
pueda pasar a travs del instrum ento. A ltern ativ am en te se hace g irar el
segundo prism a hasta cuando corresponda con el plano de polarizacin del
prim ero dando as un campo de m xim a brillantez. El in stru m en to se grada
en cero en cualquiera de estas posiciones usando solvente nicam ente en la
cm ara de m uestra. En la prctica, la luz em erg en te se ve como dos zonas
sem icirculares y el cero se obtiene cuando am bas m itades del cam po visible
I
Lente de luz Luz polarizada

m onocro m tica
Polarizador Tubo del p o la rm e tro que A n a liz a d o r

co ntie n e la m u estra
Figura 6.3 Com ponentes esenciales del polarmetro
son de oscuridad o brillantez uniform e. Se reem plaza luego el solvente con la

solucin que se va a investigar y se hace girar el analizador para volver a las
condiciones de brillantez m nim a o m xim a. Se tom a nota entonces del grado
y la direccin de la rotacin.
Si el ngulo de rotacin avanza en la direccin en que se m u even las m a n e
cillas del reloj, el com puesto es dextrorrotatorio (+) y si lo hace en sentido con
trario, entonces el azcar es levorrotatorio ().
Rotacin especfica. El grado de rotacin observado depende de un nm ero
de factores que incluyen la longitud del tubo (l, dm ) y la concentracin del
soluto (c, g/m l), as como la tem p eratu ra (t, C) y la longitud de onda de la luz
usada ( Xnm). La rotacin especfica es caracterstica de cada com puesto y se
define como la rotacin de la luz m onocrom tica causada por 1 g /m l de un
soluto pticam ente activo en un tubo de 1 dm a una tem p eratu ra fija.
rotacin especfica [a] { = a/(l X c)
En la prctica, la m ayora de los polarm etros sim ples usan lm para de

sodio ( X = 589 nm ) y las observaciones se hacen g eneralm ente a 20 C y, en
este caso, la rotacin especfica se da como [a] d .
EXPERIMENTO 6.11 M utarrotacin de la glucosa

Fundamento
La D-glucosa puede cristalizarse bien sea en la form a a o en la j3 y, las
soluciones frescas de estos anm eros tien en rotaciones especficas [a] , de
+ 113 y 19 respectivam ente. Luego de un tiempo, estas soluciones m uestran
m utarrotacin y se obtiene una mezcla de las form as a y P en equilibrio con
una rotacin especfica de + 52.5.
Materiales 10
1. Polarm etros. 5
2. o;-D-glucosa. 100g
Carbohidratos 173
3. )3 -D-glucosa. 100 g
4. Carbonato de sodio (0.1 mol/1 50 mi
5. Cronm etros. 5
Mtodo
Mutarrotacin en agua destilada. E njuague el tubo del polarm etro con agua
destilada y llnelo com pletam ente de agua. A ada las ltim as gotas con una
pipeta P asteur y tape cuidadosam ente asegurndose de que no hayan
quedado atrapadas b u rb u jas de aire. A juste el in stru m en to a cero con el tubo
del polarm etro lleno de agua. Vace el tubo y squelo com pletam ente.
T ransfiera cuidadosam ente 5 g de a-D -G lucosa a un m atraz volum trico
seco de 50 mi, agregue 40 mi de agua para disolver la glucosa, y llene hasta la
m arca con agua destilada. Mezcle rpidam ente la solucin y llene el tubo del
polarm etro con la solucin de glucosa: tom e una lectu ra de la rotacin tan
pronto como sea posible y com ience el cronom etraje (tiem po cero). Mida la
rotacin cada 10 m inutos d u ran te los 30 m inutos siguientes y luego a
intervalos ms largos hasta obtener un valor constante. Repita el experi
m ento con |3-D-glucosa y haga un grfico del cam bio de la rotacin especfica
en funcin del tiempo.
Mutarrotacin en lcali. Repita el experim ento an terio r con las form as a y (3
de D-glucosa, pero esta vez agregue 1 mi de solucin de N a2C 0 3 (0,1 mol/1)
antes de com pletar hasta la m arca. O btenga la p rim era lectura tan pronto
como sea posible y tom e lecturas cada 2 m inutos d u ran te 10 m inutos y luego a
intervalos m s largos hasta que no se observen m s cambios. Haga un grfico
del cambio en la rotacin especfica en funcin del tiempo.
Hasta qu punto coinciden sus lecturas de la rotacin especfica con las
que se han discutido arriba?
Repita el experim ento en lcali, pero ahora use sacarosa en lugar de
glucosa y explique los resultados.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE CARBOHIDRATOS
EXPERIMENTO 6.12 D eterm inacin de carbohidratos por el m todo de la

antrona
Fundamento
La reaccin de la an tro n a constituye la base de un m todo rpido y
conveniente para la determ inacin de hexosas, aldopentosas y cidos
hexurnicos, bien sea que estn libres o form ando p arte de los polisacridos.
La solucin azul verdosa m u estra una absorcin m xim a a 620 nm , aunque
algunos carbohidratos pueden d ar otros colores. Esta reaccin no es adecuada
si en la m uestra tam bin se hallan presentes protenas que contengan grandes
cantidades de triptfano, puesto que en este caso se obtiene una coloracin
roja.
La extincin depende del com puesto investigado, pero es constante para

una molcula dada.
Materiales 100
1. Reactivo de an tro n a (2g/1 en H 2S 0 4 conc). 51
2. Glucosa (0.1 g/1). 21
3. Glicgeno (0.1 g/1). 21
4. Otros carbohidratos con la m ism a concentracin si 21
se quiere.
Mtodo
A 1 mi de u na solucin de carbohidrato agregue 4 m l del reactivo de antrona
1libre de protena y m ezcle rpidam ente. (Precaucin: cido fuerte). Coloque
los tubos en u n bao de agua hirviendo d u ran te 10 m inutos tapndolos con
una bola de vidrio p ara p rev en ir prdidas de agua por evaporacin. E nfre y
lea la extincin a 620 nm contra un blanco.
P rep are curvas patrones p ara las soluciones de glucosa y glicgeno y
com prelas e n tre s. R ecuerde que la glucosa existe en el glicgeno como
glicsido (C6H 100 5) y su peso mol. es 162 y no 180. E xam ine la pureza de varias
mezclas de glicgeno comercial.
EXPERIMENTO 6.13 Determinacin de azcares reductores por el mtodo de

Somogyi-Nelson
Fundamento
Se calienta el azcar con u n a solucin alcalina de ta rtra to de cobre
produciendo as xido cuproso, que reacciona con arsenom olibdato para dar
azul de molibdeno; el color azul intenso originado se m ide en u n colormetro.
En la mezcla de reaccin se incluye sulfato de sodio p ara m inim izar la entrada
de oxgeno atm osfrico a la solucin, lo cual podra causar reoxidacin del
xido cuproso.
La curva de calibracin obtenida depende en cierto grado del azcar
determ inado, as que el m todo no es apropiado p ara la determ inacin de una
mezcla com pleja de azcares reductores.
Se deben rem over las protenas antes de proceder a la determ inacin. Esto
se hace utilizando hidrxido de zinc como agente de precipitacin de
protenas para ob ten er as u n a solucin n e u tra libre de protenas.
Materiales 100
1. Solucin alcalina de ta rtrato de cobre. (D isuelva en agua 4 g de 21
C u S 0 4. 5H 20 , 24 g de N a2C 0 3 anhidro, 16 g de ta rtrato
sdico potsico (sal de Rochelle), y 180 g de N a2S 0 4anhidro
y com plete a l l ) .
2. Reactivo de arsenom olibdato de Nelson (disponible 21
com ercialm ente).
Carbohidratos 175
3. Soluciones patrones p rim arias de azcares (glucosa, 50 mi

fructosa y m altosa 1 g/1 en cido benzoico saturado).
4. Soluciones patrones de trabajo de azcares (glucosa, 100 mi
fructosa y m altosa (descritos en 3) diluidas 1 en 10
antes de usarse para obtener concentraciones de
100//g/m l).
5. Algunas soluciones desconocidas de azcares. 100 mi
6. Sulfato de zinc (solucin de Z n S 0 4 . 7H 20 , 50 g/1). 250 mi
7. Hidrxido de bario (0.3 ml/1). 250 mi
Mtodo
En un tubo pipetee 1.5 m i de agua y 0.1 mi de la m u e stra que contenga 50150
pg de azcares y mezcle vigorosam ente. A ada a la m ezcla 0.2 mi de la
solucin de hidrxido de bario y 0.2 mi de sulfato de zinc acuoso, mezcle y
centrifugue. Use 1 ml del sobrenadante para los anlisis posteriores.
Agregue a la m u estra 1 ml del reactivo alcalino de cobre y mezcle. Coloque
una bola de vidrio encim a de cada tubo y caliente en un bao de agua
hirviendo por 15 m in. E nfre los tubos en agua fra; agregue 1 m l del reactivo
de arsenom olibdato y djelo reposar por u n m inuto hasta que term in e la
efervescencia. D iluya el color azul con agua hasta u n volum en final de 10 mi
(u otro volum en adecuado) y lea la extincin a 510 nm . La sensibilidad puede
aum entarse leyendo la extincin a 660 nm, pero se p refieren longitudes de
onda m enores de 510 p ara m inim izar los efectos de variaciones en el blanco y
de la reoxidacin del xido cuproso.
El tiem po del calentam iento tiene que ser controlado cuidadosam ente y
algunos azcares pueden necesitar perodos m s cortos o m s largos en el
bao de agua hirviendo.
/
EXPERIMENTO 6.14 D eterm inacin de glucosa por m edio de la enzim a glucosa
oxidasa (0-D-glucosa; oxgeno oxidoreductasa, 1.1.3.4)
Fundamento
La glucosa oxidasa es u n a enzim a que se en cu en tra en el medio de
crecim iento de Penicillium n otatum y cataliza la oxidacin de /? -D-gluco-
piranosa a D-glucono-l,5-lactona con la form acin de perxido de hidrgeno;
la lactona es luego hidrolizada len tam en te a cido D-glucnico. La enzim a es
especfica para /?-D-glucopiranosa, pero la m ayora de las preparaciones de
la enzim a contienen m u tarro tasa, que cataliza la interconversin de las for
mas a y |3. La D -m anosa y la D-xilosa son tam bin oxidadas por la enzim a
pero a velocidades de aproxim adam ente 1/100 de la correspondiente
D-glucosa. el otro nico azcar com n afectado es la D-galactosa que es
oxidada con una eficiencia de slo 1/1000 en relacin con la glucosa. El m todo
es por lo tanto altam en te especfico para la glucosa. En la m ezcla de reacci n .
se incluye tam bin peroxidasa y o-tolidina; la enzim a libera oxgeno a p artir
del perxido de hidrgeno y reacciona con la o-tolidina p ara d ar u n color azul.

La reaccin es rpida a te m p eratu ra am biente pero el color es inestable; por lo
tanto, todos los tubos deben ser observados al m ism o tiem po. El tiem po ms
conveniente es cerca de 8 m inutos, pero debe ser verificado m ediante la
solucin patrn de glucosa.
0-D-glucopiranosa + FAD - - D-glucono-1,5 lactona + FA D H 2

D-glucono-1,5 lactona + H 20 ------- cido D-glucnico
FADH2 + 0 2 H 20 2 + FAD
0-D-glucopiranosa + H zO + 0 2 ------- cido D-glucnico + H 20 2
Se ha reportado que la o-tolidina es carcinognica, as que debe usarse con

cuidado. No pipetee con la boca.
Materiales 100
1. Sulfato de zinc (Z n S 0 4 . 7H 20 , 100 gr/1). 200mi
2. Sulfato de sodio isotnico (93 mmol/1). 21
3. Reactivo de sulfato de sodio y sulfato de zinc. (D iluya 21
55 m i de sulfato de zinc a 1 1 con la solucin de sulfato
de sodio.)
4. H idrxido de sodio (0.5 mol/1). 250mi
5. A m ortiguador de acetato (0.15 mol/1, pH 5). 61
6. Solucin de glucosa oxidasa (Ferm cozym e de H ughes y 50mi
Hughes; consrvese a 4o C).
7. Peroxidasa (1 m g/m l; p rep are y conserve a 4o C). 50mi
8. o-tolidina (10 g/1 en etanol absoluto, guarde en 50mi
botella oscura).
9. Reactivo combinado de o-tolidina: 150 m i de am orti- 61
guador de acetato y 1 m i de glucosa oxidasa, 1 mi de
peroxidasa, 1 mi de o-tolidina. La preparacin es
activa por varias sem anas si se guarda en una botella
oscura a 4o C.
10. P atrn de glucosa (0.1 g/1, p represe fresco). 100 mi
Mtodo
Procedimiento. En u n tubo de centrfuga coloque 1.8 m l del reactivo de
sulfato de sodio-sulfato de zinc y aada 0.1 mi de la m u estra (sangre, etc).
Aada 0.1 m i de hidrxido de sodio, 0.5 mol/1, centrifugue y tom e*1 m l del
sobrenadante.
Blanco. 1 mi de agua.
Patrones. 1 mi de solucin de glucosa de concentracin apropiada.
Agregue 5 ml del reactivo com binado de o-tolidina y m ezcle vigorosam en
te. Deje reposar los tubos por 8 m in exactam ente y lea el color a 625 nm.
Carbohidratos 177
Use los m todos de Somogyi-Nelson y glucosa oxidasa para d eterm in a r el

contenido de fructosa y glucosa en u n a mezcla de azcares como la que se
encuentra en la m iel de abejas.
EXPERIMENTO CON POLISACARIDOS
EXPERIMENTO 6.15 Hidrlisis cida de glicgeno y otros polisacridos
Fundamento
La hidrlisis cida de los enlaces glicosdicos o 1-4 y a 1-6 que u n en los resi
duos de glucosa en glicgeno ocu rre al azar y, por consiguiente, se puede
form ar toda una gam a de oligosacridos interm ediarios, a pesar de ser la
glucosa el producto final.
Otros polisacridos pueden ser m s resistentes o m s susceptibles que
el glicgeno a la hidrlisis cida y algunos de ellos se incluyen en este experi
m ento como tpico de investigacin.
Materiales 100
1. P reparacin de glicgeno a p a rtir del hgado de ra ta del 1g
experim ento 10.14.
2. Otros polisacridos tales como celulosa, in u lin a y quitina. 1g
3. Acido clorhdrico (2 mol/1). 11
5. Resina de intercam bio aninico dbil.
6. Reactivo dinitrosalicilato (experim ento 9.9). 21
Mtodo
En 10 m i de agua disuelva aproxim adam ente 50 mg de glicgeno y pipetee 1 mi
de esta solucin en 7 tubos. A gregue a cada tubo 1 m i de agua y 2 m i de HC12
mol/1 y colquelos en up bao de agua hirviendo. Coloque u n a bola de vidrio
encim a de cada tubo p ara p rev en ir prdidas excesivas a causa de la evapora
cin y d u ran te u na hora rem ueva tubo por tubo a intervalos convenientes de
tiempo. N eutralice los contenidos de cada tubo aadiendo 1 mi de NaOH 4
mol/1 y calcule el poder red u cto r total con el reactivo de dinitrosalicilato,
como se indica en el experim ento 9.9. Haga u n grfico del progreso de la
hidrlisis del glicgeno y com pare con el de los otros polisacridos.
Al mismo tiem po, en u n tubo agregue 2 m i de la solucin de glicgeno a 2 mi
de HC1 2 mol/1 e hidrolice por 1 ho ra como se indic an terio rm en te. Enfre,
agite con varias porciones de la resin a de intercam bio aninico dbil en la for
ma hidroxilada hasta que la m ezcla tenga aproxim adam ente un pH neutro.
Decante el sobrenadante y selo m s tard e para crom atografa. Repita la
hidrlisis con los otros polisacridos usando condiciones apropiadas.
EXPERIMENTO 6.16 Hidrlisis enzim tica del glicgeno por a y (3 amilasas

Fundamento
La a-am ilasa cataliza la hidrlisis especfica de los enlaces glicosdicos a 1-4
en el glicgeno, pero no acta sobre los enlaces (3de la celulosa. Los enlaces
a 1-6 no son afectados; tampoco lo son los enlaces a 1-4 que ligan las u nida
des de glucosa en la m altosa. La hidrlisis no se hace en sitios especficos
y se obtienen por lo tanto una serie de interm ediarios diferentes. El producto
final es principalm ente m altosa con un poco de glucosa y m altotriosa. A
medida que procede la hidrlisis se puede seguir el increm ento en el nm ero
de los grupos term in ales reductores, usando el reactivo de dinitrosalicilato y
se pueden identificar crom atogrficam ente los productos finales.
La (3-amilasa de plantas superiores cataliza la hidrlisis de los enlaces a 1-4
para dar m altosa, pero es u n a exoam ilasa y por lo tanto rom pe las unidades
de m altosa a p a rtir del extrem o no red u cto r de la cadena. C uando se llega a
un punto de ram ificacin, la digestin se suspende dando u n a dextrina lm ite.
Se da a la enzim a el nom bre de (3-amilasa porque el producto inicial es (3-mal-
tosa el cual origina m s tard e u n a mezcla equilibrada de a y (3-maltosa. Al
igual que con la a-am ilasa, la extensin y el progreso de la hidrlisis puede se
guirse por determ inacin de la cantidad de azcares reductores producidos.
Materiales 100
1. a-am ilasa extrada de la saliva y (3-am ilasa de las
plantas.
2. P reparacin de glicgeno de hgado de rata. 1g
3. A m ortiguador de fosfato (0.1 mol/1, pH 6.7).C ontiene 11
cloruro de sodio 0.05 mol/1).
4. Reactivo de dinitrosalicilato (experim ento 9.9). 21
Mtodo
En una serie de 7 tubos disuelva 50 mg de glicgeno en 10 m i de am ortiguador
salino (3) y pipetee 1 mi. A cada tubo aada 3 mi de saliva diluida aproxim a
dam ente 1 a 100 con agua, e incube los tubos a 37 C por 1 hora. A intervalos
adecuados rem uev a 1 tubo, agregue 1 mi de agua y pare la reaccin agregando
1 ml del reactivo de dinitrosalicilato.
A gregue 6 m i de a-am ilasa a 2 m i de glicgeno e incube por 1 h a 37 C.
Desalinice la m uestra usando una resina de lecho m ixto y utilice el sobrena
dante para crom atografa.
Repita el experim ento an terio r con una preparacin convenientem ente
diluida de (3-amilasa en vez de saliva y determ in e la cantidad de azcares
reductores liberados. C om pare la cantidad de m altosa liberada con la
obtenida cuando se usa a-am ilasa y calcule el porcentaje de glicgeno degra
dado por la (3-amilasa (a-l,4-glucan m altohidrolasa 3.2.1.2.).
Carbohidratos 179
EXPERIMENTO 6.17 Identificacin cromatogrfica de los productos de la

hidrlisis cida y enzimtica del glicgeno
Identifique los productos de la hidrlisis usando crom atografa descendente
de papel o de capa delgada (experim entos 3.10 y 3.12). C orra paralelam ente
m uestras de los azcares que pueden estar presentes.
EXPERIMENTO 6.18 Ruptura del glicgeno y produccin de glucosa-l-fosfato

por la fosforilasa muscular
Fundamento
El glicgeno est presente en cantidades apreciables en el hgado y en el
msculo de los anim ales bien nutridos. E n tre las comidas, este carbohidrato
de reserva es degradado p ara producir energa. La p rim era etapa e,n elVne-
tabolismo del glicgeno es la ru p tu ra de la m olcula por la fosforilasa. Esta
enzim a cataliza la rem ocin de unidades de glucosa de la p arte lineal de la
molcula y la form acin de la glucosa-l-fosfato (G -l-P ) a p a rtir de fosfato
inorgnico.
fosforilasa
(glucosa) + Pj ---------- (glucosa) j + glucosa-l-fosfato.
La ru p tu ra del enlace glicosdico con introduccin de los elem entos del

agua se conoce como hidrlisis, m ientras que la ru p tu ra por fosfato se
denom ina fosforlisis; de aqu el nom bre de la enzim a fosforilasa. La reaccin
es fcilm ente reversible, pero en vivo la concentracin de fosfato inorgnico
es tal que el equilibrio favorece la degradacin en vez de la sntesis.
La mezcla de reaccin contiene cisterna para m a n ten er los grupos tiol (
SH) de la molcula proteica de enzim a en la form a reducida, m ientras que el
cloruro presente inhibe la fosfoglucomutasa que en otra form a catalizara la
conversin de G -l-P a G-6-P. El AMP se aade p ara obtener la m xim a
actividad enzim tica, ya que la fosforilasa existe en dos formas: a y h y la
form a b es activa nicam ente en presencia de AMP.
El G -l-P producido es aislado como sal de bario y, siendo un hem iacetal, es
hidrolizado fcilm ente por cido diluido (H 2S 0 4 0.5 mol/1) dando glucosa y
fosfato. La reaccin se com pleta prcticam ente en 10 m in a 100 C y esto se usa
para verificar la estequiom etra de los productos. ,
Materiales 100
1. Fosforilasa de glicgeno. 25 mi
2. A m ortiguador de (3-glicerofosfato de sodio (10 mm ol/1 500 mi
pH 6.8 que contiene cisterna 3 mmol/1 y NaF 0.1 mol/1).
3. Glicgeno (1.6% p /v en am ortiguador de fosfato que 500 mi
contiene 0.26 mol/1, pH 6.8; cistena 6 mmol/1 AMP 2
mol/1 y NaF 0.2 mol/1).
4. Amilasa. 100 mi
5. Acetato de bario (200 g/1). 250mi

6. Indicador rojo de fenol (10 g/1 en etanol acuoso). 50mi
7. Hidrxido de sodio (1 ml/1). 500mi
8. Acido sulfrico (2 mol/1). 500mi
9. Etanol absoluto. 11
10. Reactivo p ara la estim acin de fosfato (experim ento 4.3).
13. Probetas (25 mi). 50
14. Hielo molido.
15. Reactivos p ara la determ inacin de azcares reductores
16. G lucosa-l-fosfato (10 mmol/1). 100mi
17. Glucosa-6-fosfato (10 mmol/1). 100m i
Mtodo
Incubacin. En u n tubo de ensayo m ezcle 5 m i de am ortiguador |3-glicero-
fosfato con 5 m i de la solucin de glicgeno y equilibre a 37 C d u ran te 10 min.
Inicie la reaccin aadiendo 0.2 m i de fosforilasa convenientem ente diluida
en am ortiguador /3-glicerofosfato. Incube d u ran te 30 m inutos a 37 C y p are
la reaccin colocando el tubo en u n bao de agua hirviendo d u ran te 2 min.
Aislam iento. E nfre el tubo bajo agua corriente y rem ueva el exceso de
glicgeno aadiendo 1 mi de solucin de am ilasa y dejndolo a tem p eratu ra
am biente por 30 m inutos. Despus de la incubacin con am ilasa, aada 2 m i de
la solucin de acetato de bario y dos gotas de indicador rojo de fenol seguido
por NaOH 1 mol/1 aadido gota a gota hasta ob ten er u n a coloracin rosada.
Mezcle de nuevo vigorosam ente y rem u ev a el precipitado de fosfato de bario
centrifugando a velocidad m xim a en u na centrfuga de mesa. Rem ueva
cuidadosam ente el sobrenadante, m ida el volum en y colquelo en un
erlenm eyer; agregue 3 veces el volum en de alcohol absoluto, mezcle bien y
deje reposar por 30 m inutos en hielo. El precipitado form ado bajo estas
condiciones es la sal de bario de la glucosa-l-fosfato.
D ecante el sobrenadante y centrifugue la suspensin d u ran te 10 m inutos a
velocidad m xim a en la centrifuga de mesa. R em ueva el sobrenadante y deje
secar el precipitado invirtiendo los tubos sobre papel de filtro. Repita el
procedim iento de precipitacin despus de a ad ir 4 m i de agua al azcar-
fosfato precipitado.
Estequiom etra. D isuelva la sal de bario en 5 m i de agua y pipetee 2 m i en un
tubo de ensayo que contenga 2 m i de H 2S 0 41 mol/1. Mezcle vigorosam ente y
coloque en u n bao de agua hirviendo d u ran te 10 m in. E nfre bajo agua
corriente, agregue luego 2 m i de NaOH 2 mol/1 p ara n eu tralizar la reaccin;
centrifugue y ensaye el sobrenadante p ara azcares reductores y fosfato
usando los m todos que se dan en el libro. Pipetee otros 2 m i de la m u estra del
Carbohidratos 181
ster de fosfato en 2 m i de H 2S 0 4, pero esta vez agregue NaOH inm ediata

m ente despus y no coloque los tubos en el bao de agua hirviendo. En este
control no hidrolizado se hace tam bin la prueba p ara fosfatos y azcares
reductores. Calcule la produccin de G -L P m ediante la determ inacin de
azcar y fosfato, suponiendo que se ha efectuado la hidrlisis completa.
Com pare los resultados con los obtenidos despus de la hidrlisis cida de
una solucin de glucosa-l-fosfato 1 mmol/1 y de una solucin patrn de
glucosa-6-fosfato diluida 10 mmol/1.
Bibliografa
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Lpidos y membranas
CLASIFICACION Y PAPEL BIOLOGICO DE LOS LIPIDOS
Los lpidos son com puestos insolubles en agua pero solubles en solventes
orgnicos tales como acetona, alcohol, cloroform o o benceno. G eneralm ente
se en cu en tran distribuidos am pliam ente en la n atu raleza como steres de
cidos grasos de cadena larga. Su hidrlisis alcalina (conocida como saponi
ficacin) origina u n alcohol y la sal de sodio o potasio de los cidos grasos
constituyentes; estos productos de la hidrlisis pueden ser solubles en agua.
Desde el punto de vista qum ico los lpidos pueden dividirse en dos grupos
principales: l p i d o s s i m p l e s y l p i d o s c o r h p u e s t o s . Los esteroides y las
vitam inas liposolubles se consideran tam bin como lpidos, pues presentan
caractersticas sim ilares de solubilidad y se conocen con el nom bre de l p i d o s
d e r i v a d o s . Muchos de estos com puestos son, sin em bargo, alcoholes y no
steres y por lo tanto no pueden saponificarse.
Lpidos simples
Los steres de glicerol y cidos grasos se conocen como
A cilg lic ero le s.
o g l i c r i d o s . El trihidroxi alcohol, glicerol, puede esterificarse
a c ilg lic e ro le s
para dar mono-, di-, y triacilgliceroles. Los cidos grasos pueden ser del mismo
o diferente tipo.
CHaO-COR,! c h 2o h RiCOOK
T I
CH-OCOR 2 + 3KOH CHOH + R2COOK
I I
c h 2o -c o r 3 c h 2o h R 3 COOK
Triacilglicerol Glicerol Sal de potasio
de los cidos grasos
182
Lfpido* y membranas 183
Los triacilgliceroles son la form a predom inante en la naturaleza, aunque

se encuentran tam bin mono y diacilgliceroles. Los acilgliceroles son
molculas no cargadas y por esta razn se conocen tam bin como l p i d o s
n e u t r o s . Se llam an as mism o g r a s a s o a c e i t e s dependiendo de si son slidos o
lquidos a te m p eratu ra am biente.
A c i d o s g r a s o s . En la naturaleza se en cu en tra una gran variedad de cidos
grasos y algunos de los m s com unes aparecen en la tabla 7.1. La m ayora de
los cidos grasos natu rales tien en una cadena lineal con un nm ero par de
tomos de carbono; sin em bargo, tam bin existen cidos grasos ram ificados y
cclicos. La presencia de dobles enlaces en los cidos grasos que com ponen los
acilgliceroles dism inuye el punto de fusin del com puesto. As, las grasas
animales que constan principalm ente de triacilgliceroles con cidos grasos
com pletam ente saturados son slidas a te m p eratu ra am biente m ien tras que
las vegetales y las de pescado, que contienen u n a gran proporcin de cidos
grasos no saturados, son lquidas a te m p eratu ra am biente y constituyen los
aceites. Es ms, la presencia de u n doble enlace ab re la posibilidad de que
existan dos form as geom tricas diferentes, los ism eros c i s y t r a n s ; sin em
bargo, la form a t r a n s no es com n en la naturaleza.
CH(CH2)7CH3 CH3(CH2)7CH
Acido oleico
CH(CH2)7CH3 H:h (c h 2)7 c o o h
c is tra n s
En la tabla 7.1 se presenta u n a form a sim ple de designar los cidos grasos.
El prim er nm ero indica cuntos tomos de carbono tiene la cadena, y el
segundo, el nm ero de dobles enlaces. Los nm eros que se en cu en tran
despus del smbolo A indican la posicin de los dobles enlaces en la m ol
cula. P or ejem plo, el cido esterico se m u estra como 18:0, lo que significa
que tiene 18 tomos de carbono y no posee dobles enlaces. El cido linoleico
se presenta como 18:2a '9, 12' lo que q u iere decir que tien e 18 tomos de carbono
y dos dobles enlaces en las posiciones 910 y 1213.
Del resum en an terio r se puede deducir que los acilgliceroles que se
encuentran en la naturaleza son mezclas complejas, pues el n m ero posible
de combinaciones de cidos grasos con el glicerol es bastante grande.
T r i a c i l g l i c e r o l e s ( t r i g l i c r i d o s ). Estos compuestos constituyen la m ayor parte
de los lpidos ingeribles. Son degradados parcialm ente por las lipasas en el
intestino y luego son re-esterificados en la mucosa intestinal. Las grasas son
luego transportadas por el sistem a linftico a la sangre /en form a de
quilomicrones, esto es, gotas de grasa de u n dim etro de 0.1 a 1 p m,
constituidos principalm ente por triacilgliceroles con algo de colesterol y una
capa de lipoprotena. Los lpidos pueden ser oxidados en el hgado para
sum inistrar energa o pueden ser depositados como grasa en regiones caracte-
Bioqumica prctica
Tabla 7.1 A lgunos cidos grasos com nm ente encontrados en organism os vivos
Nombre com n Frm ula Smbolo
Acidos grasos saturados

Lurico CH3(CH2) , 0COOH 12:0
Mirstico CH3(CH2) , 2COOH 14:0
Palmtico CH3(CH2) 14COOH 16:0
Esterico CH3(CH2) 16COOH 18:0
Acidos grasos no saturados
Oleico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 18:1a -9
Linoleico CH3(CH2)4CH=CH CH2 CH=CH(CH2 )7COOH 18:2a 9'12
Linolnico CH3CH2CH=CHCH2 CH=CHCH2 CH=CH(CH2)7C 00H 18:3a -9'12'15
Araquidnico CH3(CH2)4(CH=CH CH2)3CH=CH(CH2)3COOH 20:4^. s,8, i i , i 4
\
Lpidos y membranas 185
rsticas del anim al donde actan como depsitos de reserv a a largo plazo y
como aisladores trm icos. En algunas sem illas los triacilgliceroles se alm ace
nan en form a de aceites.
Ceras. Una cera es un ster de u n alcohol aliftico su p erio r y un cido graso
de cadena m uy larga. La cera de las abej as, por ejem plo, es un ster de alcohol
miricliCo y cido palmtico.
Cera de abejas (palm itato miriclico): C30H6 jOCOC! SH3 1
Estos com puestos gen eralm en te actan como una cubierta a prueba de
agua para proteger las clulas contra infecciones, dao m ecnico o ganancia
excesiva de agua. Un ejem plo de cera es la capa ex tern a brillante de las
manzanas.
Lpidos compuestos
La hidrlisis com pleta de u n lpido com puesto produce, por lo menos, otro
com ponente adem s del alcohol y los cidos grasos encontrados usualm ente.
Estas sustancias son com ponentes estru ctu rales esenciales de las m e m b ra
nas celulares y se discuten en detalle ms adelante.
Fosfoglicridos (fosftidos de glicerol). Estos com puestos se conocen tam bin

con el nom bre de fosfolpidos y son m uy abundantes en los organism os vivos.
Q um icam ente son sim ilares a los triacilgliceroles ya que son steres de cidos
grasos y glicerol, pero adem s contienen cido fosfrico esterificado con un
alcohol (X). La frm ula general de estos com puestos es:
CH20-C 0R
Un L-fosfoglicrido R jO O O CH
O
CH2 O - P - O - X
El tomo de carbono n m ero 2 del glicerol es asim trico y los com puestos que
se encuentran en la n atu raleza son p arte de la serie L tal como se m u estra en
el ejem plo anterior.
Cuatro de los fosfolpidos m s com unes se m u estran en la tabla 7.2. Sus
nom bres derivan del alcohol X ligado al residuo de cido fosfrico. (Se
recom ienda nom brarlos fosfoglicridos de X o fosfatidil X). Uno de los
fosfolpidos ms ab u n d an te contiene colina y se conoce como fosfoglicrido de
colina o fosfatidil-colina.
Tabla 7.2 Algunos fosfolpidos encontrados en la naturaleza
Nombre recomendado Grupo sustituyente Nom bre comn

fosfoglicrido de colina -C H 2CHj N(CH3)3 ,lecitina
fosfoglicrido de etanolam ina -C H 2CH2 n h 2 cefalina
fosfoglicrido de serina -C H 2CH(NH2)COOH
fosfoglicrido de inositol
HO-t^
-O H
f ^
-O H
O H -^ -
Plasmalgenos. Los plasmalgenos tienen u n a estru ctu ra sem ejante a la de

los fosfoglicridos, excepto, que el cido graso en la posicin uno se u n e al
glicerol a travs de un enlace te r de vinilo y no a travs del enlace ster usual.
c h 2- o - c h = c h - r 1
Un plasmalgeno R2C 0 - 0 - H
O
C H j- O - P - O - X
-
Esfingolpidos. En los esfingolpidos el esqueleto de la m olcula es el alcohol

am inado esfingosina o un compuesto relacionado con l, en vez de glicerol.
CH=CH(CH2) 12CH3
CHOH
Esfingosina HNH2
h 2o h
En el caso de las esfingomielinas, el grupo alcohol prim ario de la esfingosina

est esterificado con fosforil-colina, m ientras que el grupo am ino est acilado
con el residuo de cido graso. Los esfingolpidos se m etabolizan a m enudo
ms lentam ente que los fosfolpidos y parecen fo rm ar las estru ctu ras ms
estables de las clulas. P or ejemplo, la esfingom ielina de la cubierta de
mielina que acta como aislante de las fibras nerviosas no es m etabolizada
apreciablem ente d u ran te la vida adulta.
Glicolpidos. Como el nom bre lo sugiere, estos com puestos contienen tanto
lpido como carbohidrato. Los cerebrsidos tienen una estru ctu ra sim ilar a la
de la esfingomielina, excepto que la fosforil colina ha sido reem plazada por

galactosa. Los ganglisidos son tam bin derivados de la esfingosina, pero en
este caso, una cadena de oligosacridos que contiene cido N -acetilneuram -
nico est unida al grupo alcohol prim ario de la esfingosina. Los cerebrsidos se
encuentran en altas concentraciones en el tejido nervioso, particu larm en te
en la m ateria blanca del cerebro, m ientras que los ganglisidos se en cu en tran
en altas concentraciones en la m ateria gris.
CH=CH(CH2 )12CH3 CH=CH(CH2 )12CH3

HOH HOH
H-NH-OCR)
O
c h 2o- I - c h 2 CH2 N(CH3 )3
-
Una esfingom ielina Un cerebrsido
Lipoprotenas. En los m ateriales biolgicos los lpidos se en cu en tran frecuen

tem ente asociados con protenas form ando complejos lipoprotenicos. Las
lipoprotenas solubles se encargan principalm ente del tran sp o rte de lpidos
en la sangre, m ientras que las lipoprotenas insolubles constituyen la parte
principal de m uchas m em branas biolgicas tales como el retculo endopls-
mico, las lmelas de los cloroplastos, las crestas de las m itocondrias y la
envoltura de m ielina de los nervios.
Lpidos derivados
Esferoides. Estos compuestos son solubles en los solventes orgnicos, pero la
m ayora de ellos no son saponificables. Se consideran g en eralm en te como
lpidos debido-a sus caractersticas sem ejantes de solubilidad. La estru ctu ra
bsica de los esteroides es el anillo de 17 carbonos, ciclopentanoperhidrofe-
nantreno.
Ciclopentanoperhidrofenan treno
Cuando un grupo su stitu y en te est por encim a del plano del anillo, se le co
noce como (3 y se indica por una lnea continua, m ien tras que si est situado
por debajo del anillo se le llam a a y esta posicin del grupo se indica por una
lnea discontinua.
Los esteroides se en cu en tran am pliam ente distribuidos en los anim ales
superiores donde ejecutan una gran cantidad de funciones. Por ejem plo el
colesterol, que es el ms abundante de los esterles se en cu en tra en m uchas
m em branas celulares de los anim ales y sirve adem s como un precursor
im portante de m uchos esteroides.
CH3
ch3
Colesterol
HO
Los cidos biliares, clico y deoxiclico, que participan en la digestin y

absorcin de las grasas, son esteroides al igual que la horm ona aldosterona,
sintetizada en la corteza adrenal que regula el balance de agua y electrolitos
en los mamferos. M uchas otras horm onas son tam bin esteroides y los
cambios pequeos en su estru ctu ra qum ica afectan profundam ente su
actividad biolgica. Tal es el caso de las horm onas sexuales que se m uestran
abajo.
ch3
OH c=o
Testosterona Progesterona
(horm ona sexual m asculina) (horm ona sexual fem enina)
Vitam inas liposolubles. Estos compuestos se en cu en tran asociados con

lpidos naturales de la dieta y debido a sus caractersticas de solubilidad se
incluyen dentro de los lpidos (tabla 7.3),
Tabla 7.3 Algunas vitam inas liposolubles
Vitamina Fuentes principales Funcin biolgica
vitamina A hgado de peces, vegeta- La carencia de vitam ina A en la

(retinol) les y productos lcteos dieta produce visin nocturna defi
ciente y even tu alm en te ceguera. La
vitam ina A se necesita tam bin pa
ra m antener epitelios sanos y para
la form acin norm al de huesos y
dientes.
vitamina D 3 hgado de peces, pro-

(Colecalciferol) ductos lcteos
La vitam ina D se necesita para la

absorcin norm al de calcio en el
intestino y la form acin de los
huesos a partir de fosfato de calcio.
La deficiencia de la vitam ina causa
raquitism o en los nios.
vitamina E cereales y plantas
(a-tocoferol) verdes
Los tocoferoles se necesitan en

anim ales distintos al hom bre para
la reproduccin norm al. Probable
m en te actan com o antioxidantes
vitamina K, para proteger los constituyentes
(filoquinona) vegetales verdes celulares de la oxidacin.
Se conocen varias form as de vitam i

na K que son requeridas para la coa
gulacin norm al de la sangre. Una
deficiencia de esta vitam ina causa
aum ento en el tiem po de coagula
cin de la sangre.
MEMBRANAS
Las m em branas de la clula son claram ente visibles bajo el microscopio

electrnico y form an u n a p arte esencial de su estru ctu ra. Las clulas
procariticas sim ples tales como Micrococcus lysodeikticus y otras bacterias
tienen nicam ente u n a m em b ran a rodeando la clula. Las clulas eucari-
ticas presentes en organism os superiores tien en tam bin una m em brana
celular y adem s contienen otras estru ctu ras lim itadas por m em branas tales
como ncleo, m itocondrias y lisosomas. Estas m em branas separan eficiente
m ente las clulas unas de otras y tam bin las dividen en distintos
com partim ientos acuosos. Las m em branas son tam bin estru ctu ras bsicas
que contienen m uchas enzim as y sistem as de transporte. La m ayora de las
m em branas estn constituidas por aproxim adam ente 40% de lpidos, 60% de
protenas ju n to con algunos iones y carbohidratos.
Fosfolpidos en las membranas

La m ayora de los lpidos presentes en las m em branas estn compuestos por
molculas de fosfolpido asociadas en una form a regular. Esta organizacin
estru ctu ral se debe a que los fosfolpidos son com puestos anfipticos es de
cir, que tienen regiones hidrofbicas e hidroflicas en la m ism a molcula,
(figura 7.1).
La m ayora de los fosfolpidos son tam bin zw itteriones (iones dobles)
puesto que a u n pH n eu tro el grupo fosfato posee u n a carga negativa y la base
una carga positiva (fosfatidil colina, fosfatidil etanolam ina) o las dos cargas al
contrario (fosfatidil serina). El inositol es otra base com n unida al residuo de
fosfato, tiene grupos polares, pero no posee u n a carga form al. La estru ctu ra
del grupo de la cabeza polar determ in a la m agnitud y distribucin de la carga
sobre la m em brana.
La regin polar de los fosfolpidos es hidroflica y tiende a ubicarse en un
medio acuoso, m ientras que la parte hidrofbica de la m olcula tiende a
au m en tar su entropa expulsando agua de su vecindad y asocindose con
regiones hidrofbicas de otras molculas. P or consiguiente, los fosfolpidos se
orientan sobre u n a superficie acuosa en form a tal que la regin polar
interacta con el agua y las cadenas acilo quedan al aire (figura 7.2 (a)). Un
tipo sim ilar de asociacin ocurre en las m em b ran as en las que las cadenas
laterales acilo se asocian p ara form ar una bicapa lipdica, (figura 7.2(b)); esta
idea fue propuesta en p rim era instancia por G o rter y G rendal en 1925.
Colesterol y otros lpidos en las membranas

La m ayora de los otros lpidos que se en cu en tran en las m em branas son
tam bin molculas antipticas y esto le confiere a la m em b ran a propiedades
particulares. Muchos glicolpidos parecen d eterm in a r la especificidad
Lipidos y membranas 191
X
- I
o P - O Regin polar
---- 01-----------------------------
CH,
C H ,----- CH
I I Regin no polar
0 0
I I
c= o c= o Cadenas hidrocarbonadas de
cidos grasos asociadas entre s
Forma conveniente de
representacin de una
molcula de fosfolpido
Figura 7.1 Naturaleza antiptica de los fosfolpidos
inmunolgica de las clulas y los tejidos y ser responsables de la m ayor parte

de la carga presente en la superficie celular.
Protenas y membranas
Davson y Danielli (1934) fueron los prim eros en proponer el concepto de que
en la estru ctu ra de las m em branas celulares haba protena incorporada a la
bicapa lipdica. Ellos sugirieron que la bicapa lipdica estaba recu b ierta por
ambas caras con una monocapa de protena y esto fue m s tard e modificado
por Robertson, quien sugiri que la protena se encontraba presen te en la
configuracin extendida Esta hiptesis unitaria de la m em b ra n a fue pro
puesta como la base estru ctu ral de todas las m em b ran as biolgicas, pero
actualm ente ha sido reem plazada por el modelo de mosaico flu id o de Singer y
Nicolson (1972), que explica la m ayora de las propiedades fsicas de las
m em branas. De acuerdo a este ltim o modelo, los fosfolpidos form an una
Figura 7.2 Asociacin de m olculas de fosfolpidos en una m em brana y en la interfase

aire-agua
F o rm a de aso c ia c i n Encim a P a rcia lm e n te em be b ida s fa b k ^ a tfa ^ 6 E m bebidas e n la bicapa
U n i n d e la p r o te n a (H id ro flica ) (H id ro flica e h id ro f b ic a ) (H idrofbica)
Figura 7.3 Asociacin de protenas con la bicapa fosfolipdica en las m em branas
bicapa en la que estn em bebidas las protenas y la m ayora de las m olculas

estn libres para m overse en el plano de la m em b ran a. Las protenas pueden
asociarse con la bicapa lipdica en cuatro form as por lo m enos (figura 7.3).
Unas pocas protenas que se en cu e n tran en la superficie de las m em branas
se hallan ligadas electrostticam ente a la bicapa y pueden separarse
em pleando altas concentraciones de sal. Sin em bargo, la m ayora de las
Lipidos y membranas 193
protenas estn ligadas m s fu ertem en te a la m em b ran a y en m uchos casos

slo pueden separarse destruyendo la estru ctu ra de la m em b ran a con
detergentes o solventes orgnicos.
PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LIPIDOS

EXPERIMENTO 7.1 Solubilidad de los lipidos
Fundamento
Solubilidad. Los grupos principales de los lipidos tienen caractersticas de
solubilidad diferentes y esta propiedad se usa en su extraccin y purificacin a
partir de m ateriales biolgicos.
Emulsin. La m ayora de los lipidos son solubles en etanol al 95% v/v, pero
forman una em ulsin de gotas pequeas cuando se les agrega agua. Esto da a
la suspensin u na apariencia lechosa caracterstica y constituye u n a prueba
muy sensible para grasas.
Materiales 100
1. Acidos grasos (butrico, esterico y oleico). 50g
2. G rasas y aceites (m argarina, m antequilla, aceite de oliva 50g
m anteca de cerdo y aceite de hgado de bacalao).
3. Fosfolpidos (lecitina de huevo). 50g
4. Colesterol. 50g
5. Solventes (acetona, alcohol, cloroformo y ter). 11
Mtodo
1. Exam ine la solubilidad de los lipidos y cidos grasos en agua y en los
solventes orgnicos dados an teriorm ente; anote cuidadosam ente las
diferencias e n tre los grupos principales de lipidos.
2. Coloque una gota de solucin de uno de los lipidos en un papel de filtro y
djelo secar. O bserve la form acin de ujia m ancha de grasa.
3. Aada 1 mi de agua a u n a solucin alcohlica de los lipidos. O bserve el
aspecto de la solucin in m ed iatam en te despus de m ezclar y luego de
dejar reposar por varios m inutos.
4. En dos tubos de ensayo coloque 3 mi de agua, agregue dos gotas de aceite
de oliva a uno de los tubos y una soluci de lecitina en aceite de oliva al
otro tubo. Mezcle vigorosam ente y com pare la solubilidad de las
em ulsiones form adas. Qu efecto tiene la lecitina y por qu?
EXPERIMENTO 7.2 Pruebas para cidos grasos

Fundamento
Saponificacin. Cuando se calientan aceites o grasas en presencia de lcali, se
liberan cidos grasos y glicerol en un proceso que se conoce como saponifica
cin.
Formacin de jabn. El exceso de lcali presen te reacciona con el cido

liberado form ando la sal de sodio o potasio, dando a la solucin u n a ap arien
cia jabonosa caracterstica. Los jabones son solubles en agua pero se preci
pitan aadiendo exceso de NaCl. Las sales de m agnesio y calcio tam bin son
insolubles y originan la n ata que se form a cuando el jabn se agita en agua
dura.
Materiales 100
.1. G rasa anim al (m antequilla). 50 g
2. A ceite vegetal (aceite de oliva). 50 mi
3. Acido graso (cido esterico). 50 g
4. H idrxido potsico alcohlico (100 g/1). 500 mi
5. Acido clorhdrico conc. 200 mi
6. Fenolftalena (10 g/1 en alcohol). 100 mi
7. H idrxido de sodio (0.1 mol/1). 100 mi
8. C loruro de calcio (50 g/1). 100 mi
9. C loruro de m agnesio (50 g/1). 100 mi
10. A cetato de plomo (50 g/1). 100 mi
Mtodo
Saponificacin. En un tubo coloque grasa hasta u n a altu ra de aproxim ada
m ente 0.5 cm; agregue suficiente KOH alcohlica p ara cu b rir la grasa y deje
h erv ir cuidadosam ente por cerca d e l m inuto. A gregue 10 m i de agua, hierva
por 10 m inutos m s y enfre. A gregue cuidadosam ente HC1 conc. hasta que la
solucin sea ligeram ente cida y rem ueva la capa de cidos grasos que aparece
sobre la superficie del lquido. C aliente el cido graso con agua y agregue
lcali len tam en te hasta que se obtenga u n a solucin clara; utilice esta solucin
en los ensayos p ara la form acin de jabn.
Formacin de jabn. C aliente un poco de cido esterico con lcali diluido y

observe la aparicin de u n a solucin jabonosa. Use esta solucin y la del
experim ento a n terio r en los experim entos siguientes:
1. A cidifique con HC1. Qu se observa?

2. S atu re la solucin con NaCl y observe la separacin del jabn de sodio.
3. A tres m uestras de la solucin jabonosa agregue unas pocas gotas de
solucin de cloruro de calcio, cloruro de m agnesio y acetato de plomo.
O bserve la precipitacin de las sales insolubles.
Pruebas para los cidos grasos. A u n a solucin de fenolftalena aada

cuidadosam ente lcali diluido hasta que aparezca u n color estable ligera
m ente rosado; aada esta solucin gota a gota a la m u e stra disuelta en ter. Si
Lfpidos y membrana* 195
hay cidos grasos presentes, el color desaparecer. C om pare el com porta

m iento de la m antequilla, aceite de oliva y cido esterico.
EXPERIMENTO 7.3 P r u e b a p a r a g lic e r o l
Fundamento
Cuando se calienta glicerol con bisulfato potsico se produce deshidratacin y
se form a el aldehido acrolena, el cual tien e u n olor caracterstico. Esta
reaccin ocurre tanto con el glicerol libre como con los steres de glicerol.
CH2 OH CH,
calor II
HOH CH + 2 H20
khso 4
H2 OH HO
Glicerol Acrolena
Materiales 100
1. M uestras (m antequilla, aceite de oliva, cido esterico y 20 g
glicerol).
2. Bisulfato potsico. 150 g
Mtodo
Coloque una capa de aproxim adam ente 0.5 cm de K H S 0 4 en u n tubo pyrex
agregue cinco gotas de la solucin a ensayar o u n a cantidad equivalente de la
misma sustancia slida, cu b ra con m s K H S 0 4 y caliente len tam en te. Note
el olor picante caracterstico de la acrolena.
EXPERIMENTO 7.4 P r u e b a s p a r a in s a tu r a c i n
Fundamento
Los cidos grasos presentes en las grasas anim ales estn g eneralm ente
saturados, m ientras que aquellos presentes en los aceites vegetales contienen
uno o ms enlaces dobles. La hidrogenacin de estos enlaces convierte los
aceites vegetales lquidos en grasas slidas, siendo esto lo que se hace
com ercialm ente para la produccin de m argarina.
Los halgenos p u ed en u n irse fcilm ente a los enlaces dobles. La decolora
cin de una solucin de brom o o yodo por u n lpido indica la presencia de los
enlaces dobles.
Materiales 100
1. M uestras (aceite de oliva, aceite de maz, m antequilla, 100 mi
cido oleico, cido esterico y etanol).
2. Agua de bromo. 100 mi
3. Solucin diluida de yodo en cloroformo. 100 mi
CH3(CH2)7CH=CH(CH2 )7COOH + Br2

cido oleico bromo
H H
CH3(CH2)7 -(C H 2)7COOH
r r
cido dibrom oesterico
Mtodo
L entam ente agregue agua de bromo gota a gota a la m uestra, agitando
despus de cada adicin hasta cuando el brom o se decolore com pletam ente.
C om pare la capacidad de los diferentes com puestos p ara decolorar las solu
ciones de yodo y de bromo.
ANALISIS CUANTITATIVO DE LOS LIPIDOS

Un anlisis qum ico completo de las grasas encontradas en la naturaleza es un
procedim iento bastante dispendioso, pero hay un nm ero de m ediciones tales
como el valor de acidez, el ndice de saponificacin y el ndice de yodo, que dan
una inform acin til acerca de la composicin y pureza de u n a grasa d eterm i
nada.
EXPERIMENTO 7.5 D eterm inacin del valor de acidez de una grasa

Fundamento
Las grasas alm acenadas pueden enranciarse debido a la oxidacin de los
dobles enlaces para fo rm ar perxidos y a su hidrlisis por m icroorganism os
con liberacin de cidos grasos. La cantidad de cidos grasos libres da, por lo
tanto, un ndice de la frescu ra y la calidad de la grasa.
Se sugiere que cada p ar de estudiantes escoj a un lpido y haga un ensayo de
(a) una m u estra fresca y (b) u n a que haya sido expuesta al aire por un tiempo.
C om pare sus resultados con los obtenidos por otros grupos para diferentes
lpidos.
El valor de acidez es el n m ero de m iligram os de KOH requerido para
neutralizar los cidos grasos libres presentes en 1 g de grasa.
Materiales 100
1. Aceite de oliva, m antequilla y m arg arin a (use u n a m u e stra 200 g
fresca y o tra que se ha dejado al aire por varios das).
2. Solvente de grasa (volm enes iguales de 95% v /v de alcohol - 61
y te r neutralizado a la fenolftalena).
4. H idrxido de potasio (0.1 m ol/l). 11
5. B uretas (5 m i y 25 mi). 50
Mtodo
Pese cuidadosam ente 10 g de la sustancia problem a y suspenda la grasa des
pus de d erretirla en 50 m i de u n solvente de grasa. A gregue 1 m i de solu
cin de fenolftalena, m ezcle cuidadosam ente y titu le con KOH 0.1 mol/1
hasta que el color rosado plido perm anezca por m s de 2030 s. A note el
nm ero de m ililitros de lcali que se necesita y calcule el valor de acidez de la
grasa. Nota: 0.1 mol/1 KOH contiene 5.6 g/1 o 5.6 m g/m l.
EXPERIMENTO 7.6 Indice de saponificacin de una grasa

Fundamento
Cuando se som ete a reflujo un ster de glicerol en presencia de un lcali, el
ster se hidroliza para d ar glicerol y sales m etlicas de cidos grasos (jabones).
Los m ateriales para este experim ento se calculan suponiendo que cada
par de estudiantes ensayan u n a grasa o aceite.
El ndice de saponificacin es el nm ero de m iligram os de KOH que se
requieren para n eu tralizar los cidos grasos resultantes de la hidrlisis
completa de 1 g de grasa. El ndice de saponificacin da una idea del tipo de
cidos grasos presentes en el lpido ya que e n tre m s larga sea la cadena
hidrocarbonada, m enor ser la cantidad de cido liberado por gram o de lpido
hidrolizado.
i Materiales 100
1. G rasas y aceites (triestearina, aceite de coco, aceite de 20 g
maiz y m antequilla).
2. Solvente de grasas (volm enes iguales de 95% de etanol 11
y ter).
3. KOH alcohlico (0.5 mol/1). 31
4. Condensadores de reflujo. 100
5. Bao de agua hirviendo. 100
8. B uretas (10 m i y 25 mi). 100
9. Frascos cnicos (250 m i). 100
Mtodo
Pese cuidadosam ente lg de grasa en un vaso de precipitados y disulvalo en
aproxim adam ente 3 m l del solvente de grasas. T ransfiera cuantitativam ente
los contenidos del vaso de precipitados a un frasco cnico de 250 mi lavando el
vaso tres veces con 1 m i m s de solvente; agregue 25 mi de KOH alcohlico 0.5
mol/1 y conecte a u n condensador de reflujo. P rep are otro frasco cnico de 250
mi conectado tam bin a un condensador de reflujo en el que se han colocado
exactam ente los mismos m ateriales, con excepcin de la grasa, para que as
sirva de blanco. C aliente ambos frascos por 30 m inutos en un bao de agua
198 Bioqumica prdica
hirviendo. D eje en fria r a tem p eratu ra am biente y titule con HC1 0.5 mol/1
usando fenolftalena como indicador.
La diferencia e n tre las lecturas obtenidas para el blanco y para la m uestra
da el nm ero de m ililitros de KOH 0.5 mol/1 necesarios para saponificar 1 g de
grasa.
El peso m olecular del KOH es 56 y, sabiendo que la hidrlisis de un
triglicrido libera tres m olculas de cido graso, tendrem os:
Indice de saponificacin (S ) = 3 x 56 x 1000/ peso mol. prom edio de grasa.
Por consiguiente: Peso mol. prom edio de grasa = 3 x 56 x 1000/S
EXPERIMENTO 7.7 Indice de yodo de una grasa

Fundamento
Los halgenos se unen a los dobles enlaces de los cidos grasos no saturados
form ando compuestos de adicin.
Se deja reaccionar m onocloruro de yodo (IC1) con el lpido en la oscuridad.
Se determ ina la cantidad de yodo consumido m idiendo la cantidad de IC1 que
no reaccion. P ara hacerlo se aade KI y se titula el yodo liberado con una
solucin patrn de tiosulfato; se com paran entonces los resultados con los
obtenidos de un blanco tratado en la m ism a form a pero del que se ha omitido
la grasa.
H H
CH=CH + IC1 - U -
1
IC1 + KI ------KC1+I2
I2 + 2Na2S2 0 3 ------ > 2NaI + Na2 S4 0 6
La mezcla de reaccin se guarda en la oscuridad y se titula tan pronto como

sea posible puesto que los halgenos se oxidan en presencia de la luz. Se calcu
la la cantidad de m aterial necesario suponiendo que cada p ar de estudiantes
ensayar dos lpidos.
El ndice de yodo es el n m ero de gram os de yodo (I2) consumidos por 100
gramos de una grasa.
Materiales 100
1. G rasas (soluciones de 20 g/1 de aceite de maz, aceite de 11
oliva, aceite de linaza y m antequilla en cloroformo).
2. M onoclruro de yodo (aprox. 0.2 mol/1). 31
3. Yoduro de potasio (100 g/1). 1.51
4. Tiosulfato de sodio (0.1 mol/1). 41
Lfpldos y membranas 199
5. Solucin indicadora de alm idn (10 g/1). 250 mi

6. Frasco con tapas (250 mi). 200
7. B ureta (25 mi). 100
8. Cloroformo 11
Mtodo
En un frasco con tapa pipetee 10 m i de una solucin de grasa, agregue 25 mi de
solucin de IC1, tape el frasco e incube en la oscuridad por 1 hora despus de
agitar vigorosam ente. Al mism o tiempo, p rep are un blanco en el cual se
reem plaza la solucin de grasa por 10 mi de cloroformo.
Enjuague los tapones y los cuellos de los frascos con 50 mi de agua, agregue
10 mi de solucin, de KI, y titule el yodo liberado con la solucin patrn de
tiosulfato. C uando la solucin d un color pajizo claro, agregue aproxim a
dam ente 1 m i de solucin de alm idn y contine titulando hasta que el color
azul desaparezca. Los frascos deben agitarse fu ertem en te d u ran te la titu la
cin para asegurar que todo el yodo ha sido rem ovido de la capa de cloro
formo.
La diferencia en tre la lectura del blanco y de la m u estra (Bl M ) corres
ponde al nm ero de m ililitros de tiosulfato 0,1 mol/1 necesario para
reaccionar con un volum en equivalente de yodo. Puesto que la cantidad de
grasa usada es 0.2 g y 11 de yodo 0.1 mol/1 contiene 12.7 g de yodo, el ndice de
yodo puede calcularse as:
Indice de yodo = (Bl - M)x 12.7/1000 x 100/0.2

= ( B l- M ) x 6.35.
PROPIEDADES DEL COLESTEROL
EXPERIMENTO 7.8 Preparacin del colesterol a partir de cerebro

Fundamento
El colesterol es m uy soluble en acetona, m ientras que la m ayora de los lpidos
complejos son insolubles en dicho solvente.
Materiales i0
1. Cerebro de te rn e ra o de cerdo. 1 kg
2. Acetona. 3.51
3. Licuadoras. 3
4. Equipo de filtracin conem budo grande B chner. 5
5. Equipo de destilacin. 5
6. Embudo para filtrado grande y papel de filtro plisado. 5
7. Bao de agua hirviendo 5
8. Etanol. 11
Mtodo
A 100 g de cerebro agregue 400 m i de acetona y lice d u ra n te 1 m inuto. Lave la

licuadora con u n poco de acetona, mezcle los homogenizados y agtelos por 10
m inutos. F iltre la suspensin en u n em budo B chner, lice el residuo con
200 mi de acetona tal como se hizo an terio rm en te, filtre y com bine los filtra
dos. Rem ueva el exceso de acetona por destilacin bajo presin reducida.
Enfre el frasco con agua co rrien te y recoja el colesterol crudo en u n em budo
Bchner.
Disuelva el m aterial crudo en un volum en m nim o de alcohol caliente y
filtre an en caliente usando papel de filtro. Este paso puede hacerse
colocando el frasco de recoleccin en un bao de agua hirviendo con el
em budo de filtracin listo p ara el efecto.
Seque el colesterol al aire y anote el rendim iento y el punto de fusin. Si lo
considera necesario, el colesterol puede cristalizarse usando alcohol caliente
como se indic m s arriba.
EXPERIMENTO 7.9 D eterm inacin del colesterol sanguneo
Fundamento
El anhdrido actico reacciona con el colesterol en solucin clorofrm ica para
producir un color caracterstico azul-verdoso. La n aturaleza exacta del
cromforo es desconocida pero la reaccin probablem ente incluye la esterifi^
cacin del grupo hidrxilo en la posicin 3 ju n to con otros rearreglos en la
molcula.
La sangre o el suero son extrados con una m ezcla de alcohol-acetona, la
cual rem ueve el colesterol y otros lpidos y precipita la protena. El solvente
orgnico se rem u ev e por evaporacin en un bao de agua hirviendo y el
residuo seco se disuelve en cloroformo. Se determ in a luego colorim trica-
m ente el colesterol m ediante la reaccin de L ieberm ann-B urchard.
El colesterol libre se en cu en tra igualm ente distribuido e n tre las clulas y
el plasma, m ien tras que el esterificado se en cu en tra nicam ente en el plasma.
En esta determ inacin es absolutam ente necesario u sar vidriera seca.
Materiales IM
1. Suero o sangre. 25mi
2. Mezcla de alcohol-acetona (1:1). 21
3. Cloroformo. 500mi
4. Mezcla anhdrido actico-cido sulfrico (30:1; m ezcle 930mi
inm ediatam ente antes de usar, cuidado/).
5. Solucin de colesterol (2 m g/m l en cloroformo). 250mi
6. Solucin diluida de colesterol. (Diluya la solucin an terio r 11
uno a cinco usando cloroform o p ara d a r u n a solucin de
0.4 m g/m l.).
Lpldoa y membranas 201
Mtodo
En un tubo de centrfuga coloque 10 m l del solvente alcohol-acetona y agregue
0.2 mi de suero o sangre. S u m erja el tubo en u n bao de agua hirviendo
agitando hasta qiie el solvente com ience a h erv ir. R etire el tubo y contine
agitando la m ezcla d u ra n te 5 m inutos. E nfre a te m p e ra tu ra am b ien te y
centrifugue. V ierta el lquido sobrenadante en u n tubo de ensayo y evapore a
sequedad en u n bao de agua hirviendo. E nfre y disuelva el residuo en 2 m i
de cloroformo. Al m ism o tiem po, aliste una serie de tubos que contengan los
patrones de colesterol y un blanco con 2 m i de cloroformo.
Agregue 2 m i de la m ezcla anhdrido actico-cido sulfrico a todos los
tubos y mezcle vigorosam ente. D eje los tubos en la oscuridad a te m p eratu ra
am biente y lea la extincin a 680 nm .
Aplicacin
El contenido de colesterol en el suero cae den tro del in terv alo 100250 mg/100
mi. El valor prom edio de colesterol srico p ara hom bres de 25 aos de edad es
de 200 mg/100 mi; sube luego len tam en te con la edad hasta alcanzar un
mximo e n tre 40 y 50 aos y desciende nuevam ente. Las m u jeres en general
m uestran valores de colesterol m s bajos que los hom bres hasta la
m enopausia, cuando los valores suben por encim a de los encontrados en
hom bres de la m ism a edad.
Un valor alt de colesterol (300 mg/100 m i o m s) en adultos jvenes es un
indicio serio de enferm ed ad coronaria.
Valores altos que pueden llegar a 25% por encim a de lo norm al se
encuentran tam bin en nefritis, diabetes, m ixederna y xantom atosis.
VITAMINAS LIPOSOLUBLES
Las vitam inas son factores alim enticios com plem entarios necesarios para
m anener u na buena salud. Su carencia en la dieta origina un n m ero de
enferm edades (tabla 7.3). En cierta form a las vitam inas son sem ejantes a las
hormonas, puesto que slo se req u ie ren pequeas cantidades p ara producir
efectos fisiolgicos m u y grandes. Lo mism o que las horm onas, las vitam inas
son qum icam ente diferentes y realizan m uy variadas funciones. Los dos
experim entos siguientes se relacionan con dos de las vitam inas liposolubles
(A y D) y su interaccin con las radiaciones ultravioleta.
EXPERIMENTO 7.10 Efecto de la luz ultravioleta sobre la vitam ina A.

Fundamento
La vitam ina A absorbe en la regin ultravioleta del espectro con u n m xim o a
325 nm y esta propiedad puede usarse para la cuantificacin de la vitam ina. El
mtodo es rpido y sensible, pero p resen ta la desventaja de que es poco
especfico. A lgunas otras sustancias absorben en la m ism a regin del es
pectro en que absorbe la vitam ina A y su contribucin a la absorcin total

debe tenerse en cuenta en los clculos finales. Un m todo para hacerlo es usar
una frm ula de correccin para d eterm in a r si se en cu en tran presentes
compuestos que in terfieren y para corregir el e rro r debido a su absorcin en
la regin de 325 nm . Por ejem plo, la extincin de vitam ina A pu ra en
isopropanol a 310 nm y 334 nm es apenas 6/7 de la extincin m xim a. As que si
la extincin a 325 n m se norm aliza a 1, entonces la absor b a n d a a 310 nm y 334
nm es 0.857. La extincin corregida a 325 n m (E corr ) puede obtenerse aplicando
la frm ula siguiente:
I -^corr = ^3 2 5 2.625^310 4.375E334 .
O tra form a de detectar stos compuestos y te n e r en cuenta su contribucin

consiste en m edir la extincin a 325 nm antes y despus de irra d ia r la solucin
con luz ultravioleta. La vitam ina A es destruida por la luz ultravioleta y se
presum e que los cromgenos que in terfieren no son afectados por este
tratam iento. El descenso en extincin subsecuente a la irradiacin se usa por
lo tanto como una m edida directa del contenido de vitam ina A en la m uestra.
Materiales 10
1. Isopropanol. 50 mi
2. Solucin patrn de vitam ina A (1 fxg/m i en isopropanol; 5 mi
guarde en una botella sellada bajo una atm sfera de n itr
geno en la oscuridad).
3. Aceite de hgado de bacalao y aceite de hgado de hipogloso. 50 mi
4. Espectrofotm etro de luz ultravioleta. 3
5. L m para de luz ultravioleta. 5
Mtodo
M uestras que contienen concentraciones altas de la vitam ina tales como los
aceites de peces pueden diluirse d irectam en te con isopropanol; sin embargo,
se puede o btener valores m s exactos saponificando el m aterial y ex tray en
do vitam ina A que no es saponificable.
Mida la extincin a 325 nm de u n a m u e stra de aceite de pez recien tem en te
diluida en isopropanol contra un blanco constituido por solvente (T t), saque la
cubeta, expngala a la luz ultravioleta hasta cuando la extincin perm anezca
constante y anote de nuevo la absorbancia (T2). T rate el patrn de vitam ina A
en la m ism a form a (Pt, y Pt2) y calcule la concentracin de vitam ina A en la
m uestra, as:
Concentracin de vitamina A (jug/ml) =

t i ra
x 1 x factor de dilucin.
Pt i Pt2
Registre el espectro de absorcin e n tre 280 y 380 n m de la mezcla recin
diluida y com prela con el espectro de absorcin de la solucin patrn de
vitam ina A haciendo grficos de E /E 325 p ara los patrones y las m uestras.
Upidos y'membranas 203
Cul es la pureza del patr n de vitam ina A suponiendo que la frm ula de
correccin fuera exacta?
Contienen los aceites de pez com puestos que in terfieren con la prueba?
Son com parables los resultados obtenidos por este m todo con los
obtenidos irradiando las m uestras?
EXPERIMENTO 7.11 Preparacin de vitam ina D por irradiacin de sus

precursores con luz ultravioleta
Fundamento
El ergosterol, com puesto que en las plantas desem pea un papel sem ejan te al
del colesterol en los anim ales, es un p recursor im p o rtan te de la vitam ina D 2.
La irradiacin de ergosterol (provitam ina D 2) con luz ultravioleta origina un
nm ero de rearreglos en la m olcula que dan lugar a la form acin de
provitam ina D 2y finalm ente de calciferol (vitam ina D 2). T am bin se form an
lum isterol y taquisterol como subproductos de esta reaccin fotoqumica
(figura 7.4).
R eordenam ientos sim ilares tien en lugar cuando 7-dehidrocolesterol es
irradiado dando as provitam ina D 3 y colecalciferol (vitam ina D3). Esta
reaccin se efecta en la piel del hom bre y otros anim ales expuestos a la luz
solar o a irradiacin ultravioleta.
Si una solucin de calciferol se calienta suavem ente en ausencia de la luz y
en una atm sfera de nitrgeno se produce u n a m ezcla en equilibrio de
provitam ina D 3 y calciferol.
Materiales 10
1. Placas de silica gel G p ara crom atografa en capa delgada. 20

2. C m aras de separacin. 5
3. Ergosterol y dehidrocolesterol. lg
4. Solvente para crom atografa (cloroformo). 21
5. P atrones para crom atografa de m etabolitos de vitam ina
D2 (ergosterol, provitam ina D 2, taquisterol y 2 mi
lum isterol en cloroform o, aprox. 20 m g/m l).
6. Patrones de crom atografa relacionados con vitam ina 2 mi
D 3 (dehidrocolesterol, provitam ina D3, vitam ina D3 y
colesterol en cloroform o, aprox. 20 m g/m l).
7. Cilindros de nitrgeno. 2
8. Fluorm etros. 5
9. Reactivo revelador (cido sulfrico 5% v/v). 11
10. Hornos a 140 C. 3
11. Atom izadores p ara colorantes de la crom atografa. 5
12. Cubetas de slice. 5
13. Lam paras ultravioleta. 3
Figura 7.4 Conversin de ergosterol a Vitamina D2
Mtodo
Irradiacin ultravioleta. P rep are una solucin de ergosterol en cloroformo
(2030 m g/m l). T ran sfiera una alcuota de esta solucin a u n a cubeta de slice
para fluorm etr. Pase nitrgeno sobre la superficie y selle. Coloque la cubeta
en el fluorm etro e irrdiela con luz ultravioleta de longitud de onda corta por
20 m inutos. Tom e 10 p 1de la m u estra y aplquela sobre u n a placa de silica gel
G para crom atografa de capa fina. A plique rp id am en te los patrones relacio
nados con vitam ina D2 en la m ism a placa de crom atografa y colquela
inm ediatam ente en el solvente de cloroformo.
Lipldos y membranas 205
Repita el experim ento a n terio r con dehidrocolesterol en vez de ergosterol

e identifique los productos formados.
Calor. Exam ine los efectos que se producen al calen tar las soluciones de
vitam ina D 2y D3 en cloroform o a 60 C en ausencia de luz y aire por perodos
de tiempo hasta de 4 horas.
Deteccin de vitaminas. E xam ine las placas bajo la luz ultravioleta. En estas
condiciones algunos de los com puestos aparecen como m anchas fluorescen
tes. A lternativam ente se pueden rociar las placas con cido sulfrico diluido
(tenga cuidado ), calentando luego a 140 C por 5 10 m inutos y exam nelas
finalm ente bajo la luz visible o ultravioleta. C om pare la sensibilidad de los
dos m todos de deteccin.
MEMBRANAS
EXPERIMENTO 7.12 Efectos de la composicin de los lpidos sobre la permeabi

lidad de una monocapa lipdica
Fundamento
La composicin lipdica de u n a m em b ran a tiene un efecto considerable en su
perm eabilidad y en este experim ento se usa u n a monocapa lipdica como
modelo de m em brana. C uando se coloca butanol sobre agua se form an dos
fases distintas; si adicionam os lpidos antipticos stos se situ arn en la
interfase. La p arte polar de la m olcula se asociar con la fase acuosa superior
y la regin hidrofbica con la fase orgnica. El azul de m etileno es una
molcula altam en te coloreada y su paso a travs de la in terfase puede
observarse fcilm ente. A diferencia de las m em b ran as biolgicas, este modelo
no contiene protena, pero a p a rtir de este sim ple experim ento se puede
obtener inform acin m uy til puesto que la difusin pasiva depende de la
composicin de los lpidos de la m em brana.
Materiales 100
1. Acidos grasos (cido esterico y cido oleico). 25 g
2. Acilgliceroles (triolena, tripalm itina). 25 g
3. Fosfolpido (lecitina de huevo). 25 g
4. Esterol (colesterol). 25 g
5. Butanol. 11
6. Tubos de ensayo pyrex. 700
7. Azul de m etileno en butanol (0.25 g/1). 31
Mtodo
Coloque 5 m i de agua en 7 tubos pyrex. Pipetee cuidadosam ente por las
paredes del tubo 5 m i de butanol que contenga azul de m etileno y 200 mg de
lpidos hasta cuando se form en dos capas definidas. D eje los tubos en reposo a
tem peratura am b ien te por 1-2 horas y com pare los resultados con los obteni
dos al usar un tubo control en el que el butanol contiene agua en vez de lpidos.
Se puede obtener u n a idea aproxim ada de la efectividad de los lpidos como
barreras de perm eabilidad si se m ide la extincin del azul de m etileno en la
fase acuosa.
EXPERIMENTO 7.13 Efecto de detergentes y otros reactivos sobre la

membrana de eritrocitos
Fundamento
Muchas m olculas del tipo de los detergentes causan desarreglos en las
m em branas al disolver los com ponentes fosfolipdicos. En el caso de los
eritrocitos se puede seguir dicho efecto m idiendo en u n colorm etro la
absorbancia de la hem oglobina liberada por las clulas alteradas.
Materiales IQ
1. Sangre fresca de rata o sangre h u m an a de la usada p ara 20 mi
transfusiones.
2. Solucin salina isotnica (8.9 g/1). 21
3. D etergentes (10 g/1). 5 mi
Tritn X-100; (neutro);
brom uro de cetiltrim etilam onio (catinico);
dodecil sulfato de sodio (aninico).
4. Lisofosfatidil colina (Iisolecitina 10 mm ol/1). 5 mi
5. Progesterona (100 mm ol/1 en etanol). 5 mi
6. H idrocortisona (solucin satu rad a en etanol, aprox. 5 mi
5 mmol/1).
7. Tubos de centrfuga (10 m i). 100
8. Incubadores a 37 C. 3
9. Colorm etros o espectrofotm etros. 5
Mtodo
Coloque sangre h u m an a o sangre de rata en un tubo que contenga 0.5 mi de un
anticoagulante (40 g/1 citrato de sodio). C entrifugue las clulas, lvelas dos
veces con solucin salina isotnica, y resuspndalas en un volum en de
solucin salina igual al de la sangre original; diluya la suspensin de
eritrocitos con solucin salina en tal form a que si se aaden 0.5 m i de la
suspensin a 4.5 m i de T ritn X-100 y luego se centrifuga, el sobrenadante te n
ga u na extincin de 0.8 0.9 a 540 nm . Esto rep resen ta 100% de lisis y todos
los valores de extincin subsecuentes pueden ex presarse como porcentaje de
lisis.
Pipetee por duplicado m u estras de 0.5 m i de eritrocitos diluidos en tubos de
centrfuga de 10 m i que contengan 4.5 m i de solucin salina. Mezcle
vigorosam ente y aada 50 jul del com puesto que se va a ensayar, mezcle
agitando suavem en te y coloque en Un incubador a 37 C por 20 m inutos. Usan-
do una cetrfuga de m esa separe por centrifugacin las clulas que no se han
roto y mida la absorbancia del sobrenadante a 540 nm.
Exam ine el efecto de varias concentraciones de los tres detergentes y
prepare un grfico del p orcentaje de hem olisis en funcin de la concentracin
del reactivo. Repita el experim ento con lisolecitina, progesterona e
hidrocortisona y com ente el efecto ltico relativo de estos compuestos.
Finalm ente, exam ine el efecto protector de la hidrocortisona incubando los
eritrocitos con este esteroide antes de exponerlo a los agentes lticos.
Bibliografa
Chapman, D., Introduction to Lipids, Nueva York, M cGraw-Hill, 1969.
Finan, J. B., Colem an, R. y Michell, R. M., M em branes and Their Cellular
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Quinn, P. J. The M olecular Biology of Cell M em branes, Londres, M acmillan,
1976.
8
Acidos nucleicos
COMPOSICION QUIMICA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
Los cidos nucleicos son com puestos nitrogenados de elevado peso m olecular
que se en cu en tran en las clulas asociados con protenas. Los complejos ci
do nucleico-protena se conocen con el nom bre de ncleo-protenas, que
pueden separarse en sus com ponentes (protenas y cidos nucleicos) al ser
tratados con cidos o con concentraciones altas de sales. Las protenas tienen
D e s o x ir r ib o n u c le o p r o le n a
D is m in u c i n d e
\ p e s o m o le c u la r
P r o t e n a
A c id o n u c le ic o b s ic a
I
Nucletidos
1 ---------------- 1
A c id o fo s f r ic o N u c le s id o s
i n i
B a s e s p u r n ic a s o B a s e s p ir im id n ic a s P e n to s a
a d e n in a c ito s in a d e s o x ir r ib o s a
g u a n in a t im in a
Figura 8.1 Relacin entre desoxirribonucleoprotena

y sus componentes de bajo peso molecular.
208
Acidos nucleicos 209
carcter bsico m ien tras que los cidos nucleicos, como su nom bre lo indica,
son cidos. Se conocen dos grupos principales de cidos nucleicos: el cido
ribonucleico (ARN)* y el cido desoxirribonucleico (ADN)*. La hidrlisis
controlada de ADN y ARN produce nucletidos, que pueden considerarse
como unidades bsicas de los cidos nucleicos en la m ism a form a que los
aminocidos son las unidades bsicas de las protenas y los monosacridos, de
los polisacridos. Si se prosigue la hidrlisis, los nucletidos dan nuclesidos y
finalm ente fosfatos, azcares y bases purnicas y pirim idnicas. La relacin
entre estos dos com ponentes y las nucleoprotenas de ADN se m u estran en la
figura 8.1.
El ARN tiene una composicin sim ilar, excepto que contiene el azcar
ribosa en lugar de la desoxiribosa y uracilo en lugar de tim ina.
A continuacin aparecen las frm ulas de las principales bases nitrogena
das presentes en ADN y ARN.
Purinas
La adenina y la guanina son purinas sustituidas y estn presentes en todos
los cidos nucleicos.
H NH, OH
H H H
(compuesto prim ario)
NH OH
nV
H O " \N ^ H h
Pirim idina Citosina Uracilo
(compuesto prim ario)
Tam bin se han encontrado pequeas cantidades de otras bases en cidos

nucleicos de fuentes diversas. Debe anotarse que tanto las purinas como las
pirim idinas pueden existir en la form a cetnica o enlica (figura 8.2).
* Usamos ADN y ARN para los compuestos que en ingls se abrevian DNA y RNA.
OH
HN
Jk ^
ll
ch,
nV
H
Forma cetnica Forma enlica
Figura 8.2 Form as cetnica y enlica de la

tim ina
Pentosas
Los dos grupos principales de cidos nucleicos derivan su nom bre del azcar
que poseen, el cual puede ser ribosa o desoxiribosa.
H K-H
OH OH OH H
3-D-Ribofuranosa 3-D-2-Desoxirribofuranosa
Los tomos de carbono de los azcares se designan como 1', 2', etc., para
diferenciarlos de los de las bases.
Nuclesidos
El C , de los azcares se une al nitrgeno en la posicin 0 de las purinas o en la
posicin 1 de las pirim idinas para form ar el nuclesido.
NH2 o
A denosina U ridina
La m ayora de los enlaces e n tre el azcar y la base se hacen en la form a

mencionada; sin em bargo, el ARN de tran sferen cia contiene u n nuclesido
poco usual, la pseudouridina, en el que el CJ d e j a ribosa est unido a la

posicin 5 del uracilo.
Nucletidos
Los grupos hidroxilo en posicin 2', 3' y 5' de la ribosa pueden esterificarse con
cido fosfrico dando u n a variedad conocida de steres. S im ilarm ente la de
soxirribosa puede esterificarse en las posiciones 3' y 5', dando tam bin steres
que se en cu en tran en la naturaleza.
Los nucletidos y nuclesidos se nom bran de acuerdo a las bases que se
encuentran presentes en su estru ctu ra, como se indica a continuacin.
Base Nuclesido Nucletido
adenina adenosina cido adenlico

guanina guanosina cido guanlico
uracilo uridina cido uridlico
citosina citidina cido citidlico
tim ina tim idina cido tim idlico
Si la base est unida a la desoxirribosa, los nom bres de los com puestos cam
bian; as, un nuclesido que contiene adenina y desoxirribosa se llam ar de-
soxiadenosina. A dem s de los nucletidos nom brados anterio rm en te, en la
naturaleza se en cu en tra en estado lib re un n m ero de nucletidos de im por
tancia biolgica tales como adenosina di- y trifosfato (ADP y ATP), guanosina
di- y trifosfato (GDP y GTP) y nicotinam ida adenina dinucletido (NAD).
NH2
A denosina trifosfato (ATP).

Acidos nucleicos
Los cidos nucleicos son m acrom olculas en las que los nucletidos estn
unidos por enlaces fosfodister en tre las posiciones 3' y 5' de los azcares.
Una porcin de la m olcula de ARN tendr, por lo tanto, la estru ctu ra que
aparece en la figura 8.3 en la cual la base puede ser u n a p u rin a o una
pirim idina.
La m ayora de los cidos nucleicos son m olculas m uy grandes y
rep resen tar la frm ula com pleta sera bastante complicado. Sin em bargo,
una form a til de m ostrar abreviadam ente la estru ctu ra de las bases p re
sentes es usar la p rim era letra de su nom bre. La secuencia de las bases es
suprem am ente im portante, de modo que, un cido nucleico puede rep resen
tarse indicando en su orden la p rim era letra de las bases que lo form an (figura
8.4).
ADN. El ADN est constituido por dos cadenas de polinucletidos en trelaza
das en form a de espiral y estabilizadas m ediante enlaces de hidrgeno e n tre
/
P OH
I
0
/
Base
? v
Hy H
H> r
0 OH
/
0 = P OH
O
/
0 = P OH
O
/
Figura 8.3 Parte de una m olcula de ARN
p' I
. h
>
A
\
1
G
z7 ---------- G
C
^ ---------- C
P 0 |
NI
t-
T
\
I
CL
1
\l
<
A
\
|
C
T
^ ----------- T
/
Figura 8.4 Anotacin abreviada para mostrar la
secuencia de base de un cido nucleico
determ inados pares de bases. La estereoqum ica de las bases es tal que la ade-
nina se aparea con la tim in a y la guanina con la citosina, en form a tal que los
cocientes A /T = 1 y G /C = 1 (figura (8.5). Este aspecto de la estru ctu ra del ADN
fue propuesto por Watson y Crick en 1953 basados en los datos de la cristalo
grafa de Rayos X obtenidos por Wilkins y se conoce como la hiptesis de
Watson y Crick. Esta hiptesis fue confirm ada posteriorm ente y ha servido de
base para explicar algunas de las propiedades biolgicas del ADN.
H H
Figura 8.5 Apareamiento de bases a travs de enlaces

de hidrgeno (----------- ) como ocurre en el ADN
La m ayora de las m olculas del ADN son hlices dobles; sin embargo,
algunos virus contienen ADN de un sola cadena y el ADN m itocondrial es
una estructura cerrada en form a de bucle.
Dado que los mtodos usados para la purificacin del ADN pueden ro m p er
la molcula, es difcil d ar u n valor exacto p ara su peso m olecular; sin em bargo,
se han obtenido experim en talm en te valores de 109 daltones.
ARN. Puesto que, con m uy pocas excepciones, la m olcula de ARN consta de
una sola banda de cido nucleico que form a un espiral flexible y tiene slo
unas pocas regiones donde las bases se aparean, la relacin sim ple
A /U = G /C = 1 no es necesariam ente cierta para la m ayora de las diferentes
formas de ARN. El peso m olecular del ARN de tran sferen cia es aproxim ada
m ente 25 000, pero otras form as de ARN pueden te n e r pesos m leculares que
llegan hasta un milln.
PAPEL BIOLOGICO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

Esta parte de la bioqumica ha tenido un desarrollo tan vertiginoso en estos
ltim os aos y no es posible resum irlo adecuadam ente en unas pocas lneas.
Sin em bargo, nos parece apropiado en este punto hacer un som ero recuento
del papel que juegan estas m olculas en los organism os vivos.
ADN
El ADN est intim am en te asociado con el m aterial gentico de las clulas. En
algunos m icroorganism os el ADN de una sola cadena parece ser el m aterial
que alm acena la inform acin gentica; sin em bargo, en los organismos
superiores el ADN se en cu en tra form ando p arte de la ncleo-protena de los
cromosomas. La cantidad de ADN en las clulas de u n a especie determ inada
es constante; sin em bargo, las clulas germ inales, que tien en la m itad del
nm ero de cromosomas, contienen la m itad del ADN p resente en otras
clulas. El ADN se en cu en tra casi exclusivam ente en el ncleo y slo en m uy
poca cantidad en las m itocondrias y en los cloroplastos.
La funcin del ADN es alm acenar inform acin gentica y serv ir de m olde
a travs del ARN, p ara el ordenam iento de los am inocidos en las protenas.
Replicacin celular. Las caractersticas hered itarias son transm itidas a las
clulas hijas a travs de la replicacin del ADN. El proceso es complicado e
involucra u n gran n m ero de enzim as y protenas. Sin em bargo, bsicam ente
la replicacin parece efectuarse en u n a serie de etapas cortas d u ran te las
cuales segm entos de doble hlice se separan y el nuevo ADN se form a
sim ultneam ente sobre cada cadena a p a rtir de nucletidos libres. Las nuevas
cadenas son sintetizadas de acuerdo a las reglas de apaream iento de las bases,
de tal m anera que ev en tu alm en te se form an dos m olculas idnticas al ADN
original.
C o n tro l d e l a s n t e s i s d e p r o t e n a s . Gracias a un variado nmero de

experimentos se sabe ahora que la secuencia de las bases en el ADN nuclear
determina las protenas que se sintetizan en el citoplasma de las clulas. El
cdigo gentico es de tal tipo que tres bases que forman una unidad conocida
como t r i p l e t a d e c o d i f i c a c i n , que no admite superposicin con bases de otras
tripletas similares codifica la presencia y posicin de cada uno de los
aminocidos en na protena. El cdigo es degenerado puesto que ms de
una tripleta puede codificar un aminocido dado. El mensaje gentico es
llevado del ncleo al sistema de sntesis de proten situado en los ribosomas
por una molcula intermediaria, el A R N m e n s a j e r o (mARN). Esta molcula
tiene una secuencia de bases complementarias a la del ADN nuclear; el grupo
de 3 bases del mARN correspondiente a la tripleta de codificacin del ADN se
conoce como c o d o n . As pues, el ADN acta en primera instancia como un
molde sobre el cual se sintetiza el mARN.
ARN
Mientras que el ADN se encuentra casi exclusivam ente en el ncleo, el ARN
se distribuye por toda la clula. La mayora del ARN se encuentra en el
citoplasma como ARN soluble y ARN ribosomal, pero aproximadamente el
10% se encuentra en el ncleo y una poca cantidad se halla tambin en las
mitocondrias. En las clulas de organismos superiores hay tres tipos de ARN:
ARN mensajero (mARN), ARN ribosomal (rARN), y ARN de transferencia
(tARN), todos los cuales participan activamente en la sntesis de protenas.
A R N m e n s a j e r o ( m A R N ) . Como se mencion anteriormente, la primera
etapa en la sntesis de protenas es la transferencia del mensaje gentico del
ADN al mARN: este proceso se conoce con el nombre de t r a n s c r i p c i n . El
mARN migra al citoplasma y es precisamente all donde, con la participacin
de ribosomas y tARN, las 4 bases nucleotdicas se convierten en el cdigo de
veinte tripletas que llevan la clave de la ordenacin de los aminocidos en las
protenas. Esta etapa se conoce como t r a d u c c i n . Unicamente se transcribe
parte de la cadena del ADN y por lo tanto el mARN es ms pequeo que el
ADN nuclear. El peso molecular real de un mARN dado depende del nmero
de residuos de aminocidos en la protena que codifica, y con frecuencia es
del orden de un milln (*). El mARN difiere de otras formas de ARN en que es
metablicamente inestable.
A R N r i b o s o m a l ( r A R N ) . Los ribosomas son partculas microscpicas de la
clula, visibles nicam ente bajo el microscopio electrnico, con una com
posicin bastante uniforme de aproximadamente 60% de protena y 40% de
ARN. Los ribosomas 80 S de las clulas eucariticas estn constituidos por
* N del T. Ya que existen funciones de reconocimiento y control que no se traducen, el nmero de
bases en un mARN es generalmente mayor que el estrictamente necesario para codificar los
aminocidos de una protena.
dos subunidades, u n a de 60 S y la otra de 40 S, que difieren en cuanto a com

posicin qum ica. Los ribosom as 70 S son ligeram ente m s pequeos y estn
form ados por dos subunidades, la 50 S y la 30 S. Varios ribosomas pueden
unirse a u na cinta de mARN p ara fo rm ar u n polisoma que se asem eja
bastante a las cuentas de u n collar de perlas.
1. El ARN mensajero se une al ribosoma 2. El tARN que lleva el aminocido 1

se une al codon X del mARN
3. El segundo tARN se une al codon Y
j|j tARN libre
4. El enlace peptfdico se forma entre los aminocidos (T ) y (2 ) y el primer tARN es

liberado.
Figura 8.6 Representacin esquemtica de la sntesis de protena

A R N de transferencia (tARN ). Existe u n tARN especfico p ara cada

aminocido cuya funcin es tran sp o rta r el am inocido activado al lugar de
sntesis de protena. A diferencia de las otras form as de ARN, los tARN,
tienen un peso m olecular bajo y gracias a esto la secuencia de ncleotidos
ha sido determ inad a p ara m uchos de ellos. U na p arte de la m olcula
contiene una trip leta de bases, el anticodon, que reconoce y se u n e al codon
del mARN. Todos los tARN tien en el m ism o grupo term in al de bases, CCA
y la adenina final reacciona con el am inocido activado. O tras secuencias
de bases en el tARN conform an lugares de reconocim iento que tienen que
ver con la unin al ribosom a y la interaccin con la am inoacil sintetasa
especfica.
Sntesis de protena. El ARN m ensajero y el tARN que tran sp o rta u n

aminocido activado se u n en a los ribosom as en la form a indicada(T). Una vez
que el p rim er tARN se h a unido al mARN en el codon (X), otro tARN qe
transporta u n segundo am inocido (2) se u n e al codon vecino (Y). El grupo
amino del am inocido del segundo tARN reacciona con el grupo carboxilo
term inal activado del p rim e r tARN form ando u n dipptido. El p rim er tARN
es entonces liberado y el ribosom a se m ueve a lo largo del mARN para
exponer el cqdon siguiente (Z) que se halla listo p ara recib ir el tARN que
transporta el te rc er am inocido (figura 8.6). El proceso se rep ite hasta que se
complete la cadena peptdica. V arias m olculas de p rotena se sintetizan
sim ultneam ente sobre el m ism o mARN por ribosom as que se m u ev en a
intervalos a lo largo de la cinta de ARN-(figura 8.7).
El proceso es m ucho m s com plejo de lo que se ha esbozado y req u iere un
nm ero diverso de factores en las diferentes etapas. La sntesis necesita
energa que es sum inistrada por la hidrlisis del GTP.
Acidos nucleicos de virus. Todos los virus contienen cido nucleico, el cual
puede constituir hasta el 50% de la partcula. P uede ser ADN o ARN y algunas
veces el ADN puede estar en form a de banda sencilla con n a estru ctu ra
terciaria definida. El cido nucleico est rodeado por u n a envoltura de
protena y esta ltim a es la responsable de la especificidad inm unolgica del
virus, m ientras que el cido nucleico constituye la p arte in fectante de la
partcula. Algunos virus se ad h ieren a la m em b ran a de la clula e inyectan su
propio ADN dentro de ella; entonces usan la m aq u in aria sinttica de la clula
para producir protenas y cidos nucleicos virales. Los virus de plantas
contienen ARN en vez de ADN y en estos casos el ARN acta como m aterial
gentico, a la vez que ejecu ta las funciones ya conocidas en la sntesis de
protenas.*
* N. del T. El proceso descrito se refiere a la sntesis de proteina en procarotes. Existen algunas

diferencias en clulas eucariticas.
Figura 8.7 Sntesis de varios pptidos sobre un mismo polisoma
EXPERIMENTOS CON ACIDOS NUCLEICOS
EXPERIMENTO 8.1 A islam iento del A R N de levadura

Fundamento
El ARN de levadura se obtiene extrayendo un hom ogenizado de clulas con
fenol. La solucin concentrada de fenol rom pe los enlaces de hidrgeno en las
m acrom olculas, causando desnaturalizacin de la protena. La suspensin
turbia se centrifuga y aparecen dos fases: la fase inferio r de fenol contiene
ADN y la fase superior acuosa contiene carbohidratos y ARN. La protena
desnaturalizada se halla p resente en am bas fases y puede rem overse por
centrifugacin. El ARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido no
contiene ADN pero g eneralm ente est contam inado con polisacrido. Se
puede obtener m ayor purificacin tratando esta preparacin con amilasa.
Materiales 10
1. L evadura seca 200 g
2. Solucin de fenol (900 g/1). 11
3. Acetato de potasio (200 g/1, pH 5). 200 m i
4. Etanol absoluto. 31
5. E ter etlico. 500 mi
6. Bao de agua a 37C. 5
Mtodo
Suspenda 30 g de levadura seca en 120 m i de agua a 37C. D eje por 15 m inutos a
esta tem p eratu ra y agregue 160 m i de solucin concentrada de fenol. (Precau
cin: m u y corrosivo). Agite m ecnicam ente la suspensin d u ran te 30 m in u
tos a te m p eratu ra am biente; luego centrifuge en fro a 3000 g d u ran te 15
m inutos para ro m p er la em ulsin. Con u n a pipeta P asteu r rem u ev a cuidado-
sm ente la capa superior acuosa y centrifugue a 10 000 g d u ra n te 5 m inutos

en una centrfuga refrig erad a p ara sep arar la pro ten a desnaturalizada.
Agregue acetato de potasio al sobrenadante hasta ob ten er u n a concentracin
final de 20 g/1 y precipite el ARN aadiendo 2 volm enes de etanol. E nfre la
solucin en hielo y djela all por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifuga
cin en fro a 2000 g por 5 m inutos. Lave el ARN con u n a m ezcla etanol-agua
(3:1), luego con etanol y finalm ente con ter; deje secar al aire y pese. Nota: el
contenido de ARN en levadura es alrededor de 4% de su peso seco.
Compare su producto con' una preparacin com ercial m idiendo el
contenido de pentosa, fsforo y ADN y determ in an d o el espectro de absor
cin. G uarde su preparacin p ara usarla en experim entos futuros.
EXPERIMENTO 8.2 Electroforesis de nucletidos de A R N

Fundamento
Los enlaces ster de ARN son hidrolizados fcilm ente debido a la presencia
del hidroxilo libre 2' de la ribosa. Esto p erm ite la form acin de fosfodisteres
los cuales se hidrolizan dando nucletidos 2' y 3'. El ADN no contiene un grupo
hidroxilo en la posicin 2' y es por lo tanto relativ am en te estable al lcali di
luido. Los nucletidos hidrolizados pueden ser luego separados por electrofo
resis en am ortiguador de citrato, pH 3.5, en el que poseen varias cargas
negativas.
Materiales 10
1. Hidrxido de potasio (0.3 mol/1). 100 mi
2. Acido ribonucleico. 2g
3. Acido perclrico (200 g/1). 100 mi
4. A m ortiguador de citrato (0.02 mol/1, pH 3.5). 5 veces la
capacidad
del tanque
de electro
foresis
6. Incubadoras a 37C. 3
7. Espectrofotm etro ultravioleta. 5
8. P atrones de nucletidos (AMP, GMP, CMP Y UMP).
9. Equipo para electroforesis en acetato de celulosa. 5
10. L m para ultravioleta. 3
Mtodo
Disuelva el ARN en 5 mi de hidrxido de potasio 0.3 mol/1 (2030 m g/m l) e
incube a 37 C d u ra n te 18 horas. Al da siguiente coloque la solucin en un
bao de hielo y titu le hasta o b ten er u n pH de 3.5 con cido perclrico 200 g/1.
Rem ueva cualquier precipitado que se form e por centrifugacin y use el

sobrenadante para la separacin electrofortica.
Rem oje las tiras de acetato de celulosa en el am ortiguador, seque el exceso
de agua y colquelas teniendo cuidado de que los extrem os estn dentro del
am ortiguador. A plique los nucletidos en el extrem o de la tira cercano al
ctodo y corra la electroforesis a 10 V/cm . Se puede observar fcilm ente el
transcurso de la separacin exam inando las tiras con luz ultravioleta, ya que
el acetato de celulosa fluoresce bajo la irradiacin m ien tras que los nucleti
dos absorben fu erte m en te en el ultravioleta y aparecen como m anchas os
curas.
Eluya cada uno de los nucletidos con 4 mi de HC1 0.01 mol/1 y haga un
grfico del espectro de absorcin obtenido en la regin en tre 220-320 nm . Use
como blanco fracciones eluidas de una tira que ha sido corrida en la m ism a
form a pero a la cual no se le haba agregado nucletidos.
Identifique los nucletidos hasta donde sea posible usando los datos de
extincin que aparecen en la tabla 8.1. Use los valores de pK de los grupos
inicos presentes en los nucletidos que se dan en la tabla 8.2 para predecir el
orden de separacin.
Tabla 8.1 Absorcin de los nucletidos de ARN en ultravioleta a pH 2
Coeficiente de extincin
milimolar a 260 nm
Nucletido ^260,1 E5o/ E260 . Eao/E 26o
cido adenlico 14.3 0.85 0.22

cido guanlico 11.8 0.92 0.68
cido citidlico 6.8 0.47 1.90
cido uridlico 9.8 0.78 0.30
Tabla 8.2 Valores de pK de los grupos ionizables de los nucletidos de ARN
Grupos ionizables
Fosfato Fosfato
primario Amino secundario Hidroxilo
cido adenlico 0.9 3.7 5.9
cido guanlico 0.7 2.3 5.9 9.5

cido citidlico 0.8 4.3 6.0 13.2
cido uridlico 1.0 5.9 9.4
EXPERIMENTO 8.3 Separacin de nucletidos del A R N por cromatografa de

intercambio inico
Fundamento
Como en el experim ento an terio r, el ARN es hidrolizado por lcali p ara
separar los nucletidos que lo constituyen. Los productos de la hidrlisis son
luego separados en u n a colum na de intercam bio inico fu erte m en te cida y
son identificados por su espectro de absorcin ultravioleta caracterstico
(tabla 8.1). El UMP y el GM P salen de la colum na como dos picos definidos,
m ientras que el AMP y el CMP salen com binados en u n solo pico, debiendo
usarse en este caso u n a frm ula em prica para calcular las cantidades rela ti
vas de los dos nucletidos.
Materiales 10
1. Acido ribonucleico de fuentes anim ales o bacterianas. 2g
2. Hidrxido de potasio (0.3 mol/1). 100 m i
3. Acido perclrico (200 g/1). 100 mi
5. Acido clorhdrico (1 mol/1). 50 m i
6. C olum na de crom atografa Dowex 50 W (15 cm x 1.5 cm). 5
8. Frascos volum tricos (10 m i). 10
9. Frascos volum tricos (25 mi). 5
Mtodo
Hidrolice 0.2 g de ARN con KOH 0.3 mol/1 y neu tralice con cido perclrico tal
como se indic en el experim ento anterior. En u n tubo de ensayo pipetee 3.8
mi de la solucin y agregue 0.2 m i de HC1 1 mol/1 hasta o b ten er una
concentracin final de cido de 0.05 mol/1. Mida la extincin de la solucin a
260 nm diluyendo u n a alcuota con HC1 0.05 mol/1 y aplique e n tre 5 y 12
unidades de extincin a la p arte superior de u n a colum na de Dowex 50 W
previam ente equilibrada con HC1 0.05 mol/1. Eluya con HC1 0.05 mol/1 y
recoja el eluido en u n frasco volum trico de 10 mi. Mida la extincin del eluido
a 260 nm a m edida que sale de la colum na y u n a vez que haya salido de ella el
prim er nucletido, coloque bajo la colum na u n segundo frasco de 10 m i que
contenga 0.5 m i de H C11 mol/1 y eluya con agua hasta que haya salido todo el
GMP. Increm ente entonces el flujo de la colum na y recoja el AM P y CMP en
un frasco de 25- m i que contenga 1.25 m i de cido clorhdrico 1 mol/1.
Llene hasta la m arca el p rim er frasco con HC1 0.05 mol/1 y los otros dos
frascos con agua. Mezcle fu erte m en te y haga grficos del espectro ultravioleta
entre 220 y 320 n m tom ando m u estras de cada frasco. Explique por qu los
nucletidos salen de la colum na en el orden qu lo hacen y use la frm ula que
se da a continuacin p ara calcular la cantidad de cada nucletido presente. Se
m antiene la relacin A M P/U M P = G M P/C M P = 1 p ara ARN?
Pico 1: UMP (jumol) = (E2 60 x 10)/9.8.

Pico 2: GMP (/mol) = (E2 5 7 x 10)/11.8.
Pico 3: Si [X] = (2.32 x E 25 1 ~ E2 79 )2.08,
AMP (//mol) = ([X] x 25)14.3,
CMP (/mol) = E21 9 - (0.24 x [X] x 25)132.
EXPERIMENTO 8.4 Composicin de bases en el ARN
Fundamento
Los cidos ribonucleico y desoxiribonucleico pueden hidrolizarse con cido
perclrico al 72% por 1 hora hasta lib erar las bases que lo form an. El m todo no
es com pletam ente cuantitativo, puesto q u e se pierde algo de tim ina. Las bases
resultantes se sep aran luego por crom atografa de papel y se detectan con luz
ultravioleta.
Materiales 10
1. Acido ribonucleico. lg
2. Acido perclrico (72%). 20 mi
3. Bases m arcadoras (adenina, guanina, citosina, uracilo 1 mi
y tim ina, 5 mmol/1).
4. Bao de agua hirviendo. 5
5. L m para de luz ultravioleta. 5
6. Acido clorhdrico (0.1 mol/1). 250 m i
8. Acido clorhdrico (conc.)
9. Isopropanol.
10. Equipo de crom atografa de papel. 5
11. Solventes p ara crom atografa (isopropanol: agua: 5 veces la
HC1 conc. 130:37:33). capacidad
del tanque
Mtodo
Mezcle el cido nucleico (100 mg) con 1 m i de cido perclrico y caliente por 1
hora en un bao de agua hirviendo. Tape el tubo con u n a bola de vidrio o una
am polleta para ev itar la evaporacin. Ya que existe el peligro de explosin,
esta hidrlisis debe efectuarse en un extractor de gases protegido por una
malla metlica. No caliente hasta la sequedad.
E nfre el tubo, agregue 1 m i de agua y centrifugue el contenido: use el
sobrenadante claro y haga crom atografa descendente en papel W hatm an No.
1 de un da para otro. Se deben co rrer como m arcadores bases p u ras p aralela
m ente a las m uestras.
Tabla 8.3 Absorcin de las bases de purina y pirim idina en cido

clorhdrico 0.1 m ol/1
Longitud de onda C oeficiente de

Bases m xim a extincin m ilim olar
a d e n in a . 260 13.0
guanina 250 11.2
uracilo 260 7.9
tim ina 265 7.9
citosina 275 10.5
Seque el crom atogram a en u n a corriente de aire seco d u ran te 4 horas; lu e

go localice las bases con luz ultravioleta. C orte las m anchas y colquelas en 5
mi de HC10.1 mol/1 de un da p ara otro para elu ir el contenido. H aga un grfi
co del espectro de absorcin de la solucin. Identifique las bases com parando
el espectro de absorcin con patrones de pu rinas y pirim idinas y determ in e
las cantidades relativas de las bases en los cidos nucleicos a p a rtir de los
coeficientes de absorcin dados en la tabla 8.3.
Com pare la relacin de las bases con los valores obtenidos por hidrlisis
alcalina seguida de electroforesis de los nucletidos.
EXPERIMENTO 8.5 Aislamiento del ADN a partir del bazo de cerdo

Fundamento
Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad presen te en algunos
tejidos es pequea y por lo tanto no son buen m aterial p ara su extraccin.
Adems, algunos tejidos contienen actividades altas de la enzim a desoxiribo-
nucleasa (DNasa) la cual fragm enta el ADN. U na fu en te adecuada p ara la
extraccin de ADN debe, por lo tanto, contener cantidades altas de est
m aterial y te n e r m uy baja actividad de desoxiribonucleasa. El tejido linfoide
es m uy bueno; el tim o es la m ejo r fuente, pero el bazo puede usarse con
buenos resultados.
El ADN se desnaturaliza fcilm ente y debe trab a jarse con cuidado para
obtener un producto estru ctu ralm en te sem ejante al encontrado en la clula.
Debe evitarse la tensin m ecnica y condiciones fsicas y qum icas extrem as y
deben inhibirse las nucleasas. Se puede agregar citrato de sodio p ara ligar
Ca++y Mg++los cuales son cofactores de las DNasa. A quellas etapas del proce
dim iento anteriores a la separacin de las protenas deben hacerse tan rpida
m ente como sea posible y en fro.
Las nucleoprotenas son solubles en agua y soluciones de alta concentra
cin inica, pero son insolubles en soluciones de baja concentracin inica
(0.050.25 mol/1) y esta propiedad es usada en su extraccin. P rim ero el tejido
es homogenizado en solucin salina isotnica am ortiguada con citrato de
sodio, pH 7, en la que se solubilizan la m ayora de las otras molculas,

m ientras que las desoxiribonucleoprotenas p erm an ecen insolubles pero
pueden solubilizarse luego en solucin salina 2 mol/1.
La protena se separa tratando la solucin con una m ezcla de cloroform o/
alcohol amlico y el ADN se precipita con etanol. El producto se disuelve en
am ortiguador salino diluido y se guarda congelado. En esta form a es estable
por varios meses.
Materiales 10
1. Bazo de cerdo. 300 g
2. A m ortiguador salino (NaCl 0.15 mol/1 am ortiguado con 31
citrato de sodio 0.015 mol/1, pH 7).
3. C loruro de sodio (2 mol/1). 61
4. Cloroform o/alcohol amlico (6:1). , 21
5. Alcohol absoluto. 21
6. Eter. 500 m i
7. Licuadoras. 5
Mtodo
P ique en pedazos m uy pequeos 50 g de bazo de cerdo y hom ogenice en 200 m i
de am ortiguador salino d u ran te 1 m inuto. C entrifugue la suspensin a 5000 g
por 15 m inutos y rehom ogenice el precipitado en 200 m i de am ortiguador sali
no. Deseche el sobrenadante; com bine y suspenda los sedim entos en NaCl 2
mol/1 hasta obtener u n volum en final de 11, en el que la m ayora del m aterial
debe disolverse. R em ueva los sedim entos por centrifugacin y agite la solu
cin continuam ente con una varilla de vidrio aadiendo al m ism o tiem po un
volum en igual de agua destilada. Envuelva el precipitado fibroso en el
extrem o de la varilla de vidrio y djela secar en un vaso de precipitados por 30
minutos. D u ran te este tiem po el grum o se desh id ratar parcialm ente y el
lquido rem a n en te se debe secar con papel de filtro.
Disuelva la desoxiribonucleoprotena en aproxim adam ente 100 m i de
NaCl 2 mol/1, agregue un volum en igual de la m ezcla de cloroform o/alcohol
amlico (6:1), y hom ogenice por 30 s. C entrifugue la em ulsin a 5000p d u ran te
1015 m inutos y recoja la capa su p erio r acuosa (opalescente). La recoleccin
debe hacerse por succin cuidadosa en form a tal que no se agite la pro tena
presente en la interfase de los dos lquidos. Repita dos veces m s el
tratam iento con solvente orgnico y recoja el sobrenadante en un vaso de 500
mi.
Precipite el ADN agitando len tam en te el sobrenadante con dos veces su
volum en de alcohol enfriado en hielo y rote u n a varilla de vidrio hasta que las
fibras se enrollen. Saque la varilla y presione cuidadosam ente el ADN fibroso
contra las paredes del vaso de precipitados p ara ex p rim ir el solvente. Lave
finalm ente el precipitado m etiendo la varilla en u n a serie de solventes y
exprim iendo el exceso en la form a descrita. Los cuatro solventes usados son
70% (v/v) etanol, 80% (v/v) etanol, etanol absoluto y ter. D eje ev ap o rar el ter
rem anente colocando el ADN en u n vidrio d reloj aproxim adam ente
durante 10 m inutos.
Pese el ADN seco y disulvalo agitndolo en am ortiguador salino diluido 1
a 10 con agua destilada (2 m g/m l); alm acnese congelado hasta cuando se
necesite.
EXPERIMENTO 8.6 Absorcin ultravioleta de los cidos nucleicos

Fundamento
Debido al sistem a de dobles enlaces conjugados presentes en la m olcula de
las purinas y pirim idinas, los cidos nucleicos absorben fu erte m en te en la
regin ultravioleta del espectro. P resen tan u n m xim o caracterstico a 260
nm y un m nim o a 230 nm .
No se conoce g en eralm en te el contenido de agua de los cidos nucleicos, as
que los coeficientes de extincin no pueden calcularse en base a su peso. Sin
embargo, la extincin puede expresarse adecuadam ente como Ep , que es la
extincin de u na solucin que contiene 1 mol/1 de fsforo. P ero au n as, el
coeficiente de extincin de u n cido nucleico no es u n a constante sino que
depende del tratam ien to previo del m aterial, lo m ism o que del pH y de la
fuerza inica del medio. Los valores tpicos de Ep se dan a continuacin:
Ep para ADN = 60008000,

E P para ARN = 7 0 0 0 -1 0 000.
El coeficiente de extincin de u n cido nucleico puede in crem en tarse por

degradacin o hidrlisis hasta u n 40% y esto se conoce como efecto
hvpercrmico. Los enlaces de hidrgeno y las interacciones itn en la
macrom olcula de los cidos nucleicos alteran el com portam iento resonante
de las bases, as que la extincin de los cidos nucleicos es m en o r que la sum a
de las extinciones de los nucletidos que los com ponen.
Cuando se calienta le n tam en te u n a solucin de ADN de doble banda, la
extincin no cam bia apreciablem ente hasta alcanzar u n punto que se conoce
como la te m p e ra tu ra de fusin (Tm); en este p u nto la absorbancia sube
rpidam ente hasta u n valor determ inado el cual no cam bia apreciablem ente
si se aum enta m s la te m p eratu ra. A la te m p eratu ra de fusin se rom pen los
enlaces de hidrgeno e n tre las bases de las cadenas opuestas y las dos bandas
de ADN se separan. Si la solucin de ADN se en fra luego len tam en te, las dos
bandas se recom binan y la curva de en friam ien to puede superponerse so
bre la curva de fusin. Sin em bargo, si el ADN se en fra rpidam ente, ocurre
cierta recom binacin e n tre las dos cadenas, pero de u n a m a n era desordenada,
as que la extincin de la solucin es m s alta que la de la solucin de ADN
antes de calentarse (figura 8.8).
Temperatura
Figura 8.8 Efecto de la temperatura sobre la extincin del ADN
Materiales 10
1. Acido desoxiribonucleico. 0.5 g
2. Acido ribonucleico. 0.5 g
3. Desoxiribonucleasa (ADNasa). 2 mi
4. A m ortiguador de acetato (0.5 mo 1/1, pH 5.5). 11
5. Solucin de sulfato de m agnesio en am ortiguador de 11
acetato. (P rep are u n a solucin de sulfato de m agnesio
0.01 mol/1 en la solucin de am ortiguador arrib a indicada).
6. A m ortiguador salino (NaCl 0.15 mol/1; citrato de sodio 11
0.105 mol/1, pH 7).
7. Espectrofotm etro ultravioleta con celda para cubetas 5
controlada term ostticam ente.
8. Bao de agua para tem p eratu ras hasta de 95 C. 5
Mtodo
Prueba espectrofotomtrica. Disuelva 10 mg de ARN y ADN en am ortigua
dor salino y com plete hasta 100 mi. Haga el grfico del espectro de absorcin
de las 2 soluciones, e n tre 220 y 320 n m y exprese los resultados finales como E P
luego de d eterm in a r el contenido de fsforo como se indica en el experim ento
8.9.
Com pare los resultados obtenidos en su experim ento con los de m uestras
com erciales y com ente las diferencias observadas.
Accin de la desoxirribonucleasa (desoxirribonucleato oligonucletido hidro-
lasa, 3.1.4.4). D isuelva ADN (10 mg/100 m i) en la solucin de sulfato de
magnesio con am ortiguador de acetato y pipetee 2.5 m i en una cubeta. A ada
0.5 m i de la solucin de enzim a, diluya convenientem ente y siga el cambio de
extincin a 260 nm . C om prela con un blanco que contenga agua destilada en
lugar de enzima.
Repita el experim ento con ARN y explique los resultados.
\
Efecto del calor sobre ADN. P rep are tres soluciones de ADN en am ortigua
dor salino diluido (0.1), norm al (1) y concentrado (5 x ), hasta un valor de
extincin inicial e n tre 0.3 y 0.5 (0.1 m g/m l). Coloque las soluciones en tres
cubetas en un espectrofotm etro que contenga u n a celda p ara cubetas
term ostticam ente controlada y anote los cambios en la extincin a m edida
que se aum enta la te m p e ra tu ra hasta 90 C. La te m p eratu ra de la celda es
usualm ente m s alta que la de la cubeta m ism a, as que debe m edirse la
tem peratura de la solucin de ADN d irectam en te en la cubeta si es posible.
Mida tam bin el cam bio en la extincin a m edida que las cubetas se enfran
lentam ente desde 90 C hasta la te m p eratu ra am biente. Repita el ex p erim en
to, pero esta vez en fre las soluciones rpidam ente.
Com pare las curvas de enfriam iento y fusin p ara los dos experim entos y
com ente el efecto de la fuerza inica en la te m p eratu ra de fusin.
EXPERIMENTO 8.7 Determinacin del ADN por la reaccin de difenilamina

Fundamento
Cuando se tra ta ADN con difenilam ina en condiciones cidas, se form a un
compuesto azul con u n a absorcin definida m xim a a 595 nm . Esta reaccin la
dan en general las 2-desoxipentosas y no es especfica p ara ADN. En solucin
cida, la cadena lineal de u n a desoxipentosa se convierte a la form a /3-hidro-
xilevulinoaldehdo altam en te reactiva y que reacciona con difenilam ina para
dar un complejo azul. En el ADN n icam en te reacciona la desoxiribosa del
nucletido de purina, as que el valor obtenido rep resen ta la m itad del total de
desoxiribosa presente.
Materiales 10
1. ADN (m uestra com ercial). 10mg
2. ARN (m uestra com ercial). 10mg
3. Solucin de bazo de cerdo del experim ento 8.5. 10mg
4. Solucin de ARN de levadura del experim ento 8.1. 10mg
5. A m ortiguador salino (NaCl 0.15 mol/1; citrato de sodio 500m i
0.015 mol/1, pH 7).
6. Reactivo de difenilam ina. (D isuelva 10 g de difenilam ina 11
pura en 1 1 de cido actico glacial y agregue 25 m i de
cido sulfrico concentrado. Esta solucin debe p rep a
rarse fresca).
Mtodo
Disuelva 10 mg de cido nucleico en 50 mi de am ortiguador salino, saque 2 m i y
agrguele 4 m i de reactivo de difenilam ina. C aliente en u n bao de agua h ir
viendo d u ran te 10 m inutos, en fre y lea la extincin a 595 nm . Lea la m u estra
y los patrones contra u n blanco de agua. Ensaye los cidos nucleicos p rep ara
dos por usted y las m u estras com erciales de ADN.
EXPERIMENTO 8.8 Determinacin del A R N por la reaccin de orcinol
Fundamento
Esta es u na reaccin general p ara las pentosas y se debe a la form acin de
fu rfu ral cuando se calienta la pentosa con cido clorhdrico concentrado. El
orcinol reacciona con fu rfu ral en presencia de cloruro frrico como
catalizador, dando u n a coloracin verde. Solam ente los nucletidos de p u rin a
dan una reaccin considerable.
Materiales 10
1. Soluciones de ADN y ARN preparadas tal como en el 250 m i
experim ento 8.7 (0.2 m g/m l).
2. Reactivo de orcinol (disuelva lg de cloruro frrico) 11
(FeCl3 . 6H20 ) en 11 de HC1 concentrado y agregue 35 mi
de orcinol en alcohol 6% p /v).
Mtodo
Mezcle 2 m i de la solucin de cido nucleico con 3 m l del reactivo de orcinol.
C aliente en u n bao de agua hirviendo por 20 m inutos, enfre y determ in e la
extincin a 665 n m contra u n blanco de orcinol.
EXPERIMENTO 8.9 Determinacin del contenido de fsforo en un cido

nuclico
Fundamanto
El cido nucleico se oxida con cido perclrico dando fosfato inorgnico, el
cual puede ser determ inado por los mtodos convencionales.
Materiales 10
1. Reactivos p ara la determ inacin de fosfato inorgnico
(experim ento 4.3).
2. Acido perclrico (60% v/v). 10 m i
3. Frascos p ara digestin y soportes. 20
Mtodo
Pipetee 2 m i de u n a solucin de cido nucleico (0.1 m g /m l) en u n frasco de
digestin. A gregue 0.5 m i de cido perclrico y digiera la m u estra usando una
llam a dbil d u ran te 1 ho ra hasta que todo el m aterial inorgnico haya
desaparecido. (Precaucin: puede ocurrir explosin; v er experim ento 8.3).
Despus de enfriar, agregue 1 m i de agua destilada a cada frasco y m ida el
contenido de fsforo como se describi en el experim ento 4.3.
Bibliografa
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P arish, J. H ., Principles and Practice of Experiments w ith Nucleic Acids,
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W atson, J. D ., The Double Helix, L o n d res, W e id e n fe ld y N ico lso n , 1968.
9
Enzimas
INTRODUCCION
Las enzimas como catalizadores

Catlisis. Los organism os vivos pueden o b ten er y gastar la energa m uy
rpidam ente debido a la presencia de catalizadores biolgicos llamados
enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgnicos, las enzim as
modifican la velocidad de una reaccin qum ica sin afectar el equilibrio final;
y slo se req u ieren pequeas cantidades p ara efectu ar la transform acin de
un gran n m ero de m olculas de sustrato. Sin em bargo, a diferencia de la
m ayora de catalizadores inorgnicos, las enzim as son bastante especficas,
ya que catalizan un n m ero com parativam ente pequeo de reacciones y en
algunos casos tan solo u n a reaccin. As mism o, las enzim as funcionan
solam ente bajo condiciones m u y definidas de pH, tem p eratu ra, concentra
cin de sustrato, cofactores, etc., propiedades que se ilu stran en algunos de los
experim entos siguientes.
Clasificacin. Las enzim as se designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de
reaccin que catalizan. Los seis grupos principales de enzim as son:
1. O xidoreductasas.
2. Transferasas.
3. Hidrolasas.
4. Liasas.
5. Isom erasas.
6. Ligasas (sintetasas).
230 4
Enzimas 231
Cada enzim a se designa por u n nom bre sistem tico y por u n n m ero que
la identifica de acuerdo a sus grupos y subgrupos. La lactato: NAD oxido-
reductasa, por ejem plo, es la n m e ro 1.1.1.27. El p rim e r n m ero nos dice
que la enzim a est en el grupo 1 y por lo tan to es una oxidoreductasa. El
segundo nm ero es el subgrupo e indica el grupo qum ico que modifica, que
en este caso es el CHOH. El te rc er n m ero denota el subgrupo, el cual indica
que el aceptor de hidrgeno es el NAD o NADP. El cuarto es el n m ero carac
terstico de la enzim a. Existe tam bin un nom bre com n recom endado, m s
corto y ms conveniente que el nom bre sistem tico. P a ra el caso de la enzim a
antes m encionada este es deshidrogenasa lctica.
EXPERIMENTO 9.1 Catlisis enzim tica

Fundamento
El perxido de hidrgeno se descom pone en agua y oxgeno en presencia de u n
catalizador. En este experim ento, se com para la capacidad de la enzim a
catalasa y del catalizador inorgnico p ara descom poner el perxido de
hidrgeno. Esto puede m edirse titulando con p erm anganato de potasio y
usando Mn++ como catalizador.
5 H2 0 2 + 2M n04~ + 6H + ------- 5Q 2 + 2Mn+ + + 8H 2 O
Materiales 100
1. Perxido de hidrgeno (10 mm ol/1). 22 1
2. A m ortiguador de fosfato sdico o potsico 51
(50 mmol/1, pH 7.2).
3. Solucin de catalasa (0.2 jug/ml). 31
4. Platino coloidal (20jug/ml). 31
5. HC1 (5 mm ol/1). 15 1
6. M nCl2 (0.1 mol/1). 500 mi
7. P atrn de K M n 0 4 (2 mmol/1). 10 1
8. B uretas (10 mi). 50
9. Bao de agua a 37C. 25
10. KCN (10 mm ol/1). Cuidado: Veneno! 31
Mtodo
Catlisis. P rep are cinco tubos de ensayo pyrex que contengan la mezcla
indicada en la tabla siguiente y colquelos en u n bao de agua a 37 C.
Al mismo tiem po, coloque la solucin de perxido de hidrgeno en el bao de
agua hasta alcanzar u n a te m p e ra tu ra de 37 C. D espus de que perm anezca 5
m inutos a esta te m p e ra tu ra com ience la reaccin aadiendo 5 m l a la mezcla
presente en cada uno de los tubos. R em ueva los tubos despus de 3,6,9,12 y 15
m inutos de incubacin e in m ed iatam en te p are la reaccin agregando 5 m i de
Componentes mi
agua 3 mi
amortiguador de fosfato (50 mmol/1,
pH 7.2). 1 mi
catalizador (catalasa o Pt coloidal) 1 mi
HC1 5 mol/1 para in activ ar el catalizador. Coloque los tubos en un bao de

hielo y titu le los contenidos de cada tubo con solucin patr n de K M n 0 4.
Titulacin. A cada m u estra agregue dos gotas de M nC l2 0.1 mol/1 y titu le con
K M n 0 4 2 m m ol/1 hasta o b ten er u n color rosado plido. Si el K M n 0 4 h a sido
preparado en tal form a que sea realm en te u n a solucin patrn, entonces 1 m i
ser equivalente a 5 mmol de H 20 2. Usando los datos de la titulacin, haga un
grfico de la desaparicin de H 20 2contra tiem po despus de corregir el e rro r
debido a la descomposicin espontnea del H 20 2.
Controles. El H 20 2 es inestable y se descom pone u n poco espontneam ente
en ausencia del catalizador. P ara corregir el e rro r que esta descomposicin
introduce en los resultados se debe in cu b ar p aralelam en te con la m u estra una
serie de tubos que contengan H 20 2, am ortiguador y agua pero sin catalizador.
El valor obtenido en estos tubos se resta del de las m uestras.
Comparacin de los catalizadores. Los estudiantes deben tra b a ja r en p arejas
y m ientras uno de ellos hace el experim ento con catalasa, otro usa platino
coloidal. Todos los ensayos deben hacerse por duplicado.
Usando el grfico calcule la actividad de cada catalizador a p a rtir de la
pendiente de la cu rv a y exprese los resultados en trm inos de m icrom oles de
H 20 2 descom puesto por m inuto por m iligram o de catalizador. Adems,
exprese los resultados en form a de m icrom oles de H 20 2 descom puesto por
m inuto por m icrom ol de catalizador y com pare la eficiencia relativa de la
catalasa y del P t coloidal.
Peso m olecular del platino = 195,
Peso m olecular de la catalasa = 25 000.
/
P ara efectos de los clculos suponga que hay slo u n centro activo por cada
tom o o molcula.
Envenenamiento. R epita el experim ento con los dos catalizadores, pero
utilice 1 m i de u n a solucin de KCN 10 m m ol/1 en vez de 1 m i de agua.
Precaucin: este compuesto es venenoso; por tanto, no use pipetas sino una
bureta para dispensarlo. C om ente los resultados.
Medicin de la actividad enzimtica
Ensayo de la enzima. Debido a q u e slo se necesitan m u y bajas concentracio
nes de enzim a p ara catalizar u n a reaccin dada, slo m u y pocas enzim as
Enzimas 233
pueden m edirse directam ente. P o r consiguiente, la presencia de u n a enzim a

se dem uestra generalm en te siguiendo la desaparicin del sustrato o la
aparicin de u n producto de la reaccin. La enzim a es incubada con el sustrato
bajo condiciones cuidadosam ente controladas y se sacan alcuotas a intervalos
de tiempo apropiados p ara ser analizados.
Controles. A dem s de las m u estras, siem pre se p rep aran controles, uno de
los cuales no contiene enzim a m ien tras el otro contiene enzim a pero no
sustrato. P ueden ser necesarios tam bin otros controles cuando la enzim a
requiere varios cofactores. El objeto de los controles es corregir los erro res
que se presenten debido a reacciones qum icas espontneas no especficas ni
catalizadas por la enzim a.
Curvas de progreso. La velocidad de u n a reaccin enzim tica se puede
expresar como funcin de la concentracin de sustrato transform ado o
producto obtenido con respecto al tiem po, luego de re sta r los valores debidos a
cualquier transform acin no enzim tica. El tipo de curva obtenido se m u estra
en la figura 9.1 y se conoce como purva de progreso. La transform acin del
sustrato con respecto al tiem po es lineal al comienzo, pero pronto com ienza a
dism inuir. Inicialm ente no hay productos presentes en la m ezcla de
incubacin, pero, a m edida que progresa da reaccin, la reaccin inversa se
hace ms y m s im p o rtan te hasta alcanzar el equilibrio. La concentracin de
sustrato tam bin dism inuye con el tiem po de m a n era que la actividad se hace
m enor porque la enzim a estar m enos satu rada de sustrato. F inalm ente, la
enzima puede ser inhibida por los productos form ados o puede inactivarse
lentam ente bajo las condiciones experim entales. Todos estos efectos juntos
hacen que sea casi im posible d eriv ar u n a ecuacin estn d ar que se aju ste a la
curva de progreso. P o r tanto la actividad enzimtica (v)se d eterm in a conside
rando nicam ente la velocidad inicial de reaccin (v = a/b) ya que en tales
condiciones los efectos discutidos son m s pequeos (figura 9.1).
Figura 9.1 Curva tpica de progreso

Unidades enzimticas. La actividad enzimtica se expresa frecu en tem en te

en trm inos de unidades (U). Una unidad es la cantidad de enzim a que
cataliza la conversin de un micromol de sustrato por m inuto bajo
condiciones definidas. En algunos casos la unidad es m u y grande y la actividad
debe expresarse m s adecuadam ente en trm inos de n m o l/m in o pm ol/m in.
La unidad SI de actividad enzim tica es la katal (kat) que representa la
transformacin de 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad es grande pero
se pueden o bten er valores m s fcilm ente m anejables expresando las
actividades en m icrokatals (pkat), nanokatals (nkat) o picokatals (pkat).
1 U = 1 /xmol min-1 ,
1 katal = 1 mol s_1,
1 U = pkat/60 = 16.67 nkat.
La pureza de u n a enzim a se expresa en trm in o s de actividad especfica

que se define como el n m ero de unidades enzim ticas (U) por m iligram o de
protena. La actividad especfica en unidaes SI se da en katals por kilogram o
de protena.
Las actividades relativas de enzim as puras pueden se r com paradas usando
como referencia sus actividades molares. Esto se conoce tam bin como
actividad molecular o nm ero de recambio definido como el n m ero de
m olculas de sustrato transform ados en u n m in u to por u n a m olcula de la
enzim a bajo condiciones ptimas. Por ejem plo, la actividad m olar de la
catalasa es aproxim adam ente de 5 x 10.
EXPERIMENTO 9.2 Curva de progreso obtenida durante la hidrlisis de

p-nitrofenilfosfato por la fosfatasa alcalina srica ( monoster ortofosfrico
fosfohidrolasa, 3.1.3.1.)
Fundamento
La fosfatasa alcalina (pH ptim o 910) se halla en hueso, rin, hgado e
intestino y acta sobre los steres fosfricos liberando fosfato inorgnico.
OH OH
R -0*=O + H20 R-OH HO- = 0
H OH
P ara su determ inacin se usa como sustrato p-nitrofenilfosfato y el
p-nitrofenol liberado por la hidrlisis enzim tica es m edido colorim trica-
m ente. El p-nitrofenol en solucin alcalina absorbe a 405 nm . El sustrato
p-nitrofenilfosfato no absorbe a esta longitud de onda, de m a n era que el curso
de la reaccin catalizada por la enzim a puede ser seguido fcilm ente
m idiendo el cam bio de la extincin a 405 n m (experim ento 4.7).
/
Enzimas 235
Materiales 100
1. A m ortiguador de bicarbonato-carbonato de sodio 500 mi
(0.1 mol/1, pH 10.0).
2. Solucin de sustrato, p-nitrofenil fosfato (5 mm ol/1 en 500 mi
am ortiguador alcalino).
3. Patrones de p-nitrofenol (50 p mol/1). D isuelva 69.6 m g 11
de p-nitrofenol en 100 m i de am ortiguador alcalino,
diluya esta solucin 1 a 100 con el am ortiguador. Las
soluciones (2) y (3) siem pre deben estar frescas para
cada experim ento.
4. Suero. 50 mi
5. Colorm etros. 50
Mtodo
Prueba. A gregue 0.8 m i de am ortiguador de carbonato-bicarbonato a 2 mi de
la solucin de sustrato y m ezcle vigorosam ente. u n tiem po cero agregue 0.2
mi de suero y siga el cam bio en extincin a 405 nm .
Blanco. Se p rep ara lo m ism o que la m uestra, excepto que en vez de 0.2 m i de
suero ,se usa am ortiguador.
Patrn. P rep are u na serie de soluciones de p-nitrofenol y haga u n grfico de
la extincin a 405 nm en funcin de la concentracin.
A. Respuesta normal.
B. (i) Parte no lineal de la curva de progreso usada para
calcular la actividad.
(ii) Inhibidor presente en la preparacin de enzima.
C. Activador presente en la preparacin enzimtica.
D. Agotamiento del sustrato.
E. Inactivadores tales como metales pesados en la mezcla
de reaccin.
Figura 9.2 Efecto de la concentracin de enzim a

sobre la actividad
Clculos
Reste el valor de la extincin obtenida p ara el blanco del valor de la m u e stray
calcule a p a rtir de la curva patrn el p-nitrofenol liberado. Exprese la
actividad de la fosfatasa alcalina srica en trm inos de unidades por m ililitro
de suero recordando que en el ensayo se usaron 0.2 mi de suero.
Concentracin de la enzima
Las pruebas enzim ticas se hacen en u n a alcuota del m aterial disponible
pero la actividad debe referirse al volum en total de la solucin o del peso de la
enzima. Por ejem plo, en bioqum ica clnica se usa 0.1 mi 0.2 mi de suero pero
la actividad se expresa en unidades por litro. P or esta razn es im portante
d eterm in a r si la actividad vara lin ealm en te con la concentracin de la
enzima. C ualquier desviacin de la linealidad es el resultado de algn factor
lim itante (figura 9.2).
EXPERIMENTO 9.3 Variacin de la actividad de la fosfatasa alcalina con la

concentracin de la enzima
Materiales
P rep ara 21 de am ortiguador y sustrato y 200 m i de suero tal como lo hizo en el
experim ento an terio r. Este m aterial es suficiente p ara 50 parejas de
estudiantes.
Mtodo
Repita el experim ento an terio r con volm enes de suero desde 0.1 a 0.6 mi. El
volum en del sustrato se m an tien e constante (2 mi) y el volum en del
am ortiguador se aju sta de m an era que la m ezcla final sea 3 m i como an te rio r
m ente. Se p rep ara u n a cu rv a de progreso p ara cada volum en de suero como se
describi arrib a y se d eterm in a la velocidad inicial de la reaccin. Haga u n
grfico de la actividad enzim tica en funcin de la concentracin de enzim a
expresada como m ililitros de suero.
Escoja u n tiem po conveniente m s all de la porcin lineal de la cu rv a de
progreso y exprese la actividad como la cantidad prom edio de p-nitrofenol
liberada por m inuto. Haga un grfico de la concentracin de enzim a en
funcin de la actividad y com pare los resultados con la curva anterior, en la
cual se usarop las velocidades iniciales p ara ex p resar la actividad.
ACTIVIDAD ENZIMATICA Y CONCENTRACION DE SUSTRATO
Enzimas del tipo Michaelis-Menten

Cintica. Si se d eterm in a la actividad de u n a enzim a en presencia de concen
traciones crecientes de sustrato, se obtiene g en eralm en te una curva
hiperblica rectan g u lar sim ilar a la q u e se m u e stra en la figura 9.3.
Enzimas 237
Figura 9.3 Efecto de la concentracin de sustrato sobre

la actividad enzim tica
A bajas concentraciones de sustrato v cam bia lin ealm en te con s, dando

cintica de p rim er orden: v = d s/d t = Ks, donde k es la constante de
velocidad.
A concentraciones altas de sustrato v es in d ependiente de s, dando una
cintica de orden cero: v = d s/d t = constante = V.
A concentraciones in term edias de sustrato se halla una m ezcla de cin
ticas de cero y p rim e r orden.
Se puede o btener u n a ecuacin que relacione v y s p ara la curva entera.
Esta ecuacin fue derivada por p rim era vez por M ichaelis y M enten en 1971:
Vs
donde V y K m son constantes.

El supuesto bsico en su derivacin es que la enzim a y el sustrato form an
un complejo que se disocia p ara d ar la enzim a y los productos.
Derivacin de la ecuacin de Michaelis. P ara d eriv a r esta ecuacin, Mi
chaelis y M enten presu m iero n que la velocidad de disociacin del complejo
es tan pequea que no p ertu rb a significativam ente el equilibrio e n tre la e n
zima y el sustrato. P osteriorm ente, Briggs y H aldane extendieron esta idea
y derivaron una ecuacin p ara condiciones de equilibrio dinmico, es decir,
cuando la velocidad de disociacin del complejo es la m ism a que su velocidad
de formacin d u ran te el perodo en que se hacen las mediciones.
Este supuesto m s general se hace en la derivacin siguiente.

El proceso total puede rep resen tarse por la ecuacin general:
E + S J" ES > E + Productos,

( e ^ - p ) (s) k-' (p)
donde e = concentracin de la enzim a (E), s = concentracin de sustrato (S),

p = concentracin del complejo enzim a-sustrato (ES) y k+j , k 2 , k_ j =
constantes de velocidad. La concentracin del sustrato libre se considera igual
a su concentracin total, ya que la cantidad que se en cu en tra ligada en el com
plejo es generalm en te pequea.
La velocidad de form acin de ES = k+ , (e p)s.
La velocidad de disociacin de ES = i p + k +2p.
Bajo condiciones de equilibrio dinmico, la velocidad de form acin = la velo
cidad de disociacin, as que:
k +i ( e - p ) s = (fe_, + fe+ 2)P-
Reagrupando esta ecuacin tendrem os:

es
P ~ + (*_, * k +2)/(k+1)
La velocidad de la reaccin enzim tica est dada por v = k +2p, as que:
k+2es
s + (k-\ + k+2 )/(k+ )
C uando toda la enzim a est p resente en form a de complejo, se obtiene

entonces la velocidad m xim a posible la cual est dada por V = fc+2 e. Si se
reem plaza la expresin (k_ , + k+ 2 )/(fe+1) por K m, entonces la ecuacin se
transform a en:
Vs y
v = --------- o v = ------------
s +Km 1 + K m /s
Estas expresiones pueden reagruparse para obtener la form a usual de:
( V - v ) ( K m + s) = VKm .
Enzimas 239
Las constantes cinticas K my V. S is = K m, entonces v = V/2, por lo tanto, la

constante de M ichaelis es la concentracin de su strato a la cual se obtiene la
m itad de la velocidad m xim a.
Si se dan las condiciones de equilibrio sugeridas por M ichaelis y M enten,
entonces k+ 2 es pequea en com paracin de k+ ! y puede ser ignorada. Por lo
tanto, K m = k i/k+ i , y es la constante de disociacin del com plejo enzim a-
sustrato. Una K m grande implica, por tanto, u n a constante de disociacin
grande o una constante de asociacin pequea (1/K m). Al contrario, una K m
pequea im plica u n a constante de disociacin pequea o una constante de
asociacin grande (1 /K m). La constante de M ichaelis da por lo tanto una
medida de la afinidad enzim a-sustrato.
K m grande = baja afinidad enzim a-sustrato.
K m baja = alta afinidad enzim a-sustrato.
Las constantes cinticas K m y V pueden d eterm in arse m s conveniente
m ente utilizando una transform acin lineal de la ecuacin de Michaelis, que
se obtiene tom ando recprocos:
v V V s'
El grfico de 1/u contra 1/s da u n a lnea recta cuya p endiente es K m/V (figura
9.4 (a)). Los recprocos de las constantes cinticas pueden d eterm in arse de los
interceptos con los ejes ya que cuando
1 1 1
= 0,
s v V
y cuando
-=0 1- 1
v s Km
Una form a a ltern a de h acer el grfico es h acer la curva de s / v en funcin de

s (figura 9.4 (b )). Esto se obtiene m ultiplicando la ecuacin de los recprocos
por s.
S _ S Km
v V V
cuando
s = 0, s_= K*
v V
K
''m
s
(a) (b)
Figura 9.4 D eterm inacin de la constante de Michaelis
y cuando - = 0, s =- K m.
v
El grfico de ( 1 / v ) en funcin de ( 1 / s ) se conoce como el grfico de Linew ea-

ver-B urk y es el m todo que se usa m s frecu en tem en te p ara calcular K m. Sin
em bargo, la pendiente de la lnea depende m ucho de las actividades m edidas a
bajas concentraciones de sustrato, que son las m enos exactas, y por tal razn
se debe p re fe rir el grfico de ( s / v ) en funcin de s.
Validez de la ecuacin de Michaelis. La m ayora de las enzim as dan una
hiprbola rectan g u lar cuando se hace el grfico de v en funcin de s lo cual
concuerda con la teora de M ichaelis-M enten. Hay, sin em bargo, excepciones
que se tra ta r n posteriorm ente en la seccin de enzim as alostricas. P ara la
derivacin de la ecuacin de M ichaelis se tiene que p a rtir de u n n m ero
grande de supuestos que pueden no ser siem pre vlidos. Estos supuestos son
los siguientes:
1. Se form a u n com plejo e n tre la enzim a y el sustrato que se disocia p ara
dar los productos.
2. Slo u n ligando se u n e a la enzim a, concretam ente el sustrato. Se
ignoran las coenzimas, inhibidores y activadores.
3. Se obtiene rp id am en te u n equilibrio dinm ico y este s m antiene
d u ran te el tiem po de la medicin.
4. La cantidad de sustrato unido es m uy pequea, de m an era que la
concentracin de sustrato libre es la m ism a que la concentracin total
de sustrato presente.
5. La cantidad total de la enzim a p resente es la sum a de la enzim a libre y la
enzim a unid a al sustrato en el com plejo ES.
Enzimas 241
EXPERIMENTO 9.4 D eterm inacin de la constante de Michaelis para la

digestin de casena m ediante la tripsina (3A.4.4.)
Fundamento
La constante de Michaelis, de cualquiera de las enzim as que se tra ta n en este
libro, puede ser determ in ad a m idiendo la actividad a diferentes concentra
ciones de sustrato, pero la determ inacin de tripsina es especialm ente
adecuada, ya que su ensayo se hace por titulacin y puede realizarse
convenientem ente con grupos de alum nos bastante grandes.
La tripsina es una enzim a que se en cu en tra en el jugo pancretico y que
cataliza la hidrlisis de los enlaces peptdicos que se form an con los grupos
carboxilo de los am inocidos bsicos L-arginina y L-lisina. A m edida que la
digestin avanza, se liberan grupos amino, de m an era que la reaccin puede
seguirse determ inando el in crem ento en el n m ero de grupos am ino, usando
la titulacin con form aldehdo.
El form aldehdo reacciona con .los grupos am ino originando compuestos
de metilol y liberando H +. La solucin se hace m s cida y la cantidad de lcali
que se requiere para n eu tra liz ar el increm ento en acidez da u n a m edida de la
cantidad de grupos am ino formados. El form aldehdo te rm in a tam bin en
forma efectiva la reaccin, pues modifica la protena enzim tica evitando as
cualquier actividad posterior.
- n h 3+ + h *c h o 4= = -N H -C H 2OH + H+
-N H -C H 2OH + H-CHO + = -N (C H 2OH)2
Materiales 100
1. Solucin de casena (40 g/1, pH 8.5). (Disuelva 40 g de 61
casena en aproxim adam ente 900 mi de agua que contenga
20 mi de hidrxido de sodio 1 mol/1. Agite la suspensin
continuam ente y caliente suavem ente hasta que se
disuelva. F inalm ente, aju ste el pH a 8.5 con H C 11 mol/1 y
com plete hasta 1 litro eon agua).
2. Tripsina (40 g/1). Se puede usar tripsina cruda prep arad a 11
a p a rtir de pncreas.
3. Solucin de form aldehdo (400 g/1). 21
4. Fenolftalena (2.5 g/1 en alcohol). 200 mi
Las cantidades han sido calculadas bajo el supuesto de que ste es un ejercicio
de grupo en el cual varias parejas reciben u n a m ism a concentracin de
casena.
Mtodo
Se recom ienda, m uy especialm ente, realizar u n a p ru eb a piloto por las p e r
sonas a cargo del laboratorio, antes de llevarlo a cabo con los estudiantes,
para buscar la actividad m s conveniente de la trip sin a p ara el tiem po de
incubacin, y d ilu ir la preparacin enzim tica si es necesario.
Mida 5 m i de form aldehdo en seis m atraces pequeos, agregue a cada uno
u n a gota de fenolftalena e hidrxido de sodio 0.1 mol/1 hasta obtener u n a
coloracin ligeram en te rosada y uniform e en todos ellos.
Mida 100 m i d la solucin de casena en u n tubo cnico y colquelo en u n
bao de agua a 37 C d u ran te 10 m inutos. C aliente la solucin de tripsina a
37 Q, pipetee 10 m i de la casena y m ezcle vigorosam ente. A note cuidadosa
m ente el tiem po. Tom e inm ed iatam en te 10 m i de la m ezcla y colquela en
uno de los frascos que contiene form aldehdo. A gregue u n a gota de la solu
cin de fenolftalena por cada m ililitro de la m ezcla reaccionante y titu le con
hidrxido de sodio 0.1 mol/1 hasta que aparezca u n color rosado plido estable.
Un poco antes de obtener el p u nto final, agregue u n a gota e x tra del indicador
por cada m ililitro de hidrxido de sodio que se haya consumido. Saque otras
m uestras de 10 m i de la m ezcla de digestin a 2, 4,6,8 y 10 m inutos y trtelas
exactam ente en la m ism a form a. El color final debe se r el m ism o en todos los
casos. Haga u n grfico del increm ento en e l volum en de titulacin en funcin
del tiem po y d eterm in e la velocidad inicial de la reaccin.
P rep are soluciones de casena de 5, 10, 15, 20 y 30 g/1 y d eterm in e la
actividad a cada u n a de las concentraciones de sustrato. Usando sus resu lta
dos, haga un grfico de v en funcin de s, l / v en funcin de 1/s y s /v en funcin
de s, y d eterm in e los valores de V y K m.
Enzimas alostricas
Efecto del sustrato. A lgunas enzim as dan u n a cu rv a sigmoidea cuando se
hace un grfico de la actividad en funcin de la concentracin del sustrato
(figura 9.5) y no obedecen a la cintica de M ichaelis-M enten. Estas enzim as
estn com puestas de subunidades y contienen m s de u n sitio activo por
molcula. La curv a sigmoidea de v en funcin de s puede explicarse sobre la
base de que cuando u n a m olcula del sustrato se u n e a la enzim a, ocurre u n
cambio conform acional en la m olcula responsable de que la siguiente
m olcula de sustrato se u n a m s fcilm ente. La velocidad de unin del
sustrato depende, por lo tanto, del n m ero de sitios activos ocupados en
determ inado m om ento por las m olculas del sustrato. A pesar de que la
hem oglobina no es u n a enzim a se puede u sar como u n buen ejem plo de u n a
protena alostrica q u e posee cuatro sitios de unin p ara el oxgeno. La
facilidad relativa con que se u n en los tomos d e oxgeno del prim ero al cuarto
es del orden de 1:4:24:9.
Control metablico. Las enzim as alostricas tien en sitios especficos para la
unin de activadores e inhibidores los cuales pueden actu ar causando un
Enzimas 243
Actividad
enzimtca,
Figura 9.5 Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad

de una enzim a alostrica
cambio en la conform acin de la protena. Esto p erm ite a los com puestos que
no estn qum icam ente relacionados con el sustrato u n irse a la enzim a y
afectar su actividad. P or tanto, las enzim as alostricas se en co n trarn en
muchos puntos de control m eta blico. Por ejem plo, el citrato es u n inhibidor
alostrico de la fosfofructocinasa, u n a enzim a clave en el control de la gli-
chsis, as que, cuando el citrato se acum ula en el ciclo de los cidos tricar-
boxlicos, la velocidad de la gliclisis dism inuye p ara ev itar la acum ulacin
de interm ediarios del m ism o ciclo. P or el contrario, AM P y A D P son acti
vadores alostricos de la fosfofructocinasa, as que cuando la concentracin de
ATP es baja (ADP y AMP altos), la velocidad de la gliclisis aum enta.
Cintica alostrica. La derivacin de u n a ecuacin exacta p ara la curva

sigmoidea de las enzim as alostricas es complicada, pero se puede obtener
una ecuacin sim plificada en la form a sugerida por A tkinson, si se hacen los
siguientes supuestos:
1. Los interm ediarios ES, ES2, ES3, etc., tien en slo u n a existencia tran si
toria.
2. El equilibrio e n tre la enzim a y las m olculas de sustrato se obtiene
rpidam ente.
Si hay n sitios de unin para el sustrato S, entonces:
E + nS <-*->
K- i
ES E + Productos.
Suponiendo condiciones de equilibrio,

reordenando,
K[ ES]
(9-1)
[S]
Ahora, si la cantidad total de enzim a presen te es [E0], entonces:
[E0 ] = [E] + [ES ],
y reordenando,
[E] = [E0] [ES ].
M ultiplicando por fc3:
* a[E ] =fe3 [E0] k 3 [E S ]. (9-2)
A hora
u = k 3[ESn ] (9-3)
y
V = k 3 [E0 ]. (9-4)
S ustituyendo (9-3) y (9-4) en (9-2) se obtiene:
ME]=V-tf. (9-5)
S ustituyendo (9-1) en (9-5) tenem os:
k 3K[ ESn ]
V-v (9-6)
[S]"
Sustituyendo (9-3) en (9-6):
Kv \
V v =
[S]"
[S ]n
(9-7)
.V-v K
Enzimas 245
Reordenando la ecuacin,
V [S]n
(9-8)
V ~ K + [S]"
Si hay u n solo sitio de un i n p ara el sustrato (n = 1), entonces esta ecuacin se

transform a en la ecuacin de Michaelis y se obtiene u n a curva hiperblica.
Constantes cinticas. Se puede obtener una transform acin lineal fcil de
usar tom ando los logaritm os de la Eq. (9.7). Las constantes cinticas se pueden
calcular a p a rtir del grfico de lnea recta (figura 9.6).
log v / ( V v) = rclog [S] log K
n da el n m ero de sitios de unin si los supuestos originales son correctos,

pero en la prctica n es usualm ente m enor, puesto que la existencia de
interm ediarios no es transitoria, n puede ser considerado como el grado de
cooperatividad: a m edida que se in crem enta el valor de n, el grfico v con
respecto a [S] se hace m s sigmoideo.
K es en la prctica u n a constante de equilibrio dinm ico complicada, y pa
ra las enzim as alostricas, cuando [S] = K, v no es V/2; pero, cuando v = V/2,
podemos obtener a p a rtir de la Eq. (9.7):
2 [S ] = K.
Figura 9.6 D eterm inacin de las constantes cinticas para

una enzim a alostrica
Por consiguiente, la concentracin de su strato que da el 50% de la actividad

m xim a se relaciona con la constante K en la siguiente form a:
K = [ S ]? 0
o, usando logaritm os,
lo g = n lo g [S ]s0
EXPERIMENTO 9.5 Deshidrogenasa isoctrica de levadura: una enzim a alos-

trica*
Fundamento
La deshidrogenasa isoctrica de levadura cataliza la conversin de L-iso-
citrato a a -cetoglutarato y dixido de carbono usando NAD como coenzima.
Este es un punto de control fu n d am en tal en el ciclo del cido tricarboxlico
que puede ser modificado por u n n m ero de efectores incluyendo NAD,
AMP y M g+*. La actividad enzim tica se m ide siguiendo el in crem ento en
extincin a 340 nm a m edida que el NAD se reduce a NADH2.
COCT COCT
L-Isocitrato a-C etoglutarato
Materiales 10
1. L evadura fresca de panadera. 150 g
2. A ren a lavada.
3. Bicarbonato de sodio (0.1 mol/1). 200 m i
4. A m ortiguador de tris-H C l (30 mm ol/1, pH 7.4). 500 m i
5. D, L-isocitrato de sodio en am ortiguador de tris, pH 7.4. 200 m i
6. NAD (2 m m ol/1) en am ortiguador de tris, pH 7.4. 250 m i
7. AMP (3 m m ol/1) en am ortiguador tris, pH 7.4. 50 m i
8. MgCl2 (0.1 mol/1). 50 m i
9. M orteros y m anos de m ortero. 5
10. Espectrofotm etros ultravioleta con rgistrador. 5
* Con permiso del Dr. P. J. Butterworth.

Enzimas 247
Mtodo
Preparacin de la enzim a. Usando u n m o rtero y u n a m ano de m ortero,
prepare un extracto crudo de la enzim a m oliendo lev ad u ra fresca con arena
lavada y solucin de bicarbonato de sodio (0.1 mol/1). La pared celular de la
levadura es m uy resisten te y se necesita m olerla m u y bien p ara que se rom pa.
La proporcin de levadura y aren a se ajustan en form a tal que haya suficiente
arena para dar un m xim o de accin abrasiva y suficiente bicarbonato p ara
que la enzim a que se libera pueda disolverse. La m olienda req u ie re prctica y
se aconseja que un m onitor p rep are el extracto fresco p ara la clase;
Despus de m olerla, tran sfiera la mezcla a tubos de centrfuga y rem u ev a
la arena y las partculas celulares grandes centrifugando a 1000 g d u ra n te 10
minutos. Recoja el sobrenadante y vuelva a cen trifu g ar a 30 000 g d u ran te
1 hora. D escarte el precipitado y alm acene el sobrenadante sobre hielo
hasta que se necesite.
Determinacin de la enzim a. P re p a re una serie de tubos que contengan las
siguientes mezclas de reaccin e incube a 37 C d u ran te 10 m inutos.
NAD (2 m m ol/1) 1.5 m i

MgCl2 (0.1 mol/1) 0.1 mi
Enzim a diluida 0.2 mi
La cantidad de enzim a necesaria debe d eterm in arse p rev iam en te y si la

preparacin es m uy activa debe diluirse con am ortiguador de tris.
Comience la reaccin aadiendo 1.2 m i de sustrato prev iam en te incubado
a 37 C y siga el in crem ento en extincin a 340 nm . Incluya los blancos y
controles apropiados p ara corregir el efecto de reacciones no enzim ticas.
Experim ento. Mida la actividad de la enzim a a diferentes concentraciones
de sustrato desde 0.11.2 mmol/1. Esto se obtiene com enzando la reaccin
con 0.1 a 1.2 m i de sustrato y aadiendo am ortiguador tris hasta que el volu
m en final aadido sea 1.2 mi. Se usa como sustrato u n a m ezcla de las form as
L y D y por consiguiente la concentracin de L-isocitrato v ara de 0.05 a 0.6
mmol/1.
Repita el experim ento pero ah o ra incluya AM P en la m ezcla reaccionante
para obtener concentraciones finales de este m etabolito de 0.2 mm ol/1 y 0.5
mmol/1.
Exprese la actividad enzim tica en trm inos de nanom oles de NAD
reducido por m inuto y p rep are grficos de v con respecto a [S], / v con
respecto a 1/[S ] y log v / ( V - v) con respecto a log [S].
Si el tiem po lo perm ite, rep ita el experim ento an terio r despus de calentar
la enzim a a 60 C d u ran te 5 m inutos. O tro ex perim ento posible consiste en
exam inar el efecto de la concentracin de Mg++ sobre la reaccin.
COENZIMAS Y ACTIVADORES
H ay m uchos casos en que si se mezcla u n a enzim a con su sustrato bajo
condiciones apropiadas, o no hay catlisis o se obtiene slom uy poca actividad.
Esto se debe frecu en tem en te a la ausencia de u n a coenzim a o activador.
Coenzimas
Son com puestos orgnicos de bajo peso m olecular que participan activam ente
en la catlisis. Con frecuencia actan como aceptares o donadores de grupos
qum icos especficos. P o r ejem plo, NAD acepta y dona tomos de hidrgeno y
es una coenzim a p ara m uchas de las dehidrogenasas. El n o m b re coenzim a se
da a cofactores solubles, m ien tras que el trm ino, grupo prosttico, se reserv a
para coenzimas que estn fu erte m en te unidas a la protena.
Activadores
Son com puestos de n atu raleza qum ica sim ple y no son tan especficas como
las coenzimas. P arece que actan activando el com plejo enzim a-sustrato. Se
sabe que m uchos de los iones m etlicos son activadores de u n a gran variedad
de enzimas; por ejem plo, Mg++, como en el ex p erim en to 9.7.
EXPERIMENTO 9.6 N icotinam ida adenina dinucletido como coenzim a de la

deshidrogenasa lctica (L-lactato: N AD oxidorreductasa, 1.1.1.27).
Fundamento
M uchas de las oxidaciones biolgicas se efectan m ediante la rem ocin de
hidrgeno que es transferido a u n aceptor tal como NAD. La enzim a y el
sustrato pueden estar presentes en la m ezcla reaccionante, pero la reaccin
no se efecta sin la coenzima. El piruvato form a u n com puesto de hidrazona
altam ente coloreado con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNP), m ien tras que los
otros com puestos de la m ezcla de reaccin no absorben a la longitud de onda
usada en el ensayo. La cantidad de piruvato tran sfo rm ad a en lactato puede ser
medida. Se prep aran dos tubos de ensayo en duplicado, uno con NADH2y el
otro sin ella.
CH3CO-COOH + NADH2 CH3CH(OH)COOH + NAD

Piruvato Lactato
Materiales 100
1. A m ortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/1), pH 7.4. 11
2. Piruvato de sodio. D isuelva 0.5 g en 100 m i de am orti- 500 mi
guador de fosfato. El sustrato am ortiguado se p rep ara
diluyendo la solucin a n terio r 1 a 50 con am ortiguador,
para d ar una concentracin de 10Mg/ml.
Enzimas 249
3. N icotinam ida adenina dinucletido reducido (10 m g/m l). 20 mi

Se p rep ara antes de u sarla en am ortiguador de fosfato.
4. 2,4-dinitrofenilhidrazina (2 mmol/1). D isuelva 40 mg 500 m i
en 9 m i de cido clorhdrico concentrado y com plete
con agua hasta 100 mi.
6. D eshidrogenasa lctica. Se puede usar en suero o u n a 50 mi
dilucin apropiada de enzim a com ercial p rep arad a a
p artir de m sculo de conejo.
Mtodo
P repare cuatro tubos de ensayo en duplicado en la form a como se indica
enseguida y equilibre a 37 C.
Muestra Muestra Blanco (B) Control (C)

(M 1) (M 2)
Sustrato en am ortiguador
(mi) 1 1 1
Amortiguador de fosfato
(mi) 0.1 1.1 0.2
NADH2 (m i) 0.1
Se aade 0.1 m i de la enzim a a todos los tubos excepto al control. Despus

de incubar por 15 m inutos, se agrega 1 mi de DNP a todos los tubos y se les
deja reposar por 20 m inutos a te m p eratu ra am biente. Se desarrolla el color
m ediante la adicin de 10 m i de hidrxido de sodio. D espus de 10 m inutos,
se lee la extincin a 510 nm contra u n blanco de agua.
Clculos
El tubo de control contiene 10 Mg de piruvato, as que la cantidad de piruvato
convertida en 15 m inutos est dada por:
control m u estra
-------------------------- x 10 ue.
control blanco
EXPERIMENTO 9.7 Activacin de la fosfatasa alcalina de intestino de ternero

por iones de magnesio
Fundamento
La fosfatasa alcalina es activada por iones divalentes incluyendo Mg++, Mn++,
Zn++, Co++, pero el efecto se obtiene especialm ente con Mg++ . La concentra
cin de Mg++ p ara ob ten er la m xim a activacin es u n poco alta, alrededor de
5 mmol/1, y por tal razn se ha sugerido qu la sal de m agnesio del ster de

fosfato sea el verdadero sustrato.
Materiales y mtodos
Los m ateriales y m todos usados son los mism os del experim ento 9.2, excepto
que la enzim a de intestino de te rn e ra se usa en lugar de suero y tam bin se
necesita MgCl2.
Diluya la enzim a de te rn e ra hasta obtener u n a actividad conveniente para
el ensayo con 10 m m ol/1 MgCl2, luego p rep are u n a serie de tubos con
diferentes concentraciones de MgCl2 desde 0 hasta 10 m m ol/1 y d eterm in e la
actividad. P rep are u n grfico de la actividad en funcin de la concentracin de
MgCl2.
INHIBICION ENZIMATICA
Tipos de inhibicin
Muchos com puestos reaccionan con las enzim as produciendo u n a dism inu
cin en su actividad. Esta propiedad de las enzim as es usada p ara d isear
drogas e insecticidas que inhiban selectivam ente ciertas enzim as en la
bacteria o insecto infectante, pero que no afecten a los anim ales o las plantas.
Los dos principales tipos de inhibicin son: com petitiva y no com petitiva.
Inhibicin com petitiva. En este caso el inhibidor reacciona con la nzim a
com pitiendo con el sustrato por el sitio activo. El grado de inhibicin depende
de las concentraciones relativas del su strato y del inhibidor, y se puede
prcticam ente ob ten er la velocidad m xim a en presencia del inhibidor
cuando la concentracin del sustrato es su ficien tem en te alta.
O casionalm ente, la inhibicin es irrev ersib le y el sustrato no puede
desplazar el inhibidor ligado a la enzim a. Este es el caso de algunos inhibidores
organo-fosforados de la colinesterasa. La inhibicin com petitiva se puede
observar cuando el inhibidor se u n e a u n lu g ar suficientem ente cercano al
sitio activo para d ism in u ir la afinidad de la enzim a por el sustrato.
Los inhibidores com petitivos tienen estru ctu ras qum icas sem ejantes al
sustrato n atu ra l y son bastante especficos. Esto puede ilu strarse para el caso
de la enzim a succnico deshidrogenasa, la cual cataliza la conversin de
succinato a fum arato. El m alonato y el m aleato actan como inhibidores
competitivos de esta enzim a.
CHCOOH
II + fadh2
HOOCCH
Sustratos: Succinato Fum arato
Enzimas 251
COOH CH-COOH
I I
ch2 CH-COOH
OOH
Inhibidores: Acido m alnico Acido m alico
Inhibicin no com petitiva. En la inhibicin no com petitiva, el inhibidor se

combina con la enzim a pero no en el sitio activo, de m a n era que la enzim a
puede ligarse al sustrato y al inhibidor al m ism o tiem po. El sitio de unin del
inhibidor est generalm en te lejos del sitio activo, por lo cual no afecta la unin
del sustrato. El com plejo enzim a-sustrato-inhibidor no puede disociarse y la
inhibicin ocurre por dism inucin de la cantidad de enzim a disponible. El
aum ento en la concentracin de sustrato no tien e efecto sobre el grado de
inhibicin.
La m ayora de los inhibidores no com petitivos no estn relacionados
qum icam ente con el sustrato y el mism o inhibidor puede afectar varias
enzimas.
E n tre los ejem plos de inhibicin no com petitiva tenem os la accin de los
agentes que bloquean los grupos tioles tales como el p-clorom ercuribenzoato,
los iones de m etales pesados como Ag ++y Cu++, y la reaccin del cianuro con
las enzim as que contienen hierro-porfirina.
Determinacin de las constantes de inhibicin (K). En presencia de un
inhibidor, la ecuacin de M ichaelis-M enten vara tal como se m u estra a
continuacin, donde i es la concentracin del inhibidor y K la constante de
inhibicin.
Sin inhibidor, - _ _ Z _ _
1 +( Km /s)'
V_______
Inhibidor com petitivo,
1 + K m /s (l + i/K)
Inhibidor no com petitivo
_ V_______
y_ (1 +Km/s)(l + i/K-S
Tomando los recprocos d la ecuacin:
Sin inhibidor, 1^1 +Enl

v V V s'
t 1 1 Km i \ 1
Inhibidor com petitivo, = + ---- 1 1 + .
v V V \ K js
Inhibidor no com petitivo, =l \ + \ ( \ + \ .

v V\ KJ V i K,/s
Un grfico de (1/u) en funcin de (1/s) puede usarse p ara d eterm in a r K, y el

tipo de inhibicin en la form a como se indica abajo (figuras 9.7 y 9.8). Un
inhibidor com petitivo altera el K m m ientras que el no com petitivo origina un
cambio en V.
V
Vx = ------------
(1 + i/K,)
V y K m se d eterm in an en ausencia y en presencia de un inhibidor y como se
conoce i, el K se puede calcular fcilm ente.
O tra form a til de d eterm in a r y el tipo de inhibicin consiste en m edir
la actividad de la enzim a a concentraciones fijas de su strato variando las
concentraciones del inhibidor. Se hace un grfico de (u/u) en funcin de i,
donde v es la actividad en ausencia del inhibidor y v la actividad en presencia
de inhibidor en u n a concentracin (i). Se rep ite el experim ento usando
diferentes concentraciones de sustrato y se com paran los resultados.
Kx *
Figura 9.7 Efecto de un inhibidor competitivo sobre la presentacin
de Lineweaver-Burk
Enzimas 253
1 O
Figura 9.8 Efecto de un inhibidor no com petitivo sobre

la representacin de L inew eaver-Burk
v
Para un inhibidor no competitivo: = 1 + .
vi K
v
Para un inhibidor competitivo: = 11 +
^ --------- x
Vi s +K m K
Tal como se puede apreciar de las ecuaciones anteriores, el grfico de

f u / ) en funcin de i para el caso de la inhibicin no competitiva es indepen
diente de la concentracin de sustrato s, mientras que la pendiente para el tipo
de inhibicin competitiva es dependiente de s. Este mtodo es especialmente
til si se tiene dos sustratos y se desea saber si una misma enzima acta sobre
ambos. Se puede absolver esta pregunta introduciendo un inhibidor no
competitivo puesto que en un grfico fu/Vi) en funcin de i, los puntos
debern aparecer sobre la misma lnea si la enzima acta sobre los dos
sustratos.
En la prctica, se obtienen otros tipos de inhibicin diferentes de los casos
simples considerados ac.
EXPERIMENTO 9.8 E f e c t o d e lo s i n h i b i d o r e s s o b r e la d e s h i d r o g e n a s a l c tic a d e

corazn d e b u e y
Fundamento
La deshidrogenasa lctica cataliza la reduccin reversible de piruvato a
lactato usando como coenzima NADH2. La coenzima reducida (NADH2)
adsorbe fuertemente a 340 nm, mientras que la forma oxidada (NAD) no
254 Bioquimica prctica
adsorbe a esta longitud de onda, y el avance de la reaccin puede seguirse

midiendo el descenso en la extincin a 340 nm usando piruvato como sustrato.
La teora de este mtodo se expuso ms extensam ente en el captulo 4.
En este experim ento se examinan dos compuestos que tienn estructura
similar al sustrato natural piruvato para ver si son inhibidores competitivos o
no competitivos.
ch 3 ch 3
1
C=0
j + NADH2* * H-C-OH +
cocr COO"
Sustratos: Piruvato L-lactato
OH
i nh 2
c= o y = o
COO' COO"
Inhibidores: Oxalato Oxamato
Materiales 10
1. Amortiguador de fosfato (0.1 mol/1, pH 7.4). 1 1
2. Piruvato de sodio (21 mmol/1, preprese fresco en 200 mi
amortiguador de fosfato).
3. NADH2 (3.5 mmol/1, preprese fresca). 25 mi
4. Deshidrogenasa lctica de corazn de buey, diluida en 100 mi
amortiguador de fosfato, si lo cree necesario.
5. Oxalato de sodio (3 mmol/1 en amortiguador de fosfato). 50 mi
6. Oxamato de sodio (15 mmol/1, en amortiguador de fosfato). 50 mi
8. Espectrofotmetros registradores. 5
Mtodo
E n s a y o i n i c i a l . Prepare la mezcla siguiente en duplicado y equilibre a 37 C
durante 10 minutos.
Componente mi
Amortiguador de fosfato 2.5
NADH2 (3.5 mmol/1) 0.1
Deshidrogenasa lctica de corazn de
buey (diluida) 0.3
Enzimas 255
Aada rpidamente 0.1 mi de la solucin de piruvato desodio preincubada

a 37 C, transfiera a una cubeta y observe el cambio de extincin a 340 nm en
funcin del tiempo, en un celda (calentada termostticamente) de un
espectrofotmetro ultravioleta. Diluya la preparacin enzimtica hasta
obtener en la regin un cambio de extincin de 0.05 - 0.10 por minuto.
Clculo de la actividad. Las actividades enzimticas se pueden expresar
adecuadamente en nanomoles por minuto por mililitro de enzima o en
nanomoles por minuto por miligramo de protena. El coeficiente de extincin
molar de NADH2 a 340 nm es 6.22 x 1031 m ol_1 cm -1 , as que una solucin de 1
jxm ol/m l tiene una absorcin de 6.22.
Para la mezcla de reaccin de 3 mi usados en la prueba,
Actividad enzimtica (jumol/min) '
= cambio en extincin por minuto /6.22 x 3.
Dado que se usaron 0.3 mi de la solucin enzimtica,
Actividad enzimtica (pmol min-1 mi-1 )
= Extincin por minuto /6.22 x 3 x 1.0/0.3
= Extincin por minuto x 1.61.
La actividad final se obtiene multiplicando por el factor de dilucin para
obtener micromoles por minuto por mililitro y dividiendo por la concentra
cin de protenas en miligramos por mililitro para dar micromoles por minuto
por miligramo.
Determinacin de la constante de Michaelis. Diluya la solucin de piruvato
de sodio diez veces y repita el experimento anterior usando volm enes desde
0.1 hasta 1.0 mi de sustrato para comenzar la reaccin. Ajuste el volumen
inicial del amortiguador usado en cada caso hasta obtener una mezcla de
reaccin de 3 mi. Calcule la actividad y haga un grfico de v en funcin de s,
\/v en funcin de 1/s y s /v en funcin de s, y determ ine K m y V.
Efecto de los inhibidores, (i) Repita el experimento anterior, pero esta vez
incluya 0.1 mi de inhibidor en la mezcla de reaccin, ajustando de nuevo el
volumen del amortiguador para dar un volumen final de 3 mi de mezcla de
reaccin. Haga un grfico de 1/v en funcin de 1/s y determ ine la constante de
inhibicin K . (ii) Repita el ensayo inicial pero esta vez determ ine la actividad
a dos concentraciones de sustrato fijas variando la concentracin del
inhibidor hasta llegar a concentraciones finales de 0.1 mmol/1 de oxalato y 0.5
mmol/1 de oxamato. Si u es la actividad en presencia del inhibidor y v es la
actividad en ausencia del inhibidor, haga un grfico de v /v i en funcin de i.
Use estos grficos para decidir el tipo de inhibicin dado por exalato y oxamato
y determine las constantes de inhibicin.
Concentraciones altas de sustrato. Examine el efecto de concentraciones al
tas de sustrato en un grfico de v en funcin de s y s/v en funcin de s. Esto se
logra usando volm enes hasta de 1 mi de piruvato de sodio 21 mmol/1 para

comenzar la reaccin enzimtica. Hay algo inesperado en los grficos? Si lo
hay, explique lo que ha observado.
TEMPERATURA Y pH
Efecto de la temperatura sobre las enzimas

La velopidad de una reaccin catalizada por una enzima, al igual que la
mayora de las reacciones qumicas, aumenta con la temperatura. Esto se
debe principalmente al efecto sobre las constantes de velocidad de las diversas
reacciones parciales que componen la reaccin total, tales como k + u k _ l t k + 2
y a la afinidad de la enzima por los cofactores, activadores, etc. Los valores de
pK de los grupos ionizables involucrados en la reaccin son tambin afectados
por la temperatura, pero dado que esto no es fcil de interpretar, no se
considerar detalladamente en este libro. A elevadas temperaturas, la pro
tena de la enzima se desnaturaliza dando como resultado una prdida de
actividad. Esto significa que la velocidad inicial de la reaccin aumentar con
la temperatura hasta que se haga prcticamente imposible de medir debido a
una inactivacin casi inmediata. En la prctica, la mayora de las enzimas son
completamente inactivadas por encima de los 70 C.
Sin embargo, si la actividad de la enzima es medida incorrectamente
determinando la cantidad de sustrato transformado en un tiempo dado a
temperaturas diferentes, se puede obtener la as llamada temperatura
ptima (figura 9.9).
Figura 9.9 Temperatura ptima (T) de

una enzima
Enzimas 257
Estado de
Figura 9.10 Diagrama de energa de la reaccin A -* B en presencia

(--------- ) y ausencia (------- ) de una enzima
Esta temperatura ptima es el resultado de un balance entre el

incremento en la actividad y la velocidad de destruccin de la enzima. La
temperatura ptima no es un valor constante para una enzima dada, sino
que depende del tiempo durante el cual se hace la medicin de la actividad.
Entre ms corto sea el tiempo de medicin, ms alta ser la temperatura
ptima aparente.
Efecto de la tem peratura sobre la reaccin enzimtica. Las molculas deben
poseer cierta energa de activacin ( E ' ) para que puedan reaccionar, y las
enzimas actan como catalizadores disminuyendo la energa de activacin
(E), permitiendo que la reaccin avance ms rpidamente (figura 9.10). El
cambio total en la energa libre (AG) permanece inalterado.
La energa de activacin puede determinarse midiendo la velocidad
mxima a diferentes temperaturas y haciendo un grfico de log10 V en
funcin de 1IT. La pendiente de la lnea est dada por E/2.303 R. Esta relacin
se obtiene a partir de la ecuacin emprica de Arrhenius:
................. .............. ......................................... !
se obtiene Integrando esta ecuacic
log! o k = C -E /2 .3 0 3 R T ,
donde C = una constante, k = constante de velocidad de la reaccin,

T = temperatura absoluta, R = constante de los gases (8.32 x 1 0 ~3 J m ol-1
K-1 ), E = energa de activacin (J/m ol).
No es siempre fcil obtener la constante de reaccin pero, dado que la
velocidad mxima es directamente proporcional a k, esta actividad se expresa
usualmente en un grfico en funcin del recproco de la temperatura.
La ecuacin de Arrhenius es semejante a la ecuacin derivada de la teora
de las velocidades absolutas de reaccin:
dlnft/dT = (AH + R T )/R T 2.
De esta ecuacin se deduce que la energa de activacin es igual a E -A H +RT,

donde AH es el calor de activacin o entalpia de la reaccin.
Efecto de la temperatura sobre la protena enzimtica. Se puede determinar
fcilmente este efecto exponiendo la enzima a temperaturas altas y midiendo
luego la actividad a una temperatura a la que la enzima es estable. Esto nos
dice la cantidad de enzima que ha sido destruida. Se hace un grfico del
cambio de la actividad enzimtica en el tiempo a cada una de las tempe
raturas. La velocidad inicial v se obtiene a partir de este grfico, el cual se
repite a diferentes temperaturas. La energa y por lo tanto el calor de la
inactivacin, puede ser obtenida como se describi anteriormerite a partir de
un grfico de log10 v en funcin de 1/T. El calor de inactivacin AH es
generalmente bastante alto como resultado del cambio considerable en la
entropa, debido a la apertura y desenrollamiento de la molcula de protena
durante la desnaturalizacin.
EXPERIMENTO 9.9 Determinacin de la temperatura ptima para laoc-ami-
lasa
Fundamento
Lao-amilasa cataliza la hidrlisis de los enlaces a 1-4 del almidn produ
ciendo azcares reductores. La reaccin puede seguirse midiendo el incre
mento en azcares reductores mediante el reactivo 3,5-dinitrosalicilato en
solucin alcalina de cido 3,5-dinitrosaliclico que se reduce a cido 3-amino-
5-dinitrosaliclico produciendo una coloracin que se mide a 540 nm.
Se recomienda que este experimento y el prximo se efecten como
proyectos opcionales debido a que implican un gran nmero de mediciones.
Las cantidades requeridas se calculan asumiendo que cada pareja ensayar
por duplicado solamente a una temperatura.
Materiales 100
1. Amortiguador de fosfato de sodio o de potasio (0.1 mol/1, 51
pH 6.7).
2. Solucin de almidn en amortiguador (5 g/1 en amor- 31
tiguador de fosfato. Mezcle 5 g de almidn soluble con
Enzimas 259
50 ml de amortiguador hasta obtener una pasta blanda.

Agregue 500 mi de solucin de amortiguador de fosfato
hirviendo, contine la ebullicin por 1 minuto, enfre
luego a temperatura ambiente y diluya a 11 con solucin
de amortiguador).
3. Cloruro de sodio (10 g/1). 11
4. a-amilasa convenientem ente diluida. 11
6. Colormetros. 50
7. Baos de agua a temperaturas hasta de 75 C. 30
8. Tartrato sdico potsico. (Disuelva 300 g de la sal en 500 mi
cerca de 500 mi de agua).
9. Acido 3,5-dinitrosaliclico. (Disuelva 10 g de este reactivo 200 mi
en 200 mi de hidrxido de sodio 2 mol/1).
10. Reactivo de dinitrosalicilato. (Prepare mezclando las 11
soluciones 8 y 9, y complete con agua hasta 1 1).
Mtodo
Prepare ocho tubos que contengan las siguientes mezclas reaccionantes:
Contenidos mi
Almidn (5 g/1) 2.5
Amortiguador de fosfato (0.1 mol/1, pH
6.7). 1.0
Cloruro de sodio (10 g/1) 0.5
Coloque los tubos anteriores y el tubo que contiene la enzima en un bao de

agua a una temperatura dada. Despus de 10 minutos agregue 0.5 mi de la
enzima a siete de los tubos anteriores y 0.5 mi de agua al blanco. Incube los
tubos durante 0, 5, 10, 15, 20, 30 y 40 minutos y pare la reaccin aadiendo
0.5 mi de NaOH 2 mol/1 a todos los tubos. Agregue 0.5 mi de reactivo de dini
trosalicilato y caliente los tubos durante 5 minutos en un bao de agua
hirviendo, enfre y lea la extincin a 540 nm contra un blanco. N o t a : los tubos
deben enfriarse a temperatura ambiente antes de tomar la lectura puesto
que la extincin es sensible a cambios de temperatura.
Haga un grfico de la extincin de cada solucin en funcin del tiempo de
incubacin y prepare una curva del progreso de la reaccin. Recoja los datos
de los otros grupos y haga con ellos un grfico del cambio en la velocidad
inicial de reaccin en funcin de la temperatura as como de la cantidad de
sustrato transformada por minuto a los 10 y a los 40 minutos en funcin de
la temperatura. Compare los grficos y explquelos.
Haga un grfico de log10 v en funcin de 1/T y determ ine el calor de
activacin. Qu supuestos se han hecho en este experimento?
Por conveniencia, la actividad puede expresarse en trminos de cambios

de extincin a 540 nm por minuto.
EXPERIMENTO 9.10 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la o-

amilasa
Materiales
Presumiendo que el experimento se efecta como proyecto de clase, los
reactivos y cantidades son los mismos utilizados en el experimento anterior.
Mtodo
Prepare una dilucin apropiada de a -amilasa en tal forma que se obtenga
una buena actividad cuando se incuba por 5 minutos a 37 C. Coloque la
enzima en un tubo pyrex e incube durante 10 minutos. Pipetee 0.5 mi de la
enzima en cuatro tubos de ensayo colocados en un bao de agua a tem pe
raturas fijas desde 50 hasta 75 C. Retire los tubos despus de 5, 10, 15 y 20
minutos, (u otros intervalos apropiados de tiempo) y enfre rpidamente
bajo agua corriente. Incube los tubos a 37 C y m ida la actividad enzimtica
despus de aadir el sustrato en la misma forma como se procedi en el
experimento anterior. La muestra se incuba durante 5 minutos y se deter
mina la actividad con 3,5 -dinitrosalicilato. As se puede determinar la velo
cidad de inactivacin de la enzima. Recoja los datos de los otros grupos que
han trabajado a otras temperaturas y prepare con ellos un grfico de la velo
cidad de inactivacin ( v ) en funcin de l / T , y determ ine el calor de inacti
vacin. Compare esta cifra con la obtenida para el calor de activacin en el
experimento anterior.
pH y actividad enzimtica
E l p H p t i m o . Las en zim a s son activas en u n in terv a lo lim itad o de pH
y u n grfico de la actividad en fu n ci n de pH da u n a cu rva en form a de
cam pana parecida a la q u e se m u estra e n la figu ra 9.11. El pH al cual se
o b tien e la actividad m x im a se con oce com o el pH ptim o y es
caracterstico d e la en zim a, siem p re y cuando esta sea esta b le e n las
condiciones ex p erim en ta les usadas.
Los cam bios de actividad con el pH se d eb en a cam bios e n el estado
de ion izacin de la p roten a en zim tica y de los otros co m p o n en tes de
la m ezcla de reaccin . M ich aelis y D avid soh n su g iriero n en 1911 q u e de
las d iferen tes form as de ion izacin d e la p roten a slo u n a es activa. A
valores d e pH por en cim a o por debajo d el pH p tim o d ism in u y e la
cantidad de esta form a y por lo tanto se p rod u ce u n a d ism in u ci n en la
actividad en zim tica.
K my V. Los cambios en el pH modifican la actividad enzimtica afectando V ,
K m , o la estabilidad de la protena enzimtica. La mayora de los grficos
Enzimas 261
Figura 9.11 pH ptimo de una enzima ilustrada con la

fosfatasa alcalina de rata
publicados de pH ptimos son resultados de cambios de V y K m y no sedes
puede dar un tratamiento matemtico adecuado. Tericamente los efectos del
pH sobre K m y sobre V deben ser estudiados por separado.
Estabilidad enzimtica. Si la enzima no es estable a ciertos valores de pH,
entonces el pH ptimo no es caracterstico de la enzima. La estabilidad puede
verificarse exponindola a diferentes valores de pH durante un tiempo igual
al del experimento, ajustando luego la solucin a un pH en el cual la enzima es
estable y midiendo luego la actividad.
EXPERIMENTO 9.11 pH ptimo de una enzima

Materiales y Mtodos
Determine el pH ptimo de la fosfatasa alcalina o de la a -amilasa usando los
materiales y el mtodo descrito en los experimentos 9.2 y 9.9. Para la fosfatasa
alcalina use amortiguadores de bicarbonato-carbonato de sodio 0.1 mol/1 en
un intervalo de pH de 9 a 11 y prepare una curva patrn para cada valor de pH.
En el caso de la a-amilasa, utilice amortiguador de fosfato sdico o potsico en
intervalos de pH entre 5.8 y 8.0.
AISLAMIENTO DE UNA ENZIMA

Un gran nmero de enzimas han sido purificados parcialmente y muchas han
sido obtenidas en forma cristalina. A continuacin se da un ejemplo de los
muchos encontrados en la literatura.
EXPERIMENTO 9.12 Separacin de muramidasa (mucopptido N -acetilmura-

mil hidrolasa, 3.2.1.17) a partir de la clara de huevo
Fundamento
La enzima es un agente antibacteriano potente y acta catalizando la
hidrlisis de los enlaces |31-4 entre el cido N-acetil murmico y la N-acetil-
glucosamina presentes en el mucopptido de las paredes celulares. Esta
propiedad particular constituye la base del mtodo de ensayo en el que la
enzima se mezcla con una suspensin turbia de bacterias liofilizadas. A
medida que la hidrlisis se va llevando a cabo, la turbidez de la suspensin
disminuye y esto puede seguirse fcilmente en un espectrofotmetro a 450
nm.
CH2 OH CH,OH
N-aeetilglucosamina Acido N-acetilmurmico
La muramidasa tiene un peso molecular bajo (14 300) y un punto

isoelctrico alto (pH 10.5); esta ltima propiedad se usa para separar la enzima
de otras protenas.
La muramidasa se conoce tambin con el nombre de lisozima, pero se
recomienda el uso del primer nombre en lugar del segundo.
Material** 10
1. Huevos de gallina. 15
2. Muselina.
3. HC1 (1 mol/1 y 0.1 mol/1). 1Q0 mi
4. Lana de vidrio.
5. Solucin salina en amortiguador(NaCl, 0.5 mol/1 y 21
tris-EDTA, 0.5 mol/1, pH 8.2).
6. Resina de intercambio catinico, CM-Sephadex. 60 g
; 7. Amortiguador de carbonato-bicarbonato de sodio 21
(0.2 mol/1, pH 10.5).
8. NaCl. 20g
9. Acido actico (1 mmol/1). 10 mi
10. Patrn de albmina para la determinacin de protena 100 mi
(1 m g/m l).
12. Colectores de fracciones. 5
13. Espectrofotmetros visibles y" ultravioleta. 5
14. Baos de agua a 25 o 37 C. 5
Enzimas 263
15. A m ortiguador de fosfato sdico o potsico (0.1 mol/1, pH 7). 11

16. Suspensin liofilizada de M i c r o c o c c u s l y s o d e i k t i c u s 500 mi
recien tem en te p rep arad a en am ortiguador de fosfato a
0. 3.m g/m l).
Mtodo
D e term in a ci n d e p ro te n a y a c tiv id a d e n zim tic a
E quilibre la suspensin de bactrias liofilizadas a 37 C y
M u ra m id a sa .
agite antes de usarla. En u n a cubeta pipetee 2.8 m i de sustrato y
com ience la reaccin aadiendo 0.2 m i de la solucin de m uram idasa.
Mezcle vigorosam ente y siga el descenso en la absorbancia a 450 nm en
el espectrofotm etro registrador. C alcule la actividad de la enzim a
usando la p arte lineal de la curva de progreso y exprese los resultados
en trm inos de m icrogram os de bacteria hidrolizada por m inuto.
P re p a re u n a curva patrn p ara p rotena m idiendo la absorban
P ro te n a .
cia a 280 nm de soluciones de albm ina srica bovina en concentracio
nes hasta de 1 m g/m l. El contenido de p rotena puede d eterm in arse en
cada punto m idiendo la extincin de la solucin a 280 nm y leyendo el
valor de la protena a p a rtir de la cu rv a patrn.
P u rific a c i n
E quilibre 10 g de CM -Sepha-
P r e p a r a c i n d e la c o lu m n a c r o m a to g r fic a .
dex en solucin salina p reparada en am ortiguador, diluida 1 a 10; agite
suavem ente d u ra n te 24 horas; luego p rep are una colum na crom ato-
grfica de este m aterial tal como se describi en el captulo 3.
T a b l a d e p u r i f i c a c i n . En cada estado de la purificacin anote los valores
siguientes en form a de tabla:
1. V olum en (mi).
2. A ctividad enzim tica (unidades/m l).
3. A ctividad total de la m uram idasa (un id ad es/m l x vol).
4. Contenido total de protena (mg).
5. A ctividad especfica (actividad total de la m u ram id asa/m g de
protena).
6. Factor de purificacin p ara la m uram idasa (actividad especfica
dividida por la actividad especfica inicial).
7. R endim iento (porcentaje de la actividad total original).
E x t r a c c i n . Recoja las claras de tres huevos, filtre a travs de m uselina para
rem over la chalaza, recoja 50 m i de filtrado y agrguele 100 mi de agua. Agite
la mezcla cuidadosam ente sin p erm itir la form acin de b u rbujas de aire para
prevenir la desnaturalizacin. S epare m u estras de 2 mi y djelas en un bao
de hielo para la determ inacin de actividad y protena.
p o r p H . A juste m uy cuidadosam ente el pH del extracto a 7.5
P re c ip ita c i n
aadiendo m uy le n tam en te HC1 1 mol/1 y 0.1 mol/1 a lo largo de un perodo
de 10 m inutos. T e n g a c u i d a d o d e n o e x c e d e r s e . R em ueva la p rotena precipi

tada m ediante filtracin a travs de lana de vidrio colocada en u n em budo, y
aada al filtrado solucin salina en am ortiguador hasta ob ten er u n a concen
tracin final de 0.05 mol/1 de NaCl y 0.05 mol/1 de tris-EDTA, pH 8.2. Mida el
pH y aj stelo si es necesario a 8.2. A note el volum en y luego separe m uestras
de 2 mi colocadas en u n bao de hielo p ara los ensayos de m u ram id asa y
protena.
C r o m a t o g r a f a e n c o l u m n a . A plique cuidadosam ente el extracto a la colum
na de CM -Sephadex y recoja fracciones de 10 m i usando u n colector de
fracciones. Luego de que el extracto haya p enetrado a la colum na, lvela con
50 m i de solucin salina am ortiguada antes de elu ir con am ortiguador carbo
nato-bicarbonato de sodio 0.2 m o l / 1 . C ontine recogiendo fracciones hasta
que haya salido la m uram idasa de la colum na.
D eterm ine el contenido de protena y enzim a de cada fraccin y haga un
grfico del perfil de elucin de la colum na. Calcule el porcentaje de
recuperacin de p rotena y enzim a.
C r i s t a l i z a c i n . La m uram idasa es una pro ten a fu erte m en te bsica y form a
fcilm ente sales cristalinas en cloro, yodo, carbonato, etc. Bajo condiciones
ptimas, la cristalizacin se efecta len tam en te y alcanza u n m xim o despus
de 7296 horas.
Com bine las fracciones de m ayor actividad enzim tica y aju ste el pH a
10.5, y luego agregue len tam en te NaCl hasta u n a concentracin final de 0.3
mol/1. D eje reposar en el refrigerador d u ra n te 34 das.
Si se ha efectuado la cristalizacin, decante el sob ren ad an te que le sea
posible y luego separe los cristales p o r centrifugacin. D isuelva el precipitado
en 1 mi de cido actico 1 m m ol/1 y rem u ev a el m aterial insoluble por cen
trifugacin. D eterm ine el contenido de protena y m u ram id asa y anote el
factor final de purificacin y de rendim iento. Si el tiem po lo perm ite, use la
solucin para d eterm in a r el peso m olecular por filtracin en gel de capa
delgada (experim ento 3.5).
FORMAS MOLECULARES MULTIPLES DE LAS ENZIMAS

Las enzim as que catalizan la m ism a reaccin qum ica pero difieren en
algunas de sus propiedades fsico-qumicas se conocen como f o r m a s m l t i p l e s
m o l e c u l a r e s y para su separacin e identificacin se puede u sar electroforesis
y crom atografa. Las propiedades fsico-qumicas de estas enzim as estn
relacionadas con su actividad y por lo tan to tam b in difieren en propiedades
tales como K m , sensibilidad al calor, efecto de inhibidores, etc. El trm ino
i s o e n z i m a se usa p ara aquellas form as en las que la m ultiplicidad deriva del
control gentico de la e stru ctu ra p rim aria de la enzim a.
En 1971 la Comisin de N om enclatura Bioqum ica de la IU PA CIUB
propuso que estas form as m ltiples deben clasificarse en siete grupos
Enzimas 265
distintos (tabla 9.1). Las m olculas modificadas a causa del aislam iento y
separacin de las enzim as no estn incluidas en esta clasificacin.
Tabla 9.1 Clasificacin de las formas moleculares mltiples de las enzimas.
Grupos Razn para la multiplicacin Ejemplo
I Protenas genticamente independientes Deshidrogenasa mlica en

mitocondria y en el cito
# 0 plasma
II Heteropolmeros (polmeros de dos o ms Deshidrogenasa lctica

cadenas polipeptdicas no unidas covalente-
mente)
III
88 88
Variantes genticas (allicas) Glucosa-6-fosfato deshidro
genasa

IV Protenas conjugadas Fosfatasas alcalinas de ma
mferos
' t ) te $
V Protenas derivadas de una cadena polipeptdica Familia de la quimotripsina
VI
s se s
Homopolmeros (polmeros de una sola subuni Glutmico deshidrogenasa
dad no unida covalentemente)
o co ffi $
VII Formas conformacionalmente diferentes Todas las modificaciones
alostricas
AV
EXPERIMENTO 9.13 S e p a ra c i n de fo sfa ta sa a lc a lin a de ri n en D E A E -
c elu lo sa
Fundamento
En este experim ento se separan las form as m oleculares de fosfatasa alcalina
presentes en rin, usando crom atografa de intercam bio inico. Las m olcu
las son glicoprotenas que contienen cantidades variables de cido silico.
Poseen, por lo tanto, diferentes cargas negativas y esta propiedad puede u sar
se para separarlas em pleando colum nas de intercam bio inico.
La enzim a que se halla fu erte m en te ligada a la m em b ran a celular se ex

trae prim ero en butanol y su volum en se reduce por dilisis contra Carbowax.
La enzim a concentrada se coloca sobre u n a colum na con el intercam biador
aninico DEAE-celulosa, y se eluye con u n grad ien te de cloruro. El principio
de los gradientes de elucin y la teora de la crom atografa de intercam bio
inico aparecen en l captulo 3.
Materiales 10
1. Tal como en el experim ento 9.2.
2. Riones de cerdo. 5
3. n-B utanol. 250mi
4. Hom ogenizadores. 5
5. Hielo.
6. C olum nas de crom atografa de DEAE-celulosa (50 cm x 5
2,5 cm).
7. A m ortiguador Tris-H Cl (0.05 mol/1, pH 7.7). 61
8. A m ortiguador Tris-HCl-NaCl (como en 7, pero usando 21
cloruro de sodio 0.35 mol/1).
10. C lorm etro o m todo qum ico p ara d eterm inacin
de cloro.
11. Carbow ax (300 g/1 en solucin acuosa). 41
12. Colectores de autom ticos de fracciones. 5
Mtodo
S e p a r a c i n d e l a e n z i m a . R em ueva el exceso de grasa de los riones, lvelos,
cuidadosam ente con agua fra, squelos lig eram en te con papel de filtro y pese
20 g de tejido. Crtelu en pedazos pequeos y hom ogenice en' agua helada
hasta obtener u na suspensin de aproxim adam ente 1 g/m l. C uidadosam en
te agregue butanol (1.5 x vol. de suspensin) en cantidades m uy pequeas
d u ran te u n perodo de 15 m in p ara ev itar sobrecalentam iento. Esta etapa se
lleva a cabo a te m p e ra tu ra am biente ya que la enzim a es bastante estable y la
extraccin es bastante eficiente. T ransfiera la suspensin a u n tubo de 50 mi y
centrifugue d u ra n te 40 m inutos a 3000 g . Esto causa la form acin de varias
capas (figura 9.12). Con u n a varilla de vidrio rom pa la capa de fragm entos
celulares livianos y usando u n a pipeta P asteu r saque la fase acuosa que con
tiene la enzim a. A lm acene el extracto a 0o C hasta cuando se necesite.
d e l a c o l u m n a . E quilibre la DEAE-celulosa con am ortiguador
P re p a ra c i n
tris-H Cl 0.05 mol/1, pH 7.7 y llene la colum na con el m aterial como se descri bi
en el captulo 3. D eje que la resin a em paque por r ; v'asta que pase todo
el am ortiguador a travs de la colum na.
F r a c c i o n a m i e n t o d e l a f o s f a t a s a a l c a l i n a d e r i n . C oncentre la enzim a
m ediante dilisis en contra de C arbow ax de u n da p ara otro; luego equilibre
!
Enzimas 267
Fase de butanol
mm Fragmentos celulares livianos
Fase acuosa (fosfatasa alcalina)
Fragmentos celulares pesados
Figura 9.12 Extraccin de la fosfatasa alcalina

con butanol
por dilisis d u ran te 4 horas contra am ortiguador tris-H C l 0.05 mol/1. Apli
que la enzim a concentrada a la p arte superior de la colum na de resina y
elyala con u n gradiente lineal de cloruro como se indic en el captulo 3. El
am ortiguador inicial es 300 m i de tris-H C l 0.05 mol/1 y el am ortiguador de
cloruro es el mismo, excepto por el hecho de co n ten er NaCl 0.35 mol/1. A jus
te el flujo de la colum na e n tre 20 y 30 m l/h y recoja fracciones de 5 mi du
rante toda la noche usando u n colector de fracciones.
D eterm ine en las fracciones cloro, protena (m idiendo la extincin a 280
nm), y la actividad de la fosfatasa alcalina (experim ento 9.2). H aga u n grfico
de los valores obtenidos en funcin del volum en del efluente. La separacin
term ina luego de q u e h ay an pasado 200 m i de am ortiguador, cuando la
concentracin de cloruro se aproxim a a 0.1 mol/1. G en eralm en te se obtienen 3
picos pequeos y uno grande.
EXPERIMENTO 9.14 A lg u n a s p ro p ied a d e s de la s d istin ta s fra c c io n e s de

fo sfa ta sa a lc a lin a d e r i n
Fundamento
Con las fracciones separadas en el experim ento an terio r, se puede realizar
una serie de experim entos. A continuacin se dan unos pocos de ellos. P ara
llevarlos a cabo se m ezcla el contenido d los tubos correspondientes a cada
uno de los cuatro picos y se reduce el volum en por m edio de dilisis contra
carbowax.
Materiales y Mtodos
1. Mida la constante de Michaelis.
2. C om pare la actividad con varios sustratos m idiendo la velocidad de
liberacin de fosfato (p-nitrofenilfosfato, /3-glicerosfosfato, adenosina
trifosfato).
3. Exam ine el efecto de la te m p eratu ra (55 y 60 C) sobre la estabilidad de
las form as m oleculares.
4. Exam ine el patr n electrofortico en gel de poliacrilam ida. Se usan las
condiciones del experim ento 3.16; y las zonas de actividad de la enzim a
se detectan incubando las barras de gel con a-nalftilfosfato (1 m g/m l) en

am ortiguador de carbonato-bicarbonato de sodio (0.1 mol, pH 10.0) que
contiene M g S 0 4 10 mmol/1. E xam ine los geles bajo luz ultravioleta
(350 nm ) para observar la fluorescencia dela-naftol. P ara obtener unas
bandas coloreadas p erm an en tem en te se acopla el oi-naftol con Fast
blue B p ara o b ten er bandas de color azul oscuro.
EXPERIMENTO 9.15 S e p a ra c i n de la s is o e n z im a s d e d e s h id r o g e n a s a l c tic a

p o r e le c tro fo re sis e n g el d e p o lia c rila m id a
Fundamento
O r i g e n d e l o s i s o e n z i m a s . La m ayora de los tejidos anim ales contienen hasta
cinco isoenzim as de deshidrogenasa lctica que pueden ser separadas
fcilm ente por electroforesis. Se en u m eran de acuerdo con su velocidad de
m igracin hacia el nodo, en tal form a que la L! es la especie que m igra m s
rpido y la LD5, la form a que tiene la m ovilidad m s baja. Las isoenzimas
derivan de las varias com binaciones de dos subunidades diferentes para
originar cinco posibles tetrm eros. La LDj contiene n icam en te subunidades
H y se denom ina as por ser la form a p red o m in an te en el corazn (H eart),
m ientras que la LD5 contiene slo subunidades M y es la form a predom inante
en el m sculo esqueltico (Muscle). Las otras 3 isoenzim as (LD 2, LD 3 y LD 4)
provienen de la com binacin de estas dos subunidades p ara fo rm ar molculas
hibridas (figura 9.13). La cantidad y distribucin de las form as enzim ticas es
caracterstica del tejido de origen y por tal razn se pueden u sar para
identificarlo.
V i s u a l i z a c i n d e l a a c t i v i d a d e n z i m t i c a p o r c o l o r a c i n . Las isoenzimas de
LDH se visualizan incubando los geles con u n a m ezcla que contiene el
sustrato norm al y la coenzima, fenazina m etosulfato (FMS) (u n aceptor
artificial de electrones) y u n colorante de tetrazolio. Este colorante al
reducirse form a bandas altam en te coloreadas y poco solubles de form azn
que precipitan en los lugares en donde hay actividad enzim tica (figura 9.14).
10
Materiales
5
1. Soluciones y equipo p ara electroforesis en gel de
poliacrilam ida tal como en el experim ento 3.16. 11
2. A m ortiguador de fosfato sdico o potsico (0.05 mol/1,
pH 7.4).
3. Rata (200300 g de peso). 1
4. D eshidrogenasa lctica de corazn de buey y m sculo
de conejo en lu g ar de tejidos de rata.
5. A m ortiguador Tris-H Cl (0.1 mol/1, pH 9.2). 11
6. Lactato de litio. 10 g
Enzimas 269
oo OO oe
QO o# oe o
LD. ld 2 LD, LD , LD S
O S u b u n id a d H
# S u b u n id a d M P e s o m o le c u la r d e l t e t r a m e r o , 1 3 6 0 0 0
P e s o m o le c u la r d e l m o n m e r o , 3 4 0 0 0
Figura 9.13 Composicin de las isoenzimas de deshidrogenasa lctica
7. N icotinam ida adenina dinucletido (NAD). - 300 mg

8. Azul de nitrotetrazolio (NBT). 30 mg
9. Fenazina m etosulfato (FMS). 20 m g
10. Reactivo revelad o r (lactato de litio 0.1 mmol/1, NAD 500 m i
50 mg y NBT 5 m g en 100 m i de am ortiguador tris-H C l,
pH 9.2). Esta solucin es estable d u ran te 1 sem ana en
la oscuridad a 4o C. In m ed iatam en te antes de usarse
agregue PM S (aproxim adam ente 0.5 mg).
11. Incubadoras a 37 C. ' 5
Mtodo
P repare ocho geles de poliacrilam ida tal como se describe en el experim ento
3.16 y djelos reposar. M ientras tanto sacrifique u n a ra ta y p rep are homoge-
nizados de hgado, rin, m sculo esqueltico, corazn y otros tejidos en
am ortiguador de fosfato 0.05 mol/1 (0.5 1 g en 10 mi). R em ueva los residuos
por centrifugacin y alm acene el sobrenadante en u n bao de, hielo hasta
cuando se necesite.
Coloque 50 p 1 de cada m u e stra por duplicado sobre los geles de poliacrila
mida y efecte la electroforesis tal como se describi an terio rm e n te
(experim ento 3.16). Al final de la p ru eb a incube los geles con el reactivo
L a c ta t o NAD + F M S (r e d ) N B T (o x)
P ir u v a t o NADH ' p M S (o x ) ^ N B T (re d )
N A D m c o t in a m id a - a d e n in a d in u c le t id o P o lim e r iz a c i n
F M S f e n a s i n a m e t o s u lf a t o
N B T a z u l d e n itr o t e t r a z o lio F o r m a z n in s o lu b le
o x = o x id a d o r e d = r e d u c id o
Figura 9.14 Reacciones involucradas en la deteccin de las

isoenzimas de deshidrogenasa lctica
revelador a 37 C hasta por 10 m inutos en luz indirecta. Tom e fotografas de

los geles o dibuje a escala u n esquem a que seale cuidadosam ente la posicin
de las bandas. A note exactam ente el tiem po que gasta en ap arecer cada b an
da, la intensidad final de la coloracin y el espacio e n tre las isoenzimas.
Si el tiem po lo p erm ite, rep ita el ejercicio con suero sanguneo, eritrocitos
hemolizados, intestino delgado y tejido pulm onar.
EXPERIMENTO 9.16 A i s l a m i e n t o d e la s is o e n z i m a s d e d e s h id r o g e n a b a l c tic a

p o r e le c tro fo re sis e n b lo q u e d e a lm id n .
Las isoenzim as se sep aran pr electroforesis de zona usando como m edio de

soporte granos de alm idn. La v en taja de este m todo es que las isoenzimas se
pueden sep arar en cantidades suficientes p ara ex am in ar sus propiedades. En
la prueba se incluye u n a solucin que contiene alb m in a srica bovina teida
con azul de brom ofenol y hem oglobina h u m a n a como m arcador, q u e tam bin
p erm iten verificar cu alq u ier cam bio en el patr n electrofortico debido a
electrosmosis.
Materiales 10
1. Extracto de tejidos de ra ta como en el ex p erim en to 9.15.
2. A m ortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/1, pH 7.4). 61 + 5 veces
la capacidad
del tan q u e
3. A lm idn de papa. 3 kg
4. Moldes para la preparacin del bloque (30 cm x 12 cm x 5
1 cm).
5. Gasa absorbente.
6. F uentes de poder. 5
7. Solucin m arcadora de albm ina srica bovina y
hem oglobina hum ana. (D isuelva alb m in a srica bovina
en eritrocitos hem olizados y agregue azul de brom ofenol
para colorear la albm ina).
8. Reactivos p ara la determ inacin espectrofotom trica de
deshidrogenasa lctica (experim ento 9.8).
9. Em budos de vidrio de fondo plano, con lana de vidrio. 50
Las cantidades se h a n calculado suponiendo que cada uno de los cinco

pares de estudiantes separa deshidrogenasa lctica de u n tejido diferente.
Mtodo
Lave por decantacin 500 g de alm idn de papa dos veces con agua destilada y
dos veces con am ortiguador de fosfato. D espus de la ltim a lavada, deje
decantar el alm idn d u ra n te 2 horas, rem u ev a el exceso de am ortiguador y
prepare el bloque de alm idn usando el m olde respectivo. R em ueva el exceso
de lquido colocando el bloque e n tre dos hojas de papel W hatm an 3 MM.
Enzimas 271
Conecte el bloque al com partim iento de los electrodos m ed ian te varias capas
de gasa absorbente im pregnadas con solucin am ortiguadora. A plique u n po
tencial de 68 V /cm para eq u ilib rar el sistem a, desconecte y luego haga una
ranura horizontal en el bloque (9 cm) a 22 cm del extrem o andico y a 1 cm del
borde lateral. Coloque en la ra n u ra 1 mi de la m u estra. Al m ism o tiem po
aplique la solucin m arcadora a igual distancia del nodo y a 1 cm del otro
borde lateral (figura 9.15). Llene el orificio con alm idn y cubra el bloque con
una lm ina de P ersp ex para m ayor seguridad.
Coloque todo el aparato en el cu arto fro o en el refrig erad o r y aplique u n
potencial de 68 V /cm d u ran te 20 horas. Despus de la electroforesis m ida la
distancia de m igracin y la distribucin de los m arcadores, rem u ev a la p arte
del bloque que contiene los m arcadores y descrtela (figura 9.15). C orte el
resto del bloque tran sv ersalm en te en tiras de 1 cm de ancho y tran sfie ra cada
tira a un em budo de vidrio de fondo plano con lana de vidrio. P resione fu er
tem ente el alm idn con una varilla de vidrio, eluya dos veces con 2 mi de
am ortiguador de fosfato pH 7.4. A note el volum en final de elucin. Tom e una
m uestra conveniente para la determ inacin de la actividad de la deshidroge-
nasa (0.1 1 m i) y p rep are un diagram a de la actividad total de cada fraccin
en funcin de la distancia de m igracin a p a rtir del ctodo. D eterm in e la enzi
ma en el extracto crudo y d eterm in e el p orcentaje de recuperacin en el
bloque.
Figura 9.15 Electroforesis en bloque de almidn

Si los tejidos no se pueden o b ten er fcilm ente, se puede u sar deshidroge-

nasa lctica de corazn de buey o de m sculo de conejo prep arad a com er
cialm ente.
EXPERIMENTO 9.17 O tra s in v e stig a c io n e s s o b re la s is o e n z im a s d e d e sh id ro

g e n a s e l c tic a o b te n id a m e d ia n te e le c tro fo re sis e n b lo q u e d e a lm id n
Materiales y Mtodo
Los experim entos siguientes pueden efectu arse con fracciones obtenidas en
el experim ento 9.16, pero tam b in se pueden u sa r enzim as de corazn de buey
y m sculo de conejo p ara dem o strar las diferencias en las proporciones de
isoenzimas en estos dos tejidos. El corazn de buey contiene p red o m in an te
m ente las isoenzim as L D t y LD2 m ien tras que el m sculo de conejo contie
ne p referencialm en te las LD5.
A continuacin se describen algunos experim entos q u e p u ed en realizarse.
Estos d em u estran el cam bio gradual en las propiedades de las diferentes
isoenzimas:
1. D eterm ine la constante de M ichaelis usando como sustratos piruvato y
2-cetobutirato.
2. Exam ine la estabilidad de la enzim a calentndola h asta por 30 m in u
tos a 55 70 C.
3. Incube la enzim a d u ra n te 30 m inutos con concentraciones crecien
tes de u re a hasta 6 mol/1 y com pare la actividad con el control. Haga
un grfico de v / v en funcin de la concentracin de urea.
4. D eterm ine las constantes de inhibicin con oxalato.
Bibliografa
B ergm eyer, H. U., M e t h o d s o f E n z y m a t i c A n a l y s i s , Vols 14, N ueva Y ork
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Wilkinson, J. H., I s o e n z y m e s , 2a. ed., Londres, C h ap m an y Hall, 1970.
10
Metabolismo
Las propiedades fsicas y qum icas de las m olculas biolgicas son u n a parte
esencial de la bioqum ica, pero o tra faceta igualm ente im portante, es la form a
como estos m ateriales se sintetizan y se degradan en los organism os vivos.
Este ltim o aspecto de la bioqum ica se conoce como m etabolism o y ha sido
brevem ente tratado en captulos anteriores. Los experim entos que vienen a
continuacin tra ta n de ilu stra r algunas de las m uchas y variadas vas
metablicas presentes en organism os vivos. En el texto se incluyen
resm enes de las vas m etablicas con el fin de ay u d ar a e n ten d er los
experim entos, pero no se su m in istra evidencia de la existencia de tales ru tas
pues este aspecto se tra ta adecuada y exten sam en te en la m ayora de los libros
tericos de bioqumica.
DIGESTION, ABSORCION Y TRANSPORTE CELULAR

Los organismos vivos obtienen su energa del alim ento que consum en, el cual
se rom pe en m olculas m s pequeas en un proceso conocido con el nom bre
de digestin y que en los m am feros se efecta en el tracto gastrointestinal.
Las molculas pequeas resu ltan tes de la digestin se absorben a travs de la
pared intestinal y son tran sp o rtad as por el to rre n te sanguneo a los tejidos.
Los metabolitos e n tra n luego a las clulas de los tejidos a travs de la
m em brana plasm tica y all son degradados a n m s (catabolismo) o son
usados en procesos sintticos (anabolismo).
Los experim entos que se p resen tan en esta seccin ilu stran algunas de las
tcnicas usadas por los bioqumicos p ara estu d iar el m etabolism o usando
sistemas que van desde modelos qum icos hasta clulas aisladas, tejidos y aun
animales enteros.
273
0 . 1 1
Figura 10.1 Liposomas
EXPERIMENTO 10.1 Permeabilidad a los aniones en modelos de membranas

(liposomas)
Fundamento
Liposomas. Las pelculas secas de fosfolpidos se hin ch an espontneam ente
cuando se ponen en contacto con soluciones acuosas form ando estru ctu ras
m ltiples, condcidas como liposomas. Estas estru ctu ras estn conform adas
por bicapas concntricas de fosfolpidos separadas por pequeos espacios
acuosos (figura 10.1).
La sacarosa es atrap ad a dentro de los liposomas a m edida que ellos'se
form an y como esta m olcula g eneralm ente no puede d ifundirse a travs de
la m em brana del liposoma, la presin osmtica que genera contribuye a
m a n ten er la m orfologa del liposoma. Si los liposom as son suspendidos en
soluciones isoosmticas de iones que no pueden p e n e tra r la bicapa
fosfolipdica, no se observa ningn cam bio en el volum en de liposoma. Sin
em bargo, si los fosfolpidos son perm eables a los iones, el liposoma au m en ta de
volum en a m edida que el agua y los iones p en etran den tro de l para
m an ten er el equilibrio osmtico. La perm eabilidad de u n soluto puede
entonces d eterm in arse siguiendo la dispersin de la luz en u n a suspensin de
liposomas. C uando los liposomas au m en tan de volum en la absorbancia
dism inuye y cuando ellos se contraen, la absorbancia aum enta.
Permeabilidad de la membrana. Los liposomas son modelos m u y tiles en el
estudio de la perm eabilidad de los aniones a travs de la p arte fosfolipdica de
las m em branas. El objeto de este experim ento es que el investigador use los
resultados obtenidos p ara form u lar sus propias hiptesis respecto a la form a
Metabolismo 275
como los aniones cru zan las m em branas. Al discutir los resultados deben
tenerse en cuenta los siguientes aspectos generales:
1. Los liposomas son p rcticam en te im perm eables a cationes (H +, N a+,
K +).
2. M uchas especies slo cruzan la m em b ran a cuando se e n cu e n tran en
form a no ionizada.
3. Si o cu rre tra n s p o rte ' de iones, se debe m a n te n e r la n eu tralid ad
elctrica.
El transporte inico es modificado por m uchos com puestos; en particular,
el antibitico valinom icina tien e especial in ters pues acta como u n
transportador especfico de K+. La m olcula tien e u n a e stru c tu ra en form a de
corona con el in K+ acomodado exactam ente en el centro hidroflico del
anillo. El resto de la m olcula es hidrofbica y puede por lo tan to cru zar
fcilm ente los fosfolpidos de la m em b ran a tran sp o rtan d o K+*. Las m olculas
que como la valinom icina facilitan el tran sp o rte de iones especficos a travs
de las m em branas se conocen como ionforos.
Materiales 10
1. Fosfatidilcolina. 200 mg
2. Fosfato de dicetilo. 20 m g
*3. Colesterol. 25 mg
4. Cloroformo. 50 m i
5. Sacarosa (100 mm ol/1). 20 m i
6. M atraces de vidrio (100 mi). 5
7. Evaporadores rotatorios. 5
8. Soluciones problem a (50 mm ol/1). 50 m i
NaCl, KC1, NH4CI.

Nal. KI, NH4I.
CH3 COONa, CH3COOK, CH3COONH4
NaCNS, KCNS.
9. Valinomicina. 50 pg
10. Espectrofotm etros (visibles) con registrador. 5
Mtodo
Preparacin de liposomas. En u n m atraz de vidrio de 100 m i m ezcle 20
Umol de fosfatidil colina con 2/mol de fosfato de dicetilo y aproxim adam en
te 3 mi de cloroformo. El fosfato de dicetilo da a los liposom as u n a carga total
negativa. M ediante evaporacin ro tato ria rem u ev a el cloroform o y luego
aada 3 mi de sacarosa 100 m m ol/1 a la pelcula de lpido seco. Es indispensable
*La adicin de valinomicina puede, por consiguiente, alterar en algunos casos el hinchamiento de
los liposomas.
evaporar todo el cloroform o antes de ag reg ar la sacarosa y p ara confirm arlo

sim plem ente se debe estar seguro de que no queda olor en el m atraz. Despus
de agregar la solucin de sacarosa, agite el m atraz su av em en te p ara dispersar
los lpidos.
H i n c h a m i e n t o d e l i p o s o m a s . l cam bio en la absorbancia total cuando los
liposomas se hin ch an es m uy pequeo y, por tanto, es necesario buscar las
condiciones ptim as p ara determ inarlo. P ara en contrarlos se m ezclan 100 p 1
de la suspensin de liposom as con 3 mi de agua destilada y luego se sigue el
descenso en la extincin a 450 n m en u n espectrofotm etro registrador. Se
hacen los ajustes necesarios en la velocidad del papel del registrador, en la
sensibilidad del aparato, etc.; y, finalm ente, se procede a h acer la investiga
cin sobre la perm eabilidad a los aniones.
En u na cubeta com bine 100 p l de la suspensin de liposomas y 3 m i de la
solucin problem a. Siga el cam bio en la absorbancia con respecto al tiem po.
Si no o cu rre hincham iento, agregue 1 p g de valinom icina p ara hacer p e r
m eables los liposomas especficam ente al K + y contine m idiendo la absor
bancia a 450 nm . Explique sus resultados y form ule posibles m ecanism os
m ediante los cuales los diferentes aniones pueden atra v esar las m em b ran as
fosfolip dicas.
C o l e s t e r o l e n m e m b r a n a s . Haga otra preparacin de liposomas, pero esta vez
agregue 10 p m o l de colesterol, 20 pm ol de fosfatidil colina y 2/mol de fosfato
de dicetilo. Seleccione de acuerdo al experim ento an terio r aquellas sales
que puedan p e n e tra r los liposomas y rep ita el experim ento usando los
liposomas q ue contienen colesterol. D iscuta sus resultados y explique cmo el
colesterol afecta la perm eabilidad de la m e m b ran a del liposoma.
EXPERIMENTO 10.2 C o n tr o l d e la c a p ta c i n d e g lu c o s a p o r in s u lin a e n c lu la s

g ra sa s a isla d a s
Fundamento
C a p t a c i n d e g l u c o s a . La insulina au m en ta la velocidad de tran sp o rte de
glucosa a travs de la m em b ran a de m uchas clulas y esto se d em u estra en el
siguiente experim ento, m idiendo la velocidad de desaparicin de la glucosa
del medio usado p ara la incubacin de clulas grasas aisladas. En este caso
p articu lar el tran sp o rte a travs de la m em b ran a celular es la etapa lim itan te
en el m etabolism o de la glucosa; por lo tanto, u n increm en to en la
desaparicin de la glucosa del m edio se p u ed e u sar como ndice de la
estim ulacin del tran sp o rte de glucosa a travs de la m em b ran a de la clula
grasa.
C l u l a s g r a s a s a i s l a d a s . Las clulas grasas se aslan tratan d o con colagenasa el

tejido adiposo obtenido del epiddim o de ratas machos. La colagenasa cataliza
la hidrlisis de las fibras de la m atriz in tercelu lar y libera clulas grasas
Metabolismo 277
aisladas, las cuales, debido a su alto contenido de triglicridos, flotan cuando la

suspensin se som ete a centrifugacin m oderada. Este m todo separa
fcilm ente las clulas grasas de otros tipos de clulas presentes en el tejido y
perm ite obtener u n a poblacin hom ognea de clulas. Estas clulas son
m etablicam ente activas y responden a u n a gran variedad de estm ulos tanto
fisiolgicos como farmacolgicos.
Materiales 10
1. C loruro de sodio (0.154 mol/1). 11
2. C loruro de potasio (0.154 mol/1). 50m i
3. C loruro de calcio (0.110 mol/1). 25m i
4. Fosfasto de potasio (0.154 mol/1). 10m i
5. Sulfato de m agnesio (0.154 mol/1). 10m i
6. Bicarbonato de sodio (0.154 mol/1). 250 m i
7. K rebs-R inger bicarbonato de baja concentracin de 1285 m i
calcio (KRB). Mezcle las soluciones 1 a 6 en las siguientes
proporciones y luego b u rb u jee 95% 0 2/5% C 0 2 d u ran te
20 m in.
1000 m i de solucin 1.
8. P rep are u n a solucin de albm ina 30% p /v en KRB 500 m i
y dialice de u n da p ara otro en contra de KRB en fro.
Ai siguiente da, diluya hasta 4% p /v usando KRB y
b urbujee 95% 0 2/5% C 0 2 hasta ob ten er u n pH 7.4.
G uarde a 37 C en recipiente cerrado bajo u n a atm sfera
de 95% 0 2/5% C 0 2 y luego conglela.
9. Medio de incubacin (K R B -albm ina que contiene 100 m i
glucosa, 3 mm ol/1).
10. Cilindros de gas de 95% 0 2/5% C 0 2. 3
11. Ratas m acho (200 300 g). 10
12. Tubos plsticos de centrfuga (10 15 mi). 100
13. Colagenasa. 30 mg
14. Solucin concentrada de insulina. (D isuelva 8 m g en 8 mg
1 m i de HC1 3 m m ol/1.)
15. Reactivos para la determ inacin de glucosa por el
m todo glucosa oxidasa (experim ento 6.14).
16. Baos de agua con agitador a 37 C. 5
Nota: En todos los casos en que se m anipulen clulas se debe u sar m aterial de
plstico o de vidrio siliconizado.
Mtodo
P r e p a r a c i n d e c l u l a s g r a s a s a i s l a d a s . M ate dos ratas m acho, extriga la
grasa del epiddim o y colquela en un tubo plstico q u e contenga 10 m i de
K RB-albm ina y 5 m g d e colagenasa. Pase 95% 0 2/5% C 0 2d u ra n te un tiem po,
tape el tubo, e incube en un bao de agua a 37 C agitando suavem ente
durante 1 h. Saque los fragm entos de tejido que puedan q u ed ar usando u n a
pinza y centrifugue luego la suspensin de clulas en u n tubo plstico a 400 g
du ran te 1 m in. Usando u n a pipeta P asteu r p en etre a travs de la capa de
clulas, llegue hasta el fondo del tubo y rem u ev a el lquido por aspiracin.
Resuspenda las clulas grasas en 10 mi de K R B -albm ina y lave suavem ente
agitando con una varilla plstica. C entrifugue a 400 g por 1 m in y deseche el
lquido. R epita el lavado dos veces y finalm ente resuspenda las clulas en u n
volum en adecuado de K RB-albm ina-glucosa (Solucin 9 ).
C a p t a c i n d e g l u c o s a . D eterm ine en p rim e r lugar el in crem ento en la

captacin de glucosa en funcin de la concentracin de insulina. P ara hacerlo
incube por triplicado 1 mi de la suspensin de clulas grasas con las siguientes
concentraciones de insulina: 0, 1, 10, 100 y 1000 MU/ml (1 m g = 25 unidades).
La insulina se agrega a los tubos plsticos usados p ara incubacin en un
volum en pequeo (5ju 1) y luego se aade 1 m i de la suspensin de clulas u san
do una jeringa plstica ancha de 1 mi. B u rb u jee 95% 0 2/5% C 0 2 d u ran te 2
m in e incube en tubos plsticos cerrados d u ra n te 2 h a 37 C agitando suave
m ente.
Al te rm in a r la incubacin, centrifugue las clulas y d eterm in e la cantidad
de glucosa presen te en el m edio de incubacin usando el m todo p ara glucosa
del experim ento 6.14. E xprese los resultados como el prom edio de los
microm oles de glucosa captada por m ililitro de suspensin por hora, m s o
menos el e rro r estn d ar de los triplicados. P ara o b ten er la cu rv a de dosis-
respuesta, haga un grfico de captacin de glucosa en funcin del log,0 de la
concentracin de insulina. Qu concentracin de insulina da la m itad de la
estim ulacin m xim a de la captacin de glucosa por las clulas? Cmo se
Compara el resultado con la concentracin plasm tica de insulina en reposo
que es alrededor de 20MU/ml?
EXPERIMENTO 10.3 T ra n sp o rte d e a m in o c id o s a tr a v s d e l in te stin o d e lg a d o
Fundamento
T r a n s p o r t e d e m e t a b o l i t o s . Despus de la digestin de los alim entos en el
intestino, los am inocidos y otras m olculas pequeas son absorbidos y pasan
al to rren te sanguneo. En m uchos casos la absorcin se efecta en contra de
un gradiente de concentracin m ediante tran sp o rte activo. La energa
necesaria para dicho proceso es sum inistrada por la hidrlisis del ATP, de
m anera que venenos m etablicos que red u cen o bloquean la produccin de
ATP inhibirn esta clase de transporte.
Metabolismo 279
El tipo de tran sp o rte (activo o pasivo) depende en gran p arte de la

geom etra de la molcula, cosa que se com prueba al estu d iar la absorcin de
ismeros pticos de am inocidos y azcares.
Asas de intestino invertido. U n m todo til p ara estu d iar el tran sp o rte en
intestino consiste en u sar u n a porcin del intestino delgado que ha sido
volteado al revs y cuyos extrem os han sido luego atados. El intestino
invertido se sum erge en u n m edio inico am ortiguado que contenga el
metabolito cuyo tran sp o rte se va a estudiar y se m iden los cambios en la
concentracin del m etabolito despus de incubar. Al voltear el intestino al
revs, el transporte se efecta de u n volum en grande, que es el medio de
incubacin, hacia un volum en pequeo dentro del intestino invertido. Esto
exagera cualquier absorcin que o curra y es por tanto u n a preparacin
mucho ms sensible que el intestino en su form a norm al.
Determinacin de histidina. La histidina se d eterm in a m idiendo el cambio
de color producido cuando el am inocido reacciona con cido sulfanlico
diazotizado (experim ento 5.6).
Materiales 10
1. C loruro de sodio (0.154 mol/1). 11
2. C loruro de potasio (0.154 mol/1). 50 m i
3. Sulfato.de m agnesio (0.154 mol/1). 20 mi
4. A m ortiguador de fosfato de potasio (0.1 mol/1, pH 7.4). 250 mi
5. Kreba-Ringer-fosfatp sih calcio (KRP). Mezcle las 1250 m i
soluciones an terio res en las proporciones siguientes y
burbujee con 95% 0 2/5% C 0 2.
Volumen (mi) Solucin

1000 1
40 2
10 3
200 4
6. Medio de incubacin (KRP que contiene glucosa 18 1250 m i

m m o l/1).
7. Cilindros de gas (95% 0 2/5% C 0 2). 3
8. Ratas. . 5
9. Glucosa-salina (NaCl 0.154 mol/1 que contiene glucosa 11
18 m m o l/1).
10. L-histidina (5 mm ol/1 disuelta en KRP que contiene 500 mi
glucosa 18 m m o l/1).
11. Soluciones de inhibidores. (P rep are en m edio de incuba

cin y b u rb u jee 95% Oz/5% C2. P r e c a u c i n : s o n
su sta n c ia s v e n e n o s a s .)
(a) C ianuro de sodio (2 mmol/1). 100 mi
(b) Yodoacetafo de sodio (10 mmol/1). 100 m i
(c) Yodoacetato de sodio (40 mmol/1). 100 m i
(d) M alonato de sodio (5 mmol/1). 100 m i
12. Acido actico p ara desproteinizacin (0.35 mm ol/1). 250 m i
13. Acido sulfanlico (10 g/1 en HC1 1 mol/1). Si el blanco 100 m i
presenta coloracin, recristalice el reactivo.
14. N itrito de sodio (50 g/1, preprese fresco). 100 m i
15. Carbonato de sodio (75 g/1 de sal anhidra). 100 m i
16. Etanol (20% v /v ). 11
17. P atrn de L-histidina (0.15 mm ol/1). 100 m i
18. Jeringas de 1 m i de capacidad con agujas sin punta. 10
19. Colorm etros. 5
20. Baos de agua a 37 C con agitador. 5
22. Papel de filtro, W hatm an No. 54.
23. Hilo para ligaduras.
24. V arillas de vidrio con extrem os abom bados (v er 5
figura 10.2).
Mtodo
P r e p a r a c i n d e a s a s d e i n t e s t i n o i n v e r t i d o . Sacrifique la rata y haga una
incisin a lo largo de la lnea media del abdomen. Saque el intestino delgado,
corte sus dos extremos y remueva manualmente el mesenterio. Lave todo el
intestino con una solucin de glucosa-salina a temperatura ambiente con
el fin de remover la sangre, residuos, etc. y prepare las asas de intestino
invertido. Para ello, inserte en el intestino una varilla de vidrio delgada con
extremos abombados como se indica en la figura 10.2 (a). Haga un nudo en la
regin abombada de la varilla e invierta el intestino empujando suavem ente
la varilla adentro y a lo largo del intestino (figura 10.2(b)). Amarre cuidadosa
mente ambos extremos del intestino invertido, retire la varilla y coloque el
intestino en una solucin glucosa-salina a temperatura ambiente. Ate cada
23 cm del intestino con hilo y corte asas abiertas como se indica en la parte
(c) de la figura 10.2. Haga un nudo suelto alrededor del extrem o abierto del asa
e introduzca una aguja sin punta conectada a una jeringa de 1 mi. Apriete el
nudo e inyecte 0.4 mi de la solucin de KRP-glucosa para los experimentos en
los cuales se est midiendo la velocidad de absorcin o 0.4 mi de la solucin de
aminocidos para los experimentos en que se estudian gradientes de
concentracin (figura 10.2 (d)); apriete el nudo y saque la aguja. Todos los
nudos tienen que estar suficientem ente apretados para prevenir la salida de
lquido, pero debe tenerse cuidado de que no sean tan fuertes que daen el
tejido.
Metabolismo 281
Intestino: lado seroso, lado mucoso
(b) Intestino invertido
Corte ac Isadoras
I
(c) Asas invertidas de 23 cm de longitud
. . , . ., Jeringa 1 mi
0.4 mi de sustancia problema .
(d) Segmentos de asas con sustancia problema en su interior
Figura 10.2 Preparacin de asas invertidas de intestino delgado de rata
Transporte de aminocidos. S u m erja el asa en 15 m i de solucin de histidina 5

mmol/1; b u rbujee 95% 0 2/5% C 0 2, tape el frasco y agite d u ran te 10 m in en un
bao a 37 C. Al finalizar este perodo de tiem po tom e 0.2 m i de la solucin que
se encuentra dentro del asa (lado seroso) y 0.2 m i de la del medio (lado
mucoso), desproteinice y d eterm in e la L-histidina.
Al final del experim ento, vace el asa, seque con papel de filtro (W hatm an
No. 54) y pese el tejido luego de rem over los hilos.
Determinacin de histidina. En u n tubo de ensayo m ezcle 2 m i de la solucin
de cido actico con 0.2 m i de la solucin problem a, tape con u n a bola de vidrio
y coloque los tubos en u n bao de agua hirviendo d u ra n te 10 m in. E nfre y

agregue agua destilada hasta obtener u n volum en final de 5 mi. F iltre o
centrifugue segn lo re q u ie ra la cantidad de precipitado.
Tome 2 mi de la solucin desproteinizada, agregue 0.4 m i de cido
sulfanlico (10 g/1 en H C11 mol/1), m ezcle vigorosam ente y agregue 0.4 m i de
nitrito de sodio (50 g/1). Sacuda el tubo y djelo reposar d u ran te 5 m in
agitando de vez en cuando. A gregue 1.2 m i de la solucin de carbonato de sodio
(75 g/1) y agite fu erte m en te d u ran te 10 s. aproxim adam ente. A gregue 4 m i de
etanol (20% v /v ) y 2 m i de agua, mezcle vigorosam ente y despus de 30 m in lea
la extincin a 498 n m contra un blanco de agua destilada. P ara calcular la
concentracin de histidina presen te se p rep ara u n a curva patr n usando
volm enes de 0 a 2 m i de histidina 0.15 m m ol/1 en lugar de los 2 mi de la
solucin desproteinizada.
Clculos
1. Calcule el g radiente de concentracin, esto es, la diferencia de concen
traciones del am inocido en el fluido de la p arte serosa y en el fluido de
la p arte mucosa.
2. Exprese la velocidad de absorcin como m icrom oles de am inocido
absorbido por gram o de tejido por ho ra (pinol g - 1 h - 1).
3. Calcule el porcentaje de recuperacin com parando la cantidad de
am inocido encontrada en el fluido mucoso y en el fluido seroso, con la
cantidad aadida originalm ente.
Experimentos adicionales
1. Exam ine el efecto de varios inhibidores sobre la absorcin de L-
histidina.
2. C om pare la absorcin de las form as L y D de la histidina.
3. C om pare la velocidad de absorcin de diferentes azcares usando u n a
prueba para carbohidratos totales (experim ento 6.12).
EXPERIMENTO 10.4 Absorcin de xilosa en el intestino hum ano

Fundamento
Absorcin de xilosa. Esta p rueba se usa en qum ica clnica p ara detectar
defectos en la absorcin en la p arte superior del intestino delgado. Se usa la
pentosa D-xilosa puesto que este azcar no es metabolizado. Adems, no
existe m ecanism o de reabsorcin en el ri n y el azcar es excretado en la
orina. La prueba se hace determ inando la cantidad total de D-xilosa excretada
5 h despus de u n a dosis oral de 5 g del azcar. D u ran te este perodo, una
persona norm al excreta 2350% de la dosis, m ien tras que las personas que
tienen esteatorrea debido a m ala absorcin, ex cretan m enos del 20%.
D eterm inacin de xilosa. C uando se calienta xilosa en solucin cida se
produce furfural, el cual reacciona con p-brom oanilina dando un complejo de
color rosado, cuya extincin se puede m ed ir en u n colorm etro.
Metabolismo 283
Materiales 100
1. Reactivo de p-brom oanilina. (Disuelva 20 g de p-bro- 61
m oanilina en cido actico glacial saturado con 4 g de
tiourea, com plete hasta 1 1 con cido actico; agite bien
y filtre.)
2. D-xilosa p u ra p ara consum o hum ano. 300 g
3. P atrones de D-xilosa (0.1 g/1. P rep ren se frescos). 11
5. Colorm etros. 50
Mtodo
Prueba. La persona a quien se va a practicar la p ru eb a debe estar en ayunas
desde el da anterior. A ntes de to m ar el azcar debe o rin ar y se descarta esta
orina. Luego tom a u n a solucin de 5 g de D-xilosa disuelta en 300 m i de agua.
Recoja m uestras de o rina cada hora d u ran te las cinco horas siguientes. Mida
su volum en y la concentracin de D-xilosa presente.
Determinacin de D-xilosa. En u n tubo de ensayo diluya la orina 1 a 10 y 1 a
50, tom e 1 m i de cada dilucin y m ezcle con 5 m l del reactivo de color. Incube
d u ran te 10 m inutos en u n bao de agua a 70 C. E nfre a te m p eratu ra
am biente y deje luego reposar en la oscuridad d u ra n te 70 m in hasta cuando
aparezca el color. R epita la p ru eb a usando 1 m i de solucin p atr n de D-xilosa
en lugar de la orina diluida; p rep are adem s u n control p ara las m u estras y u n
control para los patrones aadiendo 1 m i de o rina diluida o 1 m l del p atrn a la
solucin de p-brom oanilina y lea in m ed iatam en te los colores.
Haga todas las pruebas por duplicado y lea las extinciones a 524 nm.
Clculos
La concentracin de la solucin de D-xilosa es 0.1 m g/m l; por lo tanto, si V es
igual al volum en de la m u e stra en m ililitros y D la dilucin, entonces la
cantidad de xilosa p resen te en la m u estra est dada por:
(E muestra E control de muestra ) / (E patrn E control de patrn ) X 0.1 X V X D (mg).
Haga histogram as 'd e la D-xilosa excretada cada h o ra y calcul el
porcentaje de xilosa excretada d u ran te el tiem po q u h a durado el
experim ento.
OXIDACION Y REDUCCION EN CELULAS VIVAS

Para ejecutar las m uchas y variadas funciones caractersticas de la m ateria
viva los organism os vivos req u ie ren u n sum inistro continuo de energa
(figura 10.3). En la m ayora de los casos esta energa se obtiene m ediante la
oxidacin de m etabolitos provenientes de la digestin de los alim entos (figura
10.3). La oxidacin puede efectuarse en tres form as diferentes; sin em bargo,
OXIDACION DE LOS AUMENTOS
t ,
Fuente de energa
Figura 10.3 Intercam bio de energa en los organism os vivos
todas tienen en com n el im plicar la prdida de electrones del com puesto que
se oxida (figura 10.4).
La energa qum ica p resen te en los alim entos y q u e se libera d u ran te los
procesos de oxidacin se deriva en ltim a instancia de la energa lum inosa del
sol captada por m edio de la fotosntesis. La reaccin total es u n proceso de
reduccin en el que los electrones se tran sfieren al com puesto que se est
formando.
adicin de oxigeno CH3C H 0 + /2 0 2 ------ CHjCOOH

acetaIdehido cido actico
remocin de hidrgeno
CH(OH)COOH CO-COOH
| + 2H
C H jC O O H CH jC O O H
cido mlico cido oxaloactico (al aceptor)
Transferencia de electrones'
citocromo (Fe + + ) > citocromo (Fe+++) + e
(al aceptor)
Figura 10.4 Mtodos de oxidacin biolgica

ATP ADP + P ATP
AH,
AH, = la mayora de sustratos ATP = adenosina trifosfato

NAD = mcotinamida adenina dinucletido ADP = adenosina difosfato
fp = fiavoproteinas Pi = fsforo inorgnico
Cit = citocromos
Metabolismo
Figura 10.5 Cadena de transporte electrnico
285
La oxidacin y la reduccin estn siempre ligadas de manera anloga a

como lo est la formacin de un cido y su base conjugada, y no puede darse la
una sin la otra. Por lo tanto, es ms exacto hablar de una reaccin redox.
AH < = t A + H+
Acido Base Protn
conjugada
B B+ + e
Oxidante Reductor Electrn
EXPERIMENTO 10.5. Oxidacin biolgica y transporte de electrones
Fundamento
Casi todas las oxidaciones biolgicas se efectan por remocin de hidrgeno
del sustrato. Los tomos de hidrgeno son luego transferidos a un aceptador el
cual puede ser uno de los nucletidos de piridina, NAD+ o NDP+. En las
clulas aerbicas la reduccin de NAD es seguida de una serie de
transferencia de electrones hasta llegar a la formacin de agua (figura 10.5).
Esta secuencia de compuestos redox se conoce como la cadena de transporte
electrnico o cadena respiratoria y se halla presente en la mitocondria.
El transporte de electrones se puede estudiar en el laboratorio midiendo la
cantidad de oxgeno consumido mediante un electrodo de oxgeno. Alterna
tivamente, se puede usar un compuesto que acte como un aceptor artificial
de electrones y que cambie su color al oxidarse o reducirse. En este experi
mento el 2,6-diclorofenolindofenol (DFI), acepta electrones liberados por la
flavoprotena reducida (fp. 2H) reducindose a la forma incolora. La veloci
dad de transferencia de electrones puede entonces medirse siguiendo la pr
dida de color del pigmento.
C1
C1
2,6-Diclorofenolindofenol (DFI)
fp.2H + DFI fp + DFI.2H

(azul) (incoloro)
Metabolismo 287
Materiales 10
1. Corazn fresco. 20 g
2. Molinos de carne. 5
3. Muselina.
4. Arena lavada con cido.
5. Amortiguador de fosfato de potasio (50 mmol/1, pH 7.4). 250 mi
6. Morteros con sus manos. 5
7. Hielo. -
8. 2,6-Diclorofenolindofenol (1.5 mmol/1 en el amortiguador 50 mi
de fosfato).
9. Sustratos (soluciones de glucosa, succinato y lactato 20 mi
(90 mmol/1) en amortiguador de fosfato).
10. NAD en amortiguador de fosfato (5 mmol/1). 20 mi
Mtodo
P r e p a r a c i n d e l e x t r a c t o . Muela 3 g de msculo cardaco y colquelos en un
vaso de precipitados de 250 mi; agregue 200 mi de agua helada; agite durante 1
min y deje reposar 1 min ms. Decante cuidadosamente el agua y lave el tejido
dos veces ms con agua en la forma indicada. Filtre el tejido a travs de la
muselina y exprima ligramente para remover el exceso de lquido.
Transfiera el tejido a un mortero previamente enfriado en un bao de
hielo, y mulalo junto con un volumen igual de arena y alrededor de 4 mi de
amortiguador de fosfato helado. Contine con esta extraccin por lo menos
cinco minutos, y entonces decante cuidadosamente la suspensin a travs de
dos capas de m uselina estiradas sobre un embudo de vidrio. Recoja el extracto
en un tubo de ensayo y almacene sobre hielo hasta cuando se necsite.
O x i d a c i n d e s u s t r a t o s . Prepare una mezcla patrn de reaccin en la forma
como se indica a continuacin para determinar si la glucosa, el lactato, o el
succinato son oxidados por el extracto de msculo de corazn.
Conc. final de los

Soluciones Vol (mi) reactivos (mniol/1)
DFI (1.5 mmol/1) 0.5 0.25
Sustrato (90 mmol/1) 0.5 15.0
NAD (5 mmol/1) 0.5 1.0
Amortiguador de fosfato de 0.5
potasio (50 mmol/1, pH 7.4)
Incube la mezcla a 37 C durante 5 min y comience la reaccin agregando 1 mi

de extracto de corazn previamente calentado a 37 C durante 5 min. Anote
cuidadosamente el tiempo que lleva la decoloracin del colorante y exprese la
actividad como el recproco del tiempo. Si no hay prdida del color despus de
30 minutos, la actividad ser cero.
Efecte experimentos con tubos de control adecuados e investigue si se
necesita el NAD para la oxidacin de estos sustratos.
EXPERIMENTO 10.6 Demostracin de la fosforilacin oxidativa

Fundamento
Transporte de electrones. La transferencia de hidrgeno de un sustrato
(AH2) al NAD generalmente est acompaada por un pequeo cambio en la
energa libre.
AH2 + NAD+ A + NADH + H+

AG pequea
Sin embargo, la subsiguiente oxidacin de la coenzima reducida por oxgeno

molecular libera una gran cantidad de energa:
NADH + H+ + V402 ------ NAD+ + H20

AG0' = -217 kJ/mol
La liberacin de esta energa no se efecta en una sola etapa, tal como se

sugiere en la ecuacin anterior, sino que tiene lugar en una serie de etapas
sucesivas en la cadena de transporte de electrones. Esto se puede comparar a
la diferencia que existe entre saltar de un segundo piso al suelo o bajar por las
escaleras. El cambio total en energa es el mismo en ambos casos, pero el usar
las escaleras es menos traumtico y tambin puede hacerse ms fcilmente
en el sentido contrario.
Formacin de ATP. En la cadena de transporte de electrones, la energa no
slo es liberada en etapas discretas, sino que en ciertos puntos es convertida a
una forma que puede ser utilizada por la clula. La adenosina trifosfato (ATP)
es la moneda circulante de energa de la clula, y la energa libre estndar
para la formacin de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico es 30 kJ/mol.
ADP + P ------ ATP + H20

AG' = +30 kJ/mol
El mecanismo exacto de esta fosforilacin oxidativa es an materia de
controversia, pero se sabe que existen algunas formas de acople entre la
oxidacin y la fosforilacin del ADP. En el caso de las deshidrogenasas que
usan NAD como coenzima, se incorporan tres molculas de fosfato (P) en
otras tantas de ATP por cada tomo de oxgeno (O) usado. Por lo tanto se Ob
tiene un cociente P/O de 3. Algunos sustratos, tales como succinato y acil-
Metabolismo 289
CoA; reaccionan directamente con las flavoprotenas saltndose la etapa en

que se usa NAD: en estos casos se obtiene un cociente P/O de 2 (figura 10.5).
L a t r a m p a d e l a h e x o c i n a s a . Tambin se incluye en la mezcla reaccionante
glucosa y la enzima de hexocinasa para que el P incorporado en el ATP
durante la fosforilacin oxidativa, sea atrapado en forma del compuesto
estable glucosa-6-fosfato.
Glucosa + ATP ------------- * Glucosa-6-fosfato + ADP

Hexocinasa
Si se omite la trampa de hexocinasa, las ATPasas mitocondriales rompen el

ATP y por tanto se obtendrn valores bajos de incorporacin de P. Se mide el
contenido de P en el medio antes y despus del experim ento y la respiracin
se demuestra por medio de la decoloracin del azul de metileno.
O x i d a c i n d e l a z u l d e m e t i l e n o . El potencial redox de las formas oxidada y
reducida del azul de metileno (AM + 2H AM 2H) es muy cercano al del
complejo ubiquinona (CoQ + 2H CoQ* 2H). Por lo tanto, el azul de
metileno puede competir muy favorablemente con la ubiquinona por los
equivalentes reductores y en este caso es posible que se utilicen dos caminos
de flujo de electrones a partir del glutamato.
,A M ----- -> AMH2

Glutamato - NAD fp<" h 2ch= ----- VfeO,
^ C o Q ---- Citocromos * > H20
D urante la respiracin activa la va aerbica com pite ventajosam ente con

la del azul de m etileno y por consiguiente el colorante slo se decolora
parcialm ente hasta tan to no se haya usado todo el oxgeno. En este m om ento,
el azul de m etileno se decolora com pletam ente porque la cadena resp irato ria
deja de funcionar. Si se incluye u n agente desacoplador tal como el 2,4-
dinitrofenol, la velocidad de la respiracin se au m en ta y el cam bio de color
ocurre ms rpidam ente. El cianuro bloquea el flujo de electrones inhibiendo
la citocromo oxidasa, la cual acta al final de la cadena. En presencia de
cianuro, el azul de m etileno se descoloriza m u y rpidam ente, pero no pierde
totalm ente el color, ya que el colorante es oxidado fcilm ente por el oxgeno
m olecular que an se en cu e n tra presente.
Materiales v 10
1. Medio de sacarosa (sacarosa 300 mmol/1; EDTA 0.5 11
mmol/1, pH 7.4).
2. Ratas (200-300 g). 2
3. Homogenizador coaxial y motor elctrico. 2

4. Hielo.
5. Ultracentrfugas refrigeradas. 2
6. Medio de incubacin. (Prepare la mezcla dada en la 50 mi
tabla, ajuste con lcali a pH 7.4 y complete el volumen
hasta obtener las mlaridades indicadas.
Componentes mmol/1
Glucosa 150
k h 2p o 4 50
EDTA 3
ATP 3
NAD 0.2
Albmina de suero bovino 2.5 mg/ml
Hexocinasa cruda 0.5 mg/ml
Se aade ATP puesto que es ms barato que ADP y de

todas formas el ATP es convertido inmediatamente a ADP
por la enzima hexocinasa. EDTA rem ueve los metales
pesados que puedan encontrarse como contaminantes
de los reactivos. NAD se incluye para suplir cualquier
prdida que ocurra al aislar las mitocondrias. La alb
mina de suero bovino rem ueve los desacopladores de la
fosforilacin oxidativa tales como cidos grasos de cadena
larga, que puedan acumularse en mitocondrias aisladas.)
7. 2,4-Dinitrofenol (5 mmol/1). 10 mi
8. Azul de metileno (250 g/1). 10 mi
9. Cianuro de potasio (50 mmol/1). ( E s v e n e n o s o . ) 10 mi
10. Sacarosa (1 mol/1 que contiene MgCl2 25mmol/1). 25 mi
11. Acido triclorpactico (100 g/1). 500 mi
12. Baos de agua a 37 C con agitador. 5
13. Reactivos para la determinacin de fosfato (expe-
rimento 4.3).
14. Parafina lquida (conservada bajo nitrgeno). 100 mi
15. Cilindros de nitrgeno. 3
16. Glutamato de hidrgeno y sodio (0.2 mol/1). 10 mi
Mtodo
d e m i t o c o n d r i a s d e h g a d o . Mate una rata por dislocacin del
P re p a ra c i n
cuello, sngrela y rpidamente extrigale el hgado. Lave el tejido con el
medio de sacarosa previamente enfriado a la temperatura del hielo para re
mover la sangre. Remueva el exceso de lquido con papel de filtro y coloque
en un vaso de precipitados previamente pesado. Efecte todas las operaciones
Metabolismo 291
siguientes en un cuarto fro y mantenga la temperatura de todas las

soluciones y aparatos por debajo de 4o C. Agregue 10 ml del medio de sacarosa,
por cada gramo de hgado y homogenice en el homogenizador coaxial.
Conecte la manija del rotor del homogenizador al motor elctrico, introdzca
la parte gruesa del rotor en el vaso correspondiente del homogenizador y
manteniendo ste ltimo fijo permita que el rotor alcance 2400 rev/m in.
Mueva el vaso lentam ente de arriba a abajo por 810 veces asegurndose de
que la parte gruesa del rotor toque el fondo del vaso cada vez.
Centrifugue la suspensin a 600 g durante 10 min tal como se indica en el
esquema siguiente (figura 10.6). Lave dos veces la mitocondria y almacnela
sobre hielo hasta que se necesite. Esta preparacin contiene suficiente m i
tocondria para el trabajo de tres parejas. Para un grupo de 1012 estudiantes
se necesita matar dos ratas.
Prepare cinco tubos de incubacin tal como se indica ms abajo. Utilice
tubos pyrex para los nmeros 1 y 2 y tubos de ensayo corrientes para 3,4 y 5.
Los materiales deben agregarse en el orden que se indica y se debe mezclar
fuertemente despus de cada adicin.
Homgenizado de hgado (10 g/100 mi en sacarosa 0.3 mol/l amortiguada).
10 min a 600 g
Sobrenadante Precipitado (resuspenda en la mitad

del volumen de sacarosa)
t Combine 10 min a 600 g
Sobrenadante Precipitado: ncleo y partculas

celulares.
10 min a 8000 g
Sobrenadante Precipitado: mitocondrias crudas.

(Resuspenda en el mismo volumen de
sacarosa y lave dos veces mediante
centrifugacin.)
10 min a 8000 g
Sobrenadante Precipitado: mitocondrias lavadas
Figura 10.6 Aislamiento de mitocondrias a partir de hgado de rata

., , , v Fosfato Respiracin
Contenidos (mi) j 2 3 4
Medio de incubacin 1 1.0 1.0 1.0 1.0
Glutamato cido de sodio (0.2 mol/1) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
2,4-Dinitrofenol (5 mmol/1) 0.1 0.1
Azul de metileno (0.25 g/1) 0.2 0.2 0.2
Cianuro de potasio (50 mmol/1) 0.1
Agua 0.3 0.2 0.1
Sacarosa (1 mol/1 que contiene MgCl2 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
25 mmol/1)
Suspensin mitocondrial (lavada dos 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
veces con sacarosa)
Determinacin de fosfato. Lleve las mezclas de los tubos 1 y 2 a 37 C y en el

minuto cero agregue las mitocondrias. Mezcle vigorosamente y de inmediato
retire una muestra de 0.2 mi y desproteincela mezclando con 2.8 mi de cido
tricloroactico 100 g/1. Retire por centrifugacin la protena precipitada y
determine el contenido de P en una alcuota del sobrenadante, tal como se
indic en el experimento 4.3.
Tape los tubos y colquelos en un bao de agua con agitacin a 37 C. Tome
alcuotas adicionales cada 5 minutos y determ ine el contenido de P, tal como se
indic anteriormente. Haga un grfico de la desaparicin de P del medio e
interprete los resultados.
Captacin de oxgeno. Agregue aproximadamente 2 mi de parafina lquida a
los tubos 3,4,5 e incube a 37 C sin agitar; observe los cambios en la coloracin
con relacin al tiempo. Interprete los cambios ocurridos, teniendo en cuenta
las observaciones que se hicieron al comienzo de este experimento.
EXPERIMENTO 10.7 Hidrlisis Acida de adenosina trifosfato (ATP)

Fundamento
El ATP es un compuesto de fundamental importancia en la transferencia de
energa. Una gran parte de la energa liberada en la oxidacin de los
carbohidratos y grasas es atrapada en la molcula de ATP durante la
fosforilacin oxidativa. La energa capturada puede usarse para impulsar
muchas reacciones biosintticas. Por lo tanto el ATP puede considerarse
como la moneda circulante de energa de las clulas vivas.
Muchos textos de bioqumica consideran el ATP como un fosfato de alta
energa y se refieren a enlaces fosfatos de alta energa, como si hubiese
enlaces fosfatos especiales. Esto, por as decirlo, es muy inexacto, pero se usa
corrientemente y causa desesperacin a los fisicoqumicos. Se dice que el
ATP tiene un enlace de fosfato de baja energa y dos de alta energa (~ ) y
con frecuencia se representa as:
Adenosina p ~ p ~ p
Metabolismo 293
Cuando se hidroliza el fosfato terminal de ATP, el cambio en la energa libre

es bastante alto (AG0 ' = 30 kJ/mol). Adems, cuando una m ol de A D P se
hidroliza dando AMP y fosfato inorgnico, se liberan otros 30 kJ, mientras que
el cambio en la energa libre asociado con la hidrlisis del tercer grupo fosfato
es mucho ms pequeo. De aqu surgieron los trminos enlaces fosfato de
baja energa y alta energa a pesar de que la energa no est concentrada en
estos enlaces.
Se deca entonces que el ATP y unos pocos compuestos ms posean
enlaces fosfato de alta energa mientras que otros steres de fosfato tenan
una energa de hidrlisis mucho ms baja, por ejemplo, la hidrlisis de 1 mol
de glucosa-6-fosfato libera slo 12 kJ/mol.
Materiales 100
1. Reactivos para la determinacin de fosfato inorgnico
(experimento 4.3).
2. Adenosina trifosfato (10 mmol/1). 200 mi
3. Adenosina difosfato (10 mmol/1). 200 mi
4. Adenosina monofosfato (10 mmol/1). 200 mi
5. Glucosa-6-fosfato (10 mmol/1). 200 m i
6. Acido sulfrico (1 mol/1). 1.51
7. Acido perclrico (60%). 100 mi
8. Matraces volumtricos (10 mi). 50
9. Bolas de vidrio.
Mtodo
F o s f a t o t o t a l . En un tubo de ensayo mezcle 0.2 mi de la solucin del compuesto
fosforilado con 0.5 mi de cido perclrico al 60%; coloque una bola de vidrio
encima del tubo para prevenir prdidas por evaporacin y caliente en un bao
de agua hirviendo durante 45 minutos. Deje enfriar el tubo encima de la mesa
durante 5 min y complete el enfriamiento colocando el tubo debajo del agua
corriente. Transfiera cuantitativamente el contenido al matraz volumtrico
de 10 mi, complete hasta la marca con agua destilada, m ezcle vigorosamente y
retire 2 mi para la determinacin de fosfato.
F o s f a t o l i b e r a d o p o r h i d r l i s i s c i d a . En un tubo de ensayo grande mida 4.5
mi de cido sulfrico 1 mmol/1 y colquelo en un bao de agua hirviendo
durante 10 min. Al tiempo 0, agregue 0.5 mi de la solucin problema al cido
caliente, mezcle vigorosamente y retire alcuotas de 0.2 mi cada minuto
durante 5 min y luego a intervalos de 5 minutos hasta completar 1 h. Agregue
1.8 mi de agua destilada a cada muestra y mida la concentracin de fosfato
inorgnico presente (experim ento 4.3).
Haga un grfico de la cantidad de fosfato liberado con respecto al tiempo y
compare con el contenido total de fosfato de los compuestos.
EXPERIMENTO 10.8 P ro d u cci n d e p iru v a to y a c e ta ld e h d o d u ra n te la

fe r m e n ta c i n d e glu cosa p o r le v a d u ra
Fundamento
F erm en ta ci n . La primera etapa del metabolismo de glucosa en levadura es
la produccin de piruvato. Este proceso, que se efecta mediante una serie de
reacciones que involucran un nmero considerable de intermediarios, se
conoce como fermentacin o gliclisis. La reaccin total podra considerarse
como la transferencia de dos pares de tomos de hidrgeno de la glucosa al
NAD (figura 10.7). Puesto que la coenzima se encuentra slo en cantidades
catalticas, es necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda, y as, el
NADH2 formado es reconvertido a NAD por oxgeno molecular a travs de la
cadena respiratoria. Esto no es posible en condiciones anaerbicas y en este
caso la reoxidacin se efecta cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo,
y luego en alcohol tal como se muestra en la figura 10.7.
D em o stra ci n d e los in te r m e d ia r io s m eta b lico s. Los metabolitos de piruva
to y acetaldehdo se encuentran presentes norm alm ente en muy bajas con
centraciones, por tanto, para demostrar su existencia como intermediario en
el camino metablico, es necesario impedir que sean transformados en otros
compuestos. Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan caminos
metablicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversin del
compuesto, que se est investigando mediante inhibidores. Tambin se
pueden cambiar las condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a
una velocidad muy por debajo de su actividad mxima, o se puede usar un
agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda
metabolizarse. Estos dos ltimos procedimientos se ilustran en el experim en
to siguiente.
La pirvico-decarboxilasa (2-oxocido carboxi-liasa, 4.1.1.1.) no es activa
en soluciones ligeram ente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y
2 NAD + C6 H, , 0 6 ----------------- 2 N A D H , + 2 C H ,C O C O O H
Pirvico
Decarboxilasa
T , M g t+
2 C , H sOH 2 C H .C H O + CO
Figura 10.7 Oxidacin aerbica y anaerbica de glucosa en la levadura

Metabolismo 295
su presencia puede demostrarse por la reaccin con nitroprusiato de sodio o

2,4-dinitrofenilhidrazina.
En el segundo experim ento se aade a la mezcla de incubacin sulfito de
sodio, que atrapa el acetaldehdo. La presencia de acetaldehdo puede
demostrarse por el color azul producido por la reaccin con nitroprusiato de
sodio y piperidina.
Materiales 100
1. Fosfato de sodio dibsico (0.5 mol/1). 500 mi
2. Fosfato de potasio monobsico (0.5 mol/1). 500 mi
3. Suspensin de levadura (100 g/1 en Na2 H P 0 4). 500 mi
4. Suspensin de levadura (100 g/1 en KH P 0 4). 500 mi
5. Suspensin de levadura (100 g/1 en agua). 11
6. Glucosa (100 g/1). 21
7. Nitroprusiato de sodio (50 g/1, preprese antes de usar). 10 g
8. Hidrxido de amonio. 500 mi
9. Sulfato de amonio.
10. Sulfito de sodio. 60 g
11. Hidrxido de sodio (100 g/1). 200 mi
12. Hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina. 200 mi
(Solucin saturada en cido clorhdrico 2 mol/1).
13. Piperidina (30 g/1 en solucin acuosa). 500 mi
Mtodo
Formacin de piruvato a partir de glucosa. En dos tubos de ensayo pyrex
pipetee 5 mi de solucin de glucosa (A y B); al tubo A agregue 5 mi de
suspensin de levadura en solucin ligeramente alcalina de Na2 H P 0 4 y al
tubo B aada 5 mi de la suspensin de levadura en solucin rida de KH2P 0 4.
Coloque los tubos en un bao de agua a 37 C durante 1 h, luego aada a cada
tubo 2 mi de la solucin de cido tricloroactico, mezcle vigorosamente y
centrifugue durante 10 min a 2500 g. Separe el sobrenadante y selo para la
determinacin de piruvato.
Determinacin de piruvato mediante nitroprusiato de sodio. En un tubo de

ensayo agregue 2 ml del sobrenadante hervido previamente a 1 g de sulfato de
amonio slido. Agregue dos gotas de solucin de nitroprusiato de sodio (50 g/1)
recin preparada, mezcle vigorosamente, y deje deslizar cuidadosamente por
las paredes del tubo amoniaco concentrado hasta que se formen dos capas. Si
hay piruvato, se forma un anillo verde o azul en la interfase de los dos lqui
dos. La formacin de un anillo rosado transitorio en la interfase indica la pre
sencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloracin azul
o verdosa caracterstica de la reaccin con piruvato.
Determinacin de piruvato con 2,4-dinitrofenilhidrazina. Agregue 1 mi de

solucin saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina a 2 mi de sobrenadante, mezcle
fuertemente y coloque dos o tres gotas de la mezcla en un tubo de ensayo,
agregue 1 mi de solucin de hidrxido de sodio (100 g/1) y diluya con agua
hasta 5 mi. La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato.
Formacin de acetaldehdo a partir de glucosa. En dos tubos marcados C y D
pipetee 5 mi de la solucin de glucosa, agregue a ambos tubos 5 mi de la
suspensin de levadura en agua, al tubo D aada 0.5 g de sulfito de sodio.
Mezcle vigorosamente e incube los dos tubos a 37 C durante 1 h. Centrifugue,
separe el sobrenadante, mezcle 2 mi de sobrenadante con 0.5 mi de solucin
fresca de nitroprusiato de sodio y 2 mi de piperidina acuosa y agite. Si hay
acetaldehdo presente, se observar una coloracin azul.
EXPERIMENTO 10.9 Produccin de equivalentes reductores por cloroplastos

aislados
Fundamento
La sntesis de carbohidratos a partir de agua y dixido de carbono ocurre en
dos etapas, conocidas como la reaccin de luz y oscuridad. La reaccin de luz
que se demuestra en este experimento se efecta solamente en presencia de
radiacin visible, que es absorbida por el pigmento verde presente en
cloroplastos. Los electrones presentes en la clorofila son promovidos a niveles
ms altos de energa y retornan al estado inicial durante una serie de
reacciones sem ejantes a las que ocurren en la cadena respiratoria de la
mitocondria. Durante este proceso de transporte de electrones se produce
ATP. Al mismo tiempo, se producen equivalentes reductores en forma de
NADPH2 y se libera 0 2 (figura 10.8).
La fotolisis del agua en cloroplastos aislados fue demostrada inicialmente
por Hill y se conoce como la reaccin de H ill. En este experimento se
pretende demostrar la produccin de equivalentes reductores al iluminar
cloroplastos aislados de hojas de espinaca. Esto se hace incluyendo en la
mezcla reaccionante un aceptor artificial de hidrgeno (2,6-diclorofenolindo-
fenol). La reduccin del colorante no se efecta en la oscuridad.
Materiales 10
1. Hojas de espinaca frescas. 1 kg
2. Bolsas plsticas para las hojas. 5
3. Medio de separacin (sacarosa 0.4 mol/1 que contiene 21
amortiguador de fosfato potsico 0.06 mol/1, pH 6.5).
4. Mezcla de reaccin (amortiguador de fosfato de potasio 11
0.03 mol/1, pH 6.5 que contiene cloruro de potasio
0.01 mol/1).
5. Licuadoras. 5
Metabolismo 297
A
Ferrodoxina
NAD P H ,
Citocromo
Plastoquinona
Clorofila a + Clorofila b *
F o to s is te m a I F o to s is te m a II
1 Luz
Figura 10.8 Formacin de ATP y NADPHj durante la fotosntesis
6. Muselina.
7. Acetona (80% v /v en agua). 200 mi
8. 2.6-Diclorofenolindofenol (0.1 mol/1 en el medio de 500 mi
reaccin).
9. Dtionita de sodio.
10. Lmparas de mesa con bombillo de 100 W. 5
11. Centrfugas refrigeradas. (Puede usarse una centrfuga 5

de mesa en el cuarto fro.)
12. Matraces volumtricos (25 mi). 5
Mtodo
Aislamiento de cloroplastos. Lave las hojas varias veces con agua, djelas
escurrir, y colquelas en una bolsa plstica en el cuarto fro durante unas
horas hasta que las hojas se hinchen. Los pasos subsiguientes se llevan a cabo
con materiales helados y en el cuarto fro con el fin de m antener la integridad
de los cloroplastos. Separe las nervaduras de las hojas, pese las hojas y en una
licuadora homogenice 100 g con 100 mi de medio de sacarosa, durante
aproximadamente 2 min. Filtre la solucin verde a travs de varias capas de
muselina y centrifugue el sobrenadante a 200 g durante 2 min en una
centrfuga refrigerada para sedimentar las clulas que no se han roto, los
ncleos y pedazos de hojas. Separe el sobrenadante y centrifugelo en fro
durante 10 min a 1000 g. Lave los cloroplastos suspendiendo el sedimento en el
medio de separacin, centrifugue una vez ms bajo las mismas condiciones.
Finalmente, suspenda el precipitado de cloroplastos en 20 ml del medio de
reaccin helado, agitndolo suavem ente con una varilla de vidrio y
almacnelo sobre hielo hasta cuando se necesite.
Determinacin del contenido de clorofila. Agregue 1 mi de la suspensin de
cloroplastos a 10 mi de una solucin de acetona en agua 80% v /v , mezcle
fuertemente, y usando papel de filtro Whatman No. 1 filtre y recoja en un
matraz volumtrico de 5 mi. Enjuague los tubos con 5 mi de solucin acuosa
de acetona usndola luego para lavar el papel de filtro. Repita el lavado una
vez ms y complete hasta la marca de 25 mi con acetona 80% v /v . Mida la
extincin de la solucin verde a 652 nm contra un blanco de solvente.
Concentracin de clorofila (m g/m l) = Extincin a 652 nm x 5.8.
Reaccin de Hill. Diluya la suspensin de cloroplastos con la mezcla de
reaccin hasta obtener una concentracin de clorofila de aproximadamente 5
m g/m l y agregue 1 mi de la suspensin verdosa a 9 mi de la solucin de 2,6-
diclorofenolindofenol. Prepare tres tubos en la forma que se indic anterior
mente, coloque uno en la oscuridad durante el transcurso del experim ento e
inmediatamente lea la extincin del segundo tubo a 520 nm contra el tercer
tubo, al cual se han agregado varios cristales de ditionita de sodio para de
colorar completamente el colorante. Prepare un cuarto tubo que contenga
el doble de las cantidades de solucin y expngalo a la luz de un bombillo de 100
W. Coloque un matraz lleno de agua entre el bombillo y la muestra para que
sirva como un filtro de calor y tambin como lente para enfocar el rayo de luz
sobre la muestra. Siga la reduccin del colorante midiendo la extincin de las
muestras retiradas a intervalos convenientes hasta un tiempo de 30 min. Al
final del experim ento lea la extincin del tubo que se ha guardado en la
oscuridad.
Metabolismo 299
EXPERIMENTO 10.10 Produccin de almidn durante la fotosntesis

Fundamento
La segunda fase de la fotosntesis no requiere la presencia de luz y por
consiguiente se le conoce como reaccin de oscuridad. En esta fase hay
fijacin de dixido de carbono y se producen carbohidratos utilizando el
NADPH y ATP producidos durante la reaccin de luz.
6 C02 + 6 H2O + 1t ... -> C6H120 6 + 6 0 2

clorof"a Glucosa
Polimerizacin
(C6H!0O5)
Almidn
El producto final de la fotosntesis depende de la especie de la planta, pero la
mayora de las hojas almacenan los carbohidratos en forma de grnulos de
almidn. La luz visible es esencial para que se produzca la fotosntesis y en
ausencia de radiacin no se sintetiza almidn. Esto puede demostrarse en el
experimento siguiente cubriendo la mitad de la hoja con papel de aluminio y
tiendo con yodo para demostrar la presencia de almidn despus de que se
haya extrado la clorofila.
Materiales 10
1. Planta de hojas verdes cultivada a la sombra. 5
2. Papel de aluminio.
3. Lmparas de mesa conbombillo de 100 W. 5
4. Solucin de yodo (0.1 mol/1 en KI, 30 g/1). 200 mi
5. Solucin diluida de yodo (5 mmol/1 en KI 30 g/1). 200 mi
6. Perforadores de corchos. 5
7. Etanol (tipo industrial). 11
8. Parrillas elctricas. 5
Mtodo
Cubra la mitad de la hoja de la planta con papel de aluminio y expngala a la
luz solar o a un bombillo de 100 W a una distancia de 6090 cm durante 24 h. Al
da siguiente descubra la hoja y usando un perforador de corcho corte discos
de 12 cm de dimetro de las dos partes de la hoja. Coloque los discos en agua
caliente hasta que se ablanden las paredes celulares y luego extraiga la
clorofila con alcohol caliente sobre la parrilla elctrica (Sea cuidadoso:
posibilidad de incendio \ Cambie el etanol si es necesario, hasta que se haya
extrado toda la clorofila y transfiera el disco a un plato de Petri que contenga
solucin diluida de yodo. Compare la forma en que se han coloreado los discos
tomados de cada una de las dos partes de la hoja.
Otra forma de realizar este experim ento consiste en teir la hoja de una
planta jaspeada (tal como el Coleo) con yodo. En este caso, el almidn debe
estar presente slo en las porciones verdes, demostrando la necesidad de la

clorofila para la fotosntesis.
VITAMINAS Y HORMONAS
Las vitaminas son factores alimenticios, accesorios para m antener una buena
salud y su ausencia de la dieta produce enfermedades por deficiencia. Por
ejemplo, la falta de vitamina C (cido ascrbico) produce escorbuto y la
ausencia de vitamina B, (tiamina) origina el beri-beri.
Las hormonas son mensajeros qumicos producidos en las glndulas
endocrinas y que son transportados a los tejidos blancos donde actan
produciendo cambios bioqumicos y fisiolgicos profundos en el organismo.
Estos dos grupos de compuestos se consideran en conjunto puesto que slo
se necesitan pequeas cantidades para producir grandes cambios bioqumicos
o fisiolgicos. Adems de esto, las vitaminas y las hormonas tienen
estructura qumica diversa y participan en una gran cantidad de actividades
metablicas. Las vitaminas liposolubles se discuten en el captulo 7 y esta
seccin se dedica a la vitamina hidrosoluble C.
EXPERIMENTO 10.11 D e te rm in a c i n d el cido a scrbico u sa n d o 2,6-diclorofe-

n o lin d o fen o l
Fundamento
El cido ascrbico es oxidado por el colorante 2,6-diclorofenolindofenol a cido
dehidroascrbico. Al mismo tiempo, el colorante se reduce a un compuesto
incoloro permitiendo determinar fcilm ente el punto final de la reaccin.
CHjOH
Acido dehidroascrbico Pigmento leuco (incoloro)

Metabolismo 301
Adems del cido ascrbico otros com puestos pueden decolorar el

pigmento, pero la especificidad puede au m en tarse hasta cierto punto
efectuando la reaccin en solucin cida en la cual las sustancias que
interfieren reaccionan m uy lentam ente.
El 2,6-diclorofenolindofenol se obtiene com ercialm ente en form a de table
tas y cada una es equivalente a 1 mg de cido ascrbico.
Materiales 100
1. Solucin de 2,6-diclorofenolindofenol. (M uela u n a tableta 81
en aproxim adam ente 40 m i de agua caliente, en fre y
diluya hasta 50 mi; filtre la solucin si es necesario).
2. Solucin patrn de cido ascrbico (20 mg/1, prep rese 11
inm ediatam ente antes de usarse).
3. Acido actico glacial. 11
4. Jugos de fru tas (jugo de lim n, jugo de m ora, otros). 11
5. B uretas (10 m i). 50
6. Cloroformo. 500 mi
Mtodo
1. Para soluciones incoloras. En u n tubo resistente al calor pipetee 5 m i de
jugo de fru ta diluido que contenga aproxim adam ente 0.1 mg de vitam ina C,
agregue 1 mi de cido actico glacial y titu le con la solucin del colorante hasta
obtener un color rosa estable. A note el volum en usado p ara la titulacin (T).
Repita la titulacin usando p ara el blanco 5 m i de agua (El) y 5 m i de
solucin patrn de cido ascrbico (Pt) y calcule el contenido de v itam ina C en
la m uestra:
m ___ d j
V itam ina C en la m u estra (mg/100 m i) = ------------ x 2 x Dilucin.

Pt - Bl
2. Para soluciones coloreadas. Es difcil v e r el p u nto final cuando la m u estra
es m uy coloreada, por lo tanto, debe agregarse cloroform o a la m u e stra de
reaccin y el p unto final se logra cuando se obtiene u n color rosa estable en la
fase orgnica. La m u e stra y el blanco se tra ta n en form a idntica y el
contenido de vitam ina C se calcula como se indic an terio rm en te.
EXPERIMENTO 10.12 P ru eb a de saturacin con cido ascrbico

Fundamento
El cido ascrbico acta como u n a vitam ina en hum anos y en conejillos de
indias, los cuales no p u eden sin tetizar este com puesto. P or lo tanto, se
requiere el sum inistro de vitam in a C p ara m a n te n e r b u en a salud y cuando la
cantidad de la vitam in a en la dieta es suficiente se dice que los tejidos del
cuerpo estn saturados de esta vitam ina. En este caso, la cantidad de cido as-
crbico excretado en la o rina depende del ingerido. En u n a persona norm al,
la excrecin de vitam in a C en 24 horas es del orden de 1060 mg. Valores

por debajo de 10 m g /d a indican una deficiencia de vitam ina C. La m edi
cin de la v itam ina C excretada en un perodo de 24 horas puede usarse como
ndice de saturacin en sujetos hum anos, pero la recoleccin de m uestras de
orina de 24 horas no es m uy conveniente y es m s recom endable m edir la ex
crecin de cido ascrbico en la orina despus de in g erir u n a dosis alta de la
vitam ina. D espus de su m in istrar el cido ascrbico a la persona se m ide la
excrecin m xim a 4 6 horas despus d ingerida la dosis. Si la excrecin es
m enor de 4050 mg, se rep ite la p rueba hasta que se logre la satu raci n .
En el caso de personas adultas norm ales, la saturacin debe lograrse en 2
3 das, pero en casos de escorbuto se necesitan hasta 23 sem anas. Perodos de
tiem po interm edios e n tre stos dos indican algn grado de deficiencia de
vitam ina C.
Materiales 100
1. Tabletas de cido ascrbico (pueden obtenerse en la 50 g
farm acia).
2. Los mism os m ateriales del experim ento 10.11.
Mtodo
Prueba de saturacin. A continuacin se da un protocolo conveniente para
esta prueba:
7:30 a.m. Tom e u n desayuno ligero.
10:00 a.m. Ingiera la dosis de cido ascrbico (11 m g /k g del peso corporal) en
aproxim adam ente 100200 m i de agua.
2:00 p.m. Vace com pletam ente la vejiga y deseche la orina.
4:00 p.m. Vace la vejiga recogiendo la orina en u n recipiente adecuado,
' y m ida el volum en de la orina.
D eterm ine el cido ascrbico en la orina den tro de los 30 m in siguientes. Si
esto no fu ere posible, acidifique la o rina con cido actico (1 vol de cido
actico glacial por 9 vol de orina) y haga la determ inacin antes de 24 h.
Acido ascrbico urinario. A gregue 2 m i de cido actico glacial a 50 m i de

orina y diluya con agua a 100 mi. Titule alcuotas de 5 m l del colorante con
orina diluida hasta que la coloracin rosa desaparezca. Es im p o rtan te realizar
la titulacin en aproxim adam ente 2 m in puesto q u e com puestos diferentes al
cido ascrbico red u cen el colorante si se prolonga la titulacin, pero si la
titulacin se efecta m uy rpido, entonces se n ecesitara agregar m ucha orina
puesto que la reduccin del colorante por cido ascrbico no es instantnea.
Calcule la excrecin en m iligram os de la cantidad de la vitam ina excretada
d u ran te el perodo de la prueba. Los valores en el intervalo de 23 mg de cido
ascrbico significan probablem ente que no hay vitam ina C, puesto que p arte
de la reduccin del colorante se debe a la presencia de otros com puestos
reductores en la orina.
Metabolismo 303
Repita el experim ento en das sucesivos hasta ob ten er saturacin. P ara

una persona de peso norm al, la saturacin significa u n a excrecin de 4050
mg de cido ascrbico d u ra n te el perodo de recoleccin de la orina. Al final
del experim ento, ser probablem ente necesario d iluir la orina m s de dos
veces para poder titu larla.
EXPERIMENTO 10.13 V itam ina C en arvejas o frijoles en germ inacin

Fundamento
El cido ascrbico no acta como vitam ina en las plantas puesto que ellas
contienen todas las enzim as y cofactores necesarios p ara su sntesis.
Materiales
1. A rvejas o frijoles. 500 mg
2. Acido tricloroactico (50 g/1). 31
3. M ateriales usados en el experim ento 10.11
Mtodo
Haga un sem illero utilizando tie rra bien hm eda y divdalo en varios lotes. En
cada uno de ellos siem bre 1 g de arvejas (peso seco) y recolecte las arvejas de
los diferentes lotes 1, 2,3, etc. das despus de su germ inacin determ inando el
contenido de cido ascrbico en cada grupo recolectado.
Quite la tie rra ad h erid a lavando cuidadosam ente con agua y homogenice
la planta com pleta en 10 m i de cido tricloroactico (50 g/1). D iluya a 20 mi con
agua en u na probeta graduada, deje reposar por 15 m in agitando de vez en
cuando. C entrifugue y m ida el cido ascrbico en el sob ren ad an te tal como se
describi en el experim en to 10.11.
EXPERIMENTO 10.14 Efecto de la dieta y las horm onas sobre el contenido de

glicgeno en hgado de rata.
Fundamento
Inanicin. El glicgeno es el carbohidrato de reserv a en los anim ales y se
encuentra en el hgado, m sculo esqueltico, rin y en la m ayora de los
tejidos, pero prcticam ente no se en cu e n tra en el cerebro. El glicgeno
heptico m antiene el nivel de glucosa sangunea, por consiguiente, rep resen
ta la reserva central de com bustible para todos los tejidos del cuerpo. En un
anim al bien alim entado, la glucosa es convertida a glicgeno en el hgado
(glicognesis), pero d u ran te el ayuno completo, cuando ya no se absorbe
glucosa en el intestino, el glicgeno heptico se rom pe p ara d ar glucosa
(glicogenlisis) y se agota com pletam ente en aproxim adam ente 24 h. Despus
de este tiempo, se m an tien e la concentracin de glucosa sangunea m ediante
sntesis de glucosa a p a rtir de compuestos diferentes a los carbohidratos
(gluconeognesis) (figura 10.9). La sntesis y degradacin de glucosa es
G L IC O G E N O H E P A T IC O
(g lu c o s a ),,
F o s fo r ila s a y
a - 1 ,6 -g lu c o s id a s a
G lie o g e n lis is G l u c o s a - 1 -fo s fa t o
F o s fo g lu c o in u ta s a
P\ HjO
G LUCOSA
G lu c o s a -6 -fo s fa to
S A N G U IN E A
G lu c o s a - 6 -
f o s f a ta s a
G lu c o n e o g n e s is
G lic e r o l (a p a r t ir d e g r a s a )
A m in o c id o s ( p a r t ir d e p r o t e n a )
L a c ta t o {a p a r t ir d e g lic g e n o m u s c u la r )
Figura 10.9 Mantenimiento de la glucosa sangunea
controlada por varias horm onas, dos de las cuales se usan como ejem plo en
este experim ento.
Adrenalina. La horm ona adrenalina, sintetizada en la m edula adrenal, es

secretada en cantidades crecientes d u ra n te situaciones de stress y produce
cambios fisiolgicos en el anim al que le p erm iten so rtear situaciones de
em ergencia. Este efecto, ju n to con los cambios en el sistem a nervioso
sirriptico, se ha denom inado el m ecanism o de miedo, hu id a o lucha puesto
que p rep ara al anim al para so rtear la situacin en u n a de estas formas.
CH(OH)CH2-n h -c h -,
Adrenalina l|
HO
OH
La adrenalina produce tam bin cambios metablicos, incluyendo la

movilizacin de grasas del tejido adiposo y la ru p tu ra del glicgeno heptico
para producir glucosa, y del glucgeno m uscular para producir cido lctico
Metabolismo 305
A d e n i l c ic la s a
( in a c tiv a )
A d r e n a l in a ATP
F o s fo r ila s a
c in a s a
( in a c tiv a )
A d e n i l c ic la s a
( a c tiv a )
PP + A M P C 1 P --------- F o s fo r ila s a b
(in a c tiv a )
ADP
F o s fo r ila s a
c in a s a
(a c tiv a )
' lS k - ATP
F o s fo r ila s a a
(a c tiv a )
C a ta liz a la r u p t u r a
d e g lic g e n o a
g lu c o s a * 1 -fo s fa t o
Figura 10.10 Estimulacin de la glicogenlisis por la adrenalina
que aparece en la sangre. Este proceso, conocido con el nom bre de glicogenli
sis, se efecta usando como in term ed iario AMP - 3', 5' cclico, el cual au m en ta
la cantidad de la form a activa de la enzim a fosforilasa. El m ecanism o es un
poco com plejo y se ilu stra so m eram en te en el diagram a de la figura 10.10.
Cortisol. Algunos esferoides de la corteza ad ren al se conocen como glucocor-
ticosteroides debido a su efecto sobre el m etabolism o de los carbohidratos. El
cortisol y la cortisona, que son los esteroides m s activos, producen cambios
opuestos a los producidos por la insulina: la captacin de glucosa por los tejidos
dism inuye y la ru p tu ra de los carbohidratos tam bin dism inuye debido a la
movilizacin de grasas y a la sntesis de glicgeno a p a rtir de am inocidos en el
proceso conocido como gluconeognesis.
CH2OH
C=0
Cortisol (hidrocortisona)
O
Aislam iento de glicgeno. Las protenas y los cidos nucleicos se separan por
precipitacin con cido tricloroactico; luego se precipita el glicgeno con
alcohol acuoso, dejando as otros com puestos hidrosolubles en solucin. Se
puede ob ten er un a m ayor purificacin precipitando luego con alcohol.
Materiales 24
1. Ratas del m ism o peso y sexo. 12
2. A drenalin a (solucin estril p ara inyeccin). 1 mg
3. Cortisol (solucin estril para inyeccin). 20 mg
4. Acido tricloroactico (TCA) (50 g/1). 2.5 1
5. Etanol (95% v/v). 51
6. Eter. 11
7. Solucin de yodo (5 mm ol/1 en K I 30 g/1). 50 mi
8. H om ogenizadores. 6
9. D esecadores de vaco. 6
10. P apel de filtro W hatm an No. 54.
11. Reactivos p ara la determ inacin de glicgeno.
Mtodo
Preparacin de las ratas. A lim ente las ratas con dieta co rrien te d u ran te 1
sem ana; luego divdalas en cuatro grupos iguales (A, B, C y D). A lim ente los
grupos A y B ad lib itu m , y som eta los grupos C y D a ayuno d u ran te 48 h
antes del experim ento. Inyecte las ratas del grupo B su b cu tn eam en te con
adrenalina (10 pg/100 g de peso del anim al) y m telas 10 m inutos m s tarde.
Ocho horas antes de m a ta r las ratas del grupo D, aplqueles una inyeccin
subcutnea de cortisol (1.2 m g/100 g de peso) y rep ita esto cada 2 h hasta
cuando se m aten los anim ales. El grupo A son los controles alim entados y el
grupo C, los controles en ayunas.
A islam iento del glicgeno heptico. Sacrifique las ratas, saque los hgados tan
rpido com o sea posible y pselos. C orte el hgado en pedazos m u y pequeos
con tijeras y tran sfiera el tejido al hom ogenizador, pero deje a te m p eratu ra
am biente u na peq u e a porcin de peso conocido que se u sar m s tarde*.
D ecante el homogenizado, filtre a travs de papel de filtro W hatm an No. 54 y
recoja el filtrado en un frasco helado. A gregue la m itad del volum en original
de cido tricloroactico al sedim ento, hom ogenice b rev em en te y filtre como
se indic arriba. Tom e u n a gota de cada filtrado y agrguela a u n a gota de yodo
sobre una baldosa de porcelana. Diga lo que observa y el por qu.
Com bine los filtrados y agregue 2 vol. de etanol 95%. Agite la mezcla y
djela hasta cuando el precipitado de glicgeno flocule. Si en cu e n tra alguna
dificultad precipitando el glicgeno, agregue u n poquito de cloruro de sodio y
caliente ligeram ente. D espus de cen trifu g ar separe el sobrenadante,
Agregue al hgado cido tricloroactico (50 g/1) helado (aproximadamente 10 ml/g de hgado) y
homogenice.
Metabolismo 307
disuelva el precipitado en un volum en m nim o de agua y reprecipite el

glicgeno agregando 2 vol. de etanol 95%. C entrifugue el glicgeno y lave el
precipitado dos veces con 95% etanol y luego con un poco de ter. Recoja por
centrifugacin, extienda el residuo sobre un vidrio de reloj y seque en un
desecador.
Anote el porcentaje de m aterial recobrado y gurdelo.
Extraiga con cido tricloroactico la porcin de hgado que ha guardado a
tem peratura am biente y haga el ensayo de yodo como se indic an terio rm e n
te. Qu diferencia observa en esta fraccin y por qu?
Finalm ente, use el m todo de la an tro n a (experim ento 6.12) para
determ inar la cantidad de glicgeno p resente en su preparacin y anote el
porcentaje de recuperacin por gram o de peso hm edo de hgado.
Teniendo en cuenta sus conocimientos del m etabolism o, y las indicaciones
que se dan al comienzo del experim ento bajo el subttulo de FUNDAMENTO,
explique las variaciones observadas en el contenido de glicgeno en cada uno
de los grupos de ratas estudiados.
A d e n il ciclasa
(inactiva)
A d ren a lin a
Glucagn ATP
A CTH
A d e n il ciclasa P r o t e n a
(activa) c in a s a
( in a c tiv a )
PP + A M P c c lic o ' - L ip a s a
( in a c tiv a )
ATP
P r o t e n a -
c in a s a
(a c tiv a )
L ip a s a
(a c tiv a )
CH,OCOR CH2OH R ,C O O H
CHOCOR CHOH + R ,C O O H
d H ; OCOR3 CHj OH R jC O O H
T ria c i Ig lc e r o l g lic e r o l A c id o s g r a s o s
Figura 10.11 Movilizacin de grasas por hormonas

EXPERIMENTO 10.15 Control de la liplisis por horm onas en clulas grasas

aisladas
Fundamento
Liplisis. La liplisis es el rom pim iento de los triacilgliceroles p ara d ar
glicerol y cidos grasos; el proceso es estim ulado por varias horm onas,
incluyendo adrenalina, glucagn y algunos pptidos de la pituitaria. Estas
horm onas se u n en a la m em b ran a celular donde estim ulan la adenil ciclasa y
producen un aum ento en la concentracin de AMP cclico en la clula. Este, a
su vez, origina u n au m ento de la ru p tu ra de triacilgliceroles m ediante la
estim ulacin de la lipasa celular (figura 10.11). Este efecto de cascada es m uy
sim ilar al de la estim ulacin horm onal de la glicogenlisis (figura 10.10).
La liplisis en el anim al en tero puede estim arse m idiendo la cantidad de
cido graso o de glicerol liberado, pero en el proceso ocurre alguna
reesterificacin de cidos grasos para fo rm ar n u ev am en te triacilgliceroles.
Se cree que el glicerol no es m etabolizado en cantidades apreciables por las
clulas grasas debido a la poca actividad de la enzim a glicerosinasa. La
velocidad de produccin del glicerol constituye pues u n a m edida m s exacta
de la liplisis, ya que la produccin de cidos grasos m ide la actividad de la
liplisis m enos la de reesterificacin.
En el experim ento siguiente se m ide la produccin de cidos grasos y
glicerol en clulas grasas aisladas en presencia y en ausencia de la horm ona
adrenalina. El efecto de la ad ren alin a vara en presencia de glucosa o insulina
y esto tam bin se d em u estra en este experim ento.
Materiales 10
1. M ateriales p ara la separacin de clulas grasas usados
en el experim ento 10.2, excepto que se usan soluciones
que no contengan glucosa.
2. A drenalina. 10 Mg
3. Insulina. (250;uU)
4. Glucosa. 1g
5. Tubos de plstico con tapa. 100
6. Baos de agua a 37 C con agitacin. 5
7. Cilindros de gas (95% 0 2/5% C 0 2). 3
Mtodo
P rep are clulas grasas aisladas como se indic en el ex p erim en to 10.2 usando
un medio que no contenga glucosa. P rep are cuatro grupos de tubos en
triplicado usando tubos plsticos con tapa como se indica en la tabla. Use, 1 mi
de clulas grasas aisladas y agregue las horm onas y glucosa en el volum en m s
pequeo posible (5 10 j a l ) . B u rb u jee gs (95% 0 2/5% C 0 2) e incube a 37 C
agitando suavem ente. Al final de la incubacin d eterm in e cidos grasos libres
y glicerol en el m edio de incubacin (experim ento 10.15 (a) y 10.15 (b)).
Metabolismo 309
Teniendo en, cuenta las observaciones que se hicieron al comienzo del

experim ento y sus conocim ientos previos acerca del m etabolism o, explique
los resultados obtenidos.
. No. del A drenali- Glucosa Insulina

tubo na (p m o l/m l) (AiU/ml)
E xperim ento ( u g /m \)
Control 1 -3
(sin horm onas)
Adrenalina 46 0.1 ___
(sola)
Adrenalina y glucosa 79 0.1 3 ___
Adrenalina e insulina 1012 0.1 10
EXPERIMENTO 10.15(a) D e t e r m i n a c i n de g lic e r o l
Fundamento
La protena p resen te en las m uestras se precipita con cido tricloroactico y
luego se d eterm in a el glicerol m idiendo el cam bio en la extincin a 340 n m a
medida que se oxida el glicerol por accin de glicerol deshidrogenasa.
ch2oh Glicerol ch2oh

H -O H + NAD dr0-enasa, =Q + NADjj2
. h 2oh h2oh
G licerol D ihidroxiacetona
Materiales 10
2. E ter dietlico. 1.5 1
3. A m ortiguador de glicina (0.1 mol/1, pH 9.5). I 50&ml
4. Solucin de NAD (6 m g /m l en am ortiguador de glicina 100 mi
preparado inm ed iatam en te antes de usarse).
5. P atrn de glicerol (0.25 mm ol/1). 10 mi
6. Glicerol deshidrogenasa (diluya en am ortiguador de
glicina hast^ ob ten er una actividad de 1 /tmol m in ' 1m i '1). 10 mi
Mtodo
Separe 0.5 mi de la suspensin de clulas p ara la determ inacin de cidos
grasos y transfiera los 0.5 m i restan tes a u n tubo de centrfuga de vidrio. Al
mismo tiem po p rep are u n blanco que contenga 5 m l del medio de incubacin y
agregue 1 m i de cido tricloroactico (100 g / 1) a todos los tubos, m ezcle

vigorosam ente y centrifugue p ara rem o v er la protena. T ransfiera el
sobrenadante a u n tubo de vidrio con tapa, extraiga tres veces con 5 mi de ter
dietlico y d e term in e el glicerol en la p a rte acuosa.
Pipetee 0.5 m i de NAD disuelto en am ortiguador de glicina en u n a serie de
tubos de ensayo y agregue 0.4 m l del extracto. P rep are u n blanco de 0.4 m i de
agua y u n p atr n de 0.4 m i de glicerol. Com ience la reaccin agregando 0.1 mi
de glicerol deshidrogenasa e incube a 37 C d u ra n te 1 h. Al finalizar la incuba
cin agregue 2 m i de am ortiguador de glicina y lea la extincin a 340 nm.
Calcule el glicerol liberado usando como referen cia la solucin p atrn de
glicerol.
EXPERIMENTO 10.15(b) D eterm inacin de cidos grasos libres

Fundamento
Se agita la m u e stra con cloroform o y n itrato de cobre disuelto en am o r
tiguador; los cidos grasos se separan del com plejo que form an con la
albm ina y originan jabones de cobre, los cuales son extrados en la fase
orgnica. La cantidad de cobre en la fase clorofrm ica es equivalente a la
cantidad de cidos grasos en la m u estra y se m ide agregando dietilditiocarba-
m to sdico, u n reactivo de color m uy sensible y especfico p ara la d eterm in a
cin de cobre.
Materiales 10
1. Reactivo de cobre (270 m i de trietan o lam in a 2 mmol/1, 600 mi
30 m i de cido actico 1 mol/1 y 300 m i de sulfato cprico
100 g /1).
2. D ietilditiocarbam ato de sodio (1 g/1 en n-butanol. 100 mi
P represe antes de usarlo).
3. Tubos con tapa de vidrio (20 mi). 100
4. A gitadores V ortex. 5,
5. Cloroform o. 500 mi
6. Colorm etros. 5
8. Acido palm tico (5 mm ol/1 en CHC13). _ 10 mi
Mtodo
Extraccin. En u n tubo de vidrio con tapa m ezcle 0.5 m i de la m u estra con 2.5
m i de reactivo de cobre y agite fu erte m en te usando u n agitador Vortex.
A gregue 5 m i de cloroform o y agite con la m ano vigorosam ente por 1 mn.
Separe las capas por centrifugacin hasta o b ten er tres fases. U na superior
acuosa, u n a interfase que contiene p rotena desnaturalizada y una capa
inferior de cloroform o que contiene la sal de cobre del cido graso. S epare la
capa superior acuosa con u n a pipeta P asteu r y descrtela. Rom pa la in terfse
Metabolismo 311
con una pipeta lim pia y tran sfie ra cuidadosam ente el cloroform o a u n tubo de
ensayo. En este paso es m u y im p o rtan te ev itar contam inacin de la capa
clorofrmica con las otras dos fases que contienen u n a alta concentracin de
iones de cobre.
D eterm inacin. A gregue 0.5 m i de dietilditiocarbam ato de sodio a 3 mi de
cloroformo y lea la extincin a 440 n m en u n espectrofotm etro o colorm etro.
Curva patrn. P re p a re soluciones de palm itato de concentraciones desde 0
hasta 5 mmol/1. Tom e 0.2 m i de cada solucin, tra n sfie ra a tubos de ensayo y
evapore a sequedad en u n bao de agua hirv ien d o en u n a chim enea de
extraccin de gases. A gregue 0.5 m i de agua a cada tubo y haga la
determ inacin en la fo rm a q u e se indic an terio rm e n te.
SINTESIS DE PROTEINA EN BACTERIA

\
Las bacterias son organism os que se adaptan fcilm en te al m edio. Las

modificaciones en el m edio del cual se n u tre n algunas clulas originan
cambios en la produccin de enzim as, perm itien d o q u e las bacterias crezcan
bajo las nuevas condiciones. P o r ejem plo, algunas cepas de Escherichia coii
son capaces de sin te tiz ar enzim as relacionadas con el m etabolism o de fi-ga-
lactsidos cuando estos com puestos se a ad en al m edio de incubacin. Las
enzimas que son sintetizadas rp id am en te y en m ay o r cantidad como
respuesta a la presencia de su strato en el m edio, se conocen como enzim as
inducibles. Por el contrario, se den o m in an en zim a s constitutivas aquellas que
se en cu e n tran en la clula en cantidades constantes in d ep en d ien tem en te del
estado m etablico de la m ism a.
El m ecanism o propuesto por M onod y sus colaboradores p ara explicar la
induccin incluye control a nivel gentico, esto es, la estim ulacin o
inhibicin de la transcrip ci n (captulo 8).
En clulas procariticas tales como E. coli, el ADN celu lar est localizado
en un crom osom a circ u lar que contiene genes p ara la produccin de mARN
(genes estru ctu rales) y genes asociados con el control de la tra n sc rip
cin (genes reguladores). P o r lo tan to los genes e stru c tu ra le s se tran scrib en
solam ente cuando los genes reg u lad o res p e rm ite n que o cu rran la tran scrip
cin. El m ecanism o propuesto por Jacob y M onod se m u e stra en el diagram a
d la figura 10.12.
. EXPERIMENTO 10.16 Induccin de 3-galactosidasa en cepas de E. col (i*e i~)

Fundamento
En el experim ento siguiente, se estudian dos cepas de E. coli. En el tipo
silvestre (i* x + y + z +) todas las protenas son inducibles y son sintetizadas
solam ente cuando est p resen te el inductor. P o r el contrario, los m u tan tes
ro
Opern de los 0 -galactsidos
Bioqumica prctica
AON
r o x y z
Represor
inactivo Galactosidasa Permeasa Transacetilasa
(enzimas implicadas en el metabolismo de galactosa)
(b) Induccin enzimtica
Figura 10.12 Regulacin del opern lac en E. coli. (a) En ausencia del inductor, el represor
activo se une al gen e operador y bloquea la accin de la ARN polimerasa. (b) Cuando est presen
te el inductor se une a la protena represora convirtindola en una forma inactiva que no se
puede unir al g en e operador, perm itiendo as la transcripcin del opern lac.
Metabolismo 313
constitutivos (i~ x + y* z +) poseen cantidades altas de las tres protenas en

ausencia del inductor.
La actividad de la enzim a se m ide colorim tricam ente utilizando lcali que
detiene la reaccin y desarrolla el color am arillo del producto o-nitrofenol.
Materiales i
1. Escherichia coli (tipo silvestre).
2. Escherichia poli (m u tan te constitutivo). Cepa ML 308,
NCIB 9553, ACTC 15224.
3. Medio para el cultivo de bacterias (sales en am ortiguador 10 1
que contiene u n a fu en te de carbono (succinato de sodio
10 g /1), am inocidos para la sntesis de p rotena (1 g/1 de
hidrolizado de casena libre de vitam inas) y tiam ina
(10 mg/1). Se aade inductor o inhibidor, segn lo
requiera el experim ento).
4. B rom uro de cetiltrim etilam onio (0.8 m g/m l). 100 mi
5. o-nitrofenil-(3-D-galactsido (1 m g/m l en am ortiguador. 200 mi
P represe antes de usarse).
6. N a2 C 0 3 (1 mol/1). 200 mi
7. P a tr n d e o -n itr o fe n o l (100 p m o l/1 e n N a2C 0 3 0.1 m o l/1 ). 100 m i
8. Pipetas estriles con tapn de algodn en la boquilla
9. L isol o u n a s o lu c i n s e m e j a n t e p ara e s te r iliz a r la
v id r ie r a .
10. Colorm etros. 5
11. M ateriales para el cultivo en gran escala de E. coli.
12. Incubador o cuarto a 30 C.
13. Lactosa (200 mm ol/1). 100 mi
14. Cloram fenicol (1 m g/m l). 100 mi
Mtodo
Cultivo de las bacterias. D eje crecer las bacterias de u n da p ara otro en el
medio de cultivo en ausencia del inductor. Suspenda los m icroorganism os en
5 mi de medio de cultivo en form a tal que se obtenga u n a concentracin de 5
m g/m l y prepare para cada cepa de E. coli 5 tubos de ensayo que contengan 4
mi de medio de cultivo. A gregue 0.5 mi de la suspensin de bacterias a cada
tubo, caliente a 30 C y al tiem po cero agregue 0.5 m i de lactosa (200 m m ol/1)
como inductor.
A los 0, 30, 60, 90 y 120 m in p are la reaccin en u n tubo de cada cepa
aadiendo 0.5 m i de cloram fenicol. Incluya controles consistentes en tubos de
cada cepa incubados d u ra n te 120 m in en ausencia del inductor. C entrifugue
los tubos, lave el precipitado con medios de cultivo p ara rem o v er el inductor, y
resuspenda en 5 mi de m edio de cultivo. Relacione el n m ero de bacterias con
la turbidez del tubo. D eterm in e el crecim iento de las clulas m idiendo la
turbidez a 600 nm y d eterm in e la actividad de /3-galactosidasa en cada m u es

tra.
Cul es el tiem po requerido p ara la induccin de /3-galactosidasa? Usando
sus resultados d eterm in e el tiem po ptimo de incubacin p ara experim entos
posteriores.
D eterm inacin de (3 -galactosidasa. Es necesario d e te rm in a r la enzim a des
pus de ro m per las clulas, ya que el tran sp o rte del sustrato a travs de la
m em brana puede ser el paso lim itan te de la reaccin en clulas intactas. La
m em brana celular se rom pe sin p rd id a de actividad de la enzim a agregando
el detergente brom uro de cetil-trim etil-am onio hasta u n a concentracin final
de 0.1 m g/m l.
En u n tubo de centrfuga agite 1 mi de la suspensin lavada de las bacterias
con 0.5 m i de brom uro de cetil-trim etil-am onio (0.8m g/m l). A gregue 1.5m i de
o-nitrofenil- /3-D-galactsido recin preparado e incube a 30 C d u ran te 5 m in
(o ms tiem po si lo cree necesario). Incluya u n control en el que se agregue 1
mi de m edio de cultivo pero sin bacteria. P are la reaccin agregando 1 m i de
Na2 C 0 3 1 mol/1 y centrifugue p ara rem over la bacteria. S epare el sobrena
dante por decantacin y d eterm in e en l la concentracin de o-nitrofenol,
m idiendo la absorbancia a 420 n m y relacionndola con u n a curva patrn de o-
nitrofenol (0100 pmol/1) preparado en N a2 C 0 3 0.1 mol/1.
Exprese la actividad como nanom oles de o-nitrofenil-/3-D-galactsido hi-
drolizado por m inuto por m iligram o de clulas.
EXPERIMENTO 10.17 Efecto de varias sustancias en la induccin de la prga-

lactosidasa
Fundamento
En algunos casos, com puestos anlogos a los /3-galactsidos pueden estim ular
la induccin pero no actan como su strato de la enzim a inducida. Esta
induccin, no til desde el pu n to de vista metablico, se llam a induccin
gratuita. Un ejem plo de un inductor gratuito es el /3-tiogalactsido. Los in
ductores gratuitos p erm iten estu d iar la induccin sin in terferen cia de
sustratos o productos pero pu ed en in h ib ir com petitivam ente la enzim a /3-
galactosidasa (figura 10.13).
Materiales y Mtodo
Usando el experim ento an terio r como m odelo e introduciendo controles
apropiados, investigue la eficiencia de los com puestos que se dan a continua
cin para actu ar como inductores de la /3-galactosidasa. Use cada com puesto
en concentraciones diferentes y tra te de calcular la concentracin del
inductor que produce la m itad de la estim ulacin m xim a.
1. T iom etil-3-D-galactopiransido (hasta 10 mm ol/1).
2. Melibiosa (0.5 mol/1).
Metabolismo 315
3. Lactosa (0.5 mol/1).

4. Galactosa (0.5 mol/1).
Estas soluciones deben p rep ararse poco antes de usarlas; 50100 m i deben ser
suficientes para cinco parejas de investigadores.
EXPERIMENTO 10.18 Efecto de inhibidores de la sntesis de protena sobre la

induccin de (3-galactosidasa
Fundamento
El cloramfenicol inhibe la sntesis de las protenas unindose a los ribosomas
70 S de clulas procariticas y de m itocondrias en donde'bloquea la enzim a
peptidil transferasa. Sin em bargo, este antibitico no afecta la sntesis de
protenas en los ribosom as 80 S de las clulas eucariticas.
OH OH
CH, OH CH. OH
HC
OH OH
Lactosa (/3-D-galactosil-1,4-D-glucosa)
OH OH
Melibiosa (a -D-galactosl-1,4-D-glucosa)
Figura 10.13 Inductores de j3-galactosidasa en E. coli

En cambio, la ciclohexim ida previene la form acin del enlace peptdico

unindose a los ribosom as 80 S de las clulas eucariticas pero no acta sobre
los ribosomas 70 S de procariotes.
Materiales y Mtodo
Investigue los efectos del cloram fenicol y la ciclohexim ida sobre la induccin
de la enzim a por la lactosa, usando concentraciones de inhibidor hasta de 1
m g/m l.
EXPERIMENTO 10.19 Recam bio d e j3 -galactosidasa

Mtodo
Usando lactosa induzca E. coli d u ran te 60 m in tal como se hizo en los
experim entos anteriores, agregue luego cloram fenicol y m ida la cada en la
actividad de la /?-galactosidasa d u ran te las 2 h siguientes. Incluya un control
al cual se agrega cloram fenicol antes de la lactosa.
Cul es la vida m edia de la enzim a dentro de la clula?
METABOLISMO EN EL ANIMAL ENTERO

La m ayora de los estudios sobre m etabolism o se h an hecho usando rganos
perfundidos, preparaciones de tejidos y clulas u organelas aisladas. Sin
em bargo la inform acin que se obtiene en esta form a debe correlacionarse
con el organism o total y para ello se necesitan experim entos con anim ales
nteros. En esta ltim a serie de experim entos se usan sujetos hum anos o ratas
para ilu strar algunas de las funciones m etablicas.
EXPERIMENTO 10.20 Prueba de tolerancia a la glucosa

Fundamento
Glucosa sangunea. Los carbohidratos son la principal fu en te de energa a
corto y m ediano plazo. En los anim ales los carbohidratos se tran sp o rtan en la
sangre en form a de glucosa, la cual es llevada hasta los tejidos para asegurar a
las clulas un adecuado sum inistro energtico.
El azcar sanguneo puede considerarse como un depsito de carbohidra
tos y su concentracin en la sangre depende de la velocidad a la cual e n tra la
glucosa al to rre n te sanguneo y la velocidad a la que lo abandona (figura 10.14).
La concentracin de glucosa sangunea vara e n tre 65 y 165 m g/100m l en el
hom bre adulto norm al. V alores por debajo o por encim a de este rango indican
la presencia de algn defecto en la absorcin de los carbohidratos o en su
metabolismo. En sujetos en ayunas y en reposo el valor norm al de la glucosa
sangunea debe estar e n tre 65 y 110 mg/100 mi. Si por cualquier circunstancia
la glucosa sangunea es m uy alta, la reabsorcin por tbulos renales es
Figura 10.14 Factores que afectan la concentracin de glucosa en la sangre
incompleta y se excreta glucosa en la orina. La concentracin de glucosa a la

cual ocurre este fenm eno se conoce como u m b r a l r e n a l p ara la glucosa y es
aproxim adam ente de 180 m g/100 mi.
G l u c o s a s a n g u n e a y h o r m o n a s . La concentracin de glucosa sangunea se
puede alte ra r por varias horm onas que actan estim ulando o suprim iendo la
produccin o la utilizacin de glucosa (figura 10.14). La actividad de las
horm onas depende de si el anim al est en ayunas o no, y tam b in de la
concentracin de in term ed iario s metablicos y de otras horm onas; as que el
cuadro com pleto de la hom eostasis de glucosa es un poco complicado. La
adrenalina, el glucagn, los glucocorticoides, las horm onas de la p itu itaria
anterior y las horm onas de la tiroides causan u n au m en to en la concentracin
de la glucosa sangunea y se llam an a g e n t e s h i p e r g l i c e m i a n t e s . En cam bio la
insulina dism inuye el azcar sanguneo y es h i p o g l i c e m i a n t e . La insulina es
producida por las clulas (3 del pncreas y cuando stas dism inuyen su
actividad o cesan de funcionar, tal como ocurre en la diabetes m ellitus, el
azcar sanguneo a u m en ta hasta alcanzar valores m uy altos y entonces se
excreta glucosa en la orina.
R e s p u e s t a n o r m a l a u n a s o b r e c a r g a d e g l u c o s a . U na form a til de m ed ir la
eficiencia del m etabolism o de los hidratos de carbono consiste en su m in istrar
50 g de glucosa en agua a u n sujeto hum ano en ayunas y luego m ed ir los

cambios en la concentracin de su glucosa sangunea d u ran te 3 h. En u n a

persona norm al se produce al comienzo u n a elevacin en la glucosa sangunea
que es del orden de 90 mg/100 m i en ayunas hasta alcanzar un m xim o de
alrededor 140 mg/100 m i despus de 3040 m in. Esto d em u estra que d u ran te
la prim era hora la velocidad de absorcin de glucosa excede su velocidad de
utilizacin. Despus de este tiem po la glucosa se usa en proporcin m ayor a su
absorcin v Dor tanto, la glucosa sangunea regresa a los valores iniciales des-
onesTmnebedfeteCtarsfipreseneiajdfegliiGosfferiia::
W W ^ W iJE n m iM c W d ic i
B8BPBBBBng3iC
B P iO B lISfflili;
Tiempo (h)
incia a la glucosa aumentada

-o Toler
esta normal
incia a la glucosa disminuida por hipertiroidismo - Respi
-o Toler
incia a la glucosa disminuida en diabetes mellitus
- Toler
tados obtenidos en pruebas de tolerancia a la Figura 10.15 Resu

normales y anormales glucosa en sujetos i
Metabolismo 319
tipo de respuesta se debe pro b ab lem en te a q u e el estm ago se vaca

rpidam ente y o cu rre u n a rp id a absorcin en el intestino..
La form a de la cu rv a d epende tam b in de la edad y de la dieta prev ia del
individuo. Los valores en ayunas y los valores m xim os a u m en tan con la
edad, lo que corresponde a u n a tolerancia m en o r a la glucosa. Si la d ieta prev ia
ha sido baja en carbohidratos, se observa u n a dism inucin en la tolerancia a la
glucosa, m ien tras q u e si h a sido alta en carbohidratos, se e n cu e n tra un
aum ento en ella.
D i s m i n u c i n e n l a t o l e r a n c i a a l a glucosa. V alores bajos de tolerancia a la
glucosa se e n c u e n tra n en diabetes m ellitus debido a la falta de cantidades
adecuadas de insulina, en ferm ed ad es en que la tiroides, p itu ita ria o adrenales
estn hiperactivas; tam b in en en ferm ed ad es agudas del hgado en q u e la
sntesis de glicgeno se e n c u e n tra dism inuida.
e n l a t o l e r a n c i a a l a g l u c o s a . Un au m en to en la tolerancia a la
A u m e n to
glucosa puede en co n trarse en casos de hipofuncin de la tiroides, adren ales o
pituitaria o tam b in cuando hay algn defecto en la absorcin intestinal.
En la figura 10.15 se m u e stran algunas de las curvas que se pueden
encontrar en p ru eb as de to lerancia a la glucosa.
D e t e r m i n a c i n d e l a g l u c o s a s a n g u n e a . Los valores dados an te rio rm e n te
para la glucosa se consideran como valores de glucosa v e rd a d e ra , pues han
sido obtenidos por el m todo de glucosa oxidasa. A lgunos otros m todos p ara
glucosa m iden la capacidad red u cto ra total de la san g re y las concentraciones
de glucosa en co n trad as son del orden de 30 mg/100 m i m s altos que los
valores anteriores. Esto es debido a que en la san g re se h allan p resen tes
algunos otros com puestos red u cto res tales como el glutatin.
T o m a d e m u e s t r a s p a r a g l u c o s a . Si dejam os la san g re a te m p e ra tu ra am
biente d u ra n te 23 h, se pierd e ap ro x im ad am en te la m itad de la glucosa ya
que sta es tran sfo rm ad a a cido lctico a trav s de la gliclisis; por tanto, es
necesario to m ar algunas precauciones p ara evitarlo. El flu o ru ro inhibe la
gliclisis y por esta razn la san g re puede recogerse en u n anticoagulante que
contenga 1 m g de flu o ru ro de sodio por cada m ililitro de sangre. El exceso de
fluoruro in te rfie re con el m todo de la glucosa oxidasa; p o r esto se
recom ienda recoger 0.1 m i de san g re d irectam en te en u n a pipeta serolgica y
aadirle in m ed ian te el reactivo p ara p recip itar la protena.
Materiales 100
1. Los m ism os m ateriales del ex p erim en to 6.3.
2. Los m ism os m ateriales del ex p erim en to 6.14.
3. Glucosa pura. 3 kg
4. Pipetas serolgicas (0.1m i). 100
5. Frascos p ara m u estras de orina. 200
Mtodo
Tome una m uestra de sangre capilar por puncin en la o reja o en el dedo de u n
voluntario que haya ayunado prev iam en te d u ra n te 12 h; recoja tam bin u n a
m uestra de orina. D isuelva 50 g de glucosa en 200 m i de agua y dselo a beb er a
la persona, dndole enseguida 100 mi de agua p ara q u itarle el sabor dulce de la
boca. Tome m uestras de sangre cada m edia hora d u ra n te 2 h y recoja u n a
m uestra final a las 3 h. Recoja tam bin m uestras de o rin a cada hora.
Haga un ensayo para sustancias reductoras en orina usando el reactivo de
Benedict (experim ento 6.3) y m ida la concentracin de glucosa en la sangre
por el m todo de glucosa oxidasa. Los detalles de este procedim iento se dan en
el experim ento 6.14.
Usando los valores obtenidos dibuje la curva de tolerancia a la glucosa y
com ente los resultados encontrados.
EXPERIMENTO 10.21 Biosntesis del cido hiprico

Fundamento
Una propiedad m uy especial de los organism os vivos consiste en poder
m etabolizar una gran cantidad de com puestos orgnicos que no hacen p arte
de su am biente qum ico norm al. El estudio de los factores que afectan el
metabolism o de estos com puestos extraos al organism o es, por supuesto, de
sum a im portancia para las industrias farm acuticas y de alim entos.
D u ran te el metabolism o, los com puestos biolgicam ente activos son
transform ados en form as inactivas que son excretadas en la orina. Este
proceso se conoce con el nom bre de detoxicacin a pesar de que algunas veces
se form an com puestos txicos a p artir de m ateriales inocuos que se ingieren
en los alimentos; este caso, sin em bargo, no es frecuente. Con el fin de facilitar
la elim inacin de sustancias ex tra as a travs del rin, se los convierte en
sustancias m s polares y m enos liposolubles. En el siguiente experim ento se
ilustra un tipo de m ecanism o de detoxicacin que se conoce como
conjugacin. En los sujetos hum anos el benzoato de sodio ingerido se conjuga
con glicina para d ar benzoil-glicina (cido hiprico) cuya biosntesis puede
dar hasta 1.5 g del com puesto por hora.
Biosntesis de cido hiprico en el hgado.
C6HsCOONa + CoA-SH C6Hs CO-S-CoA

Benzoato de sodio Coenzima A BenzoilCoA
ATP ADP + P
C6HsCOS-C oA + H2NCH2COOH C6HsCO-HN-CH2COOH + CoA-SH

Benzoil-CoA Glicina Acido hiprico Coenzima A
Metabolismo 321
P ara efectos de com paracin, se sintetiza

S n te sis o rg n ic a d e c id o h ip ric o .
tam bin cido hiprico en el laboratorio y se com para el ren d im ien to y la
pureza del com puesto con aquel obtenido por biosntesis.
C*H,COCl + H,NCH,COOH + NaOH

Cloruro de Benzoilo Glicina
C6HsCOHN-CH2-COOH + NaCl + H20

Acido hiprico
Materiales 10
1. C loruro de benzoilo. 200m i
2. Hidrxido de sodio (6 mol/1). 500mi
3. Acido clorhdrico (conc.). 300mi
4. Eter. 400m i
5. Benzoato de sodio puro p ara consumo hum ano. 20 g
6. Acido actico glacial. 50 mi
7. Glicina. 100 g
8. Bao de hielo.
9. Agitadores m agnticos. 5
10. Papel indicador.
v 11. Embudos de filtracin B chner. 5
12. A paratos para m ed ir puntos de fusin. 3
D isuelva 15 g de glicina en aproxim ada
S n te sis o rg n ic a d e c id o h ip ric o .
m ente 100 m i de agua, agregue hidrxido de sodio concentrado hasta obtener
un pH alrededor de 10 y su m erja en u n bao de hielo hasta cuando la tem
peratura llegue a cero. A gregue len tam en te 24 mi de cloruro de benzoilo en
un extractor de gases, d u ra n te u n perodo de 1520 m in, agitando m ecnica
m ente la solucin. Mida el pH de la solucin y agregue lcali fu erte para
m antenerla a un pH cercano a 10; m ida tam bin la te m p e ra tu ra y agregue
hielo si es necesario p ara m a n ten erla por debajo de 5o C. Despus de que se
haya agregado todo el cloruro de benzoilo, contine agitando hasta cuando el
pH perm anezca constante. F iltre si es necesario y agregue le n tam en te cido
clorhdrico concentrado agitando la m ezcla hasta ob ten er u n pH de 3. F iltre el
cido hiprico precipitado, lave varias veces con porciones de 15 m i de ter
para rem over cualquier traza de cido benzoico y seque el producto al aire.
Calcule el rendim ien to y el punto de fusin.
B i o s n t e s i s d e l c i d o h i p r i c o . Vace la vejiga y descarte la orina. Beba una
solucin de 3 g de benzoato de sodio en 250 m i de agua a la cual se ha aadido
jugo de fru ta para m ejo rar el sabor. Recoja la orina excretada d u ran te las 2
horas siguientes. Si el volum en de orina es m enos de 250 mi, agregue 2 m i de
HC1 conc. y agite hasta cuando todo el cido hiprico se haya precipitado. Si el
volum en es m ayor de 250 mi, acidifique la orina con unas pocas gotas de cido
actico glacial y reduzca el volum en en u n bao de agua hasta aproxim ada
m ente 100 mi, antes de precip itar el cido hipurico como se indic m s arriba.
Anote el rend im ien to y el punto de fusin y com pare con el m aterial
producido por sntesis orgnica.
Si lo cree necesario, se puede recristalizar el cido hiprico usando u n
volum en pequeo de agua caliente.
EXPERIMENTO 10.22 Efecto del ayuno sobre el m etabolism o de la rata

Fundamento
En un anim al bien alim entado los carbohidratos se oxidan p ara su m in istrar
energa y el exceso se alm acena como glicgeno en el m sculo y en el hgado.
E ntre las comidas, el glicgeno heptico se usa p ara m a n ten er u n a
concentracin adecuada de glucosa sangunea (figura 10.9). Este punto es de
capital im portancia ya que el cerebro depende p ara su funcionam iento casi
exclusivam ente de la glucosa, y niveles bajos de glucosa pueden resu ltar en
coma y ev en tu alm en te en la m u e rte del cerebro. Sin em bargo, el glicgeno
heptico es totalm ente consum ido en 2448 h y d u ran te ayuno prolongado se
sintetiza glucosa-6-fosfato a p a rtir de com puestos diferentes a los hidratos de
carbono m ediante el proceso que se conoce como gluconeognesis. Con
excepcin de unas pocas im portantes diferencias, la gluconeognesis es
fundam entalm en te el proceso inverso a la gliclisis. Las principales fuentes
de carbono para la sntesis de glucosa son el lactato, el glicerol y algunos
aminocidos. El lactato proviene; del glicgeno m uscular, el glicerol de la
grasa, y los am inocidos del desdoblam iento de las protenas, de m an era que
d u ran te la inanicin el cuerpo utiliza todas sus reservas. El m etabolism o de
las grasas produce, adem s de glicerol, cidos grasos, los cuales se oxidan
produciendo A TP pero sin que puedan tran sfo rm arse en glucosa sangunea.
El glicgeno m uscu lar difiere del glicgeno heptico en que no es afectado
considerablem ente por el estado nutricional y en ausencia de ejercicios
vigorosos perm anece casi constante. El glicgeno m u scu lar no contribuye
directam ente a la glucosa sangunea puesto que la enzim a glucosa-6-fosfatasa
se en cu en tra ausen te de los msculos, pero puede hacerlo ind irectam en te a
travs de la form acin de lactato d u ran te las contracciones anaerbicas.
El ayuno, pues, produce cambios im portantes en el estado metablico del
anim al. En el experim ento siguiente se exam inan dos grupos de ratas, uno
alim entado n o rm alm en te y el otro som etido a ayuno d u ran te 3 das.
D eterm ine los com puestos siguientes en los dos grupos de ratas y explique
hasta donde sea posible los cambios observados debido al ayuno.
La u rea es el producto final del m etabolism o de las protenas y es
sintetizada en el ciclo de la urea; la arginasa es la enzim a clave en dicho ciclo.
Ya que el n m ero de ensayos a realizar en el siguiente experim ento es
m uy grande, se sugiere que los estudiantes trab a jen en grupos de 3 p arejas
Metabolismo 323
Compuesto Origen
Metabolitos
glicgeno hgado, msculo esqueltico,
corazn
glucosa sangre
aminocidos sangre
cidos grasos libres sangre
cuerpos cetnicos sangre (slo cualitativo)
urea sangre
Enzimas
glucosa-6-fosfatasa hgado
arginasa hgado
por cada rata. Los resultados obtenidos se deben re u n ir al final de la sesin con
los de los otros grupos, p ara h acer una discusin general.
EXPERIMENTO 10.22(a) Preparacin de los tejidos

Materiales 48
1. Ratas del m ism o sexo, edad y peso (cuatro alim entadas 8
y cuatro sin alim ento d u ran te 3 das).
2. Solucin del anticoagulante hep arin a obtenido en la
farm acia en recipiente de porcelana.
3. Salina isotnica (NaCl 0.154 mol/1). 250 mi
4. Tiras de K etostix.
5. Hielo molido.
8. Balanzas de torsin (0500 mg). 8
7. M orteros con sus manos. 8
8. A m ortiguador de cacodilato de sodio (0.1 mol/1, pH 6.5). 200 m i
Precaucin: es venenoso!
9. Gasa.
Mtodo
Es im portante que los experim entos se realicen rp id am en te despus de la
m uerte del anim al y se sugiere que uno o dos m iem bros del grupo p rep are los
tejidos, m ientras que los otros alistan los tubos de ensayo p ara las
determ inaciones.
Golpee la ra ta en la cabeza y decaptela usando u n a gillotina y recoja la
sangre en el recipiente de porcelana que contiene heparina. Extraiga
rpidam ente el hgado y el m sculo gastrocnem ius y colquelos en u n vaso de
precipitados sobre hielo molido. D iseque el corazn y pngalo en un vaso de
precipitados tarado que contenga solucin salina isotnica. En u n a centrfuga
de mesa, centrifugue la sangre, separe el plasm a y exam ine si hay cuerpos
cetnicos presentes, aadiendo u n a p equea gota del plasm a a la tira de

K etostix.
Extraccin del hgado para los ensayos enzimticos. En u n a balanza de to r
sin, pese 200300 mg de hgado, crtelo con tijeras en pedazos m uy peque
os, colquelo en u n m o rtero conservado a 0o C; aada 1 m i de cacodilato de
sodio a 0o, agregue la aren a q u e quepa en la p u n ta de u n cuchillo y m uela
usando la m ano del m ortero. A gregue otros 9 m i de la solucin de am ortigua
dor y filtre el extracto a travs de gasa. G u ard e el extracto en hielo hasta
cuando se necesite.
EXPERIMENTO 10.22(b) Determinacin de glucosa-6-fosfatasa

Fundamento
La glucosa-6-fosfatasa cataliza la hidrlisis de glucosa-6-fosfato en glucosa y
fosfato:
G lucosa-6-fosfato + H aO ------- G lucosa + P.
El fosfato se determ in a por el m todo descrito an terio rm e n te (experim ento
4.3). En la m ezcla de reaccin se incluye EDTA p ara q u elar M g++, necesario
para la actividad de la fosfatasa alcalina.
Materiales 48
1. A m ortiguador de cacodilato de sodio (0.1 mol/1, pH 6.5). 200 mi
2. EDTA (10 mm ol/1 en am ortiguador pH 6.5). 50 m i
3. Glucosa-6-fosfato (50 mm ol/1 en am ortiguador). 100 m i
5. Reactivos p ara la determ inacin de fosfato
(experim ento 4.3).
Mtodo
Determinacin de la enzima. P rep are la siguiente m ezcla y equilbrela a 37
C d u ran te 10 m in.
Componente mi
Amortiguador de
cacodilato 0.5
EDTA 0.1
Glucosa-6-fosfato 0.2
A gregue 0.2 m i de la fraccin del tejido p ara com enzar la reaccin e incube
d u ran te 15 m in. P are la reaccin agregando 1 m i de cido tricloroactico
Metabolismo 325
helado (100 g/1), centrifugue el precipitado y separe 1 m l del sobrenadante

para la determ inacin del fosfato. Aliste dos blancos en los cuales se
reem plaza el sustrato y la fraccin del tejido por solucin am ortiguadora.
Clculo
Al valor obtenido para las m u estras reste el contenido de fosfato del blanco y
calcule la actividad enzim tica. El contenido de fsforo en 0.332 p m ol de
glucosa-6-fosfato es 10 jug; por lo tanto, 1/xg de fsforo proviene de 0.0322
Hmol de glucosa-6-fosfato.
En cada tubo se colocaron 0.2 m i de la fraccin de tejido y se llev a 1 mi;
despus de la incubacin se agreg 1 m i de cido tricloroactico y se separ 1
mi para la determ inacin de fosfato. Por consiguiente, la dilucin final del
tejido es 10 veces.
Exprese los resultados finales en unidades internacionales de actividad
por gramo de hgado y tam bin la actividad total presen te en el tejido.
EXPERIMENTO 10.22(c) Determinacin de la actividad de la arginasa

Fundamento
La arginasa cataliza la hidrlisis de arginina dando orn itin a y urea:
A rginina + H 20 ------- O rn itin a + U rea
La actividad se determ in a m idiendo la cantidad de u rea liberada en la
reaccin.
Materiales 48
1. A rginina (0.5 mol/1, pH 9.7). 200 mi
2. Sulfato de m anganeso (4 mmol/1, prep rese fresco). 100 mi
3. Acido perclrico (5% v /v , preprese diluyendo cido 11
perclrico concentrado en agua).
4. Reactivo de a -isonitrosopropiofenona p ara la deter- 11
m inacin de u re a ((3 -isonitrosopropiofenona que contiene
170 mi de H 2S 0 4 conc. y 40 m i de cido fosfrico viscoso en 1
1 de agua 2 g/1). ( Precaucin: Fuertem ente cido.)
5. Solucin patrn de u rea (0.5 mmol/1). 200mi
8. Bolas de vidrio.
9. Papel de alum inio.
10. Colorm etros. 24
Mtodo
Incubacin de la enzima. D iluya el extracto de hgado 1 a 20 con agua helada y
use este extracto diluido como enzim a. P re p a re la m ezcla que se indica a
continuacin y eq uilbrela a 37 C d u ra n te 10 m in antes de com enzar la

reaccin agregando 0.5 m l del extracto de hgado diluido.
Contenidos mi
Arginina (0.5 mol/1, pH 9.7). 1.0
M nS04 (4 mmol/1. Preprese fresco). 0.5
Mezcle vigorosam ente e incube a 37 C d u ra n te 10 m in. T erm in e la reaccin

agregando 5 m i de cido perclrico y m ezcle fu ertem en te. P re p a re controles a
tiem po cero agregando cido perclrico a la solucin de su strato y sulfato de
m anganeso antes de a ad ir el extracto de hgado. C en trifu g u e los tubos para
rem over la proten a precipitada y separe 1 m l del sob ren ad an te p ara las
determ inaciones de urea.
D eterm inacin de urea. Mezcle 1 mi de la m u e stra con 6 m l del reactivo de
a-isonitrosopropiofenona y caliente en u n bao de agua hirviendo tapando el
tubo con u n a bola de cristal. El color rojo producido es sensible a la luz por lo
cual los tubos deben fo rrarse en papel de alum inio. D espus de 1 h re tire los
tubos, transfiralos a u n vaso de precipitado que contenga agua helada, y
cbralos con u n trapo oscuro. Despus de dejarlos e n fria r d u ra n te 15 m in, lea
la extincin a 520 nm . P rep are u n a cu rv a p atr n con la u rea 0.5 mm ol/1 y
calcule los m icrom oles de u re a liberados por m inuto.
E xprese los resultados finales como m icrom oles por m inuto por gram o de
hgado y calcule la actividad total presen te en el hgado.
EXPERIMENTO 10.22(d) D eterm inacin de glicgeno en los tejidos
Fundamento
El glicgeno es liberado de los tejidos al calentarlos en lcali fu erte y se
precipita luego aadiendo etanol. Se agrega adem s sulfato de sodio como un
coprecipitante p ara o b ten er u n a recuperacin cuan titativ a de glicgeno.
El polisacrido es hidrolizado luego en cido y se calcula la glucosa
liberada.
Materiales 48
1. Corazn, hgado y m sculo de u n a ra ta recin m u erta.
2. H idrxido de potasio (300 g/1). 250 mi
3. Tubos de cen trfu g a calibrados (10 m i). 30
* 5. N a2S 0 4 saturado. 20 mi
6. Etanol (95% v/v). 250 mi
7. M atraces volum tricos (100 mi). 24
Metabolismo 327
8. Tubos de ensayo calibrados a 10 mi. 100 mi

9. HC1 (1.2 mol/1). 100 mi
10. Bolas de vidrio.
11. Solucin indicadora de fenol rojo. 12 m i
12. NaOH (0.5 mol/1). 250 m i
13. Reactivos para la d eterm inacin de glucosa.
Mtodo
Aislamiento de glicgeno. Pese cuidadosam ente todo el corazn y el m sculo
y aproxim adam ente 1.5 g de hgado. Coloque los tejidos en tubo de centrfuga
calibrado que contenga 2 m i de KOH (300 g/1); caliente en u n bao de agua
hirviendo d u ra n te 20 m in agitando de vez en cuando. E n fre los tubos en hielo,
agregue 0.2 m i de N a2S 0 4 saturado y m ezcle fu ertem en te. P recipite l
glicgeno aadiendo 5 m i de etanol (95% v /v), deje en hielo d u ra n te 5 m in y
rem ueva el precipitado por centrifugacin. D escarte el sobrenadante y
disuelva el glicgeno precipitado en apro x im ad am en te 5 m i de agua
calentando suavem ente, diluya luego hasta com pletar la m arca de 10 m i con
agua destilada y m ezcle vigorosam ente. En el caso de anim ales alim entados,
transfiera la m u estra de hgado cu an titativ am en te a u n m atraz volum trico
de 100 mi y com plete hasta la m arca con agua.
Hidrlisis y determinacin de glicgeno. En tubos de ensayo calibrados hasta

10 mi, pipetee por duplicado 1 mi de las m uestras que contienen la solucin de
glicgeno, agregue 1 m i de HC1 (1.2 mol/1), tape los tubos con u n a bola de
cristal, caliente en un bao de agua hirviendo d u ra n te 2 h. A gregue luego u n a
gota de indicador de fenol rojo y n eu tralice cuidadosam ente con NaOH (0.5
m ol/1) hasta que cam bie el indicador de rosa a an aran jad o y luego a am arillo.
Diluya hasta 5 m i con agua destilada y d eterm in e el contenido de glucosa por
el mtodo de glucosa oxidasa (experim ento 6.14). Si es necesario, se pueden
guardar las m uestras congeladas y la determ in aci n de glucosa puede
efectuarse en la prxim a sesin de laboratorio.
Calcule los gram os de glicgeno presentes por 100 g de tejido y recu erd e
que la glucosa existe en form a de glicsido (C6H 10O 5) en glicgeno y que su
peso mol. es 162 y no 180.
EXPERIMENTO 10.22(e) Anlisis de metabolitos sanguneos
Fundamento
P rim ero se precipitan las protenas del plasm a y luego se d eterm in a n los
metabolitos en el sob ren ad an te obtenido por centrifugacin.
Materiales 48
1. Plasm a sanguneo de rata (obtenido de los cuatro
anim ales alim entados y de los cuatro que ay u n aro n por
tres das).
2. Acido perclrico (0.5 mol/1). 100 mi
3. Solucin indicadora de azul de brom ofenol. 10 m i
4. KOH (1 mol/1). 100 mi
5. Tubos de centrfuga calibrados (10 mi). 8
6. Reactivos p ara la determ inacin de glucosa
7. Reactivos p ara la determ inacin de am inocidos
8. Reactivos p ara la determ inacin de cidos grasos libres _
(experim ento 10.15(b)).
9. Reactivos p ara la determ inacin de u rea
(experim ento 10.22(c)).
Mtodo
Urea. A 1 m i de plasm a sanguneo agregue 4 m i de cido perclrico, m ezcle
fu ertem en te y separe el precipitado por centrifugacin. P ipetee 3 m l del
sobrenadante en un tubo de centrfuga calibrado. A gregue u n a gota de
solucin de azul de brom ofenol y KOH hasta cuando cam bie el color de
am arillo a azul. A gregue agua destilada hasta la m arca de 9 mi, m ezcle
vigorosam ente y deje en hielo d u ran te 30 m in. R em ueva por centrifugacin el
precipitado de KC104y alm acene en hielo, si se va a u sar el m ism o da, o con
gelado si se va a usar en la prxim a sesin de laboratorio.
Tom e 1 ml del plasm a desproteinizado y d eterm in e en l el contenido de
urea como se indic en el experim ento 10.22(c).
La dilucin total del plasm a es de 15 veces y sta debe te n erse en cuenta en
los clculos.
Aminocidos. D iluya el plasm a desproteinizado con cido perclrico 1 a 5 y 1 a
10 y use alcuotas de 2 m i como se indic en el experim ento 5.14.
Glucosa. D esproteinice el plasm a y d eterm in e la glucosa tal como se describi
en el experim ento 6.14.
Acidos grasos libres. D eterm ine los cidos grasos en el plasm a despus de
diluirlo con agua destilada (experim ento 10.15(b)).
Clculos
Exprese los resultados por m ililitro de plasm a original.
Metabolismo 329
Bibliografa
Karlson, P., I n t r o d u c t i o n t o M o d e r n B i o c h e m i s t r y , 4a. ed., N ueva York,
Academic Press, 1975.
Lehninger, A. L., B i o c h e m i s t r y , 2a. ed., N ueva York, W orth, 1975.
Loewy, A. G. y Siekevitz, P., C e l l S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n , N ueva York, Holt,
R einehart, y Winston, 1970.
Mahler, H. R. y Cordes, E. H., B i o l o g i c a l C h e m i s t r y , 2a. ed. N ueva York,
H arper & Row, 1971.
Stryer, L., B i o c h e m i s t r y , San Francisco, W. H. F reem an , 1975.

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La exactitud puede definirse como el grado de sujecin a la verdad. El cientfi

Las unidades usadas en este libro son unidades SI (Systm e Internacional

Tabla 1.1 Unidades bsicas SI

Cantidad fsica Nombre Smbolo

Tabla 1.2 Nom bres especiales y smbolos de algunas unidades SI derivadas

D efinicin en trm inos

Ninguna de estas unidades tien e plural; as pues, 5 voltios se escribe 5 V y no 5 Vs y 2

La combinacin de un prefijo y un smbolo se considera como un nuevo

Otras unidades usadas adems de las SI

1000 litros 1 m etro cbico 1m3

Tiempo. La unidad bsica SI de tiem po es el segundo, pero las unidades de

Molaridad, moles y concentracin

EXACTITUD EN LAS MEDICIONES

Una fuente com n de e rro r es la inadecuada lectura de escalas o meniscos

Patrones y blancos. P ara obtener valores bastante precisos en las mediciones

Tabla 1.4 D eterm inacin de cloruro srico

Por conveniencia se dan algunas ecuaciones usadas en estadstica, para

Curva de la distribucin normal

Figura 1.2 Distribucin gaussiana o normal de las lecturas

2. El punto de inflexin est dado por x + a y x - a, en form a tal que el 68%

() x = (xi + x 2 + x 3 + . . . + x)/n = x /n.

Si la desviacin de cada valor con respecto a la m edia se rep resen ta por

La sum a de las desviaciones elevadas al cuadrado se llam a desvianza y

La raz cuadrada de la varianza da entonces la desviacin estndar (a).

Error estndar de la media. A p artir de u n a serie de m ediciones se puede

De lo anterior se puede deducir que en tre m ayor sea el n m ero de m uestras,

El test t de Student. En algunos experim entos bioqumicos es im portante

m uestras y en este caso la m edia de u n a m u estra (m) se relaciona con la m edia

donde o es la desviacin estn d ar de la m u estra y n el n m ero de mediciones.

Si se ha hecho el mismo n m ero de m ediciones para las dos m uestras

t= (Xi X2 )/{( s2 + si )/n} 1/2

Material volumtrico de vidrio

destilada. El m aterial de vidrio com n se seca luego en un horno, pero el de

(a) Pipeta de bulbo (volumtrica)

(b) Pipeta graduada

Figura 1.3 Pipetas analticas

Pipetas graduadas. C onsisten de un tubo de vidrio de dim etro uniform e

(a) Pipeta de O stw a ld -V a n Slyke ca lib rad a para d isp e n sar

(b) Pipeta de O stw a ld -F o lin para soplar

(c) Pipeta de O stw a ld -F o lin ca lib rad a para c o n te n e r

(d) Pipeta se rol g ica calib rad a en 0.1 y 0 .2 mi

(e) Pipeta con co n stricci n , ca lib rad a para co n te n e r

Micropipetas. Se usan a m enudo en m ediciones bioqum icas y en casos en que

Probetas. Las probetas g eneralm ente se usan m al en el laboratorio y han

INFORME DEL EXPERIMENTO

Registro de los resultados

Se debe indicar tam bin el curso y el departam ento, y despus de esto se

etc. Es el precipitado pasado, liviano, gelatinoso o granuloso? Cundo se

entonces un grfico de y en funcin de x dar u n a lnea recta. La pendiente de

F ig u ra 1.5 Grfico de una lnea recta (y = mx + c)

2. D un ttulo conciso y claro, m arq u e claram ente la cantidad y unidades

F inalm ente, la figura 1.6 m u estra cmo no se debe hacer un grfico.

Figura 1.6 Form a incorrecta de presentar un grfico

A un cuando es conveniente escribir el equilibrio cido-base en la form a

Acido fu erte (cido ntrico) HNO3 -------* H+ + N 0 3

Acidos o bases dbiles. Estos compuestos se disocian slo parcialm ente y la

Acido dbil (cido frmico) HCOOH < H+ + HCOO-

La capacidad del solvente de com binarse con el hidrogenin afecta la

Disociacin del agua

T abla 2.2 El producto inico del agua y pH de neutralidad a

0 0.12 x 10 14 = 1 0 ~ 14'94 7.97

hidrogeniones y en iones hidrxilo. As pues, u n a pequea elevacin o

Mediciones exactas del pH