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Valoracin qumica de drogas vegetales

Las pruebas qumicas se usan para identificaciones, determinacin de


concentracin y pureza de las drogas. Por ejemplo, la identificacin de alcaloides
se basa en diferentes reacciones de coloracin frente a reactivos qumicos, como
en el caso de los alcaloides de cinchona (quinina, quinidina, cupreina, etc.), que al
tratarse con solucin TS de bromo (USP) y solucin TS de amoniaco (USP)
producen una coloracin verde esmeralda. Para realizar un anlisis qumico de
drogas, se deben emplear mtodos extractivos farmacuticos y purificar el
constituyente principal. En muchas drogas, el anlisis qumico es la nica forma
oficial de determinar su potencia. Para los principios activos particulares se emplea
el anlisis qumico pues se obtienen resultados muy precisos. Las pruebas para
alcaloides, la medida del efecto reductor de los azcares frente a los reactivos de
Molish y Barfoed y la determinacin de los ndices de yodo, saponificacin y acidez
de los aceites fijos, son ejemplos de ello. Las drogas de origen vegetal y animal que
no son de naturaleza celular, o que representan principios activos de plantas, se
presentan ms para su estudio qumico. El aislamiento, purificacin de identificacin
y las pruebas y ensayos, aunque aparentemente son tcnicas farmacuticas, en
realidad son mtodos qumicos de valoracin.
Estudio cromatogrfico de las drogas vegetales. Las tcnicas cromatogrficas son
ms eficaces que cualquier otra tcnica para la separacin e identificacin de
soluciones que contienen los principios activos de las drogas. Su principal aplicacin
es la determinacin de la identidad y pureza de las drogas y derivados de origen
natural. La cromatografa puede definirse como un mtodo de anlisis en el cual el
flujo de un disolvente (lquido o gas) favorece la separacin de sustancias por
migracin diferencial a partir de una estrecha zona inicial en un medio poroso
adsorbente. Para fines prcticos se puede considerar la cromatografa como un
procedimiento de separacin de principios activos y materiales inertes presentes en
las drogas, por mecanismos de extraccin fraccionada, intercambio inico,
adsorcin u otro, entre un slido poroso y un disolvente que circula a travs de l.
Una vez separadas, las sustancias pueden identificarse por otros medios analticos.
Se suelen emplear cromatografas en columna, en papel, en capa delgada o
gaseosa.
La eleccin depende de la cantidad de muestra que se tenga y la exactitud requerida
en el resultado. Descripcin de la practica La prctica se desarrollar en una sola
fase que consiste en la obtencin del extracto vegetal y la realizacin de las pruebas
fitoqumicas, para la identificacin cualitativa de metabolitos secundarios (principios
activos). Recursos a utilizar en la prctica (Equipos / instrumentos)
Material de laboratorio (por grupo)
Embudo buchner con su correspondiente erlenmeyer con desprendimiento lateral
para filtracin a vaco (100 a 200 mL) en lo posible embudo comn para filtracin
por gravedad.
vaso de precipitado de 50 mL
cpsula de porcelana mediana
esptula
agitador de vidrio
pipeta de 10 mL (con pera para succin y expulsin o pipeteador)
6 tubos de ensayo para capacidad de 10 mL
Gradilla
Pinza o depilador pequeo
Papel filtro
Capilar delgado
Toallas absorbentes
Material de laboratorio (de uso comn)
2 cmaras de cromatografa medianas (tambin pueden ser frascos de compota o
vasos de precipitados pequeos cubiertos con placas de vidrio).
2 Placas de cromatografa en capa fina de 10x10 cm (pueden ser en base de
aluminio: cromatofolios, o en base de vidrio). En una sola placa se pueden aplicar
hasta 10 muestras de extracto (1 por grupo). Si se emplean frascos de compota a
cada grupo asignarle 2 placas de cromatofolios en base de aluminio de 2 cm x 6
cm.
Referencias recomendadas: Cromatofolios: Marca Macherey Nagel ref: 805023,
caja por 25 lminas cubiertas con slicagel e indicador de fluorescencia 254 nm,
0.20 mm de espesor. Tambin podran ser de marca Merck.
Placas de cromatografa en base de vidrio: Marca Macherey Nagel ref: 821030,
placas finas con slicagel 60 e indicador de fluorescencia 254 nm, 0.25 mm de
espesor. Tambin podran ser de marca Merck.
Nota: si no es posible adquirir las placas cromatogrficas se podra emplear papel
filtro. Aspersores de vidrio o atomizadores de plstico (el nmero a emplear
depender del nmero de reveladores a usar)
Goteros o pipetas pasteur para los reactivos que lo requieran
Cinta de enmascarar delgada
Equipos, reactivos y solventes (de uso comn)
Estufa de secado que alcance una temperatura de 70-100C. Tambin puede ser
plancha de calefaccin.
Bao mara ( bao termostatado) para calentar de 50C a 70C
Lmpara UV (si es necesaria)
Campana de extraccin de aire
Reactivos y reveladores qumicos para la identificacin de metabolitos:
Reactivo de Mayer: disolver por separado 1.5 g de cloruro mercrico y 5.0 g de
yoduro de potasio en la mnima cantidad de agua, mezclar las dos soluciones y
completar con agua destilada a un volumen de 100 mL (este reactivo alcanza para
las tres prcticas)
Reactivo de Valser: Disolver 1.0 g de yoduro de potasio en agua destilada y
completar a 100 mL, agregar agitando a la anterior solucin yoduro de mercurio
slido hasta que no se disuelva (aprox 14.0 gramos). Filtrar si es necesario. (este
reactivo alcanza para las tres prcticas).
Para la reaccin de Shinoda tener limadura de magnesio o magnesio en polvo y
HCl concentrado (100 mL).
Solucin de cloruro frrico al 10% (para deteccin de compuestos fenlicos).
Preparar 100 mL.
Godn: Solucin A: solucin al 5% de H2SO4 en etanol (96%) (50 mL)
Solucin B: solucin al 1% de vainillina en etanol (96%) (50 mL)
Oleum: Para 50 mL: mezclar cuidadosamente 2 mL de agua destilada con 8 mL
de cido sulfrico concentrado, finalmente adicionar lentamente a 40 mL de cido
actico (preparar en campana de extraccin).
Dragendorff: solucin A: disolver 0.85 g de nitrato de bismuto en 10 mL de cido
actico glacial y 40 mL de agua.
Solucin B: disolver 16 g de yoduro de potasio en 40 mL de agua
Solucin de reserva: mezclar volumenes iguales de las soluciones A y B. Mantener
en frasco oscuro en nevera (80 mL aprox).
Solucin reveladora: mezclar 5 mL de solucin de reserva con 10 mL de cido
actico glacial y 50 mL de agua destilada.
Borntrger: solucin al 7% de KOH en etanol (96%) (50 mL)
Agua destilada (mximo 1Lt)
Etanol al 96% (mximo 1Lt)
HCl diluido (al 10% en agua destilada) (200 mL)
Solventes sugeridos a emplear para las mezclas de fases mviles en las cmaras
cromatogrficas: cloroformo, metanol, hexano, acetato de etilo, acetona.
Fases mviles recomendadas para la prctica: mediana)
Fase mvil 2: mezcla Hexano: Acetato de etilo (60:40) (50 mL para una placa
cromatogrfica median.
Auxiliar de laboratorio: Se recomienda preparar los reactivos, reveladores qumicos
y fases mviles bajo campana de extraccin de aire y el uso de guantes de
laboratorio.
Estudiantes: El contacto con los reactivos y solventes orgnicos es mnimo por el
empleo de goteros o pipetas pasteur durante su manipulacin. Se sugiere su empleo
bajo campana de extraccin de aire. Se recomienda vigilar el uso racional del etanol
industrial (96%).
Forma de trabajo:
Trabajar en grupos colaborativos, mximo de 4 personas los cuales se conformarn
el primer da de la prctica. Participar de todas las actividades propuestas en esta
gua de laboratorio.
Material indispensable para el primer da de prctica adquirido por cada estudiante:
Producto de la maceracin realizada durante la segunda prctica.
Procedimiento:
1. Filtrar poco a poco el producto de la maceracin (si es posible a vaco en embudo
buchner) para obtener el filtrado o extracto fluido (anotar su color y apariencia).
2. Etiquetar o marcar 3 tubos de ensayo, para cada una de las siguientes pruebas
de identificacin de metabolitos:
Tubo 1: Identificacin de Taninos. A 1 mL aproximadamente de extracto lquido,
adicionar 5 mL de solucin de etanol:agua (8:2) y agitar suave. Separar 1 mL de la
solucin anterior en otro tubo de ensayo y adicionar 3 mL de solucin de etanol:agua
(8:2). Separar de 2 a 3 mL de la solucin anterior en otro tubo de ensayo, aadir 1
mL de solucin de cloruro frrico al 10%. Observar y anotar los cambios de color.
Prueba positiva: Cambios de color a azul oscuro, violeta oscuro caf oscuro.
Tubo 2: Identificacin de flavonoides (Reaccin de Shinoda). A 1 mL
aproximadamente de extracto lquido adicionar 5 mL de solucin de etanol:agua
(8:2) y agitar suave. Separar 1 mL de la solucin anterior en otro tubo de ensayo y
adicionar 3 mL de solucin de etanol:agua (8:2). En otro tubo de ensayo adicionar
magnesio en polvo o limadura de magnesio de forma tal que cubra el fondo del tubo,
adicionarle 1 mL de la solucin diluida de extracto y luego lentamente 3 a 5 gotas
de HCl concentrado (mximo 0.5 mL). Esperar a que termine el desprendimiento de
hidrgeno y observar el cambio de color. Esta prueba debe realizarse
cuidadosamente en campana de extraccin, por parte del tutor responsable de la
prctica. Prueba positiva: Cambios de color a amarillo, amarillo oscuro, naranja, rojo
o violeta.
Tubo 3: Identificacin de terpenoides por cromatografa (ver mas adelante): Destinar
de 0.5 a 1 mL de extracto lquido para las pruebas de cromatografa en capa delgada
(CCD). Para diluirlo adicionar el doble del volumen de etanol al 96%.
3. Identificacin de alcaloides (reacciones de precipitacin): Colocar el volumen
restante del extracto lquido obtenido en el punto 1 en una cpsula de porcelana,
calentar a bao mara hasta evaporar completamente el etanol. Este proceso debe
permitir la obtencin de un extracto blando (cubre el fondo de la cpsula de
porcelana). Anotar el aspecto, color y olor del extracto obtenido. Se recomienda
realizar el secado a bao mara en bao termostatado de 50 a 60C, si no, en bao
mara convencional controlando la temperatura del bao.
Adicionar al extracto blando obtenido en la cpsula de porcelana 5 mL de HCl diluido
(10%), con ayuda de esptula desprender el extracto de las paredes y del fondo de
la cpsula en contacto con el HCl diluido. Realizar el procedimiento anterior 2 veces
ms, adicionando cada vez 5 mL de HCl diluido (10%). Filtrar y separar en dos tubos
de ensayo aproximadamente 5 mL de filtrado (debe estar claro). Adicionar a un tubo
de ensayo alrededor de 1 mL de Reactivo de Mayer y al otro tubo alrededor de 1
mL de Reactivo de Valser. Anotar los resultados observados. Observar y anotar los
cambios de color. Prueba positiva: Precipitados de color blanco, crema beige.
Cromatografa en capa fina:
Con ayuda de un capilar tomar una muestra del extracto lquido diluido del tubo
3, aplicar 3 veces sobre la placa cromatogrfica (fase estacionaria). Introducir la
placa en la cmara para cromatografa, previamente saturada con la mezcla de
elucin respectiva (se recomienda emplear dos placas cromatogrficas, cada una
para una fase mvil diferente). Dejar eluir el solvente a travs de la placa, hasta
alcanzar alrededor de 0.5 mm del borde superior de la placa. Con ayuda de un
depilador o pinza retirar la placa de la cmara, dejarla secar a temperatura ambiente
y con ayuda de aspersor o atomizador asperjar con el revelador universal en
campana de extraccin.
Nota: Para la cromatografa en capa delgada se recomienda emplear reveladores
qumicos universales, los cuales permiten la identificacin de diferentes tipos de
metabolitos. Si el tutor lo desea podra utilizar tambin reveladores especficos. A
continuacin se describe la forma de utilizacin de algunos reveladores universales
y especficos y las pruebas positivas correspondientes.
Reveladores qumicos universales:
GODN (revelador universal): humedecer o aspejar las placas cromatogrficas,
primero con la solucin A y posteriormente con la solucin B. Dejar secar y calentar
la placa a 100C hasta aparicin de manchas coloreadas a la luz visible. Resultados:
terpenoides: manchas de color violeta, rosada azul; flavonoides, xantonas,
naftoquinonas: manchas amarillas; irioides: manchas cafs.
OLEUM (revelador universal): Los resultados observados son muy similares a los
obtenidos con GODN.
Reveladores qumicos especficos:
DRAGENDORFF para cromatografa (deteccin de alcaloides): humedecer o
asperjar las placas cromatogrficas, dejar secar. Observar la aparicin de manchas
naranja a la luz visible.
BORNTRGER (deteccin de antraquinonas y cumarinas): Humedecer o asperjar
las placas cromatogrficas, dejar secar. Observar la aparicin de manchas al visible
y a 365 nm. Calentar a 100C y observar de nuevo. Antraquinonas: manchas rojas;
cumarinas: manchas azules a luz UV-365 nm.