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Rompimento celular

necessria a quebra celular para produtos como enzimas e produtos recombinantes


intracelulares. A forma de realizar o rompimento celular depende do tipo de microrganismos
empregado e ocorre aps a etapa de separao e lavagem das clulas obtidas ao final do
cultivo. Os critrios para a seleo da tcnica empregada deve considerar fatores como o
tamanho da clula, tolerncia e tenses de cisalhamento, necessidade de controle de
temperatura, tempo de operao, rendimento do processo, gasto de energia, custo e capital de
investimento.

Clulas envolvidas s por membranas celulares so frgeis e facilmente rompidas sob baixas
tenses de cisalhamento ou por simples variao da presso osmtica do meio, adio de
detergentes ou aplicao de ultra-som de baixa intensidade e requerem pouca energia para
sua realizao. Uma simples operao de bombeamento nessas clulas pode provocar perda
da molcula alvo e isso se tornaria um problema no processamento do meio. Por outro lado,
clulas com estruturas de parede robusta so de difcil rompimento.

Aps o rompimento celular obtm-se homogeneizado celular constitudo por molculaalvo,


biomolculas contaminantes e fragmentos celulares. Os compostos indesejveis devem ser
removidos por processos de filtrao, centrifugao, precipitao ou extrao lquido-lquido.

Os principais mtodos de rompimento celular so divididos em mecnicos, no-mecnicos,


qumicos e enzimticos. Onde os mecnicos so subdivididos em homogeneizador de alta
presso, moinho de bolas, prensa francesa e ultra-som. Os no-mecnicos so o choque
osmtico, congelamento ou descongelamento, aquecimento e secagem. Os qumicos so
divididos em lcalis, solventes, detergentes e cidos. E os mtodos enzimticos possuem lise
enzimtica ou inibio da sntese da parede celular.

Rompimento mecnico: No rompimento mecnico o homogeneizador a alta presso o


mtodo mais utilizado para a quebra celular e adaptado das indstrias de laticnios. Esse tipo
de rompimento provoca aumento da temperatura do meio. O calor gerado no processo pode
aumentar a temperatura da suspenso em 1,5C para cada 1000psi na presso de operao.
O homogeneizador constitudo por pistes projetados para aplicar altas presses, forando a
passagem da suspenso celular por um orifcio estreito seguido de coliso contra uma
superfcie rgida e imvel em uma cmara presso atmosfrica, ou coliso contra um
segundo fluxo sob presso elevada. A reduo instantnea da presso associada ao impacto
provoca o rompimento celular sem danificar biomolculas. O rompimento das clulas ocorre de
acordo com fatores que atuam simultaneamente sobre as clulas, como cavitao, turbulncia
e cisalhamento. Os seguintes fatores afetam o desempenho de um homogeneizador: presso
de operao, velocidade de alimentao, temperatura, estado fisiolgico do microrganismo,
condies de cultivo, tipo de clula e sua concentrao. A quantidade de clulas rompidas
proporcional presso na alimentao. O homogeneizador a alta presso possibilita a
recirculao do material, o que melhora a eficincia do rompimento. Esse procedimento
apresenta as seguintes desvantagens: elevao do custo do processo, possibilidade e
degradao a molcula-alvo e gerao de fragmentos celulares muito pequenos.

O moinho de bolas utilizado para romper clulas microbianas, fungos filamentosos e


microalgas. O moinho de bolas constitudo por uma cmara cilndrica fechada, horizontal ou
vertical, um sistema de refrigerao e um eixo que gira em alta rotao. Nessa cmara so
adicionadas esferas de vidro e clulas em suspenso. Ao longo do eixo de rotao esto
distribudos um ou mais discos ou hastes que giram em alta velocidade e provocam atrito entre
as esferas e as clulas intactas e causam rompimento celular. O rompimento ocorre devido
fora de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas. As
condies de rompimento nesse equipamento so facilmente controlveis e a eficincia do
processo depende da geometria da cmara de rompimento, da velocidade e do tipo de
agitador, do tamanho das esferas, da carga de esferas e da concentrao celular, da
velocidade de alimentao e da temperatura.
As cmaras horizontais so mais eficientes porque comportam maiores cargas de esferas e
abrigam mais esferas de dimetros reduzidos. Nas cmaras verticais a vazo de fluido na
direo ascendente e ocorre a fluidizao das esferas. As esferas devem ocupar entre 80 e
85% do volume da cmara horizontal e entre 50 e 60% se a cmara for vertical. A velocidade
do agitador influencia o nmero de contatos entre as clulas e as esferas e quanto maior a
velocidade e rotao, mais rpido o rompimento celular. O tipo de agitador tambm influencia
a eficincia de rompimento. Os agitadores podem estar dispostos no eixo central ou fora ele,
perpendicular ou obliquo. Para auxiliar na agitao eles podem conter sulcos, pequenos cortes
ou furos. O material mais utilizado nas esferas o vidro, mas tambm so usados materiais
como o ao, o inox e a cermica. Quanto menor o dimetro da esfera, mais eficiente o
rompimento. A frao de clulas rompidas diminui com o aumento do fluxo de alimentao do
moinho, pois diminui o tempo de residncia no rompedor. O fluxo timo de alimentao
depende da velocidade do agitador, da carga de esferas, da geometria do equipamento e das
propriedades do microrganismo. As temperaturas de operao em processos de rompimento
celular devem ser controladas para prevenir a destruio da biomolcula-alvo. Neste processo
liberada grande quantidade de calor. Na ampliao de escala do rompimento com moinho de
bolas devem se manter constantes os seguintes parmetros: tamanho das esferas, proporo
em volume entre a suspenso celular e as esferas de vidro e velocidade de rotao do eixo ou
velocidade perifrica das ps do agitador.

O rompimento celular por ultra-som o mtodo mais utilizado em escala de laboratrio e


ocorre quando ondas sonoras, com freqncia da ordem de 20 kHz, so convertidas em
vibraes em um meio liquido e causam o fenmeno de cavitao. Essas vibraes formam
bolhas muito pequenas que entram em colapso que geram ondas de choque que circulam pelo
meio liquido e resultam em impacto e aumento da tenso de cisalhamento, com conseqente
rompimento celular. O uso do ultra-som para o rompimento em larga escala invivel, pois
necessrio utilizar grande quantidade de sondas dispostas em serie e instalar um eficiente
sistema de refrigerao.

Rompimento no-mecnico: O choque osmtico insuficiente para romper a clula


integralmente, mas pode propiciar permeabilizao seletiva. Esse tipo de rompimento
indicado para bactrias Gram-negativas.

No rompimento por congelamento ou descongelamento h a formao intracelular de grandes


cristais de gelo que podem perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou lesion-la a
ponto de formar poros permeveis biomolcula-alvo. Os fatores de influencia nesse processo
so o tipo e a idade da clula, temperatura e velocidade dos ciclos de
congelamento/descongelamento. Este mtodo simples e indicado para o rompimento de
patgenos, mas um processo demorado, de custo elevado e inadequado para biomolculas
sensveis ao congelamento.

No rompimento atravs da termlise a suspenso celular pode ser aquecida em banho


termostatizado, com injeo de vapor direto, em tambor rotativo ou em spray-drier. Mtodo
utilizado no rompimento de algas, fungos filamentosos, leveduras e bactrias destinadas
produo de protena microbiana. Este mtodo gera fragmentos celulares com maiores
dimenses e facilmente removveis por filtrao ou centrifugao.

Rompimento qumico:

Os lcalis mais utilizados so amnia e hidrxido de sdio, porque causam inativao de


patgenos ou microrganismos geneticamente modificados durante o rompimento. A gerao de
poluentes a principal desvantagem no uso de lcalis em rompimento celular.

Os detergentes tm a propriedade de dissociar protenas e lipoprotenas das paredes celulares,


provocar a formao de poros e liberar a molcula-alvo. A eficincia do rompimento depende
do pH e da temperatura e pode ser aumentado por um pr-tratamento base de solventes
orgnicos que iniciam e estimulam a autlise.

Os solventes podem ser utilizados em desidratantes qumicos das clulas. Esse procedimento
indicado s para biomolculas que no sejam desnaturadas na presena do solvente
empregado.

Rompimento enzimtico:

O mtodo de lize enzimtica adequado para a recuperao de biomolculas sensveis


tenso de cisalhamento ou presso de trabalho dos homogeneizadores. Os seguintes fatores
devem ser considerados: presena de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima e
resistncia tenso de cisalhamento. O mecanismo de rompimento baseado no fato de que
a presso osmtica interna rompe a membrana, ou parte dela, ser removido por ao das
enzimas, permitindo que o contedo intracelular seja liberado para o meio externo. As
vantagens desse mecanismo so: fcil controle do pH e da temperatura do meio; baixo
investimento de capital; alta especificidade para degradao da parede celular; e uso em
associao com mtodos mecnicos.

Preservao da biomolcula-alvo:

Aps o rompimento, as protenas podem ser degradadas por proteases. essencial reduzir a
temperatura e adicionar inibidores de proteases para reduzir seus efeitos deletrios