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UNIVERSIDADE DA INTEGRAO INTERNACIONAL DA LUSOFONIA


AFRO-BRASILEIRA

INSTITUTO DE ENGENHARIA E DESENVOLVIMENTO SUSTENTVEL

ENGENHARIA DE ENERGIAS

LABORATRIO DE ENERGIA DA BIOMASSA

CHARLES ALVES MONTEIRO

DAVI FERNANDES ANANIAS DA ROCHA

IMOBILIZAO DE ENZIMAS

ACARAPE - CEAR

02 DE MAIO DE 2017
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CHARLES ALVES MONTEIRO

DAVI FERNANDES ANANIAS DA ROCHA

IMOBILIZAO DE ENZIMAS

Relatrio referente aula prtica da


disciplina de Laboratrio de Energia da
Biomassa, do curso de Engenharia de
Energias da Universidade da Integrao
Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira.

Orientadora: Professora Dra. Maria


Cristiane Martins de Souza

ACARAPE - CEAR

02 DE MAIO DE 2017
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Sumrio
1 INTRODUO.......................................................................................................................4

2 OBJETIVOS............................................................................................................................5

3 MATERIAIS E METDOS...................................................................................................5

3.1 Processo de ativao do suporte nanopartculas magnticas (NPMG) com


glutaraldedo.............................................................................................................................5

3.2 Processo de imobilizao da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em


suporte (NPMG) ......................................................................................................................5

3.3 Medida de atividade hidroltica Enzima imobilizada...........................................5

3.4 Sobrenadante......................................................................................................................6

3.5 Anlise dos produtos da reao.....................................................................................6

3.6 Medida de atividade hidroltica da enzima CALB em presena de soluo


pNPB...........................................................................................................................................7

4 RESULTADOS........................................................................................................................7

4.1 Processo de imobilizao da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em


suporte (NPMG) ......................................................................................................................7

4.2 Medida de atividade hidroltica Enzima imobilizada...........................................7

4.3 Sobrenadante......................................................................................................................7

4.4 Anlise dos produtos da reao.....................................................................................8

4.5 Medida de atividade hidroltica da enzima CALB em presena de soluo


pNPB...........................................................................................................................................8

5 CONCLUSO.........................................................................................................................9

6 REFERNCIAS......................................................................................................................9
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1 INTRODUO

A imobilizao de enzimas em suportes apropriados se constitui em rea de


interesse enquanto pode significar melhoria de processos e barateamento de custos. O
suporte ideal deve adsorver irreversivelmente a enzima, sem afetar sua atividade e sem
interferir na reao enzimtica.

As lipases so enzimas que atuam sobre lipdeos, catalisando alguma reao


qumica que estas molculas possam sofrer. No sistema digestivo humano, ela tem
como funo, basicamente, transformar lipdeos (Gorduras) em cidos gordos e glicerol,
isto ocorre quando o pncreas libera um suco que contm vrias enzimas, uma delas a
lipase, no intestino delgado.

As Lipases so classificadas como hidrolases (triacilglicerol acil-hidrolases, EC


3.1.1.3) e atuam na hidrlise de triacilgliceris formando cidos graxos livres e glicerol
em meio aquoso ou na reao inversa em meio orgnico. Devido ao procedimento de
isolamento, as enzimas provenientes de micro-organismos so mais utilizadas
industrialmente.

Os mtodos de imobilizao de enzimas ou clulas so empregados com a


finalidade de tornar a enzima inerte ao meio reacional, por estar ligada, qumica ou
fisicamente, em um suporte slido. A imobilizao de enzimas pode ser utilizada como
mtodo para reutilizao, estabilizao ou purificao de protenas. Enzimas quanto
imobilizadas apresentam, em muitos casos, maior estabilidade, por apresentarem uma
estrutura mais rgida quando se ligam ao suporte. Utilizando suportes especficos
possvel purificar enzimas a partir de um extrato enzimtico rico em protenas.

O suporte ser previamente preparado por modificao qumica com


glutaraldedo para possibilitar a ligao da enzima CALB no mesmo. A produo
biotecnolgica do biodiesel com lipase tem estado no foco de vrios estudos recentes e
tem tido um rpido desenvolvimento, dado ao interesse de se adotar processos
ecologicamente aceitveis.
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2 OBJETIVOS

O objetivo principal da prtica da imobilizao de uma enzima obter um


biocatalisador com atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo.
Sendo os processos de bioconverso enzimtica bastante utilizados na produo,
transformao e valorizao de matrias-primas.

3 MATERIAIS E METDOS

3.1 Processo de ativao do suporte nanopartculas magnticas (NPMG) com


glutaraldedo

A ativao das NPMG (0,01g) foi realizada com glutaraldedo em soluo de


25%. A mistura foi mantida sob agitao (200 rpm) por 2 horas temperatura ambiente
(25C). Finalmente o suporte foi lavado com hexano para remover o excesso de agente
ativador. A funo do glutaraldedo reagir formando uma retcula (rede) de ligaes
para imobilizao enzimtica (SOUZA, 2013).

3.2 Processo de imobilizao da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em


suporte (NPMG)

O processo de imobilizao foi realizado pelo contato de 0,01 g de (NPMG) com


0,5 mL de soluo enzimtica (20 L de enzima (CALB) + tampo de fosfato de sdio
pH 7,0). A mistura foi mantida sob agitao (200 rpm) por 1 horas temperatura
ambiente (25C).

3.3 Medida de atividade hidroltica Enzima imobilizada

A reao de hidrlise foi realizada com 0,01 g de CALB NPMG + 0,6 g de


leo de soja (MM = 874,8 g/mol) em uma proporo reacional 5 : 1 (razo molar H2O :
leo) + 600 L de H2O. A mistura foi mantida sob agitao (200 rpm) por 1 horas
temperatura ambiente (25C).
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3.4 Sobrenadante

Com uma pipeta retirou-se o que sobrou 100 L da soluo sobrenadante de


enzima aps imobilizao + 0,6 g de leo de soja + 600 L de H2O. A mistura foi
mantida sob agitao (200 rpm) por 1 horas temperatura ambiente (25C).

3.5 Anlise dos produtos da reao

IA ndice de acidez

O ndice de acidez foi determinado utilizando a equao abaixo, descrita abaixo:


= () ()


= 0,02 56,11 1,1306
0,3

A anlise dos produtos da reao para obter o ndice de acidez foi feita atravs
de titulao cido-base, pois esse um dos parmetros especificados para controle de
qualidade do biodiesel e facilmente pode ser analisado no laboratrio de forma manual,
apesar da tcnica utilizada no ser to precisa. Para realizar a titulao foi necessrio a
padronizao do lcool com fenolftalena adicionando NaOH at ficar rosa.

IAI ndice de acidez inicial do leo

Para acidez do leo, pesou-se 0,35 g da amostra do leo em um Erlenmeyer e


anotou-se a massa. Colocou-se 20 ml de lcool (j neutralizado) e 4 gotas de
fenolftalena 1 %. Titulou-se com NaOH 0,1 M, sempre agitando o frasco, at aparecer
uma mudana de colorao (rsea) e anotou-se o volume de NaOH.

IAB ndice de acidez inicial do leo Sobrenadante

Para acidez do leo sobrenadante reacional, pesou-se 0,3 g da amostra do leo


em um Erlenmeyer e anotou-se a massa. Titulou-se com NaOH 0,1 M, sempre agitando
o frasco, at aparecer uma mudana de colorao (rsea) e anotou-se o volume de
NaOH.
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3.6 Medida de atividade hidroltica da enzima CALB em presena de soluo


pNPB

A atividade hidroltica da CALB solvel e imobilizada determinasse usando


butirato de p-nitrofenol (pNPB) como substrato, a pH 7,0 e 25C, com modificaes.

Aps hidrlise enzimtica hidrolisa a p-nitrofenol butirato (soluo amarela).


Uma curva padro realizada a partir de conceitos conhecidos de pNPB (diferentes
coloraes de amarelo).

4 RESULTADOS

4.1 Processo de imobilizao da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em


suporte (NPMG)


Resulta em biocatalisador com 80 de atividade.

4.2 Medida de atividade hidroltica Enzima imobilizada

Clculo da gua para hidrolise:

Massa de leo utilizada 06 g (MM = 874,8 g/mol)

5:1

H2O : leo

5 x 18 g/mol 874,8 g/mol

X 0,6 g

X = 600 de H2O

4.3 Sobrenadante

Em 100 de soluo sobrenadante de enzima, equivalente a 1,67 % massa


catalisada.

A reao foi de 1,67 % de catalizador lquido ou slido no meio reacional.


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4.4 Anlise dos produtos da reao

IAI ndice de acidez inicial do leo

Volume de NaOH utilizado 0,5 ml:

0,5
= 0,02 56,11 1,1306
0,3

= 2,11 103

IAB ndice de acidez inicial do leo Sobrenadante

Volume de NaOH utilizado 0,4 ml:

0,4
= 0,02 56,11 1,1306
0,3

= 1,69 103

O ndice de acidez do leo deve ser maior do que o do leo sobrenadante, pois
os cidos graxos livres esto em maior quantidade j que ainda no reagiram.

4.5 Medida de atividade hidroltica da enzima CALB em presena de soluo


pNPB


Atividade enzima no branco: 80 .

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Atividade terica no branco de imobilizao: 105 20 103 = 210

103 .

Atividade terica (100 % imobilizada = 210 103 / 0,01 NPMG).

Atividade sobrenadante = 50 % do branco e 50 % do imobilizada.


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5 CONCLUSO

A prtica experimental apresentou o processo de imobilizao de uma enzima


com o intuito de obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que no fossem
afetadas durante os processos. A reao no ocorreu totalmente devido as precariedades
do laboratrio encontradas nos processos para realizar a reao e at mesmo anlise
mais especficas, como ndice de acidez. Entretanto, foi possvel apresentar o processo e
posteriormente verificar na literatura.

O ndice de acidez do leo apresentou-se maior do que o do leo sobrenadante,


pois os cidos graxos livres esto em maior quantidade j que ainda no reagiram.

6 REFERNCIAS

CANILHA, LARISSA; CARVALHO, WALTER DE; SILVA, JOO B. A.


BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS: USO DE CLULAS E ENZIMAS
IMOBILIZADAS EM PROCESSOS BIOTECNOLGICOS. BIOTECNOLOGIA
CINCIA E DESENVOLVIMENTO, V. 9, N. 36, P.48-57, 2006.

SOUZA, M. C. M. DE. IMOBILIZAO DE LIPASE DE CANDIDA ANTARCTICA


DO TIPO B EM NANOPARTCULAS MAGNTICAS VISANDO A APLICAO
NA SNTESE DE STERES. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR, 2013.

SOUZA, M. C. M. DE. MANUAL DE PRTICAS DE LABORATRIO DE


BIOMASSA. LABORATRIO DE ANLISE QUMICA E BIOMASSA. CAMPUS
DAS AURORAS - UNILAB.