HEMAGLUTINACION INDIRECTA PARA CHAGAS

(HAI CHAGAS)
La enfermedad de Chagas es una infeccin parasitaria producida por el
Trypanosoma cruzi. El diagnstico de laboratorio depende del estadio en el
cual se encuentre la enfermedad. Durante la fase aguda, el diagnstico se
efecta directamente mediante la comprobacin de los parsitos en sangre o
por mtodos inmunolgicos que detecten anticuerpos especficos.
Durante la fase crnica, se pueden usar mtodos inmunolgicos como la
reaccin de aglutinacin de ltex, hemaglutinacin, aglutinacin directa,
inmunofluorescencia y ltimamente ELISA.
FUNDAMENTO DEL METODO
La hemaglutinacin indirecta (HAI), tambin llamada hemaglutinacin reversa
pasiva, se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos (que en este caso
son anti-T. cruzi) de producir aglutinacin especfica en presencia de glbulos
rojos sensibilizados con los correspondientes antgenos.
En el suero existen anticuerpos inespecficos (heterfilos) que son capaces de
aglutinar glbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga
enfrentando el suero con GR no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes
se eliminan mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol.
La enfermedad presenta dos fases, una aguda y una crnica. En la fase aguda,
que va del momento de la infeccin hasta unas 6 semanas despus de esta,
los pacientes pueden mostrar sntomas inespecficos, como fiebre o dolores de
cabeza. Durante la fase crnica, que puede durar hasta 30 aos,
aproximadamente el 30% de los pacientes desarrolla complicaciones de tipo
cardaco, que pueden manifestarse en forma de arritmias principalmente. El
10% de los pacientes puede tener complicaciones intestinales, especialmente
restreimiento, neurolgicas o mixtas.1 Sin embargo, la fase crnica se
caracteriza por la ausencia de sntomas en la gran mayora de los pacientes.
Esto ltimo, sumado al hecho de que los pacientes pueden encontrarse en un
lugar no endmico donde la enfermedad es desconocida, representa una
dificultad aadida al diagnstico de la infeccin.
Para el diagnstico de la enfermedad de Chagas existen diversos mtodos.
Algunos de estos se utilizan mayoritariamente para propsitos de investigacin,
mientras que otros se emplean en los laboratorios de diagnstico habitual.
Actualmente, para el diagnstico de los pacientes, la Organizacin Mundial de
la Salud (OMS) recomienda la realizacin de dos pruebas basadas en
diferentes principios y antgenos, y una tercera en caso de discordancia.
En general, los mtodos se clasifican en directos o indirectos. Los mtodos
directos detectan el parsito en la sangre del paciente, suelen denominarse
mtodos parasitolgicos, y la mayora estn basados en la microscopa. As
mismo, existen otras tcnicas dentro de esta categora, como el cultivo y el
xenodiagnosis (este ltimo basado en la aplicacin de los insectos vivos
directamente en la piel de los pacientes), cuya utilizacin est muy limitada por
el alto riesgo de infeccin del personal sanitario, la incomodidad de los
pacientes o su poca practicidad. Los mtodos indirectos detectan el ADN del
parsito (mtodos moleculares, especialmente la reaccin en cadena de la
polimerasa [PCR]) o los anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en la sangre del
paciente (mtodos serolgicos).
El diagnstico mediante microscopa se basa en la visualizacin del parsito en
la sangre de los pacientes utilizando un microscopio. Existen diferentes
variantes, que incluyen mtodos de concentracin (Strout) y microhematocrito
para el diagnstico en recin nacidos con la recoleccin de sangre en
capilares.
La tcnica de la PCR es un mtodo de diagnstico molecular que detecta el
ADN del parsito que se encuentra en la sangre de los pacientes. Esta
estrategia presenta muchas variantes, cada una de ellas con diferentes grados
de sensibilidad y especificidad.2 En general, es una tcnica ms sensible que la
microscopa, ya que puede detectar pequeas cantidades de ADN de T.
cruzi en la sangre. Sin embargo, su implementacin requiere de un laboratorio
especializado y actualmente no se ha hecho ninguna validacin de esta tcnica
para su utilizacin estandarizada en el diagnstico de la enfermedad de
Chagas.
Las tcnicas serolgicas incluyen diversos mtodos, entre los cuales se
incluyen ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), IFI (imnufluorescencia
indirecta) y HAI (hemaglutinacin indirecta). Todos ellos se basan en la
deteccin de las inmunoglobulinas G (IgG) anti-T. cruzi en la sangre de los
pacientes y su reaccin colorimtrica visible en el caso de que la sangre de los
pacientes contenga los anticuerpos.
En la tcnica ELISA los antgenos de T. cruzi se adhieren a una placa de
plstico con diversos pocillos que se incuban con la sangre de los pacientes, y
la coloracin de los casos positivos se da mediante una reaccin enzimtica.
La lectura de los resultados se obtiene mediante un equipo especializado que
mide la densidad ptica (figura 1).
En el mtodo IFI, basado tambin en la reaccin antgeno-anticuerpo, la
coloracin se da a travs de una sustancia fluorescente y para la lectura de los
resultados se requiere de un microscopio de luz ultravioleta (figura 2). En la
HAI, se sensibilizan glbulos rojos con antgeno del parsito, y si las muestras
de los pacientes son positivas, estos glbulos rojos se aglutinan, por lo que los
resultados se pueden observar a simple vista.

En contraste con los tres mtodos anteriores, que requieren de un mnimo

equipamiento y/o personal entrenado, entre los mtodos serolgicos tambin
se incluyen los test denominados rpidos. Estos pueden presentar varios
formatos, incluyendo el denominado casete (figura 3) o en forma de tiras
diagnsticas, y que son capaces de proporcionar resultados en menos de 1
hora. Estas pruebas funcionan con una cantidad mnima de sangre (sangre
total, plasma o suero) y tienen la ventaja de que no requieren personal
entrenado, equipamiento externo (que a su vez precisa electricidad o agua) o
refrigeracin (figura 4).
OBJETIVOS
- Identificar la presencia de chagas mediante el estudio serolgico de
hemaglutinacin indirecta
- Conocer y utilizar el mtodo de hemaglutinacin indirecta HAI
CHAGAS
REACTIVOS (Se empleara el kit HAI Chagas Polychaco)
Antgeno HAI (1): Suspension estabilizada de hemates de carnero
sensibilizados con antgenos citoplasmticos de Trypanosoma cruzi
Diluyente de muestras (2): Solucin isotnica tamponada con fosfatos
a Ph 7.5.Agregar 0,5 ml de solucin Proteica para 10 ml de Buffer HAI.
Mezclar , rotular y fechar (preparado dura 5 dias a 2-10C
SOLUCION PROTEICA (3): Solucion proteica de albumina bovina al
10 %, estabilizada.
Hematies No sensibilizados (4): Suspension al 1% de eritrocitos de
carnero no sensibilizados , para control de heterofilia
Control positivo (5): Suero inactivado conteniendo anticuerpos contra
tripanosoma cruzi.
Control positivo (6): Suero no reactivo, inactivado
MUESTRA
Recoleccion: El paciente debe estar preferentemente en ayunas. Obtener
suero de la manera usual. No usar plasma.
Sustancias interferentes conocidas: hemolisis o hiperlipemia producen
resultados errneos.
MATERIAL REQUERIDO
Policubetas con pocillos en U ( para eliminar la carga electrosttica es
pasar un trapo hmedo por la base d ela misma )
Micropipetas automticas (25 ul)
Tubos de ensayo y material volumtrico adecuado
Cinta adhesiva
PROCEDIMIENTO
- Colocar 25 ul de Diluyente de sueros HAI en todos los pocillos a usar de
la policubeta
- Tomar una alcuota de 25 ul de la muestra suero y colocar en el primer
pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para asegurar una correcta
dilucin de la muestra.
- Con una pipeta automtica de 25 ul, homogeneizar por cargas y
descarga. Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilucin
), pasando los microdilutores al pocillo siguiente (dilucin ) y asi
sucesivamente hasta la dilucin que se desea investigar (por ej. 1/8,
1/16, 1/32)
 - Transferir 25 ul de pocillo a pocillo hasta la dislucion que se desea
investigar
- Descartar los ltimos 25 ul
- Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones 1/ 2 y 1/4 , la cantidad
de 25 ul de globulos rojos no sensibilizados para control de heterofilia
- En el resto de los pocillos, agregar 25 ul de Antigeno HAI
- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta
- Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones durante 90 min.
- Leer a partir de los 90 min, se puede aumentar la nitidez de la
apreciacin leyendo sobre un espejo , iluminando la placa desde arriba e
interpretando un papel blanco
Interpretacin de los resultados
No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botn o pequeo anillo de
bordes regulares.
Reactivo: formacin de una pelcula o manto que cubre el 50% o ms del fondo
de los pocillos, hasta el ltimo posillo, informndose con el ttulo en dilucin
(ejemplo Positivo dil.1:64)
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
- Vibraciones accidentales durante el reposo necesario para el desarrollo de la
reaccin.
- Sueros envejecidos o congelados y descongelados repetidamente.
- Contaminaciones accidentales de los reactivos o del material empleado en el
ensayo.
- Exceso o defecto de Diluyente de Sueros HAI en los pocillos de la policubeta.
- Diluyente de Sueros HAI que tenga ms de 5 das de preparacin.
- En poblaciones endmicas, empleando el mtodo de HAI, el 98% de los
ttulos menores a 1/8 y el 95% de los ttulos mayores o iguales a 1/8 fueron
confirmados por los mtodos tomados como referencia.
- En poblaciones no endmicas, el 100% de los individuos sanos present
ttulos menores a 1/8 determinados por HAI.
- En el 100% de los individuos con serologa positiva confirmada por los
mtodos tomados como referencia y con parasitosis demostrada por
xenodiagnstico y/o hemocultivo, se observaron ttulos mayores o iguales a
1/32 determinados con Chagatest HAI.
- Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja reutilizar pocillos.
- Falta de homogeneizacin de los reactivos antes de su uso.
Conclusiones
Muchos de los pacientes de la enfermedad de Chagas en pases endmicos se
encuentran en zonas de acceso geogrfico reducido y sin servicios bsicos
como electricidad o agua. Por esta razn, es necesario el diagnstico mediante
los test de diagnstico rpido, que no requieren equipamiento especializado ni
personal entrenado.
RESULTADOS

Bibliografa
-http://amf-semfyc.com/web/article_ver.php?id=1409
-http://cate-serolog.blogspot.com/2008/07/chagas.html
Abbas A., Lichtman A., Pober J.: Inmunologa Celular y Molecular 5 edicin.
Ed. McGraw Hill Interamericana. Espaa 2004. Signatura Topogrfica
616.079 Ab19 c.4
- Rojas W.: Inmunologa 13 edicin. Investigaciones biolgicas. Colombia
2004. Signatura Topogrfica 616.079 R63
- Requeiro J., Lopez: Inmunologa, Biologa y Patologa del Sistema Inmune
Editorial Panamericana. 1996
- Russel T.: Inmunologa 2 edicin. 1999

CUESTIONARIO
1. Mencione las caractersticas clnicas que presenta una persona que
padece Chagas
R.-
2. Mencione otras pruebas de laboratorio que sean capaces de identificar
la enfermedad de Chagas
R.-
3. Esquematice el tipo de reaccin que sucede en caso de positividad y
negatividad en la prueba de HAI-Chagas

R.-
4Cules son las ventajas y desventajas del test de HAI-Chagas?
R.-
5. Describa las caractersticas principales del agente de la enfermedad de
Chagas
R.-
6. Que significado tiene el informe de laboratorio Positivo dilucin 1:32 y
Positivo dilucin 1:1024?
R.-
7.Describa las complicaciones que padecen las personas enfermas de
Chagas
R.-