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Biocatlise

Biocatlise em solventes orgnicos

Maria Raquel Aires-Barros


Centro de Engenharia Biolgica e Qumica
Instituto Superior Tcnico, Av. Rovisco Pais, 1049-001 Lisboa.

1. Introduo bioprocesso no seja condicionado pelo biocatalisador.

Os termos biocatlise ou biotransformao abrangem os A Bioconverso, inclui a seleco do meio reaccional, que
processos em que um catalisador biolgico utilizado pode ser um meio convencional (meio aquoso) ou meios
para converter um substrato num nmero limitado de no-convencionais, e o projecto do reactor. As caracters-
etapas enzimticas. Por forma a estabelecer um processo ticas do biorreactor a utilizar devem compreender simpli-
de biotransformao ecaz, necessria a anlise detalhada cidade de concepo, exibilidade, segurana de operao
dos factores que condicionam o desenvolvimento e optimi- e possibilidade de monitorizao e controlo de parmetros
zao integrados de um processo biotecnolgico operacionais. A concepo do biorreactor requer um
conhecimento adequado da cintica reaccional, da hidro-
A estratgia de desenvolvimento e optimizao de um dinmica do sistema e dos mecanismos de transferncia de
Bioprocesso depende de trs contribuies: Biocatalisador, massa. No caso de bioconverses em sistemas multifsicos
Bioconverso e Isolamento e Puricao do Produto devem ser ainda tomados em conta os fenmenos interfa-
(Figura 1). ciais, a partio do substrato e do produto entre as duas
Uma vez identicada a matria prima mais adequada para fases e a facilidade de separao das duas fases, com vista
substrato da bioconverso pretendida, deve seleccionar-se a uma integrao ecaz das etapas de bioconverso e de
o biocatalisador que apresente nveis adequados de activi- recuperao do produto.
dade cataltica, selectividade e estabilidade para operar nas O Isolamento e Puricao do produto obtido da biocon-
condies seleccionadas de temperatura, fora inica, pH verso, depende das caractersticas do produto que vo
e natureza da soluo tampo, concentrao de substrato inuenciar a sua recuperao, e a qualidade, pureza e escala
e produto e ainda na eventual presena de solventes org- pretendidas.
nicos. Trs abordagens podem ser consideradas visando a
triagem e seleco de um biocatalisador para a converso
pretendida: (i)biocatalisadores existentes; (ii) modicao 2. Principais razes para a utilizao de
de biocatalisadores existentes recorrendo a tcnicas de
engenharia gentica; e (iii) rastreio para isolamento de
meios no-convencionais
novos biocatalisadores (clulas inteiras de extremlos ou Atendendo a que o conceito de biotransformao est
de enzimas derivados destes organismos). associado ao uso de biocatalisadores, nas quais a gua o
O biocatalisador produzido por fermentao, e neste solvente preponderante, fcil compreender que a mesma
passo geralmente requerido um hospedeiro robusto, com funo tenha sido desempenhada por este solvente em
um crescimento rpido, levando a densidades celulares inmeros estudos de cintica enzimtica. Observou-se,
elevadas e nveis de expresso elevados, o que facilita a no entanto, que o uso exclusivo de gua como solvente de
recuperao do produto e minimiza o volume de fermen- meios de biotransformao restringia a gama de aplicaes
tao. O crescente desenvolvimento da tecnologia de DNA da biocatlise, bem como limitava a produtividade de
recombinado, possibilitando a expresso de enzimas em diversos processos, nomeadamente os que envolviam
diferentes hospedeiros, tem permitido a obteno de bio- substratos hidrfobos. Por outro lado, a constatao de
catalisadores mais adequados. Enzimas isolados ou clulas que muitos enzimas operam in vivo em ambientes ricos em
inteiras, quer na forma livre quer na forma imobilizada, lpidos hidrfobos, levou a concluso de que estes meios
tm sido usados como biocatalisadores. O isolamento e predominantemente no-aquosos so igualmente adequa-
puricao do biocatalisador (enzimas), consiste em dos expresso de actividade biocataltica. A convergncia
geral numa etapa de concentrao, seguida da puricao destes dois aspectos conduziu incorporao no meio
propriamente dita, por processos cromatogrcos. reaccional, de solventes orgnicos, uidos supercrticos,
fases gasosas ou fases slidas, aos quais se convencionou
A obteno de novos biocatalisadores, baseados na atribuir a designao de meios no-convencionais.
Engenharia do Biocatalisador permite modicar e melho-
rar as caractersticas do biocatalisador de forma a que o As principais razes para a utilizao de meios no-con-

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Figura 1- Bioprocesso para obteno de bioprodutos.

vencionais so essencialmente o facto destes permitirem: 3. Biocatlise em solventes orgnicos


1) a solubilizao de substratos e/ou produtos hidrfobos
, levando ao desenvolvimento de processos com produ- As bioconverses em sistemas multifsicos em que uma das
tividade volumtrica elevada.; 2) a reduo de possveis fases um solvente orgnico tem vantagens e desvantagens
efeitos inibitrios ou/e txicos por parte do substrato associadas ao uso de uma fase orgnica. Uma vez que
e/ou produto, em que o solvente orgnico pode ser selec- aps a etapa de bioconverso se seque a recuperaodo
cionado de modo a funcionar como diluente, reduzindo a produto, em termos de integrao ecaz das duas etapas de
concentrao interfacial e na fase aquosa (por partio) de forma a optimizao do bioprocesso global, importante
substratos e/ou produtos; e 3) o deslocamento do equilbrio considerar as potenciais vantagens e desvantagens destes
qumico, nomeadamente no caso de enzimas hidrolases, sistemas em termos de operao do reactor e recuperao
que em meio aquoso catalisam reaces de hidrlise, e o do produto (Tabela 1).
equilbrio pode ser deslocado no sentido do favorecimento Relativamente operao do reactor, h vantagens em usar
de reaces de sntese, atravs do controlo da actividade da
um solvente orgnico, pois este vai permitir a solubilizao
gua. O equilbrio da reaco pode ser tambm deslocado de compostos hidrfobos (substratos e produtos), a reduo
no sentido do favorecimento da formao do produto, de efeitos inibitrios/txicos de substratos e/ou produtos,
mediante a remoo contnua deste para a fase orgnica. e o deslocamento do equilbrio da reaco atravs do
Os meios no convencionais para biocatlise podem ser controlo da actividade da gua. As principais desvantagens
solventes orgnicos, udos supercrticos, sistemas em associadas ao uso de solventes orgnicos como meios de
que no so utilizados solventes orgnicos (fases slidas, bioconverso, so o aumento das limitaes difusionais
lquidas e gasosas), e recentemente udos inicos. transferncia de massa de substratos e/ou produtos, uma
vez que se introduz mais uma fase (orgnica) alm da fase
aquosa (e de uma fase slida se o biocatalisador estiver
imobilizado), e a toxicidade
do solvente orgnico para o
Tabela 1: Vantagens e limitaes do uso de solventes orgnicos biocatalisador.
Em termos de isolamento
Caractersticas do processo Vantagens e desvantagens e puricao do produto
Operao do reactor da bioconverso , esta
(+) Solubilizao de substratos/produtos hidrfobos
facilitada se o substrato e
(+) Reduo da inibio/toxicidade de substratos/produtos
(+) Deslocamento do equilbrio qumico
o produto estiveram em
(-) Limitaes transferncia de massa fases diferentes (nome-
(-) Toxicidade para o biocatalisador adamente se o produto
for hidrfobo), e por se
Isolamento e puricao
(+) Recuperao de substratos/produtos obterem concentraes
(+) Concentraes elevadas de produtos mais elevadas de produto. A
(-) Formao de emulses principal desvantagem, so

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a formao de emulses estveis, normalmente devido a Tabela 2 : Critrios para a seleco do solvente
efeitos interfaciais. A presena de reas interfaciais elevadas orgnico
pode levantar srios problemas na etapa de recuperao do
produto do reactor, podendo tornar-se o factor limitante do Fsico Qumicos
processo global. - Capacidade para solubilizao do substrato e do produto
Adicionalmente a estes factores temos tambm de consi- - Coeciente de partio
- Densidade
derar os custos adicionais para a segurana do processo, - Pontos de fuso e de ebulio
no processamento dos euentes do processo incluindo a - Tenso supercial
- Viscosidade
possvel reutilizao do solvente orgnico.
Biolgicos
- Toxicidade para o biocatalisador
Segurana
3.1 Seleco do solvente orgnico - Toxicidade
- Inamabilidade
As bioconverses em sistemas multifsicos dependem
Logsticos
da escolha do solvente mais adequado para o sistema
- Facilidade de obteno
biocataltico. - Eliminao de resduos
Os principais critrios a considerar na seleco de um Econmicos
solvente orgnico so apresentados na Tabela 2, e incluem - Custo
critrios fsico-qumicos, biolgicos, de segurana, logs-
ticos e econmicos. Do ponto de vista fsico-qumico, os
aspectos mais importantes so a capacidade de extraco A toxicidade molecular do solvente usualmente avaliada
(coeciente de partio) e solubilizao de substratos e/ou atravs do logaritmo do coeciente de partio do solvente
produtos pelo solvente orgnico, e as suas propriedades num sistema padro n-octanol/gua (log Po/w), conhecido
que vo determinar a facilidade de separao das fases como parmetro de Hansch, o qual um indicador do grau
e a transferncia de massa. O solvente orgnico deve de hidrofobicidade do solvente em causa. O valor de log Po/w
ser qumica e termicamente estvel, no deve formar de de um dado solvente pode ser determinado experimental-
emulses em meio aquoso, por forma a facilitar a separao mente ou calculado atravs do mtodo das constantes
de fases, a sua viscosidade deve ser reduzida, de forma a hidrfobas fragmentadas de Rekker. Trabalhos realizados
facilitar a transferncia de massa, e no ser degradado pelo com diferentes sistemas biocatalticos, envolvendo, em cada
biocatalisador. Do ponto de vista de segurana, o solvente caso, o uso de solventes com diferentes hidrofobicidades,
orgnico no deve apresentar toxicidade ambiental nem ser conrmaram a existncia de uma tendncia generalizada
prejudicial para a sade, e no ser inamvel .Em termos para a relao entre a actividade cataltica e a hidrofobici-
logsticos, a sua disponibilidade dever ser elevada e a sua dade do solvente, traduzida por uma curva sigmoidal. Em
reciclagem deve ser possvel. Em termos econmicos, o seu mdia, solventes com log Po/w inferior a 2-3 so considera-
custo deve ser baixo. O critrio biolgico, toxicidade do dos txicos, enquanto aqueles com log Po/w superiores a 4-5
solvente orgnico para o biocatalisador , de todos estes, o so considerados biocompatveis, muito embora os pontos
que se apresenta mais restritivo. de inexo sejam dependentes do biocatalisador, nomeada-
mente do microrganismo, considerado. O deslocamento do
ponto de inexo tambm pode ser motivado pelo grau de
3.1.1 Toxicidade molecular e toxicidade agitao do meio.
de fase A aco txica de solventes orgnicos hidrfobos
essencialmente devida toxicidade de fase, dada a sua
O efeito txico do solvente pode ser devido a dois processos:
baixa partio para o lme aquoso que rodeia o biocatali-
um resultante da difuso de molculas de solvente atravs
sador. Este factor minimiza a possibilidade de ser atingido
da membrana citoplsmtica (toxicidade molecular); e
um valor de concentrao crtica do solvente na membrana
outro associado ao contacto directo entre o biocatalisador
celular, a partir da qual observada a aco txica.
e o solvente orgnico (toxicidade de fase).
A toxicidade de fase pode ser reduzida, atravs da
A presena de solvente orgnico dissolvido na fase aquosa
utilizao de nutrientes e inculos mais concentrados,
(toxicidade molecular), pode provocar inibio enzimtica,
para compensar a extraco de nutrientes, e diminuindo
desnaturao de protenas e alterao do DNA, e modi-
a rea interfacial, usando uma agitao mais suave e/ou
cao da uidez da membrana citoplasmtica. A toxici-
diminuindo a razo volumtrica de fases orgnica/aquosa,
dade de fase, que origina, para alm da desorganizao da
de modo a reduzir os fenmenos de agregao e emulso. A
membrana citoplasmtica, a sua permeabilizao do que
imobilizao do biocatalisador e a utilizao de membranas
resulta a perda de metabolitos essenciais e de co-factores,
hidrfobas, que evitam o contacto do biocatalisador com a
pode levar extraco de nutrientes, agregao celular e
interface lquido-lquido, e a engenharia do biocatalisador,
formao de emulses.
atravs do design de biocatalisadores mais resistentes e

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Figura 2 - Classicao de sistemas bioca-


talticos englobando solventes orgnicos:
(a) sistemas de duas fases lquidas org-
nico-aquosas: emulso de meio aquoso
(disperso) em meio orgnico (contnuo);
(b) sistemas de duas fases lquidas org-
nico-aquosas: emulso de meio orgnico
(disperso) em meio aquoso (contnuo);
(c) e (d) biocatalisador imobilizado
num suporte poroso, em presena de
um sistema bifsico; (e) biocatalisador
microencapsulado numa micela inver-
tida; (f) biocatalisador modicado com
polietileno glicol e dissolvido em meio
orgnico; (g) biocatalisador imobilizado
ressuspenso em meio orgnico; (h) bioca-
talisador liolizado e na forma de cristais,
ressuspenso em meio orgnico.

apropriados a solventes orgnicos, so outras alternativas 3.2.2 Sistemas de duas fases lquidas
possveis para diminuio da toxicidade de fase. orgnico-aquosas
A estabilidade do biocatalisador num solvente orgnico
3.2 Classicao dos sistemas biocatal- pode ser melhorada usando um solvente imiscvel em gua
ticos (log P >4). Obtm-se um sistema bifsico com o enzima
e compostos hidrlos na fase aquosa e os substratos e
Os sistemas biocatalticos que utilizam solventes orgnicos produtos hidrfobos na fase orgnica (Figura 2, a,b,c,d).
podem ser agrupados de acordo com a natureza da mis-
Neste tipo de sistemas a fase orgnica pode constituir
tura: (1) mistura homognea de meio aquoso e solventes
ela prpria o substrato da bioconverso ou servir de
orgnicos miscveis com gua; (2) mistura de duas fases
reservatrio a substratos e/ou produtos hidrfobos.
lquidas orgnico-aquosas; (3) biocatalisadores dissolvidos
Podemos considerar sistemas em que a fase orgnica
em solventes orgnicos: micelas invertidas e enzimas modi-
contnua e a fase aquosa dispersa na fase orgnica, sendo o
cados covalentemente e (4) biocatalisadores ressuspensos
biocatalisador solvel na fase aquosa;ou a fase contnua a
em solventes orgnicos com baixos teores de gua: enzimas
fase aquosa e a fase orgnica est dispersa na fase aquosa,
em p (obtidos por liolizao ou cristalizao) ou biocata-
com o biocatalisador solvel na fase aquosa (Figura 2, a,b).
lisadores imobilizados, na ausncia de fase aquosa (Figura
Podemos ter tambm, considerando as duas situaes
2,a, b, c, d ,e, f , h).
anteriores, a presena de uma terceira fase slida devido ao
biocatalisador imobilizado (Figura 2 c , d).

3.2.1 Mistura homognea de meio Nestes sistemas necessrio assegurar que a rea interfacial
seja sucientemente elevada para facilitar a transferncia
aquoso e solventes orgnicos miscveis
de massa de substratos/produtos atravs da interface
com gua lquido-lquido e lquido-slido (se o biocatalisador estiver
Uma forma simples de aumentar a solubilidade de um imobilizado), atravs do controlo adequado da velocidade
substrato hidrfobo em meio aquoso, consiste na adio de de agitao e da razo volumtrica das fases aquosa e org-
um solvente orgnico miscvel com gua (metanol, etanol, nica. A partio de substrato(s) e produto(s) entre as duas
dimetilformamida) ao meio de biotransformao. Dada fases pode ser controlada mediante a seleco adequada
a sua homogeneidade, as resistncias transferncia de do solvente orgnico. A partio de produto(s) para a fase
massa so geralmente negligenciveis. Todavia a polaridade orgnica permite deslocar o equilbrio da reaco no sen-
elevada destes solventes, com valores de log Po/w inferiores tido da formao do(s) mesmo(s). A acumulao preferen-
a 2, confere-lhes um carcter txico, acentuando-se este cial de substrato(s) e produto(s) na fase orgnica minimiza
efeito txico para concentraes elevadas de solvente. a sua potencial aco inibitria sobre o biocatalisador. A
razo volumtrica entre as duas fases pode ser escolhida

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com vista a optimizar a operao do reactor. 3.2.5 Classicao dos sistemas biocata-
lticos: Pers de concentrao
3.2.3 Biocatalisadores dissolvidos em Para a seleco do sistema biocataltico e do reactor mais
solventes orgnicos adequado para uma dada bioconverso importante clas-
sicar os vrios sistemas descritos de acordo com os pers
Os sistemas de micelas invertidas constituem casos de concentrao do substrato e o volume relativo de fases
particulares de microemulses, em que a fase aquosa no orgnico/aquosa.
macroscopicamente discernvel da fase orgnica (fase
Podemos considerar trs tipos de pers de concentrao
contnua) (Figura 2 e). Estes sistemas reaccionais consistem
tericos para o substrato, considerando um substrato
em agregados formados por molculas de agentes tensio-
hidrfobo, e que as fases lquidas (aquosa e orgnica) se
activos na presena de solventes apolares e de pequenas
encontram bem misturadas, isto no h limitaes
quantidades de gua. A natureza anptica das molculas
transferncia de massa dentro das fases (Figura-3,a), b)
dos agentes tensioactivos, compostas por um grupo polar
e c)).
(hidrlo) e uma cauda apolar (hidrfoba), faz com que
elas se agrupem de modo a que as caudas hidrfobas se A gura 3 a) representa o perl de concentrao do
encontram em contacto com o solvente apolar, enquanto substrato, para o sistema de duas fases lquidas orgnico-
os grupos polares se direccionam para o interior do agre- aquosas, com o biocatalisador dissolvido na fase aquosa,
gado, formando um ncleo interior aquoso. Deste modo em que a fase aquosa pode ser a fase contnua ou a fase
as micelas invertidas permitem a solubiizao de enzimas dispersa (sistemas da Figura 2 a, b). Evidencia-se a variao
no ncleo interior aquoso e a partio de substratos da concentrao de substrato na interface quer devido s
e/ou produtos entre o ncleo aquoso e o solvente orgnico, resistncias transferncia de massa atravs da interface,
dependendo da sua hidrofobicidade. quer a efeitos de partio. Uma vez que o substrato
hidrfobo, tem pouca anidade para a fase aquosa e a sua
A rea interfacial elevada das micelas invertidas, minimiza
concentrao na interface diminui, no s devido a efeitos
as limitaes transferncia de massa. No entanto a pre-
de transferncia de massa, mas tambm devido a efeitos de
sena do tensioactivo pode provocar alguma inactivao
partio.
do enzima e causar problemas na estapa de recuperao
do produto. Quando o biocatalisador se encontra imobilizado, alm das
duas fases lquidas aquosa/orgnica temos de considerar
Alternativamente, os enzimas podem ser solubilizados
uma terceira fase, uma fase slida, que corresponde a um
em solventes orgnicos por modicao covalente com
enzima ou clulas imobilizadas. Na Figura 3 b), apresenta-
polietileno glicol (Figura 2 f).
se o perl de concentrao terico para o substrato num
sistema de duas fases lquidas orgnico-aquosas, com o
biocatalisador insolvel na fase aquosa, considerando o
3.2.4 Biocatalisadores ressuspensos em biocatalisador imobilizado num suporte hidrfobo poroso
solventes orgnicos (sistemas representados na Figura 2 c, d).

A reduo at valores praticamente vestigirios do teor de Deste modo, alm dos efeitos de transferncia de massa e
gua presente no meio de biotransformao pode revelar- efeitos de partio na interface lquido-lquido, temos tam-
se til em alguns sistemas biocatalticos. A seleco do bm de considerar os efeitos de partio e de transferncia
solvente um aspecto particularmente crtico neste tipo de de massa relativamente ao biocatalisador imobilizado.
sistemas, na medida em que se estabelece uma competio Neste caso, so importantes as caractersticas do suporte
entre este e o enzima para as molculas de gua. A utiliza- (suporte hidrlo ou hidrfobo) e o facto de o suporte ser
o de solventes hidrlos pode levar remoo da camada ou no poroso. O facto de o suporte ser hidrfobo, permitiu
de hidratao da molcula do enzima, resultando na sua aumentar a concentrao de substrato junto ao enzima.
alterao estrutural e consequente perda de actividade Se o volume de fase aquosa reduzido relativamente ao
cataltica. volume da fase orgnica do biocatalisador insolvel, deixa-
A utilizao destes meios quase anidros em bioconverses mos de ter uma fase aquosa discreta, entre a fase orgnica
implica o uso de enzimas imobilizados num suporte slido e o biocatalisador. Esta situao corresponde ao terceiro
(Figura 2 g) ou na forma de p (liolizados ou em cristais) perl (Figura 3 c)), e engloba os sistemas de biocatalisa-
(Figura 2 h). dores ressuspensos em solventes orgnicos (Figura 2 g, h).
Neste caso a transferncia de massa entre a fase orgnica e
Nos critrios de seleco do suporte de imobilizao, deve a fase aquosa no-discreta vai depender da rea especca
ser tomada em conta a sua anidade para a gua, na medida das partculas de biocatalisador, e no da rea interfacial
em que a gua presente no meio se particionar entre a entre as fases lquidas.
matriz de imobilizao, o enzima e o meio reaccional,
afectando o micro-ambiente deste. Os sistemas de biocatalisadores solubilizados em solventes
orgnicos, micelas invertidas e modicao qumica com

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Figura 3 - Pers de concentrao tericos do subs-


trato para os vrios sistemas biocatalticos

PEG, so casos particulares dos sistemas


bifsicos, em que macroscopicamente se
v uma nica fase, correspondendo ao
primeiro perl (Figura 3 a)).

3.2 Efeito da gua na


actividade e estabilidade do
biocatalisador
Mesmo num meio no-convencional
constitudo essencialmente por uma fase
orgnica, a quantidade de gua no sistema
inuencia fortemente a actividade cataltica
do enzima. Para baixos teores de gua, a
actividade enzimtica geralmente baixa.
Normalmente, a actividade enzimtica
aumenta com o aumento da camada de
hidratao do enzima, o que devido
aco lubricante da gua que aumenta a
exibilidade interna do enzima A curva tpica de variao protena conduzindo inactivao dos enzimas.
da actividade especca do enzima em funo da actividade
Em micelas invertidas consegue-se uma estabilidade elevada
da gua, normalmente, apresenta um mximo. A diminuio
atravs do controlo da actividade da gua. Para biocatali-
de actividade pode ser devida a limitaes transferncia de
sadores resuspensos em solventes orgnicos, obtm-se em
massa devido ao transporte do substrato atravs de uma fase
geral estabilidades elevadas, uma vez que a quantidade de
aquosa, ou agregao das partculas de catalisador.
gua muito pequena (valores de actividade de gua >1)
A estabilidade enzimtica, normalmente diminui com o e os enzimas adquirem uma maior rigidez conformacional
aumento da quantidade de gua. A gua participa numa (num estado desidratado, sem gua). Alm disso no ocorre
variedade de mecanismos que causam a desnaturao da protelise, outra causa comum de desnaturao em gua.

Figura 4 - Engenharia do Biocatalisador

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Por m, a gua actua como um substrato nas reaces de Engenharia Metablica que iclui a anlise dos uxos meta-
hidrlise e deste modo este tipo de reaces so favorecidas blicos; a Engenharia de Protenas atravs diversas tcnicas
com o aumento da quantidade de gua, e inversamente o de recombinao gentica (nomeadamente, error-prone PCR
rendimento das reaces de sntese menor. e DNA suing) combinadas com a metodologia da evoluo
dirigida, permitem a criao de bibliotecas de mutantes e,
aps a aplicao de mtodos de seleco e triagem, isolar
3.3 Engenharia do Biocatalisador o melhor mutante (com a caracterstica melhorada neces-
sria); a Engenharia de Processos, que permite optimizao
O desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinado e integrao das operaes de fermentao e recuperao do
criou vias para a obteno de novos biocatalisadores, biocatalisador.
baseados na engenharia de protenas, e que podem ser
Deste modo, e com todas estas ferramentas os cientistas
utilizados em solventes orgnicos. Esta metodologia consiste
so hoje em dia capazes de fazer o design do biocatalisador
na modicao de protenas existentes ou na sntese de novo
ideal.
de protenas, apresentando um conjunto de propriedades
pr-denidas. O design racional de protenas, levado a cabo Alguns exemplos de vrias tecnologias que so usadas para
por mutagnese dirigida, requer a identicao da relao melhorar uma ou mais caractersticas do biocatalisador,
estrutura-funo na molcula. O nmero reduzido de alm das tcnicas de recombinao gentica e evoluo
enzimas cuja estrutura tridimensional est perfeitamente dirigida so apresentados na Tabela.3.
resolvida limita consideravelmente a aplicao desta meto-
dologia. Actualmente, as metodologias mais utilizadas, para
a pesquisa de novos biocatalisadores, so a evoluo dirigida 3.4. Reactores multifsicos
por mutagnese aleatria e/ou a recombinao de um ou
mais genes homlogos (DNA shuing) A seleco do reactor mais apropriado para um dado bio-
processo, depende das caractersticas da bioconverso e de
O desenvolvimento do biocatalisador ideal para uma
constrangimentos reaccionais, cinticos e do biocatalisador,
dada bioconverso (identicada a caracterstica que se quer
que vo determinar o modo de operao e as caractersticas
modicar) resulta de uma aproximao multidisciplinar e
do uxo (Figura.5).
integrada de conhecimentos e tecnologias desenvolvidas nas
reas da biologia, qumica e engenharia (Figura 4). As dis- As caractersticas da bioconverso incluem, as propriedades
ciplinas envolvidas incluem a Bioinformtica (que compila dos substratos/produtos (pontos de fuso e ebulio,
toda a informao relativamente aos dados protena-funo solubilidade em gua, estabilidade ao pH e temperatura); as
e genoma-protena), a Qumica de Protenas que atravs caractersticas reaccionais (nomeadamente, pH, temperatu-
de vrias tcnicas nos d informaes acerca das relaes ra, controlo da actividade da gua) e ; as caractersticas do
estrutura-funo e estrutura actividade de protenas; a biocatalisador, que incluem a utilizao de enzimas (desin-

Tabela 3: Tecnologias disponveis para melhorar as caractersticas do biocatalisador

Objectivo Tecnologia Exemplo


Solubilizao do enzima Solubilizao de subtilisina em micelas invertidasde AOT
Aumento da actividade Modicao da catalase com um tensioactivo (Brij 35)
Modicao qumica Aplicao de hidrolases e lipases recobertas com lpidos em meio
orgnico

Alterao da enantioselectividade Melhoramento da enantioselectividade de lipases

Alterao da actividade de isomerases, hidrolases e -galactosi-


Alterao da funcionalidade Evoluo dirigida dase

Recombinao de genes obtendo-se um enzima recombinante


Converso de substratos no naturais
capaz de degradar benzeno e tolueno

Evoluo dirigida Esterase termoestvel sem perda de actividade, subtlisina E

Aumento da estabilidade Ligao multicovalente/imobilizao Hiperestabilizao de uma esterase termla

Modicao qumica
Reticulao e modicao qumica de subtilisina cristalizada
(Formao CLEC)

Aumento da actividade da subtilisina em meio aquoso/orgnico


Evoluo dirigida
(40% DMF)
Modicao do meio reaccional
Enzima liolizada na presena de NaCl O sal induz a activao do enzima em hexano anidro

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Figura 5 - Seleco de reactores multifsicos

tegrao celular) ou clulas (necessidade de cofactores), elevada, de modo a permitir uma transferncia adequada de
livres ou imobilizadas, a localizao da actividade enzimtica substratos/produtos atravs da interface e um controlo ecaz
(normalmente na fase aquosa, excepto para as lipases que so da rea interfacial.
activadas por interfaces), e por m os requisitos em gua por
Dentro dos reactores usados em sistemas multifsicos desta-
parte do biocatalisador para manuteno da sua actividade
cam-se, os reactores agitados mecanicamente (descontnuos
cataltica tambm importante considerar as interaces
ou contnuos), os reactores de membranas, os reactores de
entre o biocatalisador e os substratos e produtos
leito xo e os reactores agitados por uma fase lquida.
Os constrangimentos a considerar na seleco e operao
do reactor so constrangimentos reaccionais, cinticos e do
biocatalisador. 3.4.1 Reactor descontnuo perfeitamente
Os constrangimentos reaccionais, incluem o tipo de agitado
sistema biocataltico; a razo de fases aquosa-orgnica
que condiciona a produtividade volumtrica no reactor e Este tipo de reactores so geralmente usados em, processos
a rea interfacial disponvel para a transferncia de massa em que intervm biocatalisadores solveis (Figura 6).
de substratos/produtos; a transferncia de massa atravs da Os reactores agitados mecanicamente permitem um
interfase lquido-lquido, slido-lquido, gs-lquido, e den- controlo adequado da rea interfacial atravs da velocidade
tro da mesma fase; e efeitos de partio substratos/produtos. de agitao (e da razo volumtrica das fases), de forma a
Os constrangimentos cinticos comprendem a inibio pelo obterem-se velocidades de transferncia de massa elevadas.
substratos e/ou produtos. No entanto, reas interfaciais elevadas podem levar forma-
Os constrangimentos do biocatalisador, incluem a concen- o de emulses estveis, dicultando o passo seguinte de
trao mxima de biocatalisador permitida no reactor, a separao do produto. A maior parte dos exemplos referidos
desnaturao por agitao mecnica (no caso de reactores na literatura so com este tipo de reactores.
mecanicamente agitados) e a baixa estabilidade do bioca-
talisador, devido a efeitos de temperatura, pH, presena de
compostos txicos, necessidades de co-factores, nutrientes, 3.4.2 Reactor contnuo perfeitamente
co-substratos, e a toxicidade do solvente orgnico. agitado
Os requisitos essenciais para seleco do reactor mais apro- Este tipo de reactores so geralmente usados em processos
priado para uma dada bioconverso so, uma rea interfacial em que intervm biocatalisadores imobilizados, de modo

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a reter o biocatalisador no interior do reactor


(Figura 7).
A imobilizao do biocatalisador pode reduzir
a formao de emulses estveis, facilitando a
separao posterior das fases. A presena de uma
terceira fase slida (biocatalisador imobilizado
num suporte, geralmente um suporte poroso)
implica que alm da transferncia de massa
atravs das fases e da interface aquosa/orgnica,
temos de considerar a difuso do substrato no
interior do suporte. A agitao mecnica pode
tambm, provocar destruio das partculas de
suporte.
Figura 6 - Reactor descontnuo perfeitamente agitado (BSTR).
Estes reactores so pouco usados para biocon-
verses em sistemas multifsicos devido sua
baixa ecincia. agitao mecnica. No entanto, a sua aplicao limitada
pelo tipo de substrato (viscoso, coloidal, partculas slidas
em suspenso) e a forma do biocatalisador imobilizado.
usado para reaces de sntese de steres, mono, di e triglic-
3.4.3 Reactores de membrana (CSTR com
ridos por lipases de Rhizomucor miehei, e resoluo ptica
recirculao) de fenilalanina por -quimotripsina.
Este tipo de congurao em que acoplada uma membrana
de ultraltrao ao reactor contnuo com agitao (CSTR)
permite a utilizao de sistemas em que microscopicamente 3.4.5 Reactores agitados por uma fase
temos duas fases lquidas, nas quais o biocatalisador pode lquida
estar solvel (micelas invertidas) ou insolvel (clulas,
enzima liolizado ou em cristais) (Figura 8). A membrana Este tipo de reactores tem como base os princpios do reac-
permite a reteno do biocatalisador dentro do reactor, uma tor agitado por uma fase gasosa (air-lift), em que em vez
vez que no permevel ao biocatalisador, podendo tambm de uma fase gasosa, uma fase lquida dispersa que induz
apresentar alguma selectividade relativamente aos substratos a circulao de uma fase lquida contnua (Figura 10).
e produtos, permitindo por exemplo a recuperao selectiva Quando a fase do solvente menos densa que a gua, esta
do produto no permeado. adicionada atravs dum difusor na parte de baixo do
reactor. Este tipo de reactor mais adequado para sistemas
constitudos por duas fases lquidas macroscopicamente
distintas, nas quais o biocatalisador pode estar dissolvido
3.4.4 Reactores de leito xo
na fase aquosa ou imobilizado.
Os reactores de leito xo so mais adequados para sistemas Neste tipo de reactores combinam-se a mistura das fases
correspondentes ao ltimo perl de concentrao (Figura 3 atravs do controlo das condies do uxo e baixas tenses
c)), que corresponde aos sistemas de biocatalisadores ressus- de corte (decorrentes da agitao mecnica), com as solu-
pensos em solventes orgnicos (Figura 9). So cineticamente bilidades elevadas para substratos/produtos hidrfobos,
mais favorveis que os reactores contnuos com agitao, e obtendo-se velocidades de reaco elevadas e sendo facili-
no tm a desvantagem das elevadas tenses de corte devido tados a recuperao do produto por extraco. A diferena
de densidades entre as duas fases lquidas
pequena, o que diculta a concepo da
zona de decantao no topo do reactor. Este
problema agravado na presena de agentes
emulsicantes (presentes na soluo inicial
ou segregados pelas clulas). Usado a nvel
laboratorial para a produo de L-triptofano.

3.4.6 Reactores de membrana


Este tipo de reactores permite numa nica
operao em contnuo, a integrao da
bioconverso com a separao/concentrao
Figura 7 - Reactor contnuo perfeitamente agitado (CSTR)
do produto e recuperao do biocatalisador

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Biocatlise

Figura 8 - Reactor de
membrana (CSTR com
recirculao)

(Figura 11). A mem-


brana vai funcionar
como interface entre
as duas fases lquidas
imiscveis (evitando o
seu contacto) e como
suporte para a imobi-
lizao do biocatalisa-
dor (aumento da rea
interfacial de contacto
enzima/substrato).
Neste tipo de reactores
as fases aquosa e orgnica so mantidas separadas pela
membrana, o que evita o problema de formao de
emulses, e inactivao do enzima devido ao contacto
com o solvente. As principais desvantagens destes
reactores so: a nvel do biocatalisador de diminuio
da actividade cataltica por perdas do enzima da mem-
brana, e diminuio da ecincia de transferncia de
massa devido diminuio de uxo de permeado. Os
dois fenmenos responsveis por esta diminuio, so
a concentrao de polarizao e o fouling da membra-
na, que levam aos baixos coecientes de transferncia
de massa e ao entupimento da membrana.
Este tipo de reacrores usado para a biotransformao
de lpidos (gorduras, leos, triglicridos, cidos gordos
e steres). A maior parte dos exemplos incluem a
hidrlise de lpidos e gorduras para a produo de ci-
dos gordos, mono e di-glicridos e glicerol, ou a sntese
de steres incluindo reaces de tranestericao.
Figura 9 - Reactor de leito xo (PFR)

3.5 Exemplos de
processos industriais
As aplicaes de sistemas
biocatalticos na presena de
solventes orgnicos abrangem
uma vasta gama de processos,
nomeadamente a sntese de
pptidos utilizando quimotrip-
sina, termolisina ou pepsina;
reaces de estericao, inter-
estericao, trans-estericao
utilizando lipases; sntese de
compostos enantiomricos
puros utilizando lipases ou
leveduras, desidrogenao de
esterides utilizando desidro-
genases ou clulas inteiras de
Arthrobacter simplex.
Na Tabela 4 apresentam-se
Figura 10 - Reactor agitado por uma fase lquida.

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alguns exemplos de processos industriais.

3.6 Perspectivas futuras


As aplicases de meios no-convencionais constituudos
por solventes orgnicos, so adequadas para bioconverses
envolvendo:
- substratos/produtos pouco solveis em gua, que so
inibitrios ou txicos para o biocatalisador
- Quando existem diferenas de solubilidade entre os
substratos e/ou produtos
- Substratos e/ou produtos que so slidos e inibitrios
ou txicos, e por isso difceis de alimentar de uma
forma adequada ao reactor
- Deslocamento do equilbrio qumico no sentido de
favorecer reaces de sntese atravs do controlo da Figura 11 - Reactor de membrana.
actividade da gua
A principal limitao das bioconverses em sistemas mul- Em termos de reactores multifsicos, importante o
tifsicos, em que uma das fases um solvente orgnico, a desenvolvimento de reactores mais adequados, nomeada-
toxicidade do solvente orgnico, devido ao solvente orgnico mente reactores agitados por uma fase lquida e reactores de
dissolvido na fase aquosa e presena da interface lquido- membrana, que permitem simultaneamente a solubilizao
lquido. de substratos e produtos hidrfobos, obtendo-se velocidades
de reaco elevadas e a separao do produto, integrando a
Os desenvolvimentos mais recentes em termos das biocon- etapa de bioconverso com a etapa de isolamento e recupe-
verses em sistemas multifsicos, envolvem o design de bio- rao do produto.
catalisadores mais adequados a solventes orgnicos, o design
de novos solventes, e a seleco do bioreactor multifsico e
do processo de recuperao do produto mais adequados de 3.7 Bibliograa
modo a uma integrao das duas etapas do bioprocesso. Cabral, J.M.S., Mota, M. e Tramper, J., Multiphase Bioreactor
Design, Taylor and Francis Books, London, 2001.
Atravs da engenharia do biocatalisador, usando de tcnicas
de engenharia gentica, possvel o desenvolvimento de Fernandes, P., Aires-Barros, M.R. e Cabral, J.M.S., Biocatlise
clulas mais tolerantes a solventes orgnico e a reduo de Aplicada em Biotecnologia: Fundamentos e Aplicaes
(N-Lima e M.Mota, eds.), LIDEL-Edies Tcnicas LDA, Cap.
excreco ou lise de material e/ou permeabilizao celular.
10, 2001 (em impresso).
A metodologia da evoluo dirigida permite a obteno de
enzimas mais tolerantes a solventes orgnicos, e de enzimas Petrounia, I.P., Arnold, F.H., Designed Evolution of Enzymatic
Properties, Curr. Op. Biotechnol., 11, 325-330.
com actividades elevadas para substratos no-naturais.
Schmid, A, Dordick, J.S. et al., Industrial Biocatalysis Today
A seleco de novos solventes, nomeadamente lquidos and Tomorrow, Nature 409, 258-268 (2000).
inicos (hexauorofosfato de 1-butil-3-metil imidazole),
Straathof, A.J.J. e Adlercreutz, P., Applied Biocatalysis,
pode ser uma alternativa aos solventes orgnicos, devido a Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 2000.
constrangimentos ambientais.

Tabela 4: Exemplos de processos industriais

Reaco Biocatalisador Solvente Companhia


Epoxidao 1-octeno Noccardia corallina n-hexadecano Nippon Mining
Subtilisina (imobilizada) Bayer Sumitomo, Chemie Linz AG; BASF; Sche-
Hidrlise de steres Vrios
Lipase ring Plough
Desidrogenao de esterides Arthrobacter simplex Tolueno Upjonh

Dessulfurizao Rhodococcus sp. leo (substrato) Energy Biosystems

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