UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

DESENVOLVIMENTO DE CLULAS DE COMBUSTVEL

MICROBIANAS

DBORA ROSA LEHNEN

Dissertao de Mestrado

PORTO ALEGRE
2014
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

DBORA ROSA LEHNEN

DESENVOLVIMENTO DE CLULAS DE COMBUSTVEL

MICROBIANAS

Dissertao apresentada como

requisito parcial para a obteno do
ttulo de mestre em qumica.

Prof. Dr. Dimitrios Samios

Orientador

Porto Alegre, abril de 2014.

 AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Dimitros Samios, que mesmo passando por momentos

difceis permaneceu forte, apoiando os objetivos dos seus alunos.
Ao Prof. Allon Hochbaum que me aceitou de braos abertos em seu laboratrio
e confiou no meu trabalho dando todo suporte de que precisei.
Aos colegas da UCI, John por todos os ensinamentos pacientemente
compartilhados e discutidos; Arumina, pelas horas divididas no microscpio confocal;
Nicole, pelas palavras dirias de gentileza; Tyler, pelas complexas explicaes; Zack,
por me introduzir na cultura californiana; Sun Jun, pelos cafs da tarde e a todos pela
presteza, companheirismo, amizade e saudade que ficou.
Aos meus colegas que viraram amigos do CECOM/LINDIM e do IQ.
Ao Samuel, pelo apoio, suporte e amor sem o qual esse trabalho no teria
acontecido.
minha famlia pelo incentivo e vibrao com cada conquista.
A todos que de alguma forma colaboraram para a realizao desse trabalho.

I
 SUMRIO

1. INTRODUO ......................................................................................................... 1
2. ESTADO DA ARTE .................................................................................................. 2
2.1. MFC DEFINIES E CONSIDERAES GERAIS....................................... 3
2.2. CONSERVAO DA ENERGIA BIOLGICA ................................................. 5
2.3. REQUERIMENTOS BSICOS PARA A TRANSFERNCIA DE ELTRONS
PARA O NODO ........................................................................................................ 7
2.4. TRANSFERNCIA DE ELTRONS ATRAVS DE MEDIADORES .............. 8
2.5. TRANSFERNCIA DIRETA DE ELTRONS ................................................... 9
2.6. GEOBACTER ..................................................................................................... 16
2.7. MFC E A BIORREMEDIAO ........................................................................ 18
2.8. LIMITAES DAS MFC ................................................................................... 20
2.8.1 Limitaes catdicas................................................................................. 22
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 26
3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 26
3.2. OBJETIVO ESPECFICO ................................................................................... 27
4. MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 28
4.1. CONSTRUO DAS MFCs .............................................................................. 28
4.1.1. Eletrodos ....................................................................................................... 28
4.1.2. Montagem da MFC....................................................................................... 30
4.2. CRESCIMENTO DAS BACTRIAS ................................................................. 32
4.3. OPERAO DAS CLULAS ............................................................................ 34
4.4. MEDIDAS ELETROQUMICAS ....................................................................... 35
4.4.1 Potencial de circuito aberto (OCP) Open Circuit Potential ....................... 36
4.4.2 Voltametria de varredura linear ..................................................................... 36
4.5. MICROSCOPIA CONFOCAL DE VARREDURA A LASER ......................... 38
4.6. FISH HIBRIDIZAO FLUORESCENTE IN SITU ..................................... 39
5. RESULTADOS E DISCUSSES ........................................................................... 41
5.1. DIFERENAS ENTRE CTODOS DE OXIGNIO E FERRICIANETO....... 46
5.1.1. Voltametria de Varredura Linear (LSV) Linear Sweep Voltametry ......... 46

II
 5.2. COMPARAO ENTRE MFCs USANDO G. metallireducens, G.
sulfurreducens E UMA COCULTURA DAS DUAS ESPCIES ............................. 50
5.2.1 Medida da densidade de pilis......................................................................... 54
5.3. TESTES PARA A UTILIZAO DE OUTRAS FONTES DE CARBONO .... 55
6. CONCLUSES........................................................................................................ 59
7. SUJESTES PARA TRABALHOS FUTUROS ..................................................... 59
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 60

III
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema de uma clula de combustvel microbiana utilizando acetato no

compartimento andico e ferricianeto como catlito ........................................................3
Figura 2: Clula de combustvel microbiana em formato H. Compartimento andico e
catdico separados por uma membrana semi permevel...................................................5
Figura 3: Transferncia de eltrons atravs de mediadores de eltrons solveis
liberados pelas clulas. Molculas trocadoras de eltrons oxidadas so reduzidas na
superfcie externa da clula e estas espcies reduzidas doam eltrons para o eletrodo .....9
Figura 4: Estrutura heme composta por um tomo central de Fe..................................11
Figura 5: Representao da nano rede formada por pilis em biofilmes de G.
sulfurreducens ................................................................................................................14
Figura 6: a) Microscopia de transmisso eletrnica mostrando a associao de xidos
de Fe (III) (indicados por setas) com pili expresso por G. sulfurreducens. b) Mecanismo
proposto para a transferncia de eltrons para o aceptor de eltrons externo em G.
sulfurreducens.. ...............................................................................................................15
Figura 7: Eletrodo revestido com catalisador metlico .................................................21
Figura 8: A) Esquema das perdas de tenso para o compartimento catdico no qual
pode ser visualizado perdas por ativao, hmicas e por transporte de massa. B) Uma
curva de potncia tpica ...................................................................................................23
Figura 9: Fio de ao inoxidvel sobre parte traseira do eletrodo de TiAu ....................29
Figura 10: Eletrodo de ouro (nodo) com parte frontal parcialmente coberta com
silicone. Quadrado de 0,6 cm de lado de Au exposto .....................................................29
Figura 11: Ctodo de tecido de carbono costurado com fio de Ti ................................30
Figura 12: Eletrodos conectados a clula ......................................................................31
Figura 13: Clulas fixadas com grampo plstico, separadas pela membrana semi
permevel.........................................................................................................................31
Figura 14: Entupimento da membrana semi permevel pela alta concentrao de
ferricianeto .......................................................................................................................35

IV
 Figura 15: Grfico V x t(s) obtido na medida de potencial de circuito aberto ..............36
Figura 16: Voltamograma tpico. A) ctodos com oxignio B) ctodos com
ferricianeto .......................................................................................................................37
Figura 17: Principais etapas da hibridizao fluorescente in situ .................................40
Figura 18: A) Curva de potncia nas respectivas horas de operao e B) Curva de
polarizao nas respectivas horas de operao para a clula constituda por ctodo de O 2
e rea de nodo de 6,0 x 10-4 m2. .....................................................................................42
Figura 19: A) Curva de polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. Ambas as curvas so referentes a clula
constituda por ctodo de O2 e rea de nodo de 4,0 x 10-4 m2, distncia mnima entre
eletrodos e membrana semipermevel. ............................................................................43
Figura 20: A) Curva de polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. Ambas as curvas se referem a clula
constituda por ctodo de O2 e rea de nodo de 1,82 x 10-4 m2. ....................................44
Figura 21: A) Curva polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. As curvas so referentes a clula com
condies otimizadas, ferricianeto no compartimento catdico e rea de 3,6 x 10-5 m2...46
Figura 22: Curvas de polarizao representativas para oxignio no ctodo (linhas
pontilhadas) e ferricianeto (linhas contnuas). Ambas exibem overshoot de potncia
no incio do desenvolvimento que desaparece aps 150 horas de crescimento.
Limitaes na densidade de corrente so comparveis, mas a curva de ferricianeto
aproxima-se muito mais do comportamento ideal. ..........................................................48
Figura 23: Os tringulos representam as MFCs que utilizam ferricianeto no
compartimento andico, enquanto clulas com O2 so representadas por crculos.
Curvas de polarizao representativas so mostradas de forma preenchida e curvas de

densidade de potncia na forma aberta para MFCs utilizando [Fe(CN)6]3 e O2 no
compartimento catdico........................................................................................... 49
Figura 24: Imagem dos biofilmes obtidas por microscpio confocal de varredura a laser.
(A) Biofilme de G. sulfurreducens de espessura de 62,1 m. (B) Biofilme de G.
metallireducens de espessura de 80 m. (C) Cocultura analisada por FISH, em vermelho
G. sulfurreducens e em verde G. metallireducensmetallireducens e G. sulfurreducens 51

V
 Figura 25: Curvas de polarizao para MFC utilizando culturas puras de G.
metallireducens. Efeito de overshoot diminui aps 240 horas de operao ................52
Figura 26: Grfico de densidade de potncia atingido e MFC para uma cultura pura de
G. metallireducens em azul e G. sulfurreducens em vermelho .......................................52
Figura 27: Grfico de potncia para uma MFC utilizando uma cocultura de G.
metallireducens e G. sulfurreducens ..............................................................................53
Figura 28: Medida da densidade ptica dos pilis das espcies Geobacter ....................55
Figura 29: G. metallireducens inoculada no controle, sem fonte de carbono, em 20
mM de glicerol e no controle com acetato (esquerda para direita) .................................56
Figura 30: G. metallireducens inoculada no controle sem glicerol, 5, 10, 20 e 30 mM
de glicerol (esquerda para direita). Pode-se ver o crescimento de bactrias apenas no
frasco contendo 20 mM de glicerol ................................................................................57
Figura 31: G. metallireducens inoculado no controle com acetato, 12, 14, 16, 18, 20,
22, 24 e 28 mM de glicerol e controle sem fonte de carbono (esquerda para direita). ....57
Figura 32: Densidade ptica (D.O.) das amostras nas respectivas concentraes. 14
mM demosntrou ser a concentrao mais apropriada para o crescimento das bactrias
em glicerol .......................................................................................................................58

VI
 LISTA DE TABELAS

Tabela I: Espcies Geobacter e as respectivas caractersticas inerentes a cada espcie18

Tabela II: Fluorocromos utilizados e seus respectivos comprimentos de onda ............41

VII
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

MFC Microbial Fuel Cell Clula de combustvel microbiana

NASA National Aeronautics and Space Administration
NADH Dinucletido de nicotinamida e adenina
NAD+ Enzima Aldedo Desidrogenase
MET Mediator electron transfer Transferncia de eltrons por mediadores
DET Direct electron transfer Transferncia direta de eltrons
Ac Acetato
AQDS Antraquinona 2,6 dissulfonato
Bz Benzaldedo
Bze Benzeno
Bzo Benzoato
BzOH Benzil lcool
BtOH Butanol
Buty Butirato
Cit Citrato
p-Cr p-cresol
EtOH Etanol
p-HBz p-hidroxibenzaldedo
p-HBzo p-hidroxibenzoato
p-HBzOH p-hidrobenzilalcool
IsoB Isobutirato
IsoV Isovalerato
Ph Fenol
Prop Propianato
PrOH Propanol
Pyr Piruvato
Tol Tolueno
Val Valerato

VIII
Fum Fumarato
Mal Malato
OPC Open Circuit Potential Potencial de Circuito Aberto
LSV Linear Sweep Voltammetry Voltametria de Varredura Linear
DNA cido desoxirribonucleico
RNA cido ribonucleico
FISH Fluorescence in situ Hybridization
FITC Isotiocianato de Fluorescena
TRITC Tetrametil rodamina isotiocianato
PBS Soluo tampo salina de fosfato
kDa 1/12 m.a. C12 = 1,66 x 10-24g
tris 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol

IX
 RESUMO

Clulas de combustvel microbianas despertaram interesse nos ltimos anos

devido aplicao em tratamento de guas, biorremediao e gerao de eletricidade.
Um dos organismos que tem sido estudado a fundo para a aplicao em clulas de
combustvel microbianas a Geobacter sulfurreducens. Esta espcie de Geobacter, que
gera eletricidade pela oxidao de compostos, mostrou gerar uma quantidade
significativa de energia devido a mltiplos mecanismos extracelulares de transferncia
de eltrons atravs de pilis ou citocromos do tipo C. Outra espcie de Geobacter que
desperta grande interesse a Geobacter metallireducens por ser capaz de oxidar
compostos aromticos e reduzir metais nocivos solveis (at mesmo radioativos)
forma inofensiva insolvel. Porm, o aumento na densidade de potncia destes
dispositivos essencial para que sejam competitivos com outras fontes de energia
renovvel.
Neste trabalho foi feito o estudo da melhor configurao visando a ausncia de
limitaes catdicas para aumento da densidade de potncia nas clulas, o que
demostrou que medidas como diminuio do tamanho no nodo, proximidade dos
eletrodos e substituio do ctodo de oxignio por ferricianeto melhoram a desempenho
da clula. Tambm foram feitas comparaes de densidade de potncia em clulas de
combustvel microbianas de culturas puras de G. metalirreducens e G. sulfurreducens e
uma cocultura das duas espcies. Essa comparao demonstrou que G. metallireducens
alm de poder ser utilizada para biorremediao apresenta uma densidade de potncia
elevada, podendo ser usada tambm como cultura pura em clulas de combustvel
microbianas, para a produo de eletricidade. Tambm se pode perceber uma relao
direta entre a espessura do biofilme e a potncia produzida nas trs clulas.
A espcie G. metallireducens demonstrou ainda ser til na utilizao de glicerol
como fonte de carbono, podendo servir como espcie remediadora para este resduo.

X
 ABSTRACT

Microbial fuel cells aroused interest in recent years due to the application in
water treatment, bioremediation and electricity generation. One of the microorganisms
that has been studied thoroughly for application in microbial fuel cells is the Geobacter
sulfurreducens. This specie of Geobacter, which generates electricity by oxidizing
compounds, showed generate a significant amount of energy due to multiple
mechanisms of extracellular electron transfer through Pilis or c type cytochromes.
Another specie of Geobacter that arouses great interest is the Geobacter
metallireducens by being able to oxidize aromatic compounds and soluble reducing
harmful metals to insoluble harmless. However, the increased power density of these
devices is essential to be competitive with other renewable energy sources.
This present work studied the best configuration aiming the absence of cathodic
limitations to increasing power density of the cells. Measurements have shown that
reduced anode size, location of the electrodes and replacement of oxygen by
ferricyanide, improves the performance of the cells. Comparisons of power density
between pure cultures of G. sulfurreducens and G. metalirreducens and a coculture of
the two species were also made. This comparison showed that G. metallireducens can
be used for bioremediation and also in a microbial fuel cell to produce electricity due
the high power density produced. Direct relationships between the thickness of the
biofilm and the power produced in the three cells have been notice. The specie G.
metallireducens also showed to use glycerol as a carbon source, which may be an
alternative for glycerol consumption.

XI
1. INTRODUO

A busca por fontes alternativas de energia tem requerido grandes esforos da

comunidade acadmica e cientfica devido a questes ambientais e econmicas. A atual
dependncia em combustveis fsseis insustentvel devido poluio e aos recursos
finitos. Enquanto muitas pesquisas tm sido conduzidas em uma larga variedade de
solues energticas, uma nica alternativa no ser suficiente para substituir os
combustveis fsseis em sua integridade, mas sim, provavelmente, uma variedade de
diferentes tecnologias, gerando energia para tarefas especficas de forma especializada
em diversas situaes.1
A descoberta de que o metabolismo microbiano pode gerar energia na forma de
corrente eltrica tem levado a um crescente interesse no domnio das tecnologias com
Clulas de Combustvel Microbianas (MFCs) que parecem oferecer uma boa alternativa
para a gerao de energia eltrica em baixa escala, colaborando como uma soluo para
o problema mencionado anteriormente.2 Alm de produzir energia as MFCs so
tambm uma alternativa para biorremediao, pois so capazes de degradar matria
orgnica de esgoto domstico, por exemplo, desempenhando um importante papel na
descontaminao de guas subterrneas.3
As clulas de combustvel microbianas emergiram recentemente como uma
tecnologia promissora, porm ainda desafiadora. H a necessidade de um melhor
entendimento do mecanismo envolvido na converso da energia bioeletroqumica, na
transferncia de eltrons e nos processos de biotransformao para que as limitaes
hoje apresentadas por esses sistemas sejam sanadas possibilitando o desenvolvimento
de plantas com maior eficincia. Apesar dessas limitaes, as MFCs so consideradas
uma tecnologia sustentvel promissora para atender as crescentes necessidades
energticas e especialmente para uso de guas residuais como substrato. Dessa forma,
gerando eletricidade e realizando o tratamento dos resduos simultaneamente, os custos
operacionais da planta de tratamento so compensandos.
Neste trabalho, culturas puras da bactria Geobacter sulfurreducens, comumente
encontrada em lodos, foram utilizadas para avaliar o desempenho das MFCs em
situaes diversas, buscando a configurao de melhor desempenho em relao

1
densidade de potncia mxima. Apesar do foco das MFCs ser a utilizao de lodos e
guas residuais como substrato, h a necessidade de um melhor entendimento do
mecanismo de transferncia de eltrons que ocorre neste tipo de clula. Para tanto,
foram utilizadas culturas puras com o intuito de reduzir as variveis em estudo,
possibilitando uma maior compreenso do mecanismo envolvido. Aps definido o
modelo a ser empregado, foi feita uma comparao na produo de potncia entre as
culturas Geobacter sulfurreducens e Geobacter metallireducens e uma cocultura das
duas espcies. A primeira conhecida por produzir uma alta densidade de corrente, a
segunda por suas propriedades biorremediadoras e a combinao das duas espcies
buscando compilar as caractersticas de ambas. Por ltimo, foi feita uma avaliao do
uso de glicerol, resduo da produo de biodiesel, como substrato para as bactrias
estudadas.
Este trabalho destaca-se pelo carter inovador, tanto pela avaliao da melhor
configurao, avaliao do uso de Geobacter metallireducens em clulas de
combustvel microbianas, quanto pela avaliao do uso de glicerol como substrato para
esse tipo de cultura. Apesar de este assunto ser tema de muitas publicaes, atualmente
a abordagem do mesmo no Brasil ainda se encontra em fase inicial.4,5,6

2. ESTADO DA ARTE

A ocorrncia de uma fora eletromotriz entre eletrodos imersos em culturas

bacterianas em um meio estril em uma configurao do tipo bateria foi primeiramente
reportada por Michael C. Potter em 19117 que concluiu que energia eltrica pode ser
liberada pela desintegrao de compostos orgnicos por bactrias. Vinte anos depois
Cohen confirma estes resultados8. Apesar de estas publicaes serem consideradas o
bero das MFCs, apenas depois de 1960 a ideia da gerao de eletricidade pelas
bactrias ressurgiu no mbito do programa espacial da NASA como uma oportunidade
de reciclar os dejetos humanos durante os voos espaciais e gerar eletricidade.9 Durante
os esforos de investigao do sistema, a complexidade dos processos
bioeletroqumicos envolvidos e a necessidade de programas extensos de pesquisa
sistemticas se tornaram evidentes.10,11 Assim sendo, os rpidos avanos em outras

2
tecnologias energticas, como na rea de energia fotovoltaica, e a alta complexidade do
sistema acabaram reduzindo o interesse nas MFCs. Apenas no final do sculo XX o
assunto veio tona novamente e pesquisas considerveis comearam a ser realizadas na
rea. O interesse por essa tecnologia e o constante aumento nos estudos da mesma se
deve conscientizao de que os combustveis fsseis so finitos, das consequncias
ambientais emergentes da sua utilizao e da necessidade de desenvolver tecnologias
para um manejo sustentvel do meio ambiente e dos recursos naturais.

2.1 MFC DEFINIES E CONSIDERAES GERAIS

A clula de combustvel microbiana um dispositivo eletroqumico no qual um

substrato oxidado no compartimento andico por bactrias que utilizam os eltrons,
provenientes da oxidao no seu metabolismo e em seguida o transferem para o nodo.
Os eltrons gerados movem-se atravs de um condutor externo at o ctodo onde ocorre
reduo do composto presente no compartimento catdico, geralmente ferricianeto ou
oxignio, gerando corrente eltrica. Os prtons gerados no compartimento andico
migram para o compartimento catdico atravs de uma membrana semipermevel que
separa os dois compartimentos para completar o balano de cargas. Uma diferena de
potencial aparece entre os dois eletrodos. A Figura 1 apresenta um esquema de uma
MFC.

Figura1: Esquema de uma clula de combustvel microbiana utilizando acetato como

substrato no compartimento andico e ferricianeto como catlito.

3
 O desempenho no compartimento andico intrinsecamente dependente da
natureza e taxa do metabolismo anaerbico como tambm da natureza e taxa de
transferncia de eltrons do biofilme microbiano para o nodo. A tarefa fundamental da
clula microbiana transformar um substrato eletroquimicamente inativo e a energia
qumica que este contm em uma forma acessvel para a oxidao e, assim, para
converso em energia eltrica. Para esta transformao usa-se o metabolismo
microbiano, ou mais precisamente o catabolismo microbiano a energia liberada pela
degenerao do substrato.12 Porm a transferncia de eltrons do metabolismo
microbiano para o eletrodo envolve um processo complexo que ser explicado ao longo
deste trabalho.
Os materiais utilizados para a construo do nodo devem ter boa condutividade
eltrica e baixa resistncia eltrica, alta biocompatibilidade, estabilidade qumica e no
podem sofrer corroso. O ctodo deve possuir alto potencial redox e ser fcil de
capturar prtons.
Diversas configuraes so possveis, sendo que estas se diferenciam na
natureza e mecanismo de transferncia de eltrons, podendo ser compostos por um ou
dois compartimentos, possuir ou no membrana semipermevel, utilizar diferentes
tamanhos e materiais nos eletrodos, diferentes substratos ou ainda utilizar sedimentos,
culturas puras ou coculturas de bactrias. Alm disso, podem ser de fluxo contnuo ou
por bateladas e possuir diferentes modelos, sendo que a clula no formato H a mais
utilizada devido ao baixo custo e alta funcionalidade como se pode observar na Figura
2.

4
Figura 2. Clula de combustvel microbiana em formato H. Compartimentos andico e
catdico separados por uma membrana semi permevel.

2.2. CONSERVAO DA ENERGIA BIOLGICA

Quando seres vivos metabolizam um substrato a energia obtida a partir da

oxidao de compostos energeticamente ricos (ricos em eltrons) como carboidratos,
por exemplo. Este trabalho fundamentado em clulas vivas, mais precisamente em
microrganismos unicelulares que apresentam um complexo mecanismo de
metabolizao do substrato que envolve inmeras reaes catalisadas por enzimas,
acontecendo atravs de uma srie de intermedirios e envolvendo sucessivas reaes de
oxi-reduo. O processo metablico de transferncia de eltrons permite aos organismos
capturar, armazenar e liberar energia. Os substratos que so oxidados (perdem eltrons)
so denominados doadores de eltrons, ou seja, redutores; substratos que so reduzidos
(ganham eltrons) so denominados aceptores de eltrons (oxidantes).13
Hetertrofos como animais e bactrias podem obter energia para viver pela
oxidao de matria orgnica, ou mais precisamente, da energia livre de Gibbs, Gox da
oxidao. No modelo geral de crescimento heterotrfico, eltrons provenientes da
matria orgnica reduzem uma pequena molcula redox ativa, como NAD+ para
NADH. O NADH formado na gliclise, na oxidao de cidos graxos e no ciclo do
cido ctrico; todos processos de transferncia de eltrons intracelulares. uma
molcula rica em energia porque contm um par de eltrons com alto potencial de

5
transferncia. Quando esses eltrons so doados para o aceptor de eltrons final da
cadeia respiratria, libera-se uma grande quantidade de energia livre que pode ser usada
para gerar ATP (Trifosfato de adenosina), principal fonte de energia dos seres vivos.
Eltrons provenientes do NADH so transferidos para transportadores de
eltrons, como por exemplo, quinonas, via complexo NADH1, o qual desloca e eleva o
gradiente de prtons. Dependendo do envolvimento de oxidantes exgenos (aceptor de
eltrons final) duas principais vias metablicas podem ser distinguidas: respirao ou
fermentao.13
O processo de fermentao uma forma biolgica de desproporcionalizao a
qual ocorre na ausncia de oxidantes exgenos. Parte do substrato orgnico serve de
aceptor de eltrons e tornar-se reduzida, enquanto outra parte oxidada.14 Em
comparao aos outros processos, a fermentao o processo com o menor ganho
energtico pelo organismo. Esta baixa utilizao de energia acompanhada pela
oxidao incompleta do substrato, deixando a maior parte do seu contedo energtico
no utilizado, na forma de produtos da fermentao ricos energeticamente. A
fermentao o processo utilizado em biorreatores, por exemplo, porm devido ao
baixo ganho energtico no interessante para as clulas de combustvel microbianas.
Na respirao, os eltrons obtidos na oxidao do substrato so transferidos via
cascata redox, a cadeia respiratria a energia decresce gradualmente e finalmente
transferida para um aceptor de eltrons final. Quanto mais positivo for o potencial redox
do aceptor de eltrons final, maior a energia ganha pelo organismo:

G = nF [E (doador) - E (aceptor)] (1)

onde E representa o respectivo potencial padro biolgico e G denota a mudana na

energia livre de Gibbs sob condies biolgicas padres.14
A respirao aerbica, a qual utiliza O2 como aceptor final de eltrons, o
processo de maior ganho energtico. No processo de respirao h um aproveitamento
total da energia proveniente do substrato que completamente oxidado a CO2. Sob
condies anxicas (sem a presena de oxignio, mas na presena de nitrito),
facultativas ou estritamente anaerbias, ao invs de transferirem eltrons para o
oxignio, como acontece na respirao aerbica, outros aceptores finais, orgnicos ou

6
inorgnicos, so utilizados. Nitrato, sulfato, dixido de carbono (metanognese), ons
metlicos como Fe+3, envolvidos em processos biogeoqumicos, e fumarato so
exemplos desses aceptores.12
A principal diferena na produo de eletricidade microbiana em clulas de
combustvel contra processos bioqumicos naturais, tais como reduo de fumarato a
succinato, que eltrons so transferidos para um eletrodo ao invs de um aceptor de
eltrons natural.

2.3 REQUERIMENTOS BSICOS PARA A TRANSFERNCIA DE ELTRONS

PARA O NODO

Uma vez que eletrodos so slidos que no podem penetrar na clula bacteriana,
requerido que eltrons sejam transferidos de dentro para fora da membrana celular
microbiana tanto por contato fsico de componentes reduzidos como atravs do
deslocamento de eltrons atravs da membrana utilizando uma enzima redox ligada
mesma. Em relao aos mecanismos, a transferncia de eltrons fora da clula deve
resultar em espcies eletroativas que so capazes de ligar eletronicamente a clula
bacteriana ao eletrodo. Estas espcies devem ser, por exemplo, transportadores redox
solveis, uma protena redox da membrana externa ou um metablito primrio da
reduo que so denominados mediadores, pois fazem a ligao com o eletrodo,
fazendo a transferncia de eltrons para o mesmo.
Para uma transferncia de eltrons eficiente, necessrio que a espcie
mediadora seja capaz de estabelecer um contato fsico com a superfcie do eletrodo; seja
eletroquimicamente ativa (possuir um baixo potencial de reduo quando entrar em
contato com a superfcie do eletrodo) e possua um potencial padro parecido com o
potencial de reduo do substrato ou ao menos significativamente negativo em
comparao ao aceptor de eltrons final.12-14
Diferentes mecanismos de transferncia de eltrons foram identificados e
estudados at o momento. Para uma classificao bsica, dois tipos de mecanismos
podem ser identificados: transferncia de eltrons por mediadores (MET), no qual o
mediador uma espcie redox solvel, ou via transferncia direta de eltrons (DET) o

7
qual procede atravs de uma protena redox que est ligada a membrana da clula
microbiana.12

2.4 TRANSFERNCIA DE ELTRONS ATRAVS DE MEDIADORES

Em 1930, Cohen apontou que na utilizao de culturas bacterianas, quando

cultivadas em condies anaerbias, estas apresentaram um potencial de reduo
fortemente negativo, porm a corrente produzida foi mnima. Ele atribuiu esta baixa
capacidade de gerao de corrente a uma falta de ''eletromotividade dos produtos de
oxireduo ativos''. Como soluo para este problema, ele props a introduo de
substncias orgnicas do tipo benzoquinona para facilitar a transferncia de eltrons a
partir das culturas para os eletrodos nelas mergulhados.15 A abordagem foi retomada na
dcada de 1980, especialmente por Bennetto e colaboradores. Um grande nmero de
compostos, a maioria baseada em fenazinas, fenotiazinas, fenoxazinas e quinonas foram
investigados com o intuito de serem utilizados como mediadores nas MFCs.16
Na ausncia de oxignio, eltrons podem ser desviados da cadeia respiratria por
estes mediadores redox os quais entram na membrana celular externa, se reduzem e
saem da membrana nesse estado reduzido. O mediador reduzido oxidado ao entrar em
contato com o eletrodo, transferindo os eltrons roubados da bactria para o eletrodo e
produzindo uma corrente eltrica conduzida atravs de um circuito externo.
A grande desvantagem na utilizao de mediadores redox exgenos a
necessidade de uma adio regular do mediador, o que tecnicamente impraticvel e
ambientalmente questionvel, j que a maioria tem carter txico e conduz ao abandono
geral da abordagem sustentvel que este modelo de clula de combustvel prope.
Diferentemente dos mediadores adicionados artificialmente, algumas espcies
como, por exemplo, Shewanella produzem mononucleotdeos flavinas e riboflavinas
quando crescem em meio contendo ferro, fumarato ou eletrodos. Estas flavinas
funcionam como mediadores de eltrons para oxidantes extracelulares slidos (ex. Fe
(III) mineral ou eletrodos). Esses mediadores ficam reduzidos na superfcie celular e
oxidados extracelularmente. Porm, este tipo de organismo no o foco deste trabalho.
A Figura 3 representa o mecanismo de transferncia de eltrons por mediadores.17

8
Figura 3. Transferncia de eltrons atravs da reduo de mediadores de eltrons
solveis liberados pelas clulas. Molculas na forma oxidada so reduzidas na
superfcie externa da clula e estas espcies reduzidas doam eltrons para o eletrodo17.

2.5 TRANSFERNCIA DIRETA DE ELTRONS

Est claro que a principal barreira para os microrganismos transferirem eltrons

para um aceptor de eltrons final externo clula, como por exemplo Fe+3 ou eletrodos,
o sistema de membranas lipdicas no condutivas que serve como isolante, separando
o citoplasma, onde os eltrons so extrados da matria orgnica durante o metabolismo
central, da parte externa da clula, onde o aceptor de eltrons final se localiza.18
Considerando que clulas vivas no so condutoras, este tipo de mecanismo foi por
muito tempo considerado impossvel.
Uma estratgia utilizada pela bactria Geobacter sulfurreducens, para desviar
esses eltrons do metabolismo central para aceptores de eltrons externos a clula, como
xidos de Fe+3, composto utilizado em seu ambiente natural j que a mesma
abundante em sedimentos onde este elemento est presente. A transferncia extracelular

9
de eltrons uma caracterstica da condio fisiolgica especfica de espcies
Geobacter. A capacidade de troca de eltrons com seu ambiente extracelular define o
nicho ecolgico nico desta espcie e uma caracterstica importante das muitas
aplicaes prticas deste gnero. O processo realizado por meio de mecanismos
nicos que ainda no foram descritos em qualquer outro organismo.
O sistema de transferncia de eltrons para um aceptor externo clula composto
por uma srie de citocromos do tipo c, protenas com estrutura multi-heme, associados
com a membrana interna, o periplasma e a membrana externa, interagem para
transferirem eltrons para a superfcie da membrana externa. Dessa forma, a
transferncia direta de eltrons ocorre atravs de um contato fsico da membrana celular
bacteriana ou mais precisamente de uma organela da membrana com o aceptor de
eltrons final ou o nodo, sem difuso de espcies redox envolvidas na transferncia de
eltrons da clula para o aceptor de eltrons final, ou seja, sem a presena de
mediadores.18
As estruturas multi-heme (Figura 4), compostos do tipo porfirina que so molculas
orgnicas com uma estrutura geral de macrociclo tetrapirrlico, ligados por ligaes
metnicas, que possui no seu centro um espao apropriado para acomodar um on
metlico. Especificamente na estrutura heme, essas molculas possuem um tomo
central de ferro que se alterna entre o estado reduzido, ferroso, (+2) e o estado oxidado,
(+3) durante o transporte de eltrons, desempenhando um importante papel na
transferncia de eltrons e compe a estrutura do citocromo do tipo c.

10
 Figura 4. Estrutura heme composta por um tomo central de Fe.

O citocromo do tipo c uma protena hidrossolvel e um componente essencial da

cadeia transportadora de eltrons, participando da transferncia dos eltrons para o
aceptor final na cadeia respiratria.
Atravs da purificao dos citocromos do tipo c localizados na superfcie externa da
clula, verificou-se que estes so capazes de reduzir aceptores de eltrons extracelulares
conhecidos in vitro.19,20,21 Estudos atravs da excluso de gene sugerem que os mesmos
citocromos do tipo c transferem eltrons para uma diversidade de aceptores de eltrons
extracelulares in vivo.22 J estudos sobre a produo de corrente em biofilmes de G.
sulfurreducens demonstraram que estes citocromos comunicam-se eletroquimicamente
com o nodo, utilizando-o como aceptor de eltrons final.23,24 Em alguns casos os
citocromos esto localizados suficientemente perto da superfcie do eletrodo de modo a
transferir eltrons diretamente dos citocromos para o eletrodo, assim funcionando como
a ponte eletroqumica entre as clulas em contato com a superfcie do eletrodo. Sob
estas condies, corrente pode ser produzida atravs dos citocromos do tipo c
localizados na membrana externa.25 Esses citocromos, essenciais para a reduo de Fe+3,
so exibidos sobre a membrana externa da clula. Em comparaes entre a expresso de
genes em clulas produtoras de corrente contra clulas que cresceram utilizando

11
aceptores de eltrons alternativos, bem como estudos de deleo de gene (perda de um
ou mais nucleotdeos), identificaram diversos citocromos do tipo c localizados na
superfcie externa das clulas da espcie G. sulfurreducens que podem ser os
responsveis por fazer este contato eltrico com aceptores de eltrons externos clula,
como por exemplo, eletrodos, entre eles destacaram-se OmcB, OmcE, OmcS e
OmcZ.25,26
O citocromo OmcB tem uma massa molecular de 89 kDa, uma estrutura composta
por 12 hemes e um potencial redox mdio de 190 mV, porm alguns de seus hemes
possuem potencial mais negativo. OmcB est incorporado na membrana externa, com
uma parte da molcula exposta na superfcie exterior da clula.27 Considerando que o
OmcB integra a membrana externa, diversos citocromos do tipo c da espcie G.
sulfurreducens se encontram totalmente expostos na superfcie exterior da clula. A
partir da deleo deste gene foi possvel verificar que este responsvel pela reduo de
citrato de Fe (III) e xido de Fe (III), porm as cepas mutantes, que tiveram o gene
deletado, mostraram se adaptar e passaram a reduzir citrato de Fe (III), mas no xido
de Fe (III).
O citocromo OmcS um citocromo do tipo c composto de seis hemes com uma
massa molecular de 47 kDa e com um potencial de reduo mdio de 212 mV, mais
negativo que os citocromos do tipo c localizados no periplasma.27 O OmcS mostrou-se
envolvido em biofilmes finos gerando baixos nveis de corrente. provvel que o
OmcS seja o principal responsvel por fazer o contato eltrico com a superfcie
relativamente plana do eletrodo, porm a corrente produzida nesses estudos iniciais foi
bastante baixa.72
O OmcE outro citocromo do tipo c que se encontra na superfcie externa da
clula, mas sua localizao especfica ainda no foi determinada. Como ainda no foi
isolado, h apenas uma previso de que sua massa molecular seja em torno de 32 kDa e
que possua uma estrutura de quatro hemes. Estudos de padro de expresso bem como a
deleo do gene sugerem que o OmcE desempenha um papel na transferncia de
eltrons extracelular em cepas selvagens, porm as clulas so capazes de se adaptar
com a perda do mesmo. Em contraste ao OmcE e OmcS, o OmcZ no necessrio para
a reduo de Fe (III) insolvel. No entanto, de todos citocromos de G. sulfurreducens
estudados at o momento, apenas o OmcZ parece ser de fundamental importncia em

12
biofilmes que produzem elevados nveis de corrente.26 O OmcZ uma protena
hidrofbica com uma massa molecular de 30 kDa. Possui uma estrutura composta por
oito hemes, que abrange uma ampla gama de potenciais de reduo (- 420 mV a - 60
mV) e cujo potencial de reduo mdio de - 220 mV. A deleo do gene OmcZ,
segundo Nevin et al, claramente inibe a produo de corrente, assim como a eliminao
de outro gene que reduz a expresso de OmcZ na superfcie externa da clula.28
Anlises de voltametria cclica demonstraram um aumento da resistncia transferncia
de eltrons para o eletrodo em linhagens deficientes em OmcZ. A deleo de genes de
outros tipos de citocromos do tipo c localizados na superfcie externa da clula no
demonstraram uma resposta semelhante.29 Assim, evidncias em diversas linhas
sugerem que o citocromo OmcZ a chave para a transferncia de eltrons entre
biofilmes de G. sulfurreducens e o nodo, porm maiores investigaes das
propriedades que servem unicamente ao OmcZ para este fim so necessrias, alm do
entendimento da sua relao com Fe (III) j que o mesmo no demonstrou ser
necessrio para a reduo deste composto.
Considerando que os citocromos necessitam estar em contato direto com o
eletrodo para fazer a transferncia de eltrons para o mesmo, a capacidade de produo
de corrente da monocamada de clulas em contato direto com a superfcie do eletrodo
limitada pelo espao disponvel para os microrganismos acessarem esta superfcie.
Maiores densidades de corrente (corrente produzida por rea do eletrodo) so possveis
a partir de biofilmes eletricamente condutivos, os quais permitirem mltiplas camadas
de clulas contribuam para a produo de corrente. Conforme citado anteriormente,
biofilmes da maioria dos organismos agem como isolantes ao invs de condutores,
porm o mesmo no observado para o gnero Geobacter.
A possibilidade da existncia de um biofilme condutor foi primeiramente
proposta a partir de estudos de produo de corrente em biofilmes de G. sulfurreducens
e subsequentemente confirmada por medidas diretas.30,31 Em sistemas nos quais se pode
observar a formao de um biofilme espesso no nodo, a potncia foi de at dez vezes
superior. A alta condutividade de biofilmes de G. sulfurreducens que so capazes de
produzir corrente mesmo na distncia de mltiplas clulas em relao ao nodo,
contribui para a alta produo de corrente.30,32 As evidncias sugerem que a
condutividade do biofilme pode ser atribuda a uma densa rede de pilis que so

13
filamentos similares a flagelos, porm responsveis pela conduo de eltrons, que
formam uma nano rede (Figura 5) com uma condutividade semelhante condutividade
metlica, responsvel pela transferncia de eltrons a longa distncia atravs do
biofilme.30,32

Figura 5. Representao da nano rede formada por pilis em biofilmes de G.

sulfurreducens.

Estudos em pilis de G. sulfurreducens demonstraram que este organismo

demonstra filamentos do tipo pili provenientes de uma srie de protenas, mas os
filamentos mais abundantes so compreendidos pela protena PilA. Pilis de G.
sulfurreducens apresentam de 3-5 nm de largura e at 10-20 m de comprimento que
semelhante ao de outros pilis de tipo IV34 mas at agora apenas os pilis de G.
sulfurreducens demonstraram ser condutivos. Quanto condutividade metlica,
surpreendentemente os biofilmes de G. sulfurreducens apresentaram caractersticas
consistentes com a condutividade em metais, como por exemplo, a condutividade
inicialmente aumenta exponencialmente com a diminuio da temperatura, uma
caracterstica de metais, semelhante a condutividade que tambm foi observada em
polmeros orgnicos condutores. Uma condutividade similar tambm foi observada em
experimentos nos quais pilis foram isolados e colocados em um sistema de dois
eletrodos separados por um gap no condutivo. Foi possvel medir a condutividade entre
os dois eletrodos, demonstrando que a rede formada pelos pilis era condutiva. Anlises

14
de difrao de raio-X dos pilis sugerem sobreposio -.31 Dessa forma uma hiptese
de que os aminocidos aromticos que formam a protena estejam alinhados ao longo da
superfcie externa do pili de modo a fornecer a sobreposio -.
Na Figura 6a e 6b pode-se visualizar a nano rede formada pelos pilis bem como
o mecanismo de transferncia de eltrons proposto.

Figura 6. a) Microscopia de transmisso eletrnica mostrando a associao de xidos de

Fe (III) (indicados por setas) com pili expresso por G. sulfurreducens. possvel ver
que os pilis esto interligados com os xidos de Fe (III). b) Mecanismo proposto para a
transferncia de eltrons para o aceptor de eltrons externo em G. sulfurreducens.

O fluxo de eltrons proposto entre os citocromos baseado em sua localizao

relatado dentro da clula bacteriana. importante notar que o genoma de G.
sulfurreducens contm genes que codificam cerca de 100 citocromos do tipo c, alguns
dos quais podem tambm participar neste processo de transferncia de eltrons.18

15
2.6 GEOBACTER

O gnero Geobacter pertence famlia Geobacteraceae, que est dentro do

domnio Bactria, filo Proteobactria, classe Deltaproteobactria e
ordem Desulfuromonadales. Todas as Geobacter isoladas so bacilos Gram-negativos
que so capazes de oxidar acetato (substrato, doador de eltrons) com a reduo de Fe
(III), (aceptor de eltrons). So bactrias no patognicas, estritamente anaerbicas,
abundantes em lodos e sedimentos. As duas espcies Geobacter mais fortemente
estudadas at ento so G. metallireducens e G. sulfurreducens que alm de oxidar
acetato e reduzir Fe (III) possuem, cada uma, a capacidade de oxidar e reduzir
compostos especficos a cada espcie, conforme pode ser visto na Tabela I.72

Tabela I. Espcies Geobacter e as respectivas caractersticas inerentes a cada espcie.

Nome Temperatura Doador de Formas de Outros aceptores
tima de Eltrons utilizao de Fe de eltrons
crescimento
Geobacter 30C Ac, Bz, Bze Fe2O3, Cit Fe(III) Mn(IV), Tc(VII)
metallireducens BtOH, Buty, U(VI), AQDS
Bzo, BzOH, p-Cr, cidos hmicos,
EtOH, p-HBz, nitrato
p-HBzo, p-HBzOH,
IsoB, IsoV, Ph,
Prop, PrOH, Pyr,
Tol, Val

Geobacter 35C Ac, H2 Fe2O3, Cit Fe(III)

Tc(VII), Co(III),
sulfurreducens Fe3P U(VI), AQDS,
S, Fum, Mal,
O2
Abreviaes: acetato (Ac), antraquinona 2,6 dissulfonato (AQDS), benzaldedo
(Bz), benzeno (Bze), benzoato (Bzo), benzil lcool (BzOH), butanol (BtOH), butirato
(Buty), citrato (Cit), p-cresol (p-Cr), etanol (EtOH), p-hidroxibenzaldedo (p-HBz), p-
hidroxibenzoato (p-HBzo), p-hidrobenzilalcool (p-HBzOH), isobutirato (IsoB),
isovalerato (IsoV), fenol (Ph), propianato (Prop), propanol (PrOH), piruvato (Pyr),
tolueno (Tol), valerato (Val), fumarato (Fum), malato (Mal).

16
 As espcies Geobacter desempenham um papel importante na degradao de
uma diversidade de contaminantes orgnicos em guas subterrneas, tanto atravs de
atenuaes naturais quanto por estratgias usando a engenharia de biorremediao. A
habilidade das espcies Geobacter em transferir eltrons para eletrodos tem inspirado
diversas novas estratgias para produzir bioenergia e promover a biorremediao. Uma
importante caracterstica desse gnero a capacidade de se associar a microrganismos
metanognicos formando coculturas sob condies em que podem contribuir
significantemente para a converso de dejetos orgnicos ou hidrocarbonetos em metano.
A capacidade fisiolgica caracterstica da espcie Geobacter em acoplar a
oxidao de compostos orgnicos reduo de Fe (III) permite a esta espcie preencher
um nicho chave na cadeia alimentar microbiana anaerbia de ambientes sedimentares
como sedimentos aquticos, pntanos, arrozais e ambientes do subsolo nos quais a
reduo de Fe (III) desempenha um papel importante como aceptor de eltrons final. A
Geobacter foi detectada em diversos ambientes como aquferos contaminados com
petrleo, lixiviados de aterros, ambientes contaminados com cidos orgnicos, solos
contaminados e sedimentos aquticos, sedimentos subsuperficiais contaminados por
urnio tratado com produtos orgnicos para promover a reduo do metal, ambientes
subsuperficiais com altas concentraes de arsnio, turfa e ambientes contaminados
com compostos clorados dentre outros.72
A G. metallireducens, primeiramente denominada GS-15, foi a primeira espcie
Geobacter a ser isolada como cultura pura. O desenvolvimento recente de um sistema
gentico para G. metallireducens35 foi provavelmente o que voltou a ateno a este
organismo para elucidar a fisiologia de novas propriedades importantes, como a
degradao anaerbica de benzeno. Esta espcie foi a primeira espcie Geobacter
descoberta que possui a propriedade de degradar compostos aromticos e o primeiro
microrganismo de qualquer tipo de cultura pura que se sabe, capaz de degradar
hidrocarbonetos aromticos. Um interesse particular referente a esta espcie a
habilidade de degradar benzeno, sendo que esta a nica espcie como cultura pura
cujo mecanismo anaerbico de degradao foi reportado.
Depois da reduo de Fe (III), a transferncia de eltrons para os eletrodos a
forma de respirao mais estudada para espcies Geobacter. Esta, e as espcies
similares Desulfuromonas e Geopsychrobacter foram os primeiros microrganismos

17
descobertos capazes de conservar energia para suportar seu crescimento a partir da
oxidao de matria orgnica com transferncia de eltrons para eletrodos e aparentam
ser os organismos mais eficazes a realizarem esta forma de respirao.72
Os organismos Geobacter so os mais abundantes que colonizam eletrodos em
culturas mistas inoculadas ou comunidades naturais, especialmente sob condies
estritamente anaerbias. Dentre as espcies Geobacter a mais abundante a Geobacter
sulfurreducens, o que consistente com a descoberta de que as cepas de G.
sulfurreducens produzem as maiores densidades de corrente dentre as culturas puras,
acompanhada pela alta eficincia de Coulomb. Isto lhes proporciona uma alta
competitividade na colonizao de eletrodos. Foram reportadas densidades de potncia
em clulas de combustvel microbianas36-39 utilizando culturas puras de G.
sulfurreducens que variam entre 0,09 mW/m2, 1,2 W/m2, 1,9 W/m2 e 3,9 W/m2. Para
MFCs utilizando guas residuais os valores de densidade de potncia encontrados na
literatura40-43 foram de 19,36 mW/m2, 148 mW/m2, 1430 mW/m2 e 1540 mW/m2. Os
estudos utilizando G. metallireducens se concentram essencialmente em suas
propriedades biorremediadoras, mas as poucas MFCs encontradas na literatura que
utilizam esse microrganismo apresentaram densidade de potncia mxima44,45 de 40
mW/m2 e 80 100 mW/m2.

2.7 MFC E A BIORREMEDIAO

Espcies Geobacter so componentes importantes da comunidade microbiana em

aquferos poludos com petrleo ou chorume o que pode ser atribudo capacidade de
alguns destes microrganismos de degradar compostos aromticos. Ambientes naturais
de superfcie de aquferos so aerbios, mas condies anaerbias desenvolvem-se
rapidamente uma vez que contaminantes orgnicos so introduzidos. Uma das
principais dificuldades na biorremediao de ambientes subsuperficiais contaminados
com compostos orgnicos ou metais a introduo de um receptor de eltrons ou
doador para melhor promover a biodegradao desejada. Por exemplo, biorremediao
de guas contaminadas com petrleo so complicadas, pois a introduo de oxignio
abaixo da superfcie contaminada tecnicamente difcil e de alto custo. Fe (III) um
aceptor de eltrons encontrado em altas quantidades em ambientes de degradao
18
anaerbica e estudos demonstraram uma remoo de hidrocarbonetos aromticos de
guas subterrneas contaminadas por petrleo associada a presena geoqumica de Fe
(III) disponvel para reduo46. Anlises posteriores mostraram uma abundncia de
espcies Geobacter na zona de reduo de Fe (III), sendo responsvel por 41% da
composio da comunidade microbiana ativa em guas subterrneas e sedimentos. De
um modo semelhante, 25% da comunidade microbiana composta por espcies
Geobacter em lixiviados provenientes de aterro sanitrio que causam contaminao em
aquferos. A quantificao de genes ou protenas especficas, conhecidas por estarem
envolvidas na degradao de compostos aromticos tem demonstrado a importncia das
espcies Geobacter em remover naturalmente contaminantes aromticos. Receptores de
eltrons alternativos como, por exemplo, Fe+3 e sulfato que suportam organismos que
realizam respirao anaerbia podem ser utilizados neste caso, mas eletrodos tambm
apresentam outra possibilidade conveniente. Os estudos realizados com Geobacter
metallireducens46 indicaram que esta espcie capaz de oxidar tolueno, o composto
aromtico predominante neste tipo de contaminao, utilizando um eletrodo como
aceptor de eltrons final. Estudos preliminares indicaram que eletrodos colocados nos
sedimentos abaixo de superfcies contaminadas por petrleo podem acelerar a
degradao de hidrocarbonetos aromticos.
A espcie Geobacter metallireducens tambm a chave para a reduo microbiana
da forma oxidada do urnio, U+6, utilizando este como aceptor de eltrons final ao invs
do eletrodo, o que representa uma estratgia potencial para promover a biorremediao
de guas subterrneas contaminadas com urnio. O U+6 quando reduzido a U+4 passa
para sua forma insolvel, precipitando e assim podendo ser isolado do sistema,
acabando com a contaminao. Uma estratgia simples para prevenir a propagao da
contaminao ou ainda acelerar a descontaminao adicionar na gua contaminada um
composto orgnico que sirva como doador de eltrons, como acetato por exemplo.
Dessa forma o crescimento da cultura de G. metallireducens estimulada, pois esta
obtm a maior parte da sua energia pela oxidao de acetato com a reduo de um
aceptor de eltrons externo. Em ambientes naturais, como j citado anteriormente, so
usados xidos de Fe+3 que so abundantes na maioria dos ambientes de subsolo, j neste
caso, U+6 substitui o ferro e acaba servindo como aceptor de eltrons final. Esse mesmo

19
mecanismo pode ser utilizado para descontaminao de guas com outros
contaminantes como solventes clorados por meio de desclorao redutiva.18, 72

2.8 LIMITAES DAS MFC

Apesar das MFCs terem recebido crescente ateno nos ltimos anos devido a suas
aplicaes para o tratamento de guas residuais, biorremediao e gerao de
eletricidade, um aumento na densidade de energia necessrio para que se tornem
competitivas com outras fontes de energia renovvel. O limite superior da potncia
atingida nas MFCs ainda no conhecido por causa da alta resistncia interna que limita
a densidade de potncia mxima. Diversos tipos de MFCs foram comparadas em
relao densidade de potncia mxima onde MFCs que utilizaram substratos e
microrganismos semelhantes apresentam diferena de at uma ordem de magnitude
neste parmetro.43 Isto demonstra que o desempenho da MFC determinado por fatores
relativos configurao do reator o qual limitado por fatores que aumentam a
resistncia interna, como por exemplo, a demanda de gua e nutrientes inorgnicos,
assim como diferenas no material usado nos eletrodos e na configurao propriamente
dita do reator. Para permitir a operao das MFCs com todo o potencial cataltico dos
microrganismos necessrio que haja uma otimizao em termos da configurao do
reator e dos eletrlitos com o intuito de reduzir a resistncia interna.
O desempenho das MFCs, assim como de outras clulas de combustvel,
determinado pela corrente, densidade de potncia e taxa de oxidao do combustvel.
Diferentes fatores podem influenciar na taxa de oxidao de combustvel includo a
atividade cataltica no nodo, difuso do substrato (combustvel), difuso e consumo de
prtons e eltrons que juntos caracterizam a resistncia interna da clula.
Nas MFCs, a taxa de consumo de prtons no ctodo maior do que a taxa de
transferncia destes atravs da membrana.52 As clulas de combustvel microbianas
empregam uma variedade de compostos inorgnicos necessrios para o crescimento das
bactrias, alm do substrato. Estes compostos dissociados na fase aquosa geram ctions
como K+, Na+, NH4+, Mg2+ e Ca2+ entre outros. A concentrao desses ctions na
ordem de 105 vezes maior que a concentrao de prtons em pH neutro. Estes ctions

20
podem interferir no transporte de prtons atravs da membrana. Alm disso, o uso de
uma soluo aquosa como eletrlito tambm interfere na transferncia de prtons.52
A reduo de oxignio no ctodo a reao mais utilizada no compartimento
catdico por sua disponibilidade infinita e sem custo na forma de ar. No entanto, a
cintica da reduo do oxignio em MFCs muito lenta e tem motivado o
desenvolvimento de novas estruturas catdicas bem como ctodos revestidos por
catalisadores metlicos com o intuito de acelerar essa reao.

Figura 7. Eletrodo revestido com catalisador metlico.

Carbono o material mais comumente utilizado no eletrodo, porm um catalisador

pobre para a reduo de oxignio. Melhorias foram observadas no desempenho das
clulas quando catalisadores, como Platina, so adicionados ao ctodo para acelerar a
reao de reduo do oxignio,47-52 porm seu uso limitado devido ao alto custo
especialmente para aplicaes em larga escala como para o tratamento de guas
residuais.
Ferricianeto outro composto utilizado no compartimento catdico. Possui uma
maior cintica de reduo do que o oxignio no ctodo e relativamente alto potencial de
reduo. Ferricianeto reduzido a ferrocianeto, assim necessita ser substitudo aps ser
consumido, o que representa uma desvantagem em relao ao oxignio.
Medidas como reduo do espao entre os eletrodos43,51 e ctodo ligado diretamente
membrana semipermevel41 tambm causaram melhorias no desempenho da clula.
Os estudos reconhecem que as limitaes presentes no ctodo e existentes em MFCs
tm sido um dos maiores impedimentos para o progresso dessa tecnologia, mas

21
nenhuma medida quantitativa de como cada nova condio pode remover estas
limitaes, ao invs de apenas diminu-las, foi desenvolvida.
Como j mencionado anteriormente, densidade de potncia o dado principal com o
qual as condies das MFCs so comparadas. As densidades de potncia continuam
aumentando quando o tamanho do nodo reduzido em at 40%,52 ou quando o
tamanho do ctodo aumentado53-55, evidncia que o ctodo, mesmo na presena de
catalisadores, continua limitado cineticamente. Estudos usando MFCs com tamanhos
similares produzem densidades de potncia que chegam a se diferenciar em at uma
ordem de magnitude.56 Isto sugere que a taxa biocataltica mxima que ocorre no nodo
continua desconhecida e qualquer esforo para medir o desempenho do nodo, retorna
em informaes sobre o ctodo.

2.8.1 Limitaes catdicas

A corrente gerada na MFC depende da cintica da reao de reduo que ocorre

no ctodo. A cintica desta reao est limitada por uma barreira de energia de ativao
que impede a converso do oxidante a uma forma reduzida (Equao 2).

CH3COO- + 2OH- 2CO2 + 8e- + 5H+ (2)

Quando corrente gerada por uma clula de combustvel, uma parte do potencial
do ctodo usado para vencer a barreira de ativao, esse potencial chamado de perda
por ativao catdica (cathodic activation losses).54
A perda por ativao catdica resulta em uma caracterstica exponencial
formando perdas na curva corrente x tenso (i x V) em baixas densidades de corrente
(Figura 8). medida que corrente consumida pela MFC, a perda por ativao aumenta
e resulta em um potencial de clula menor. A perda por ativao catdica domina o
desempenho das MFCs e a magnitude desta perda depende da cintica da reao de
reduo. A cintica pode ser melhorada com a diminuio da barreira de ativao
atravs do aumentando da rea de interface da reao, aumento da temperatura e
concentrao do oxidante.54

22
Figura 8. A) Esquema das perdas de tenso para o compartimento catdico no qual pode
ser visualizadas perdas por ativao, hmicas e por transporte de massa. B) Uma curva
de potncia tpica.

O desempenho das MFCs tambm restringido por perdas hmicas, tambm

conhecidas por resistncia interna. Esta perda referente voltagem requerida para o
transporte de H+ e eltrons. Uma vez que os condutores no so ideais, existe uma
resistncia intrnseca para o fluxo de cargas. As perdas hmicas representam a voltagem
perdida para realizar o transporte de cargas. Esta perda segue a lei de Ohm:

V = i x R(hmica) (3)

23
 Onde i a corrente (A) e R(hmica) a resistncia hmica () da MFC. A
resistncia catdica uma combinao da resistncia inica (Rinica) e eletrnica, Reletr e
leva em considerao a resistncia dos eltrons, eletrlito e interconexes:

R(hmica) = Rinica + Reletr (4)

A resistncia interna dominada pela resistncia referente ao eletrlito j que a

condutividade inica muito mais baixa do que a condutividade eltrica dos materiais
do eletrodo. A resistncia hmica do eletrlito, Rinica, pode ser expressa por:

R = l (5)
AK

Onde l a distncia (cm), A a rea da seo transversal (cm2) na qual ocorre a

conduo inica e K a condutividade (-1cm-1) do eletrlito.
As perdas hmicas catdicas so mais pronunciadas em densidades de corrente
mdias e seguem a lei de Ohm, a voltagem diminui linearmente com o aumento da
corrente (Figura 8). A reduo das perdas hmicas catdicas importante para otimizar
o desempenhos das MFCs.
O processo de fornecimento de oxidantes (ex. O2) no ctodo da MFC
governado pelo processo de transporte de massa. Transporte de massa insuficiente causa
depleo do reagente que afeta tanto a voltagem quanto a taxa de reao, levando a
perdas no desempenho da clula. Esta perda a voltagem requerida para conduzir os
processos de transporte de massa no ctodo e referente perda da concentrao
catdica ou perda por transporte de massa. Estas perdas ocorrem em altas densidades de
corrente e tentem a aumentar com seu aumento (Figura 8). Limitaes por transporte de
carga devido ao transporte do oxidante no compartimento catdico so tipicamente mais
severas que as limitaes por transporte no compartimento andico. Assim, quando
perdas por transporte de massa so determinadas em clulas de combustvel, apenas a
concentrao limitante para o oxidante considerada.52,54

24
 Como j mencionado anteriormente, a reduo de oxignio no ctodo a reao
catdica mais comum em MFCs. Dois caminhos podem ocorrer durante a oxidao
catdica do oxignio. O caminho desejado a produo de gua (Equao 6):

O2 + 4H+ + 4e- 2H2O (Eo = 0,816 V) (6)

O outro caminho consiste na produo de perxido de hidrognio:

2O2 + 4H+ + 4e- 2H2O2 (Eo = 0,295 V) (7)

A reduo incompleta do oxignio resulta em uma baixa eficincia de converso

de energia e produz intermedirios reativos e espcies radicais livres que podem ser
destrutivas. A baixa taxa de reduo de oxignio na superfcie dos eletrodos de carbono
implica em uma alta resistncia interna que o maior fator limitante do desempenho das
MFCs. Portanto a otimizao das taxas das reaes catdicas impacta na eficincia e
potncia produzida pela MFC e representa o maior desafio para a pesquisa e
desenvolvimento.52,54
O Ferricianeto possui uma cintica de reduo maior do que a do oxignio alm
de ter um potencial reduo relativamente alto. Diferentemente do oxignio sua
concentrao em soluo no limitada pela solubilidade (Equao 8).

[Fe(CN)6]3- + e- [Fe(CN)6]4- (Eo = 0,358) (8)

Oh et al. descreveram um aumento de 50-80% na potncia mxima usando

ferricianeto no compartimento catdico comparado a ctodos com oxignio saturado em
soluo aquosa ou ctodos de oxignio com eletrodos de carbono revestidos de platina.
As diferenas observadas so atribudas ao alto potencial de circuito aberto e uma alta
eficincia na transferncia de massa das solues de ferricianeto comparadas ao
oxignio dissolvido. Apesar de ser amplamente usado em laboratrio, ferricianeto no
uma escolha sustentvel para a gerao de energia em MFCs, fundamental caracterstica
a qual esta tecnologia se prope.53, 56, 57 potencialmente txico (em pH cido), requer

25
reposio e difunde atravs da membrana em longos tempos de operao o que pode
reduzir o desempenho da MFC.
Outra causa que colabora para a reduo no desempenho das MFC a perda
hmica intrnseca membrana semipermevel, que apresenta uma resistncia ao
transporte de prtons. Esta membrana semipermevel funciona como um eletrlito
slido, permitindo o fluxo de prtons do nodo para o ctodo e no conduz eltrons. A
magnitude da resistncia pode ser mitigada otimizando as propriedades fsicas e o tipo
de membrana. A espessura e a rea superficial da membrana afetam a resistncia ao
transporte de prtons. O efeito da espessura da membrana no desempenho da MFC
ainda no foi reportado, porm previsto que membranas mais finas produzam menores
perdas hmicas como resultado da menor resistncia transferncia de prtons e fluxo
mais rpido. Entretanto, essas tendem uma pequena quantidade de substrato passando
pela membrana. Devido a sua alta condutividade a ctions, Nafion, um polmero
sinttico tetrafluoretileno sulfonado com espessura de poro de <5 nm, tem sido usado
extensivamente como membrana semipermevel em MFC. A estabilidade do Nafion a
longo prazo desconhecida e pode ser comprometida pela degradao por substncias
qumicas e por oxidao biolgica nos compartimentos andico e catdico. Condies
de operao como, por exemplo, temperatura ambiente, pH neutro e presena de ons
com carga positiva alm de prtons podem reprimir a funcionalidade do Nafion.48
Outros polmeros esto em desenvolvimento e sendo testados para substituio
do Nafion, que o componente de maior custo nas MFCs, porm este ainda o mais
utilizado neste tipo de sistema.

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo principal desse trabalho aumentar a densidade areal de potncia

produzida pelas MFCs .
Um aumento na densidade de energia necessrio para que as MFCs se tornem
competitivas com outras fontes de energia renovvel, mas o progresso tem sido
impedido por limitaes catdicas, conforme descrito anteriormente. A reduo de

26
oxignio no ctodo a reao mais utilizada no compartimento catdico. No entanto, a
cintica desta reao em MFCs muito lenta, o que motiva este estudo a realizar uma
comparao com diferentes tipos de ctodos e comparar o desempenho dos mesmos. A
densidade de potncia a principal medida com a qual as condies das MFCs so
comparadas e sero utilizadas como parmetro neste trabalho.
Para que as MFCs desempenhem um papel mais importante como fontes
renovveis de energia, uma compreenso fundamental dos processos que ocorrem no
nodo, bem como no ctodo, deve ser desenvolvida. A fim de compreender as
limitaes cinticas dos biofilmes associadas ao nodo, as limitaes cinticas no
ctodo da MFC devem ser removidas. Para isso optou-se pela utilizao de culturas
puras para a eliminar interferentes.
Aps a otimizao do desempenho das clulas, este trabalho busca fazer a
avaliao da possibilidade de utilizao das propriedades biorremediadoras da espcie
G. metallireducens em uma MFC. O objetivo avaliar se a espcie produz uma
densidade de corrente competitiva com relao a G. sulfurreducens, bem como avaliar
se estas duas espcies so capazes de utilizar glicerol, subproduto proveniente da
produo de biodiesel, como substrato de modo a tratar os resduos provenientes da
produo de biodiesel e produzindo eletricidade. Tambm se busca avaliar o
comportamento de uma cocultura utilizando as duas espcies.

3.2. OBJETIVO ESPECFICO

O objetivo geral deste trabalho ser alcanado atravs das seguintes aes:
Construo e otimizao e prottipo, buscando o melhor desempenho quando
avaliada a densidade de potncia;

Comparao entre ctodos de O2 e ctodos de [Fe(CN)6]3-;

Avaliao e comparao entre G. sulfurreducens, G. metallireducens e uma

cocultura das duas espcies na produo de potncia;

Avaliao da capacidade de G. metallireducens em utilizar glicerol com fonte de

carbono.

27
4. MATERIAIS E MTODOS

4.1. CONSTRUO DAS MFCs

As MFCs foram construdas no laboratrio do Prof. Allon Hochbaum, com

material fornecido pela Universidade da Califrnia Irvine, conforme os passos
descritos a seguir.

4.1.1. Eletrodos

So utilizados dois tipos de eletrodos nas MFCs: eletrodo de tecido de carbono no

ctodo e de titnio revestido de ouro no nodo.
O eletrodo utilizado no nodo construdo com uma chapa de titnio de 0,5 mm
de espessura e uma rea em torno de 1 cm2 cortada com uma tesoura, polida com uma
lixa fina para a remoo de xidos e em seguida lavada com acetona, etanol e gua,
consecutivamente, para a retirada de contaminantes orgnicos. A chapa de Ti foi
revestida em um dos lados por uma camada de 250 nm de ouro atravs de um processo
de sputtering realizado pela UC San Diego. A resistncia medida com um
multmetro e eletrodos com valores de resistncia superiores a 1,5 so descartados.
Um fio de 15 a 20 cm de comprimento e 0,38 mm de espessura de ao inoxidvel
isolado (Rohs) foi decapado a 3 4 cm de uma das extremidades e esta foi enrolada na
forma de espiral, conforme Figura 9.

28
Figura 9. Fio de ao inoxidvel sobre parte traseira do eletrodo de Ti/Au que constitui o
nodo.

A parte em espiral do fio de ao inoxidvel foi fixada parte traseira do pedao

de metal, a qual no est coberta com ouro, com resina epxi condutiva de prata (MG
Chemicals). O eletrodo foi levado ao forno a 70 C por 15 minutos para finalizar o
processo de cura da resina epxi. A parte do eletrodo no revestida com ouro foi ento
totalmente coberta com resina de silicone (DAP Adhesive Sealent), de modo que nem a
resina epxi, nem o pedao do fio de ao inoxidvel, nem o titnio, ficassem expostos.
A parte frontal do eletrodo foi tambm coberta de modo que apenas a rea de interesse
(varivel conforme o experimento) estivesse disponvel para ser usado como nodo
(Figura 10), 0,5 cm da outra extremidade do fio foi desencapada para que um conector
macho fosse conectado.

Figura 10. Eletrodo de ouro (nodo) com parte frontal parcialmente coberta com
silicone. Quadrado de 0,6 cm de lado de Au exposto.

29
 Para a construo do ctodo, um fio de titnio foi lixado e costurado em um
pedao de tecido de carbono (Fuelcellstore.com) de 6 cm x 6 cm dobrado ao meio duas
vezes (Figura 11).

Figura 11. Ctodo de tecido de carbono costurado com fio de titnio.

Na extremidade do fio de titnio, foi conectado um conector macho Micro-fit

(Digi-Key). A resistncia em ambos os eletrodos foi medida e eletrodos com
resistncias maiores ou iguais a 1,5 foram refeitos.

4.1.2. Montagem da MFC

Dois recipientes em formato H de borosilicato de 100 ml cada foram produzidos

por Adams & Chittenden Scientific Glass. As duas sadas laterais foram tampadas
com rolhas de borracha butlica e um fio de titnio de mais ou menos 20 cm foi
introduzido na rolha com ajuda de uma agulha. Conectores fmeas foram fixados nas
duas extremidades do fio. Os eletrodos, aps serem enxaguados com acetona, etanol e
gua para a retirada de contaminantes orgnicos, foram conectados s clulas. As
conexes foram testadas mais uma vez com um multmetro para verificar a resistncia.
Os eletrodos foram posicionados dentro do pescoo da clula, de modo que
ficassem o mais prximo possvel do flange (Figura 12).

30
 Figura 12. Eletrodos conectados a clula.

Um pedao de Nafion-117 (fuelcellstore.com), membrana permevel a prtons,

foi colocado no flange do nodo e fixo com um anel. Um grampo de plstico foi
acoplado s duas clulas de modo a fix-las, conforme mostrado na Figura 13.

Figura 13. Clulas fixadas com grampo de plstico, separadas pela membrana semi
permevel

Antes de ser utilizada, um agitador foi introduzido no compartimento andico,

os dois lados da clula foram tampados e a MFC foi autoclavada a 120C por 20
minutos.

31
4.2. CRESCIMENTO DAS BACTRIAS

As MFC foram inoculadas com G. sulfurreducens, G. metallireducens e/ou uma

cocultura das duas espcies. As cepas isoladas foram adquiridas do fornecedor DSMZ.
G. sulfurreducens so fornecidas em soluo de glicerol 20 %, evitando o rompimento
das clulas quando armazenadas a - 80 oC e G. metallireducens na forma desidratada.
G. sulfurreducens foi inoculada em meio de cultura recomendado pelo
fornecedor, contendo os seguintes componentes: NH4Cl (0,25 g/L), NaH2PO4 (0,6 g/L),
KCl (0,1 g/L), NaHCO3 (2,5 g/L), traos de vitaminas (10 mL), traos de minerais (10
mL), fumarato (6,4 g/L) e acetato de sdio (0,82 g/L).
O meio de cultura foi agitado sob aquecimento at a dissoluo total dos
componentes. Uma mistura de gs contendo 20% de CO2 e 80% de N2 foi injetada
atravs de uma agulha esterilizada, mantendo-se o aquecimento e a agitao at que o
volume fosse reduzido de 900 mL a 800 mL. A boca do frasco foi coberta com papel
alumnio em formato de cone, de modo a permitir apenas a sada do gs injetado. Assim
que concluda essa etapa o gs foi removido e o frasco foi tampado com rolha de
borracha, no permitindo a entrada de oxignio. O meio de cultura foi ento
autoclavado a 121 oC, para evitar qualquer tipo de contaminao.
Para iniciar uma nova cultura, um basto de madeira estril e descartvel
mergulhado no frasco me, previamente descongelado, contendo as bactrias em
glicerol, e em seguida mergulhado em um tubo de ensaio contendo 10 mL do meio de
cultura. A partir deste tubo de ensaio so feitas diluies 1:10 e 1:100.
Para iniciar as culturas utilizadas nas clulas de combustvel, 1 mL de uma
cultura prvia foi inoculada em um tubo de ensaio previamente esterilizado contendo 9
mL do meio de cultura transferido para o tubo com uma pipeta descartvel e selado com
rolhas de borracha e anel de alumnio. Agulhas e seringas descartveis so utilizadas
para fazer o manuseio de meio de cultura e bactrias previamente cultivadas para o novo
tubo. Periodicamente novas culturas so iniciadas a partir das cepas fornecidas pela
DSMZ para garantir que no haja contaminaes nem mutaes das bactrias utilizadas.
Todas as operaes so realizadas dentro da cmara anaerbica.
O cultivo de G. metallireducens foi testado em 3 diferentes meios de cultura, j
que a primeira tentativa para reidratao das cepas fornecida pela ATCC no foi bem

32
sucedida. Foram testados os meios de cultura descritos pelos fornecedores ATCC,
DSMZ e descrito em uma publicao de Summer ET AL.71 As cepas fornecidas pela
DSMZ foram reidratadas e inoculadas nos 3 meios de cultura diferentes, sendo que as
bactrias apresentaram crescimento em 5 dias no meio de cultura descrito por Summer
denominado Media I, e tempos maiores para o meio recomendado por DSMZ e ATCC.
O crescimento das bactrias foi acompanhado por medidas de densidade ptica, porm
quando h uma grande densidade bacteriana a colorao do meio muda de marrom para
uma aparncia esbranquiada, o que alterou totalmente a curva de densidade ptica que
estava sendo traada. Ao mesmo tempo a mudana na aparncia deixa claro quando as
bactrias esto se desenvolvendo descartando a necessidade de um acompanhamento
por medidas de densidade ptica.
A partir desses resultados Media I foi definido como o meio de cultura padro
para G. metallireducens. Media I preparado utilizando-se os seguintes reagentes:
KH2PO4 (0,2 g/L), K2HPO4 (0,22 g/L), NH4Cl (0,2 g/L), KCl (0,38 g/L), NaCl (0,36
g/L), CaCl2 x 2H2O (0,04 g/L), MgSO4 x 7H2O (0,1 g/L), NaHCO3 (1,8 g/L), Na2CO3
(0,5 g/L), trao de vitaminas e minerais (10 mL), citrato de Fe(III) (13,7 g/L) e acetato
de sdio (1,64 g/L).
O meio foi degaseificado e autoclavado da mesma forma descrita para o meio
utilizado nas G. sulfurreducens. Como cuidado adicional, Media I foi protegido da luz
devido a decomposio por exposio a luz sofrida por citrato de Fe(III).
Com o objetivo de comparar o desempenho dos dois tipos de bactrias utilizadas
bem como utilizar uma cocultura das duas espcies, foi necessrio testar o
desenvolvimento da G. sulfurreducens no meio usado para G. metallireducens, j que o
contrrio no seria possvel visto que a ltima no utiliza fumarato como aceptor de
eltrons, contido no meio da primeira.
O desempenho da G. sulfurreducens se mostrou satisfatrio utilizando-se Media
I, no mostrando diferenas no desenvolvimento bacteriano quando comparado com o
meio proposto pela DSMZ. A partir desta informao foi possvel realizar os
experimentos descritos no item 5.2 utilizando Media I em todas as condies.

33
4.3 OPERAO DAS CLULAS

Aps a construo da MFC esta esterilizada e, assim que a temperatura

ambiente alcanada, so adicionados 90 mL do meio de cultura e 9 mL de bactrias
pr cultivadas no compartimento andico. Ao compartimento catdico adicionada
soluo tampo de fosfato de modo a cobrir todo o eletrodo de carbono. A soluo
tampo de fosfato tem a seguinte composio: NH4Cl (0,31 g/L), NaH2PO4 (2,69 g/L),
Na2HPO4 (4,33 g/L), KCl (0,13 g/L). Para ctodos com oxignio, ar foi borbulhado
atravs de um filtro estril de 2 m para o compartimento catdico. Para ctodos com
[Fe(CN)6]3-, 25 mM de ferrocianeto de potssio foram dissolvidos na soluo tampo de
fosfato previamente preparada.
A soluo no nodo foi continuamente agitada para melhorar a distribuio do
substrato para as bactrias. O nodo foi conectado ao ctodo por uma resistncia de 560
. O meio de cultura no nodo foi substitudo, assim que o meio apresentou turbidez: 2
a 3 dias para G. sulfurreducens e 4 a 5 dias para G. metallireducens e coculturas. Aps a
remoo das bactrias planctnicas, 90 mL de um novo meio de cultura foi introduzido
no qual fumarato ou citrato de Fe(III), usado como aceptor de eltrons, foi omitido. Para
garantir a fonte de carbono das bactrias (acetato) no compartimento andico, o meio de
cultura foi substitudo a cada 3-4 dias, o que caracteriza o processo por bateladas.
A soluo no compartimento catdico substituda em ctodos de oxignio,
sempre que o pH ficar inferior a 7. Em ctodos com ferricianeto feita a substituio
assim que uma queda na potncia da clula detectada.
Para otimizar o processo seria interessante utilizar uma concentrao maior de
acetato no nodo, reduzindo as trocas do meio de cultura, porm concentrao maiores
do que 50 mM de acetato inibiram o crescimento bacteriano, mostrando-se txicas s
bactrias. Quando concentraes maiores que 150 mM de ferricianeto so utilizadas no
ctodo ocorre obstruo da membrana semipermevel (Figura 14), o que implica,
necessariamente, na manuteno do procedimento utilizado o qual substitui com uma
maior periodicidade as solues catdica e andica.

34
Figura 14: Entupimento da membrana semipermevel pela alta concentrao de
ferricianeto.

4.4 MEDIDAS ELETROQUMICAS

Todas as medidas eletroqumicas foram conduzidas usando um potenciostato

Gamry Instruments. O potencial do nodo e do ctodo foram medidos contra um
eletrodo de referncia de Ag/AgCl inserido no ctodo. Depois da MFC ser desconectada
e permanecer em circuito aberto (OCP) por, no mnimo, 30 minutos ou at a
estabilizao da voltagem, a voltametria de varredura linear (LSV) foi conduzida
usando o nodo como o eletrodo de trabalho e o ctodo como eletrodo de referncia,
numa taxa de 1 mV/s. A densidade de potncia foi calculada utilizando a equao P =
IV/A, onde I a corrente em amperes, V a voltagem em volts e A a rea do nodo
exposta em m2.

35
4.4.1 Potencial de circuito aberto (OCP) Open Circuit Potential

Este experimento mede a diferena de potencial entre o nodo e o ctodo. Antes

de ser realizada a medida, o circuito deve estar aberto (desconectado resistncia) por
um perodo aproximado de 30 minutos, at que o sistema esteja estvel. Um grfico de
V x tempo, similar Figura 15, gerado.

Figura 15. Grfico V x t(s) obtido na medida de potencial de circuito aberto.

Pode-se verificar que depois de ocorrido certo tempo o sistema atinge o estado
estacionrio (linha contnua). Esse o potencial de circuito aberto de interesse. Este
experimento deve ser realizado sempre antes das medidas de LSV, pois o valor obtido
utilizado como parmetro no experimento citado.

4.4.2 Voltametria de varredura linear

Em voltametria, um sinal de excitao de potencial varivel aplicado sobre

uma clula eletroqumica contendo um microeletrodo. Esse sinal d uma resposta
caracterstica de corrente na qual se baseia o mtodo. O sinal de excitao clssico a
varredura linear na qual o potencial de corrente contnua aplicado na clula aumenta
linearmente em funo do tempo. Neste trabalho a velocidade de varredura aplicada foi

36
de 1 mV/s e foi realizada uma varredura de 0 V ao potencial obtido com o circuito
aberto. A corrente que se desenvolve na clula ento registrada em funo do tempo e,
portanto, como uma funo do potencial aplicado. A partir desses dados um
voltamograma obtido (grfico da corrente em funo do potencial aplicado)
semelhante Figura 16.

Figura 16. Voltamograma tpico para: A) ctodos com oxignio B) ctodos com
ferricianeto.

A corrente mxima esperada (com um desvio para cima) deve ser atribuda, pois
ir afetar a sensibilidade da medida.

37
 A partir dos valores de corrente e voltagem obtidos neste experimento pode-se
construir as curvas de polarizao e potncia das clulas.

4.5. MICROSCOPIA CONFOCAL DE VARREDURA A LASER

O sistema conhecido como microscopia confocal utiliza uma fonte de laser para
promover a excitao dos fluorforos. Atravs de um conjunto de lentes o microscpio
capaz de focar um cone de luz laser em uma profundidade predeterminada da amostra
a ser estudada. Mudando-se o ponto focal (mantida a profundidade) possvel iluminar
todo o plano em estudo, ponto a ponto. Ao retornar pelo mesmo caminho ptico, a luz
devida a fluorescncia separada utilizando-se um conjunto de espelhos chamados
divisor de luz. Em seguida a luz separada passa por um pequeno orifcio, chamado
pinhole, capaz de separar a luz proveniente do ponto focado, eliminando a luz emitida
por pontos fora de foco. Com isso s a luz dos pontos em foco registrada, com a ajuda
de tubos fotomultiplicadores. Estes sinais gerados pelas fotomultiplicadoras so
processados por um computador e assim imagens bidimensionais extremamente
precisas podem ser construdas. A obteno de imagens sucessivas de diferentes planos
da mesma amostra possibilita construir imagens tridimensionais e imagens
tridimensionais em movimento. O inconveniente dessa tcnica a degradao dos
fluorforos, o que leva utilizao do confocal para o estudo de fenmenos mais
rpidos, no caso de espcimes vivos, ou para estudar detalhes internos das clulas em
espcimes vivos ou fixados.
Nesse trabalho a tcnica de microscopia confocal de varredura a laser foi usada
para analisar os biofilmes formados no nodo, utilizando um microscpio confocal
modelo LSM 780 da Carl Zeiss Microscopy. Antes de serem analisados, os biofilmes
passaram por um processo de fixao, imersos em soluo de 5% de
formaldedo/glutaraldedo de um dia para outro, desidratados em solues de etanol a
25%, 50%, 75% e 95% respectivamente e embebidos em soluo de agarose a 0,1%.
Aps este processo, os biofilmes foram imersos em 50 M de isotiocianato de
fluorescena (FITC) em PBS (soluo tampo salina de fosfato) e analisados usando
uma excitao 2-photon com um comprimento de onda de 820 nm. A espessura e a
morfologia do biofilme foram analisadas usando o software ImageJ.
38
4.6. FISH HIBRIDIZAO FLUORESCENTE IN SITU

Fluorescence in situ hybridization (FISH) ou hibridizao fluorescente in situ

uma tcnica citognica desenvolvida por pesquisadores biomdicos utilizada para
detectar, localizar, visualizar, identificar e enumerar a presena ou ausncia de
seqncias especficas de DNA ou RNA em cromossomos, sem alterar a morfologia ou
integridade celular. FISH utilizado para achar caractersticas especficas no DNA para
uso na medicina e identificao de espcies. FISH tambm utilizado para detectar e
localizar lugares especficos do RNA em clulas, amostras de tecido e clulas tumorais,
anlise de danos cromossomais, mapeamento gentico, toxicologia molecular, genmica
comparativa, biologia evolutiva, ecologia microbiana e diagnstico de doenas. Alm
disso, pode ser aplicada em deteco de microrganismos em ambientes complexos como
microbiota intestinal, cavidade oral, infeces do trato respiratrio, hemoculturas,
simbioses73. Neste contexto, essa tcnica utilizada neste trabalho para diferenciar dois
tipos de bactrias em uma comunidade, podendo-se identificar a presena ou no das
mesmas bem como o tipo de organizao com a qual estas se apresentam.
Aps a descoberta de que molculas de RNA conseguiam o anelamento com
sequncias complementares de DNA ou RNA para formar hbridos DNA-RNA e RNA-
RNA, bilogos comearam a considerar a possibilidade da hibridizao em preparos
intracelulares de DNA-RNA. A hibridizao uma reao muito dinmica em que uma
sequncia alvo desnaturada e uma sonda de fita simples de DNA ou RNA
complementar formam um hbrido estvel pela ao do calor73.
No procedimento histoqumico da FISH, o princpio bsico o anelamento da
sonda com a sequncia alvo, para a visualizao em microscpio epifluorescente.
Entende-se por sonda, uma sequncia de oligonucleotdeos complementares e
especficos marcados com substncias fluorescentes as quais se anelaro ao alvo. H
duas possveis marcaes das sondas, a direta e a indireta. O processo mais utilizado,
por ser mais rpido e de fcil execuo, a marcao direta. Um ou mais fluorocromos
so diretamente conjugados s sondas que se ligam nas regies 5 ou 3 do alvo.
A tcnica consiste na fixao, permeabilizao, hibridizao, lavagem para
remoo das sondas em excesso e deteco por microscopia fluorescente73 (Figura 17).
39
Figura 17. Principais etapas da hidridizao fluorescente in situ.

Antes da hibridizao, as amostras contendo os micro-organismos so fixadas

para proteger o RNA da degradao de RNAses endgenas e permeabilizadas para
permitir que as sondas penetrem na clula. A maioria das aplicaes da FISH tem como
alvo o RNA ribossomal. A utilizao deste alvo justifica-se primeiramente por todas as
clulas necessitarem de ribossomos para a translao, portanto, podem estar presentes
em todas as clulas vivas. A segunda razo a sequncia do rRNA ser evolutivamente
conservada em relao a outras sequncias de genes dentro de uma mesma espcie, no
sendo possvel desenhar uma sonda para identificar grandes domnios taxonmicos
como filos, classes ou ordens. A terceira e ltima razo , que, como cada clula contm

40
muitos ribossomos, esse alvo naturalmente amplificado podendo atingir um nmero
de 100.000 cpias por clula.
As sondas utilizadas em FISH so oligonucleotdeos entre 15 e 30 bases com
nica molcula fluorescente ligada covalentemente ao 5-terminal. Neste trabalho
utilizou-se uma sonda do 16S rRNA das espcies estudadas. Os fluorocromos utilizados
foram isotiocianato de fluorecina (FITC), para G. metallireducens e um derivado das
rodaminas, TetramethylRhodamineIsothiocyanate (TRITC) para G. sulfurreducens
(Tabela II).

Tabela II. Fluorocromos utilizados e seus respectivos comprimentos de onda

Comprimento de onda (nm)
Fluorocromo Excitao Emisso Cor
FITC 492 528 Verde
TRITC 557 576 Vermelho

A partir desta tcnica foi possvel visualizar a organizao da cocultura no

biofilme, verificar a pureza das demais culturas e medir a espessura do biofilme
formado no eletrodo. Os procedimentos foram seguidos rigorosamente conforme o
protocolo FISH e, em seguida, as amostras foram analisadas com microscpio confocal
de varredura a laser.

5 RESULTADOS E DISCUSSES

Em torno de 70 clulas foram construdas e as diferentes condies e resultados

referentes a estas avaliaes so apresentados a seguir. Com a otimizao de parmetros
relacionados configurao da clula foi possvel obter um melhor desempenho das
MFCs. A seguir seguem alguns exemplos de clulas construdas, as condies de
construo, as respectivas curvas de polarizao e curvas de potncia obtidas.
A clula representada pela Figura 18 foi uma das primeiras clulas construdas
com um valor significativo de potncia. A densidade mxima de potncia atingida foi de
0,087 W/m2, sendo que a rea de nodo utilizada foi de 6,0 x 10-4 m2. Quando a clula

41
foi construda no houve preocupao com a distncia entre os eletrodos e o ctodo
utilizado foi de oxignio.

Figura 18. A) Curva de potncia nas respectivas horas de operao e B) Curva de

polarizao nas respectivas horas de operao para a clula constituda por ctodo de O2
e rea de nodo de 6,0 x 10-4 m2.

Na construo da clula representada pela Figura 19 houve a preocupao de

manter os eletrodos o mais prximo possvel, facilitando o transporte de prtons atravs
da diminuio da distncia entre os mesmos. Para tanto os eletrodos foram acomodados
na boca das clulas em formato H, o mais prximo possvel da membrana
semipermevel. Este cuidado passou a ser tomado para todas as demais clulas

42
construdas, visto que houve um aumento de potncia aps a utilizao desse
procedimento. A densidade de potncia mxima atingida foi de 0,16 W/m2, sendo que a
rea de nodo foi reduzida de 6,0 x 10-4 m2 para 4,0 x 10-4 m2. O ctodo utilizado foi de
oxignio.

Figura 19. A) Curva de polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de

potncia nas respectivas horas de operao. Ambas as curvas so referentes a clula
constituda por ctodo de O2 e rea de nodo de 4,0 x 10-4 m2, distncia mnima entre
eletrodos e membrana semipermevel.
.

43
 Na construo da clula representada pela Figura 20 a rea do nodo foi
reduzida para 1,82 x 10-4 m2, pois foi notado que uma diminuio na rea do nodo
produziu um aumento na densidade de corrente, o que nos mostra as curvas de
polarizao e potncia da clula. A densidade de potncia mxima passou para 0,51
W/m2 com a utilizao de ctodo de oxignio.

Figura 20. A) Curva de polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de

potncia nas respectivas horas de operao. Ambas as curvas se referem a clula
constituda por ctodo de O2 e rea de nodo de 1,82 x 10-4 m2.

44
 As demais clulas construdas tiveram a rea do nodo reduzida at que a
reduo do tamanho do nodo no implicasse em um aumento de potncia. O oxignio
no compartimento catdico foi substitudo por ferricianeto, o que aumentou
consideravelmente os valores de potncia mxima obtidos. A clula referente Figura
21 possui todas estas condies otimizadas e ferricianeto no compartimento catdico. A
rea do nodo foi de 3,6 x 10-5 m2 e a potncia mxima obtida foi de 2,61 W/m2.

45
Figura 21. A) Curva polarizao nas respectivas horas de operao e B) curva de
potncia nas respectivas horas de operao. As curvas so referentes a clula com
condies otimizadas, ferricianeto no compartimento catdico e rea de 3,6 x 10-5 m2.

A seguir feita uma avaliao dos resultados obtidos com as clulas construdas.

5.1. DIFERENAS ENTRE CTODOS DE OXIGNIO E FERRICIANETO

5.1.1. Voltametria de Varredura Linear (LSV) Linear Sweep Voltametry

Para comparar o desempenho entre ctodos contendo oxignio ou ferricianeto,

foram utilizadas culturas puras de G. sulfurreducens, devido ao menor tempo de
incubao comparado a G. metallireducens, pelos maiores resultados de potncia
reportados e por possuir mais dados na literatura a respeito desta bactria.
Aps a remoo das bactrias planctnicas, os experimentos de LSV foram
realizados diariamente para monitorar mudanas na produo de energia nas clulas ao
longo do tempo. Assim que o OCP se mostrou estvel, um potenciostato foi usado para
varrer a voltagem do OCP a 0 V vs OCP a uma taxa constante de 1 mV/s.53 As MFCs
46
alcanaram o pico de potncia depois de aproximadamente 150 horas de operao (2
bateladas), independentemente do tipo de ctodo usado. O resultado consistente com
outros trabalhos que utilizam biofilmes de Geobacters e que observaram estados
estacionrios depois de 140 horas de operao.55
Em clulas que utilizam [Fe(CN)6]3- no ctodo, a substituio do meio de cultura
no compartimento andico produziu picos de energia seguidos por redues graduais
que se recuperaram rapidamente com as trocas posteriores. A potncia e voltagem
apresentaram um plat nas clulas que utilizaram oxignio no ctodo aps
aproximadamente 150 horas de operao e no mostraram grandes mudanas com a
substituio da soluo andica. Isto sugere que acetato foi consumido mais lentamente
quando O2 foi utilizado no compartimento catdico.
Apesar do valor terico do potencial de reduo para o oxignio (1,23 V) sere
maior do que para o ferricianeto, o potencial de circuito aberto para MFCs que
utilizaram [Fe(CN)6]3- no ctodo (0,36 V) foi maior do que naquelas que utilizaram O2
no compartimento catdico. As clulas que utilizaram [Fe(CN)6]3- apresentaram um
OCP de 750 mV comparado com 500 mV para as clulas que utilizaram O2 no ctodo,
assim deslocando para cima o ponto de incio da curva de polarizao. Estes dados
confirmam que a cintica de reduo para o oxignio desfavorvel em relao ao
ferricianeto.
As curvas de LSV para ambos os tipos de MFC exibiram overshoots de
potncia antes de 150 horas de operao. Os overshoots so resultado de um rpido
aumento no potencial do nodo com a resistncia ao fluxo de corrente reduzida,
indicando limitaes de transferncia de eltrons para o nodo61. Esta limitao est
relacionada com uma resposta lenta dos microrganismos para se ajustar a nova
resistncia. Este fenmeno foi reportado na literatura e atribudo a uma grande
variedade de fatores,56 mas quando permitido ao biofilme amadurecer e aclimatar-se s
condies da clula, este fenmeno eliminado. Apesar de overshoots em potncia
terem sido apenas reportados em MFCs que utilizam culturas variadas, este o primeiro
caso em que este fenmeno foi observado em culturas puras de Geobacter
sulfurreducens56-61. Comumente as MFCs so mantidas em operao geralmente por
semanas ou meses antes de serem realizadas medidas eletroqumicas. Observamos que
aps 150 horas de operao os overshoots de potncia desaparecem (Figura 22).

47
Assim, possvel que neste perodo de overshoots o biofilme esteja em
desenvolvimento e por isso no tenha sido reportado, pois ocorre no incio do
crescimento, quando em sua maioria os grupos de pesquisa no realizam medidas
eletroqumicas.

Figura 22. Curvas de polarizao representativas para oxignio no ctodo (linhas

pontilhadas) e ferricianeto (linhas contnuas).

Ambas as curvas apresentadas exibem overshoot de potncia no incio do

desenvolvimento que desaparece aps 150 horas de crescimento. Limitaes na
densidade de corrente so comparveis, mas a curva de ferricianeto aproxima-se muito
mais do comportamento ideal.
Culturas puras de Geobacter sulfurreducens que crescem a baixas densidades de
corrente (0,1 - 0,4 A/m2) expressam diferentes citocromos da membrana externa em
relao queles cultivados em altas densidades de corrente (2,0 4,5 A/m2) 25, 59, 62 de
modo que provvel que o perodo de aclimatao que observamos relacionado a uma
mudana na expresso dos citocromos da membrana externa.
Quando operadas com [Fe(CN)6]3- no compartimento catdico, as MFCs
atingiram uma densidade de potncia de at 2,6 W/m2, comparado com 0,38 W/m2 em
mdia, quando O2 utilizado no ctodo. O tipo de soluo catdica tambm altera
ambos, o perfil e comportamento da curva de polarizao. Apesar de algumas diferenas

48
serem atribudas ao alto OCP resultante da reduo do [Fe(CN)6]3-, a diferena de
desempenho entre as duas condies apenas aumenta com o aumento da voltagem vs.
OCP. Curvas de polarizao e potncia representativas para MFCs so mostradas na
Figura 23.

Figura 23. Os tringulos representam as MFCs que utilizam ferricianeto no

compartimento andico, enquanto clulas com O2 so representadas por crculos.
Curvas de polarizao representativas so mostradas de forma preenchida e curvas de

densidade de potncia na forma aberta para MFCs utilizando [Fe(CN)6]3 e O2 no
compartimento catdico.

Aps alcanarem o estado estacionrio, as curvas de polarizao das MFC

podem ser divididas em trs regies: de ativao, hmica e de perdas por transferncia
de massa, conforme relatado no item 2.8.1. Os biofilmes formados nas clulas com
oxignio no ctodo mostraram uma queda abrupta na voltagem da regio hmica,
seguido por um longo perodo de queda gradual de tenso na zona de transferncia de
massa. Este comportamento produz uma curva parablica que tpica de O2 no ctodo
conforme citado na literatura.42-65 Reciprocamente, biofilmes com ctodo usando
[Fe(CN)6]3- exibem perdas hmicas menores at chegar a um limite na densidade de
corrente no qual aumentar a voltagem em relao ao OPC no produz nenhum aumento

49
na corrente. A menor diferena na curva de polarizao ocorre no potencial do circuito
aberto e na densidade de corrente final.

5.2. COMPARAO ENTRE MFCs USANDO G. metallireducens, G.

sulfurreducens E UMA COCULTURA DAS DUAS ESPCIES

A bactria G. metallireducens, comumente encontrada em sedimentos aquticos,

possui altas propriedades biorremediadoras, sendo capaz de oxidar at mesmo
compostos aromticos.3,44 Porm pouco foi estudado sobre sua capacidade de gerar
energia em MFCs. A potncia mxima reportada para clulas utilizando esse tipo de
bactria com oxignio no ctodo foi na ordem de 26 200 mW/m2, 44-69
bastante
70
inferior ao obtido para G. sulfurreducens.
Para avaliar o desempenho de MFCs utilizando G. metallireducens e verificar a
possibilidade de utilizar as suas propriedades biorremediadoras combinadas com a
produo de energia eltrica, foram construdas MFCs utilizando culturas puras de G.
metallireducens, G. sulfurreducens e uma cocultura das duas espcies. O
compartimento andico de 3 clulas foi inoculado com 9 mL de G. metallireducens, G.
sulfurreducens e as duas bactrias respectivamente em meio de cultura previamente
descrito (Media I) utilizando 20 mM de acetato de sdio como doador de eltrons e 40
mM de citrato de Fe(III) como aceptor de eltrons. Aps a soluo no compartimento
andico apresentar turbidez, esta foi substituda pelo mesmo meio de cultura, porm
isento de citrato de Fe(III), obrigando as bactrias a utilizar o eletrodo como aceptor de
eltrons final. Esta soluo foi substituda a cada 3 - 4 dias para garantir o fornecimento
da fonte de carbono (acetato) para as bactrias. J a soluo catdica, contendo 50 mM
de ferricianeto, foi substituda quando a voltagem atingisse valores inferiores a 0,3 V
(potencial de reduo do ferricianeto = 0,361 V).
A clula inoculada com G. sulfurreducens apresentou uma potncia mxima de
2,21 W/m2 quando estava em operao por 153 horas. A espessura de biofilme aps 314
horas de operao foi de 62,1 m medida no eixo xz (Figura 24A).

50
Figura 24. Imagens dos biofilmes obtidas por microscpio confocal de varredura a laser.
(A) Biofilme de G. sulfurreducens de espessura de 62,1 m. (B) Biofilme de G.
metallireducens de espessura de 80 m. (C) Cocultura analisada por FISH, em vermelho
G. sulfurreducens e em verde G. metallireducens.

O valor de potncia atingido foi superior ao citado na literatura para clulas que
utilizam O2 no compartimento catdico, mas corresponde a potncia mdia obtida nos
experimentos realizados no grupo de pesquisa com as condies da clula otimizadas
(reduo das limitaes catdicas atingidas com a diminuio do tamanho do nodo e
utilizao de [Fe(CN)6]3- no compartimento catdico).
A clula cultivada com G. metallireducens demorou mais tempo para alcanar o
estado estacionrio, o que se pode concluir pela presena de overshoots nas curvas de
polarizao (Figura 25). Como consequncia, o pico de potncia foi atingido aps 240
horas de operao, quando a clula apresentou potncia de 3,61 W/m2.

51
Figura 25. Curvas de polarizao para MFC utilizando culturas puras de G.
metallireducens. Efeito de overshoot diminui aps 240 horas de operao.

A Figura 26 apresenta uma comparao entre a potncia atingida nas clulas

construdas com as culturas puras das duas espcies.

Figura 26. Grfico de densidade de potncia atingido e MFC para uma cultura pura de
G. metallireducens em azul e G. sulfurreducens em vermelho.

52
 O biofilme presente no nodo foi fixado aps 336 horas de operao
apresentando uma espessura de 80 m (Figura 24B). O experimento demonstrou que G.
metallireducens alm de poder ser utilizada para biorremediao apresenta uma
potncia elevada, podendo ser usada tambm em clulas de combustvel microbianas
para a produo de eletricidade.
A clula inoculada com as duas espcies apresentou biofilme com espessura de
apenas 8 m (Figura 24C) e potncia mxima de 0,016 W/m2 (Figura 27), muito baixa
se comparada s clulas inoculadas com culturas puras.

Figura 27. Grfico de potncia para uma MFC utilizando uma cocultura de G.
metallireducens e G. sulfurreducens

Conforme podemos observar na Figura 24C, a espcie G. sulfurreducens, em

vermelho, localiza-se na superfcie do eletrodo de maneira uniforme e a G.
metallireducen, de colorao verde, sobre a primeira, porm no sobre toda a superfcie.
O experimento sugere que quando uma cocultura formada, ocorre a transferncia
direta de eltrons entre as duas espcies conforme relatado por Summers et al71 o que
impede a transferncia de eltrons para o eletrodo e consequentemente a formao do

53
biofilme. Alm disso, pode-se perceber uma relao direta entre a espessura do biofilme
e a potncia produzida nas trs clulas.

5.2.1 Medida da densidade de pilis

Com o intuito de identificar a origem das diferenas de potncia apresentadas

entre os 3 sistemas cultivados, foi feita a medida da densidade de pilis contidos em uma
amostra pr cultivada de G. sulfurreducens, G. metallireducens e uma cocultura das
duas espcies. O resultado foi expresso em densidade ptica.
Para a extrao dos pilis foi utilizado o mtodo descrito por Helaine ET AL. 74
As 3 amostras foram concentradas por centrifugao a 6000 rpm por 5 min em um tubo
de polipropileno. O meio de cultura foi removido (sobrenadante). Em seguida a amostra
foi ressuspensa em uma soluo de 50 mM de Tris (pH 8,0) e 150 mM de NaCl, a qual
foi centrifugada novamente (6000 rpm por 5min) e o sobrenadante descartado. Esse
passo foi repetido mais uma vez. A amostra foi ressuspensa em 10 mL de uma soluo
150 mM de etanolamina a pH 10,5, a qual remove os pilis (protenas) das clulas.
Agitada em pulsos de 30 s por um total de 2 min. Centrifugado novamente por 20 min a
50000 rmp na centrfuga de alta velocidade utilizando tubos especficos para a mesma.
O sobrenadante (soluo de interesse) foi cuidadosamente removido e filtrado com um
filtro Millipore. A anlise seguiu com a precipitao dos pilis, atravs da adio de
uma soluo saturada de (NH4)2SO4 gota a gota at uma diluio final de 1:9 no
sobrenadante. A soluo foi centrifugada a 6000 rpm por 10 min e o sobrenadante foi
removido. O precipitado foi ressuspenso em 1 mL de 50 mM Tris a pH 8,0 e em seguida
filtrado em um filtro para peso molecular inferior a 10000 Da. Foi adicionado 3 mL de
50 mM soluo Tris a pH 8,0, centrifugado a 4500 rpm por 10 min e medida a
densidade ptica do sobrenadante.

54
Figura 28: Medida da densidade ptica dos pilis das espcies Geobacter

Os valores obtidos no foram coerentes com as densidades de potncia

produzidas pelas MFCs. Visto que o biofilme mais espesso foi obtido com as G.
metallireducens, era esperado que este apresentasse a maior densidade de pilis, porm
foi constatado que a amostra de G. sulfurreducens se diferenciou em relao as demais.
O mtodo apresenta erros implcitos no processo e o resultado obtido apenas um
resultado aproximado, mas esperava-se que estes fossem coerentes com a espessura e
potncia obtidas no experimento com as MFCs.

5.3. TESTES PARA A UTILIZAO DE OUTRAS FONTES DE CARBONO

A produo de biodiesel gera glicerol como subproduto que utilizado na

indstria farmacutica, produo de sabo e cosmticos, porm com o crescimento da
produo de biodiesel, o glicerol no tem sido absorvido pela indstria e grande parte
acaba se tornando resduo.
Devido capacidade das G. metallireducens em oxidar uma grande quantidade
de compostos72 foi testada a possibilidade do uso de glicerol como fonte de carbono
para esta espcie, uma alternativa para a utilizao do resduo gerado pela produo de
biodiesel. Este teste tambm foi feito para G. sulfurreducens, que, segundo a literatura72
tem capacidade de oxidar apenas acetato e H2.

55
 Primeiramente foram preparados 4 frascos de 80 mL cada com meio de cultura
especfico (Media I) abstraindo-se o doador de eltrons acetato. Citrato de Fe(III) foi
utilizado como aceptor de eltrons. O material usado bem como o meio de cultura,
foram previamente autoclavados. Glicerol foi utilizado como fonte de carbono, porm
teve que ser adicionado ao meio de cultura aps o processo de esterilizao em
autoclave por sofrer decomposio ao calor. 5, 10, 20 e 30 mM de glicerol foram
injetados respectivamente a cada frasco a partir de uma soluo me de glicerol 50%
que foi injetada ao meio de cultura atravs de um filtro estril de 20 m de espessura
para eliminar qualquer possibilidade de contaminao. A cada frasco foi adicionado 8
mL G. metallireducens previamente cultivadas. Dois frascos de controle tambm foram
preparados, um utilizando 20 mM de acetato como fonte de carbono e outro sem doador
de eltrons. Em ambos os frascos foram adicionados 8 mL de bactrias. Todo o
procedimento foi realizado dentro de uma cmara anaerbica. O mesmo experimento foi
repetido para G. sulfurreducens.
O meio de cultura inicialmente de cor marrom escuro, torna-se turvo, mudando
inicialmente para amarelo claro e em seguida tornando-se esbranquiado quando h
crescimento de bactrias. Na Figura 29 e Figura 30 pode-se verificar o crescimento de
G. metallireducens no controle contendo acetato, como esperado, alm de crescimento
da bactria no meio contendo 20 mM de glicerol, depois de 7 dias de inoculao.

Figura 29. G. metallireducens inoculada no controle, sem fonte de carbono, em 20 mM

de glicerol e no controle com acetato (esquerda para direita).

56
Figura 30. G. metallireducens inoculada no controle sem glicerol, 5, 10, 20 e 30 mM de
glicerol (esquerda para direita). Pode-se ver o crescimento de bactrias apenas no frasco
contendo 20 mM de glicerol

Os frascos inoculados com G. sulfurreducens, no apresentaram nenhuma

mudana na colorao, ou seja, no houve crescimento da bactria quando inoculada
com glicerol.
Um novo experimento foi realizado para G. metallireducens com o intuito de
testar o desenvolvimento da bactria em diferentes concentraes. Foi utilizando 12, 14,
16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28 mM de glicerol e os resultados obtidos podem ser verificados
na Figura 31.

Figura 31. G. metallireducens inoculado no controle com acetato, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24 e 28 mM de glicerol e controle sem fonte de carbono (esquerda para direita).

A bactria se desenvolveu em todas as concentraes de glicerol testadas. Para

avaliar a melhor concentrao, foi medida a densidade ptica das amostras aps 7 dias

57
de inoculao (Figura 32).

Figura 32. Densidade ptica (D.O.) das amostras nas respectivas concentraes. 14 mM
demosntrou ser a concentrao mais apropriada para o crescimento das bactrias em
glicerol.

Apesar dos resultados serem similares, a concentrao na qual houve um melhor

desenvolvimento bacteriano foi de 14 mM de glicerol, o que pode ser concludo a partir
dos resultados de densidade ptica obtidos.
Para a avaliao da densidade ptica foi utilizado o equipamento WPA
Biowave OP 800 que utilizado para dar uma indicao de clulas bacterianas atravs
da medio da densidade ptica de uma suspenso de clulas a 600 nm. importante
destacar que para as amostras turvas, tais como culturas de clulas, a absorvncia
medida devido disperso da luz e no devido a absoro molecular. A leitura
afetada pela tica do sistema (a distncia focal, a geometria da fenda de sada do
instrumento e o monocromador ptico). Diferentes tipos de espectrofotometria daro
diferentes leituras para a mesma amostra turva. Para que as leituras utilizando o
equipamento Biowave possam ser comparveis a um espectrofotmetro tradicional,
um factor de correco est includo no software Biowave II. Os resultados obtidos
foram cerca da metade do instrumento tradicional, sugerindo que um fator de correo
de 2,0 seria apropriado neste caso. Por esta razo, esse o valor padro programado,

58
porm pode ser modificado a partir de alteraes realizadas nas configuraes do
equipamento.

6. CONCLUSES

As medidas experimentais que compararam os dois tipos de ctodo

demonstraram que as limitaes catdicas so removidas quando o ctodo de oxignio
substitudo pelo que contm [Fe(CN)6]3- . Isto tem implicaes importantes para futuras
melhorias no desempenho das MFCs.
A comparao entre culturas demonstrou que G. metallireducens alm de poder
ser utilizada para biorremediao apresenta uma potncia elevada, podendo ser usada
tambm como cultura pura em clulas de combustvel microbianas, para a produo de
eletricidade.
A cocultura estudada demonstrou que ocorre a transferncia direta de eltrons
entre as duas espcies de Geobacter, o que impede a transferncia de eltrons para o
eletrodo e consequentemente a formao do biofilme. Isso pode ser afirmado tendo
como base os resultados publicados por Summer et al.71 Alm disso, pode-se perceber
uma relao direta entre a espessura do biofilme e a potncia produzida nas trs clulas,
porm essa relao no consistente quando a densidade de pilis avaliada.
A espcie G. metallireducens demonstrou ainda ser til na utilizao de glicerol
como fonte de carbono, podendo servir como espcie remediadora para este resduo.

7. SUJESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

Para trabalhos futuros sugere-se a construo de uma clula de combustvel

microbiana utilizando-se glicerol como substrato e a avaliao da potncia produzida.
Sugere-se tambm a avaliao dos metablitos produzidos na degradao do
glicerol em uma cultura de G. metallireducens.

59
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