Departamento de Bioqumica

Instituto de Qumica - USP

CADERNO DE LABORATRIO

PROTOCOLOS E RESULTADOS

BIOQUMICA EXPERIMENTAL

QBQ 0316-Diurno
2017

Professores
Ohara Augusto
Maria Tersa Machini
Graziella Ronsein

Os protocolos que constam desta disciplina foram originalmente

desenvolvidos por:
Bayardo B. Torres
Iolanda M. Cuccovia
Maria Tersa Machini Miranda
Pedro Soares de Arajo
Remo Trigoni Jr.
Sandro R. Marana
Prtica 1
Curva Padro de Albumina e Curva Padro de Para-nitrofenolato

Objetivos
Fazer curvas padro e explorar suas aplicaes para determinar a concentrao de amostras
desconhecidas.

Reagentes Materiais Aparelhagens

gua destilada papel de filtro leitora de placas
placas para
albumina 0,2 g/L espectrofotmetro
leitura
p-nitrofenol (4-nitrofenol) 2 mM
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0 vrtice
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM pH 11,0
reagente de Bradford pipetas
cido fosfrico 85%
Coomassie Blue G ponteiras
Metanol
suportes para
tubos de
ensaio

Procedimento A- Curva padro para dosagem de protenas

O padro uma soluo de albumina bovina de concentrao conhecida (0,2 g/L) e o reagente que
revela a quantidade protena o reagente de Bradford.

Antes de qualquer coisa aprenda a escolher o pipetador adequado e aprenda a us-lo!

Note como variar os volumes, como aspirar a amostra e como dispend-la. O uso correto
do pipetador ser essencial para obter resultados confiveis!

1. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e gua estipulados na Tabela 1.

2. Adicionar o reagente de Bradford.
3. Homogeneizar em vrtice.
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente
5. Ler as absorbncias das amostras a 595 nm no espectrofotmetro ou na leitora de placas (na
leitora de placas fazer 3 leituras, tirar a mdia e completar a Tabela 2).
A. No espectrofotmetro: Transferir a amostra para cubetas apropriadas. Usar o branco para
calibrar (zerar) o espectrofotmetro e realizar a medidas de absorbncia das amostras.

B. Na leitora de placas: Pipetar com preciso 200 l do branco e das amostras nos pocinhos da
placa em triplicata como mostrado na Figura 1. Anotar a absorbncia do branco e descontar
da absorbncia observada nas amostras.

Tabela 1
albumina gua reagente de
tubos
0,2 g/L (L) (L) Bradford (mL)
branco 0 100 1,0
1 10 90 1,0
2 20 80 1,0
3 30 70 1,0
4 40 60 1,0
5 50 50 1,0
6 60 40 1,0
7 70 30 1,0
8 80 20 1,0

2
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A bco bco bco tubo1 tubo1 tubo1 tubo2 tubo2 tubo2 tubo3 tubo3 tubo3
B tubo4 tubo4 tubo4 tubo5 tubo5 tubo5 tubo6 tubo6 tubo6 tubo7 tubo7 tubo7
C tubo8 tubo8 tubo8
D
E
F
G
H
Figura 1 Distribuio de amostras da prtica 2, procedimento A na placa de 96-poos.

Tabela 2
tubos massa de A 595 A 595 A 595 A 595 A 595
protena* (g) 1 2 3 mdia -Bco
branco
1
2
3
4
5
6
7
8
* Calcular a quantidade de protena presente em cada tubo baseado
nos volumes de albumina adicionados na Tabela 1.
** Realizar a leitura da absorbncia em triplicata e calcular a mdia.

Procedimento B- Curva padro para dosagem do produto da reao catalisada pela -

glicosidase
O padro uma soluo de para-nitrofenol de concentrao conhecida (2 mM). Em pH alcalino
(tampo bicarbonato, pH = 11), o para-nitrofenol perde um proton e passa a p-nitrofenolato que
absorve luz a 420 nm.
estabilizao por

1. Adicionar em cada tubo os volumes de para-nitrofenol e gua estipulados na Tabela 3.

2. Adicionar o tampo bicarbonato, pH 11,0
3. Homogeneizar em vrtice.
4. Ler as absorbncias das amostras a 420 nm no espectrofotmetro ou na leitora de placas (na
leitora de placas fazer 3 leituras, tirar a mdia e completar a Tabela 4).
5. No espectrofotmetro: Transferir a amostra para cubetas apropriadas. Usar o branco para
calibrar (zerar) o espectrofotmetro e realizar a medidas de absorbncia das amostras.
6. Na leitora de placas: Pipetar com preciso 200 l do branco e das amostras nos pocinhos da
placa em triplicata como mostrado na Figura 2. Anotar a absorbncia do branco e descontar
da absorbncia observada nas amostras.

3
 Tabela 3
tubos p-nitrofenol H 2O Tampo
1 mM (l) Bicarbonato
(l) (ml)
Bco 0 200 2
1 5 195 2
2 10 190 2
3 20 180 2
4 30 170 2
5 50 150 2
6 75 125 2
7 100 100 2
8 125 75 2
9 150 50 2
10 175 25 2
11 200 0 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A bco bco bco tubo1 tubo1 tubo1 tubo2 tubo2 tubo2 tubo3 tubo3 tubo3
B tubo4 tubo4 tubo4 tubo5 tubo5 tubo5 tubo6 tubo6 tubo6 tubo7 tubo7 tubo7
C tubo8 tubo8 tubo8 tubo9 tubo9 tubo9 tub10 tub10 tub10 tub11 tub11 tub11
D
E
F
G
H
Figura 2 Distribuio de amostras da prtica 2, procedimento A na placa de 96-poos.

Tabela 4
tubos Moles de p- A 420 A 420 A 420 A 420 A 420
nitrofenolato 1 2 3 mdia -Bco
(nmoles)
branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

4
 Relatrio 1
1. Construir a curva-padro que relaciona a quantidade de protena (albumina) em micrograma
(g/tubo) com a Absorbncia a 595 nm aps reao com o reagente de Bradford. Para contruir a
curva, complete a Tabela 1.
Tabela 1
massa de protena
tubos Abs 595
(g)
1
2
3
4
5
6
7
8

Equao de reta: y = ax + b
coeficiente angular = a
Intercepto no eixo y = b

2. Construir a curva-padro que relaciona a quantidade de p-nitrofenolato (nmoles/tubo) com a

Absorbncia a 420 nm. Para contruir a curva, complete a Tabela 2.

Tabela 2
nmoles de para-
tubos nitrofenolato Abs420
(nmoles)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Equao de reta: y = ax + b
coeficiente angular = a
Intercepto no eixo y = b

Obs. As equaes dessas retas sero utilizadas na maioria dos experimentos do curso.

5
Prtica 2
Lise de Clulas de Levedura e Dosagem das Protenas
Objetivos
Romper as clulas de Saccharomyces cerevisiae.

Reagentes Materiais Aparelhagens

-gua destilada -banho de gelo -centrfuga
-clulas de levedura (fase log tardia) -prolas de vidro 0,5 mm -estufa
-etanol -pipetadores -freezer
-Pipetas -vrtice
-fluoreto de -fenilmetilsulfonila
-leitora de
(PMSF) 100 mM em etanol -Provetas
placas
-suporte para tubos Espectrofmetro
-hipoclorito de sdio 20 g/L
(gua sanitria) -tubos plsticos para
centrfuga (tipo Falcon)
-tampo fosfato 100 mM pH 7,0 com -tubos de ensaio
EDTA 5 mM (tampo de lise)
-lisado de levedura -pacas de leitura
reagente de Bradford

Procedimento A Fracionamento celular

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO
1. Em um tubo de centrfuga com tampa colocar aproximadamente 1 g (peso mido) de clulas de
leveduras crescidas at a fase logartmica tardia.
2. Adicionar 4 mL de tampo de lise.
3. Ressuspender as clulas usando um vrtice.
4. Adicionar 40 L de PMSF (100 mM) em etanol.
5. Homogeneizar em vrtice.
6. Adicionar suspenso 8 mL de prolas de vidro lavadas e secas.
7. Agitar ininterruptamente em vrtice durante 1 min (processo de lise).
8. Resfriar em banho de gelo por 1 min
9. Repetir as etapas 7 e 8 por mais 4 vezes.
10. Centrifugar a suspenso de clulas + prolas de vidro a 850xg por 2 min.
11. Remover cuidadosamente o sobrenadante evitar coletar o material precipitado passando-
o para um tubo Falcon limpo e identificado como LISADO.
12. Manter o tubo LISADO em banho de gelo.
13. Ressuspender o precipitado + prolas de vidro em 4 mL de tampo de lise.
14. Adicionar 40 L de PMSF (100mM) em etanol.
15. Homogeneizar em vrtice.
16. Repetir as etapas 7 a 15 duas vezes reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo LISADO.
17. Centrifugar o LISADO coletado a 17.000xg por 10 min.
18. Transferir o sobrenadante do LISADO clarificado para um tubo falcon.
19. Determinar o volume aproximado do LISADO clarificado observando a graduao do tubo
falcon.
20. Homogeneizar bem o lisado e dividir em 3 alquotas de igual volume e transferi-las para tubos
plsticos tipo Falcon.
21. Identificar claramente os tubos com o nmero do grupo.
22.Executar o procedimento B.
23. Deixar os tubos Falcon devidamente marcados com o nmero do grupo no gelo para que, ao
final da aula, a tcnica os recolha e armazene em freezer a 20oC.

6
 FLUXOGRAMA

1 g de Saccharomyces cerevisiae
(PESO MIDO)

4 mL de tampo de lise
40 L de PMSF

Suspenso

8 mL de prolas de vidro
Agitao em vrtice por 1 min
Resfriamento em gelo por 1 min
Repetir a agitao e resfriamento mais 4x

Centrifugao
850X g por 2 min

Precipitado Sobrenadante

4 mL de tampo de lise
40 L de PMSF

Agitao em vrtice por 1 min

Resfriamento em gelo por 1 min
Repetir a agitao e resfriamento mais 4x Tubo
LISADO

REPETIR Centrifugao
procedimento 850X g por 2 min

Precipitado Sobrenadante

Tubo LISADO Centrifuga a 17.000xg por 10min Sobrenadante

LISADO clarificado

7
Procedimento B Dosagem de protenas no lisado de Saccharomyces cerevisiae

OBSERVAO: para esse procedimento necessrio que o lisado seja diludo. Para isso segue o
procedimento para diluio.
Diluio 50X:
1. Transferir 0,1 mL do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L50X.
2. Adicionar 4,9 mL de gua destilada.
3. Homogeneizar em vrtice.

1. Adicionar em cada tubo os volumes de gua e amostras do lisado (devidamente diludo)

estipulados na Tabela 1.
2. Adicionar o reagente de Bradford.
3. Homogeneizar em vrtice.
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente.
5. Ler a absorbncia no espectrofotmetro ou na leitora de placas como mostrado na Figura 1.
6. Completar a Tabela 2.
7. Determinar a concentrao de protenas presente no lisado utilizando a curva padro construda
com a albumina

OBSERVAO: Caso a absorbncia das amostras experimentais esteja fora dos limites das
absorbncias obtidas na curva-padro, discuta com o professor ou monitor um novo valor de
diluio.

Tabela 1
L50X H 2O reagente de
tubos
(L) (L) Bradford (mL)
Branco1 - 100 1,0
Branco2 100 1000 -
A1 20 80 1,0
A2 30 70 1,0
A3 50 50 1,0
A4 100 - 1,0

Tabela 2
A 595 A 595 A 595 A 595
tubos
1 2 3 Mdia
Branco1
Branco2
A1
A2
A3
A4

A Bco1 Bco1 Bco1 Bco2 Bco2 Bco2 Tubo1 Tubo1 Tubo1 Tubo2 Tubo2 Tubo2
B Tubo3 Tubo3 Tubo3 Tubo4 Tubo4 Tubo4
C
D
E
F
G
H
Figura 2 Distribuio de amostras da prtica 2, procedimento B na placa de 96-poos.

Procedimento C Lavagem das prolas de vidro

(Executado por monitores ou tcnica)

1. Transferir as prolas de vidro para um erlenmeyer.

2. Adicionar hipoclorito de sdio no erlenmeyer. 8
3. Agitar algumas vezes durante 15 min.
4. Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sdio
5. Repetir a lavagem com hipoclorito de sdio.
6. Adicionar gua no erlenmeyer
7. Lavar as prolas.
8. Descartar cuidadosamente a gua.
9. Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes.
10. Adicionar etanol no erlenmeyer.
11. Colocar o erlenmeyer numa estufa.
12. Aguardar a secagem das prolas.

9
Prtica 3
Determinao da Atividade Enzimtica
Objetivo
Determinar a atividade da -glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae

Reagentes Materiais Aparelhagens

gua destilada banho de gelo banho a 30oC
lisado de leveduras cubetas para leitura espectrofotmetro
p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc) 4 mM Pipetadores leitora de placas
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0 Pipetas vrtice
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM Ponteiras
pH 11,0 suportes para tubos de ensaio
tubos de ensaio

H OH
H OH -
H O O
HO H O
HO
H OH
O
-glicosidase HO
HO OH
+
H OH
H H
H H
H2O NO2
NO2
pH 11

Procedimento A Diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluio da preparao do lisado de Saccharomyces

cerevisiae. *Descongelar e homogenizar bem o lisado antes de transferir o volume sugerido.

1. Transferir 0,2 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L10X.
2. Adicionar 1,8 mL de gua destilada gelada.
3. Homogenizar vigorosamente
4. Transferir 0,4 mL de L10X para um novo tubo identificado como L50X.
5. Adicionar 1,6 mL de gua destilada gelada.
6. Homogenizar vigorosamente
7. Transferir 0,2 mL de L50X para um novo tubo identificado como L400X.
8. Adicionar 1,6 mL de gua destilada gelada.
9. Homogenizar suavemente
10. Manter todos os tubos no gelo

Procedimento B - Determinao da atividade da -glicosidase

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluies do lisado que foram
preparadas. Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento
sempre pela adio do substrato (p-nitrofenil--glicosdeo= NPGlc). Somente quando todos os
tubos j tiverem recebido o substrato dever ser iniciada a adio das diferentes diluies de lisado
(sempre agite o lisado antes de pipetar)

1. Preparar os tubos em banho de gelo.

2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1 e 2.
3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diludo.
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30oC.
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1.
6. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 2 mL de tampo carbonato-
bicarbonato pH 11,0.
7. Agitar manualmente
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 10
9. Uma vez que todos os tubos tenham sido retirados, ler as absorbncias a 420 nm.
10. Realizar a leitura da absorbncia em espectrofotmetro ou leitora de placas.
 A. No espectrofotmetro: Transferir a amostra para cubetas apropriadas. Usar o branco para
calibrar (zerar) o espectrofotmetro e realizar a medidas de absorbncia das amostras.
B. Na leitora de placas: Pipetar com preciso 200 l do branco e das amostras nos pocinhos da
placa; fazer as leituras em triplicatas. Anotar a absorbncia do branco e descontar da
absorbncia observada nas amostras. Fazer as mdias das leituras.
11. Fazer as mdias das leituras de cada amostra e completar a Tabela 3.

Tabela 1

Tempo de
NPGlc 4 mM lisado diludo
Tubos incubao a 30C
(mL) (mL)
(min)
1 0,2 0,2 5
2 0,2 0,2 10
3 0,2 0,2 15
4 0,2 0,2 20
Branco de Enzima --- 0,2 20
Obs. Para o branco da enzima acrescentar 0,2 ml de gua no lugar do substrato

Tabela 2
Basta preparar este tubo apenas uma nica vez, mesmo quando se trabalha com
diferentes diluies do lisado

Tempo de A 420
NPGlc 4 mM H 2O
Tubo incubao a 30C
(mL) (mL)
(min)
Branco de Substrato 0,2 0,2 20

Tabela 3

L10x L50X L400x

tubos A 420 (mdia) A 420(mdia) A 420 (mdia)
1
2
3
4
Branco de Enzima
Branco de Substrato

11
Tratamento de Dados e Anlise dos Resultados
PRTICA 1 - FRACIONAMENTO CELULAR
PRTICA 2 - DOSAGEM DE PROTENA
PRTICA 3 - DETERMINAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA
(Relatrio 2)
INSTRUES:
1. Completar as tabelas com os resultados experimentais das prticas 2 e 3.
2. Calcular a concentrao de protenas (mg/mL) no lisado de Saccharomyces cerevisiae.
3. Construir o grfico do ensaio de atividade da -glicosidase (nmols de produto x tempo)
para cada diluio de lisado utilizada
4. Calcular a Concentrao de Atividade Enzimtica (U/mL) e a Atividade especfica
(U/mg) do lisado de Saccharomyces cerevisiae.

TABELA PARA O CLCULO DACONCENTRAO DE PROTENAS NO LISADO DO

SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Massa de
protena concentrao
Volume da Diluio
Tubos A 595 calculdada concentrao do lisado original
amostra prvia
utilizando a (sem diluio)
curva-padro
(mg) (mL) (mg/mL) (x) (mg/mL)
A1 0,02
A2 0,03
A3 0,05
A4 0,10

TABELA PARA O CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA

L10x L50X L400x
tubos Tempo A420 produto A420 produto A420 produto
(min) (nmol) (nmol) (nmol)

1 5
2 10
3 15
4 20

12
Prtica 4
Purificao de protenas precipitao com sulfato de
amnio
Objetivo
Purificar parcialmente a -glicosidase por salting out.

Reagentes Materiais Aparelhos

gua destilada banho de gelo banho a 30oC
lisado de levedura microplacas de 96 poos espectrofotmetro
8 mM p-nitrofenil--glicosdeo papel de filtro de microplacas
(NPGlc) em gua pipetadores centrfuga
reagente de Bradford (cido ponteiras vrtice
fosfrico 85%, Coomassie Blue G, suportes para tubos
metanol) tubos de centrfuga
sulfato de amnio saturado grandes
(em tampo Pi 10 mM, pH 7,0) tubo de ensaio
tampo carbonato-bicarbonato
250 mM (pH 11,0)

Procedimento A Precipitao com sulfato de amnio

ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
IMPORTANTE: ADICIONE A SOLUO DE SULFATO DE AMNIO LENTA E GRADUALMENTE,
SEMPRE SOB AGITAO NO NVEL MNIMO DO VRTEX.
1. Adicionar 5 ml de lisado de levedura em um tubo de centrfuga.
2. Centrifugar por 3 min a 7000g a 4C para remover precipitao eventual resultante de
congelamento.
3. Transferir o sobrenadante (lisado clarificado) para outro tubo de centrfuga Falcon,
desprezando o precipitado.
4. Retirar 200 l do sobrenadante clarificado e RESERVAR NO GELO PARA ANLISE POSTERIOR.
5. Adicionar ao lisado clarificado 500 l de soluo de sulfato de amnio LENTAMENTE E MANTENDO O
TUBO SOB AGITAO CONSTANTE
6. Repetir o passo anterior mais 3 vezes.
No total devem ser adicionados ao tubo 2 ml (4 X 500 l) de soluo de sulfato de amnio
7. Manter a soluo em temperatura ambiente durante 15 min
8. Centrifugar a 7000 g por 10 min a 4C
9. Remover 200 L do sobrenadante (S1) para um tubo de 2,0 ml identificado como S1. RESERVAR
NO GELO PARA ANLISE POSTERIOR.
10. Transferir o restante da frao de S1 para um tubo Falcon limpo identificado como S1,
tomando cuidado para no ressuspender o precipitado
11. Ressuspender o material precipitado em 1,2 ml de tampo fosfato e identificar o tubo como P1
(Precipitado 1)
12. Ao material do tubo S1, adicionar lentamente 1,2 mL de soluo de sulfato de amnio,
mantendo os tubos sob agitao constante.
13. Repetir o passo anterior mais 3 vezes
No total devem ser adicionados ao tubo 4,80 ml de soluo de sulfato de amnio
14. Manter o tubo em temperatura ambiente por 15 min
15. Centrifugar a 7000 g por 10 min a 4C
1. Transferir o sobrenadantes para um tubo Falcon limpo e identificado como S2 (Sobrenadante
2); RESERVAR NO GELO PARA ANLISE POSTERIOR.
16. Ressuspender o precipitado em 1,0 ml de tampo e transferi-lo para um tubo novo e
identificado como P2 (Precipitado 2); RESERVAR NO GELO PARA ANLISE POSTERIOR.

13
Fluxograma

14
Procedimento B Diluio das amostras para anlise
(procedimentos C e D)
As diluies abaixo so sugeridas mas podem variar de acordo com o lisado que voc obteve. Tenha
em mo os resultados das prticas 1 e 2 para confirmar (com o professor ou monitores) se sero
adequadas ao lisado do grupo.

Lisado 50x (p/ dosagem de protena)

1. Transferir 20 l do lisado clarificado para um tubo eppendorf identificado como L 50X
2. Adicionar 980 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

Lisado 400X (p/ dosagem da atividade enzimtica)

1. Transferir 5 l do lisado clarificado para um tubo eppendorf identificado como L 400X
2. Adicionar 1950 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

Frao S1 (20x) (p/ dosagem de protena)

1. Transferir 70 l de S1 para um tubo eppendorf identificado como S1 20X
2. Adicionar 1330 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

Frao S1 (200x) (p/ dosagem da atividade enzimtica)

1. Transferir 10 l de S1 para um tubo eppendorf identificado como S1 200X
2. Adicionar 1990 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

Frao S2 (2x) (p/ dosagem de protena)

1. Transferir 100 l de S2 para um tubo eppendorf identificado como S2 10X
2. Adicionar 900 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice
Frao S2 (10x) (p/ dosagem da atividade enzimtica)
1. Transferir 10 l de S2 para um tubo eppendorf identificado como S2 10X
2. Adicionar 990 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

Frao P2 (40x) (p/ dosagem de protena)

4. Transferir 35 l do P2 para um tubo eppendorf identificado como P2 40X
5. Adicionar 1365 l de gua destilada
6. Homogeneizar em vrtice

Frao P2 (800x) (p/ dosagem da atividade enzimtica)

1. Transferir 50 l do P2 40x para um tubo eppendorf identificado como P2 800X
2. Adicionar 950 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

15
 Procedimento C Dosagem de protena no lisado e nas fraes
1. Adicionar em cada tubo os volumes de gua e amostras (devidamente diludas) estipulados na
Tabela 1
2. Adicionar o reagente de Bradford.
3. Homogeneizar em vrtice
4. Aps 5 min (pelo menos) colocar 200 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96
poos, seguindo a Figura 2
5. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 595 nm no leitor de microplacas
6. Completar a Tabela 1

OBSERVAO: Caso a absorbncia das amostras experimentais esteja fora dos limites das
absorbncias obtidas na curva-padro, discuta com o professor ou monitor um novo valor de
diluio.

Tabela 1
tubos Lisado S1 S2 P2 gua Reagente de
(50x) (20x) (2x) (40x) (l) Bradford
(ml)
Bco 100 1,0
1 30 70 1,0
2 60 40 1,0
3 30 70 1,0
4 60 40 1,0
5 30 70 1,0
6 60 40 1,0
7 30 70 1,0
8 60 40 1,0

Tabela 2
Tubos Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3 Mdia Subtraindo
(A 595 ) (A 595 ) (A 595 ) o Bco
Bco
1
2
3
4
5
6
7
8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
B Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8
C
D
E
F
G
H
Figura 1 Distribuio de amostras da prtica 8 na placa de 96-poos

16
Procedimento D Determinao das atividades enzimticas no
lisado e nas fraes
ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc e tampo estipulados na Tabela 3
2. Adicionar em cada tubo as amostras devidamente diludas
3. Transferir simultaneamente todos os tubos para o banho a 30oC
4. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 3 (note que necessrio
fazer trs conjuntos de 4 tubos diferentes, um para cada diluio de lisado), todas reaes
podem ser feitas simultaneamente
5. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 800 l de tampo
carbonato-bicarbonato pH 11,0
6. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
7. Colocar 200 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos.
8. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas
9. Completar as Tabelas 4 a 7

OBSERVAO. As diluies anotadas so as sugeridas mas podem ter sido outras para o seu lisado

Tabela 3
Tubos 8 mM tampo Amostras (L 400x tempo de
NPGlc fosfato pH ou S1 200X ou S2 8X incubao
(ml) 7,0 (ml) ou P2 800X ) a
(ml) 30 oC (min)
1 0,1 0,1 0,2 5
2 0,1 0,1 0,2 10
3 0,1 0,1 0,2 15
4 0,1 0,1 0,2 20
Branco 0,1 0,1 - 20

Tabela 4 Tabela 5
L 400xl S1 200x

Tubo rplica rplica rplica Tubos rplica rplica rplica

s 1 2 3 1 2 3
(A 420 ) (A 420 ) (A 420 ) (A 420 ) (A 420 ) (A 420 )
1 1
2 2
3 3
4 4
Bco Bco

Tabela 6 Tabela 7
S2 8x P2 800x
Tubo rplica rplica rplica Tubos rplica rplica rplica
s 1 2 3 1 2 3
(A 420 ) (A 420 ) (A 420 ) (A 420 ) (A 420 ) (A 420 )
1 1
2 2
3 3
4 4
Bco Bco

17
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B Bco
C L 400x tubo 1 L 400x tubo 2 L 400x tubo 3 L 400x tubo 4
D S1 200x tubo 1 S1 200x tubo 2 S1 200x tubo 3 S1 200x tubo 4
E S2 8x tubo 1 S2 8x tubo 2 S2 8x tubo 3 S2 8x tubo 4
F P2 800x tubo 1 P2 800x tubo 2 P2 800x tubo 3 P2 800x tubo 4
G
H
Figura 2 Distribuio de amostras da prtica 5D na placa de 96-poos

Procedimento E dilise da amostra purificada

1. Transferir para um tubo eppendorf, TODA amostra que contm a maior atividade enzimtica*
e adicionar 80 l de PMSF.
2. Identificar o tubo com o nmero do grupo
3. Cobrir o tubo com um pedao de membrana de dilise
4. Prender a membrana de dilise com um anel de borracha
5. Transferir o microtubo para um suporte de isopor
6. Colocar o suporte dentro de um bquer contendo tampo fosfato 10 mM sem NaCl
7. Manter em agitao por pelo menos 32 h

*No se esquea que as fraes foram diluidas diferentemente para dosar protenas e
atividade glicosidase e isso deve ser levado em conta para escolher a frao (original) que
tem maior atividade enzimtica. Se tiver dvida sobre a frao a escolher, converse com
os professores ou monitores.

18
Tratamento de Dados e Anlise dos Resultados
PRTICA 5 PURIFICAO DE PROTENAS Precipitao com sulfato de amnio

(Relatrio 3)
Clculos e Grficos
1. Construir o grfico necessrio para a determinao da concentrao de atividade enzimtica de
alfa-glicosidase no lisado e nas fraes da precipitao com sulfato de amnio. Expressar os
resultados em mU/mL

2. Em seguida, baseado na determinao da concentrao de protenas (mg/mL) feita nas vrias

fraes, determine a atividade especfica de alfa-glicosidase (mU/mg) em cada frao.

3. Calcular a recuperao e o enriquecimento da atividade de alfa-glicosidase aps a precipitao

com sulfato de amnio ((NH 4 ) 2 SO 4 ).

19
Prtica 5
Purificao de protenas cromatografia de troca inica
Objetivo
Isolar a alfa-glicosidase utilizando resina de troca inica.

Procedimento A Hidratao da DEAE-Sephadex

Matriz
Dietilaminoetil
Matriz=Sephadex= dextrana com ligaes cruzadas

(Executado por monitores ou tcnica)

1. Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um bquer.
2. Adicionar 100 mL de tampo fosfato 10 mM pH 6,8.
3. Misturar bem utilizando um basto de vidro.
4. Decantar de um dia para o outro.

Procedimento B Montagem da coluna de troca inica

(Executado por monitores ou tcnica)

Montagem da coluna
1. Utilizar o barril de uma seringa (~ 20 mL) como suporte da resina.
2. Prender a seringa em um suporte.
3. Colocar um pouco de l de vidro no seu interior.
4. Compactar a l de vidro na base utilizando um basto de vidro.
5. Lavar a coluna com gua destilada para retirar fragmentos de l de vidro.
6. Adaptar uma mangueira de aproximadamente 6 cm na sada da pipeta.
7. Fechar a mangueira com uma presilha.

Processo de empacotamento
8. Fechar a presilha.
9. Homogeneizar com um basto de vidro a suspenso contendo a resina (Procedimento A).
10. Adicionar a suspenso at a marca de 1,0 mL.
11. Deixar decantar.
12. Repetir essa operao at a resina sedimentada ocupar o interior da seringa at 1,0 mL
13. Com a resina empacotada, lav-la com 20 mL de tampo fosfato 10 mM sem NaCl.
14. Aps a lavagem, fechar a presilha.
15. Deixar 3 mm de tampo acima do topo da resina. NUNCA DEIXAR A RESINA SECAR.

20
Procedimento C Cromatografia de troca inica.

Preparao da amostra

1. Descongelar a frao P2 dialisada, medir seu volume. Se o volume for menor que 0,5 ml
completar para 0,7 ml com tampo fosfato 10 mM sem NaCl. Homogenizar bem com vortex.
2. Reserve 0,1 ml da amostra num tubo MARCADO: MATERIAL (NH 4 )SO 4 e o nmero do
grupo para dosar a quantidade de protena (tem F) e de atividade de enzima (tem G) que ser
aplicada na coluna. Embora tenhamos dosado esses parmetros anteriormente, o tempo de
dalise pode levar inativao de parte da enzima e eventual precipitao de parte das
protenas. O resto da amostra ser utilizado no experimento de SDS-PAGE.

Cromatografia

Aplicao da amostra na coluna de troca-inica.

3. Verificar se a presilha est fechada e o tampo ao nvel do menisco (cerca de 3 mm acima do
topo da coluna).
4. Utilizar uma pipeta para transferir 0,5 ml da amostra para a coluna, encostando a pipeta na
parede da coluna.
Nas etapas seguintes voc far a eluio do material aplicado usando tampo sem NaCl e com NaCl
1M. A cada acrscimo de tampo as amostras devero ser coletadas em microtubos de
centrifugao (tipo Eppendorf) numerados de 1 a 20.

5. Colocar o tubo 1 na sada da coluna e abrir a presilha.

6. Deixar a amostra escoar pela coluna at cerca de 3 mm acima do topo da resina (menisco).
7. Fechar a presilha e transferir o tubo 1 para o gelo.
Eluio das protenas no retidas pela coluna
8. Adicionar cuidadosamente tampo fosfato sem NaCl (2 mL).
9. Colocar o tubo 2 na sada da coluna e abrir a presilha permitindo que o tampo flua pela resina.
10. Coletar 1 mL em cada tubo de eppendorf.
11. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 mL de tampo.
12. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8.
13. Adicionar cuidadosamente mais 1,0 mL de tampo. Assim, acima da resina dever haver 2,0
mL de tampo.
14. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampo.
15. Ao final da coleta do tubo 10, o tampo dever estar cerca de 3mm acima do topo da resina
(menisco).
Eluio das protenas retidas pela coluna
16. Adicionar cuidadosamente tampo fosfato com NaCl 1M (2,0 mL).
17. Abrir a presilha e permitir que o tampo flua pela resina.
18. Coletar 1,0 mL (mililitro) em cada tubo eppendorf.
19. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 mL de tampo
20. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 18.
21. Adicionar 1,0 mL de tampo. Assim, acima da resina dever haver 2,0 mL de tampo.
22. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampo.
23. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 20. No deixar a coluna secar.

Procedimento D Identificao das fraes que contm a -glicosidase

MANTER OS TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

1. Preparar um conjunto de tubos numerados de 1 a 20. Adicionar em cada tubo 0,2 mL de NPGlc
Transferir os tubos em banho de gelo.
2. Adicionar em cada um destes tubos 0,2 mL das fraes coletadas durante a cromatografia.
3. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho de 30oC.
4. Incubar os tubos por 10 min.
5. Ao remover os tubos, adicionar em cada um 2 mL de tampo carbonato-bicarbonato pH 11,0.
6. Agitar manualmente
7. Deixar os tubos em temperatura ambiente.
8. Ler as absorbncias a 420 nm em leitora de placa. Para isso pipetar 200 L de amostra em21
cada pocinho da placa. Pipetar tambm 200 L do tampo utilizado e usar como branco. Anotar
o valor do branco e descontar da leitura de absorbncia das amostras.
9. Completar a Tabela 1.
10. Construir um grfico Absorbncia versus nmeros dos tubos.
11. Uma vez identificados os tubos que contm atividade enzimtica, reunir o contedo dos tubos
(fraes eludas da cromatografia) com maior atividade enzimtica em um tubo Falcon
identificado como MATERIAL DEAE Nome do grupo.

Tabela 1
Tubos A 420 Tubos A 420
Branco
1 11
2 12
3 13
4 14
5 15
6 16
7 17
8 18
9 19
10 20

Procedimento E Dosagem de protenas do material DEAE

Ateno O material DEAE usado neste procedimento no deve ser diludo. Se o grupo
tiver pouco material DEAE utilize dois e no trs tubos (duplicata).

1. Adicionar em cada tubo os volumes de gua e material DEAE estipulados na Tabela 2.

2. Adicionar o reagente de Bradford.
3. Homogeneizar em vrtice
4. Aguardar 5 minutos
5. Ler as absorbncias a 595 nm na leitora de placas ou no espectrofotmetro.
6. Anotar a leitura do branco e descontar das demais leituras.
7. Completar a Tabela 3

Tabela 2
material reagente de
gua
tubos DEAE Bradford
(mL)
(mL) (mL)
branco - 0,1 1,0
1 0,1 - 1,0
2 0,1 - 1,0
3 0,1 - 1,0

Tabela 3
A 595 Massa de Volume da Concentrao
Tubos protena amostra de protena
(mg) (mL) (mg/mL)
1
2
3

Procedimento F- Dosagem de protenas do P2 do (NH 4 ) 2 SO 4

1. Transferir 70 l do P2 para um tubo de ensaio grande identificado como P2 20X (confira o

resultado que obteve na Prtica 4 para ver se essa a diluio adequada; se no for utilize outra
diluio)
2. Adicionar 1330 l de gua destilada
3. Homogenizar em vrtice
22
4. Adicionar em cada tubo os volumes de gua e MATERIAL (NH 4 ) 2 SO 4 diludo 20X estipulado na
Tabela 4.
5. Homogenizar em vortex.
6. Aguardar 5 minutos.
7. Usar o branco da Tabela 4 para zerar o especrofotmetro ou para descontar da leitura das
amostras realizadas na leitora de placas
8. Ler a absorbncia a 595 nm.
9. Completar a Tabela 5.

Tabela 4
material
(NH 4 ) 2 SO reagente de
gua
tubos 4 Bradford
(mL)
20x (mL)
(mL)
branco - 0,1 1,0
1 0,1 - 1,0
2 0,1 - 1,0
3 0,1 - 1,0

Tabela 5
A 595 ** Massa de Volume da Concentrao
Tubos protena amostra de protena
(mg) (mL) (mg/mL)
1
2
3

** no esquecer de descontar o branco dos valores de absorbncia obtidos na leitora de

placas

Procedimento G- Determinao da atividade da -glicosidase na frao P2

do (NH 4 ) 2 SO 4

Diluio do MATERIAL (NH4)2SO4

MANTER OS TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

1. Deve ser utilizado o procedimento de diluio da prtica 4 para o material P2. Transferir
100 l do P2 20x para um tubo de ensaio grande identificado como P2 400X
2. Adicionar 1900 l de gua destilada
3. Homogeneizar em vrtice

Todos os tubos deste ensaio podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento
sempre pela adio do substrato. Somente quando todos os tubos j tiverem recebido o substrato
dever ser iniciada a adio do sobrenadante do lisado previamente diludo.

Dosagem da atividade enzimtica

1. Preparar os tubos em banho de gelo.
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados nas Tabelas 6 e 7.
3. Adicionar em cada tubo a frao (NH 4 ) 2 SO 4 do lisado devidamente diluda (200X).
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30oC.
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 9.
6. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 2 mL de tampo
carbonato-bicarbonato pH 11,0.
7. Agitar manualmente
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente.
9. Uma vez que todos os tubos tenham sido retirados, ler as absorbncias a 420 nm.
10. Completar a Tabela 7.
23
 Tabela 6
Frao
Tempo de
NPGlc 4 mM NH 4 (SO 4 ) 2
tubos incubao a 30C
(mL) 200x
(min)
(mL)
BE 0,2 H 2 O 0,2 20
1 0,2 0,2 5
2 0,2 0,2 10
3 0,2 0,2 15
4 0,2 0,2 20

Tabela 7
Tubos A 420
BE
1
2
3
4

22 Com os dados obtidos determinar a concentrao de atividade enzimtica de -glicosidase

(U/mL) presente na frao (NH 4 ) 2 SO 4 do lisado.

Determinao da atividade da -glicosidase no MATERIAL DEAE

MANTER OS TUBOS EM BANHO DE GELO
1. Dilua 10x o MATERIAL DEAE seguindo o procedimento sugerido abaixo
Transferir 0,2 mL do MATERIAL DEAE para um tubo identificado com DEAE-10X.
Adicionar 1,8 mL de gua destilada.
Homogeneizar suavemente
Manter no gelo
2. Adicionar em cada tubo de ensaio os volumes de NPGlc e MATERIAL DEAE (diludo 10x)
estipulados na Tabela 8. Preparar os tubos em banho de gelo.
3. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho a 30oC.
4. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 8.
5. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 2 mL de tampo carbonato-
bicarbonato pH 11,0.
6. Deixar os tubos em temperatura ambiente.
7. Uma vez que todos os quatro tubos tenham sido retirados, ler as absorbncias a 420 nm.
8. Completar a Tabela 9.
9. Calcular a atividade da -glicosidade no Material DEAE.

Tabela 8
material DEAE
NPGlc 4 mM tempo
tubos (mL)
(diludo 10x)
(min)
(mL)
1 0,2 0,2 5
2 0,2 0,2 10
3 0,2 0,2 15
4 0,2 0,2 20
Bco 0,2 0,2 H 2 O 20

Tabela 9
nmols Tempo
tubos A 420 de (min)
produto
1
2
3
4
24
Procedimento H- Dilise do material DEAE.
1. Voc poder dialisar o mximo de 2 mL do material DEAE. Estimar a quantidade de protena
total presente no volume DEAE escolhido (V DEAE = _______mL)
Protena DEAE =_______microgramas

2. Calcule o volume do lisado (V lisado ) de Saccharomyces cerevisiae que contem a mesma

quantidade de protena presente no V DEAE escolhido. Utilize o V lisado calculado para dialisar.
3. Calcule o volume de P2 que contm a mesma quantidade de protena presente no V DEAE
escolhido. Transferir para um microtubo o volume indicado de amostra.
4. Identificar os microtubos com:
a. Nome da amostra.
b. Nmero do grupo.
5. Adicionar gua, caso necessrio, at completar o mesmo volume do material DEAE.
6. Adicine 10 l de PMSF a cada tubo (material DEAE, lisado e P2) e agite.
7. Cobrir os microtubos com um pedao de membrana de dilise.
8. Prender a membrana de dilise com um anel de borracha.
9. Transferir os microtubos para um suporte de isopor.
10. Colocar o suporte dentro de um bquer contendo gua.
11. Manter sob agitao por pelo menos 16 horas.

Secagem a vcuo (Executado pelos monitores)

1. Aps a dilise, transferir as amostras para um concentrador a vcuo.
2. Secar as amostras.

25
Tratamento de Dados e Anlise dos Resultados
PRTICA 5 PURIFICAO DE PROTENAS CROMATOGRAFIA DE TROCA INICA

(Relatrio 4)
Clculos e Grficos
4. Construir o grfico necessrio para a determinao da concentrao de atividade enzimtica de
alfa-glicosidase no material DEAE. Expressar os resultados em mU/mL

5. Em seguida, baseado na determinao da concentrao de protenas (mg/mL) feita no material

DEAE, determinar a atividade especfica de alfa-glicosidase (mU/mg) do material DEAE.

6. Calcular a recuperao e o enriquecimento da atividade de alfa-glicosidase aps a cromatografia

de troca inica.

26
Prtica 6
Purificao de protenas SDS-PAGE
Objetivos
Analisar a composio de protenas do material que contm -glicosidase eludo na cromatografia de
troca-inica e compar-la com a composio de protnas do lisado centrifugado (antes da
cromatografia de troca inica).

soluo A
acrilamida 29,2 g
NNbis metilenoacrilamida 0,80 g
gua qsp 100 mL

soluo B
tris 1,5 M pH 8,8
(acertar valor de pH com HCl)

soluo C
tris 0,5 M pH 6,8
(acertar valor de pH com HCl)

tampo de amostra
gua 3,55 mL
soluo C 1,25 mL
glicerol 2,50 mL
SDS 100 g/L 2,00 mL
azul de bromofenol 5 g/L 0,20 mL
-mercaptoetanol 0,05 mL

tampo de corrida
tris 3,03 g
glicina 14,4 g
SDS 1,0 g
gua qsp 1L
Obs.: No acertar o pH desta soluo
tampo.

soluo de colorao
Coomassie blue R 0,1 g
metanol 40 mL
cido actico 10 mL
gua qsp 50 mL

soluo de descolorao
metanol 40 mL
cido actico 10 mL
gua qsp 50 mL

27
Procedimento A Preparao do gel de SDS-PAGE (Feito pela tcnica)
Preparao do gel de separao
1. Adicionar em um tubo os volumes estipulados na Tabela 1.
2. Homogeneizar rapidamente.
3. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro previamente
montadas.
4. Aguardar a polimerizao cerca de 60 min.
5. Colocar o pente sobre entre as placas de vidro.

Preparao do gel de empilhamento

6. Aps a polimerizao do gel de separao, adicionar em outro tubo os volumes estipulados na
Tabela 2.
7. Homogeneizar rapidamente.
8. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o pente)
contendo o gel de separao polimerizado.
9. Aguardar a polimerizao cerca de 40 min.
10. Aps a polimerizao do gel de empilhamento, retirar cuidadosamente o pente.
11. Adicionar o tampo de corrida.
Tabela 1 Tabela 2
Solues volume solues volume
gua 4,02 mL gua 3,05 mL
SDS 100 g/L 100 L SDS 100 g/L 50 L
soluo A 3,33 mL soluo A 0,65 mL
soluo B 2,5 mL soluo C 1,25 mL
TEMED 5 L TEMED 5 L
persulfato de amnio 50 L persulfato de amnio 25 L

Procedimento B Desnaturao das protenas presentes nas amostras

1. Transferir para cada microtubo de amostra (20 L) de tampo de amostra.
2. Transferir os microtubos para um banho fervente.
3. Incubar os microtubos por 5 min.
4. Retirar os microtubos.
5. Aplicar as amostras no gel de eletroforese com o auxlio de micropipetadores.
6. Cada gel ser compartilhado por dois grupos.
7. Aplicar na sequncia as seguintes amostras:
8. Padro de peso molecular, padro comercial de alfa-glucosidase, lisado, P2 e material
DEAE

Procedimento C Eletroforese, colorao e descolorao

1. Correr a eletroforese com 100V, durante aproximadamente 40 min.

2. Desligar a fonte quando o corante marcador de frente atingir a base do gel.
3. Desconectar os cabos.
4. Retirar o gel.
5. Colocar o gel no frasco contendo a soluo de colorao.
6. Corar o gel por 10 min.
7. Retirar o gel do frasco de colorao.
8. Colocar o gel no frasco contendo a soluo de descolorao.
9. Descorar o gel.
10. Visualizar as bandas de protenas.

Procedimento D Desidratao do gel (Opcional)

1. Colocar o gel num frasco contendo gua.

2. Trocar tantas vezes quanto for necessrio a gua do frasco at a remoo completado cido
actico.
3. Retirar o gel hidratado do frasco com gua.
4. Colocar o gel num frasco contendo soluo de glicerol 50 g/L.
5. Molhar com a soluo de glicerol lminas de celofane natural
6. Dispor as folhas de celofane sobre placas limpas de vidro.
28
7. Colocar os gis sobre as lminas de celofane devidamente hidratadas e limpas.
8. Colocar outra folha de celofane previamente hidratada sobre o gel, formando assim um
sanduche.
9. Retirar delicadamente as bolhas de ar que estiverem aprisionados pelas folhas de celofane.
10. Esticar as folhas e prend-las.
11. Deixar secar temperatura ambiente.

FRMULAS ESTRUTURAIS E MASSAS MOLARES

TEMED (116,20 g/mol)
SDS (288,38 g/mol)
H3C CH3
N
O
+
O S O Na
O N
H3C CH3
CONVERSO DE PERSULFATO EM ON SULFATO

S 2 O 8 2- + e- SO 4 2- + SO 4 -*

REAO DE
POLIMERIZAO DA
ACRILAMIDA E COM A
BIS-ACRILAMIDA

29
Tratamento de Dados e Anlise dos Resultados
PRTICA 6 - PURIFICAO DE PROTENAS SDS-PAGE
(Relatrio 5)
INSTRUES:
1. Identificar a banda correspondente -glicosidase no gel de SDS-PAGE.
2. Calcular o provvel peso molecular relativo da enzima atravs dos padres
utilizados na eletroforese.

30
Prtica 7
Caracterizao da enzima pH timo
Objetivo
Determinar o efeito do pH na atividade cataltica da -glicosidase. Os experimentos sero
realizados com o lisado.

Reagentes Materiais Aparelhagens

lisado de levedura banho de gelo banho 30oC
p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc) Pipetadores espectrofotmetro
8 mM em gua Pipetas Leitora de placas
tampo carbonato-bicarbonato ponteiras
250 mM pH 11,0 suporte para tubos
tampo fosfato 200 mM pH 7,0 tubos de ensaio
tampo borato 200 mM pH 8,0
tampo borato 200 mM pH 9,0
tampo citrato 200 mM pH 4,0
tampo citrato 200 mM pH 5,0
tampo citrato 200 mM pH 6,0

Procedimento A Diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

Considerando que seu lisado tenha alta atividade de -glicosidase, utilize a diluio de 400x. Se
na, use outra diluio (discuta com o professor ou com os monitores). Segue abaixo o
procedimento sugerido para a diluio da preparao do lisado de Saccharomyces cerevisiae.

11. Transferir 0,2 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com
L10X.
12. Adicionar 1,8 mL de gua destilada gelada.
13. Homogenizar suavemente
14. Transferir 0,1 mL de L10X para um novo tubo identificado com L400X.
15. Adicionar 3,9 mL de gua destilada gelada.
16. Homogenizar suavemente.
17. Manter no gelo

Procedimento B Ensaio da atividade enzimtica

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

1. Realizar os ensaios de atividade enzimtica sobre p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc) em 6

diferentes valores de pH.
2. Preparar em banho de gelo, para cada pH, um conjunto de tubos para os ensaios de atividade
de acordo com a Tabela 1.
3. Adicionar o lisado (devidamente diludo) de Saccharomyces cerevisiae.
4. Agitar manualmente com cuidado.
5. Transferir todos os tubos do gelo ao mesmo tempo para um banho a 30oC.
6. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1.
7. Ao retirar cada tubo do banho, interromper a reao enzimtica pela adio de 2 mL de
tampo carbonato-bicarbonato.
8. Agitar manualmente
9. Deixar os tubos em temperatura ambiente.
10. Usar gua para calibrar (zerar) o espectrofotmetro.
11. Uma vez que todos os tubos tenham sido retirados, ler as absorbncias a 420 nm.
12. Completar as Tabelas 2, 3 e 4.
13. Determinar graficamente o pH timo da -glicosidase

31
 pH = _____________

Tabela 1
tampo _______
NPGlc 8 mM lisado diludo tempo
tubos pH ____
(mL) (mL) (min)
(mL)
B - 0.2 0,2 20
1 0,1 0,1 0,2 5
2 0,1 0,1 0,2 10
3 0,1 0,1 0,2 15
4 0,1 0,1 0,2 20

Tabela 2
pH = 4,0 pH = 5,0 pH = 6,0
tubos A 420 tubos A 420 tubos A 420
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4

Tabela 3
pH = 7,0 pH = 8,0 pH = 9,0
tubos A 420 tubos A 420 tubos A 420
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4

Tratamento de Dados e Anlise dos Resultados

PRTICA 7 - CARACTERIZAO DA ENZIMA PH TIMO
Relatrio 6

1. Construir os grficos para determinao da concentrao de atividade (U/ml) da -

glicosidase nos diferentes valores de pH.
2. Construir a curva de pH timo (atividade relativa (%) versus pH). A atividade
relativa a porcentagem de atividade enzimtica em cada pH medida em relao a
maior atividade observada.
3. Determinar o valor de pH timo.

TABELA 4 - CLCULO DO VALOR DE PH TIMO

Atividade Enzimtica
Valor de pH Atividade Enzimtica Relativa
presente no LISADO diluido
(U/ml) (%)
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0

32
Prtica 8
Caracterizao da alfa-glicosidase: K m e Vmax
Objetivos
Caracterizar a -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae atravs das determinaes da afinidade
(K m ) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol--glicosdeo) e da velocidade mxima (V max ) de
hidrlise do substrato.

Reagentes Materiais Aparelhagens

gua destilada banho de gelo banho 30oC
lisado de levedura (P6) cubetas para leitura espectrofotmetro
p-nitrofenil-glicosdeo (NPGlc) 1,0 mM pipetadores vrtice
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0 pipetas Leitora de placas
p-nitrofenil-glicosdeo (NPGlc) 2,0 mM ponteiras
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0 suporte para tubos de ensaio
p-nitrofenil-glicosdeo (NPGlc) 8,0 mM tubos de ensaio
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM
pH 11,0
tampo fosfato 100 mM pH 7,0

Procedimento A Diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

UTILIZE A DILUIO USADA NA PRTICA 3. SOMENTE CASO NO SEJA POSSVEL,

EMPREGUE O PROCEDIMENTO ABAIXO. NOTE QUE O VOLUME TOTAL NECESSRIO SER
DE 5,0 mL.
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluio da preparao do lisado de
Saccharomyces cerevisiae.

18. Transferir 0,1 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com
L10X.
19. Adicionar 0,9 mL de gua destilada gelada.
20. Homogenizar SUAVEMENTE.
21. Transferir 0,5 mL de L10X para um novo tubo identificado com L100X.
22. Adicionar 4,5 mL de gua destilada gelada.
23. Homogenizar SUAVEMENTE.

Procedimento B Medidas de velocidade da reao de hidrlise do substrato

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1.

ATENO: prestar ateno nas diferentes concentraes de substrato.

2. Preparar os tubos em banho de gelo.

3. Adicionar em cada tubo os volumes de substrato, tampo e lisado (devidamente diludo)
estipulados na Tabela 1. Agitar manualmente com cuidado.
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC
5. Incubar todos os tubos por 30 min.
6. Remover todos os tubos do banho.
7. Adicionar 2 mL de tampo carbonato-bicarbonato.
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente.
9. Homogeneizar em vrtice.
10. Usar a gua para calibrar (zerar) o espectrofotmetro.
11. Ler as absorbncias a 420 nm.
12. Completar a Tabela 2.

33
13.Construir os grficos necessrios para a determinao do K m e V max da -glicosidase para o
substrato utilizado.

Tabela 1
NPGlc NPGlc NPGlc tampo fosfato lisado
tubos 1,0 mM 2,0 mM 8,0 mM 100 mM pH 7 diludo
(mL) (mL) (mL) (mL) (mL)
branco 0,40 0
1 0,02 - - 0,28 0,10
2 0,04 - - 0,26 0,10
3 0,08 - - 0,22 0,10
4 0,12 - - 0,18 0,10
5 0,16 - - 0,14 0,10
6 0,20 - - 0,10 0,10
7 - 0,16 - 0,14 0,10
8 - 0,20 - 0,10 0,10
9 - - 0,10 0,20 0,10
10 - - 0,13 0,17 0,10
11 - - 0,15 0,15 0,10

Tabela 2
[S]
Tempo
(no A 420
nmols de da Velocidade
tubos tubo de A 420 Corrigido
produto reao (nmol/min)
ensaio) (-Bco)
(min)
(mM)
branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

34
Prtica 9
Caracterizao da alfa-glicosidase determinao de
padro de inibio por maltose
Objetivos
Determinar o padro de inibio de maltose sobre a hidrlise de p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc)
efetuada pela -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae.

Reagentes Materiais Aparelhagens

gua destilada banho de gelo banho 30oC
lisado de levedura (P6) cubetas para leitura espectrofotmetro
maltose 0,2 M em tampo fosfato pipetadores vrtice
100 mM pH 7,0 pipetas Leitora de placas
maltose 0,4 M em tampo fosfato ponteiras
100 mM pH 7,0 suporte para tubos
maltose 0,8 M em tampo fosfato tubos de ensaio
100 mM pH 7,0
p-nitrofenil-glicosdeo (NPGlc) 1,0 mM
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0
p-nitrofenil-glicosdeo (NPGlc) 2,0 mM
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0
p-nitrofenil-glicosdeo (NPGlc) 8,0 mM
em tampo fosfato 100 mM pH 7,0
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM
pH 11,0
tampo fosfato 100 mM pH 7,0

Procedimento A Diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

Ateno: Ser utilizada a mesma soluo de enzima j diluda para a Prtica 8 Caracterizao
da enzima: K m e V max . No h necessidade de preparar uma nova diluio.

Procedimento B Medidas da velocidade de reao de hidrlise do substrato na

presena de inibidor

OBSERVAO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO

1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc e maltose estipulados na Tabela 1.

ATENO: prestar ateno nas diferentes concentraes de substrato e inibidor.

2. Preparar os tubos em banho de gelo

3. Adicionar em cada tubo os volume de tampo e lisado (devidamente diludo) estipulados na
Tabela 1. Agitar manualmente com cuidado.
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC.
5. Incubar todos os tubos pelo dobro do tempo usado na prtica 8.
6. Remover todos os tubos do banho.
35
7. Adicionar 2 mL de tampo carbonato-bicarbonato.
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente.
9. Usar gua para calibrar (zerar) o espectrofotmetro.
10. Ler as absorbncias a 420 nm.
11. Completar a Tabela 2.
12. Construir os grficos necessrios para a determinao do padro de inibio da -glicosidase
por maltose.

Tabela 1.
tampo
NPGlc NPGlc NPGlc maltose maltose lisado
fosfato
tubos 1,0 mM 2,0 mM 8,0 mM 0,2 M 0,4 M diludo
100 mM pH 7
(mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (mL)
(mL)

branco - - - - - 0,400 -
1 0,080 - - 0,100 - 0,120 0,100
2 0,200 - - 0,100 - - 0,100
3 - 0,160 - 0,100 - 0,040 0,100
4 - 0,200 - 0,100 - - 0,100
5 - - 0,100 0,100 - 0,100 0,100
6 - - 0,150 0,100 - 0,050 0,100

7 0,080 - - - 0,100 0,120 0,100

8 0,200 - - - 0,100 - 0,100
9 - 0,160 - - 0,100 0,040 0,100
10 - 0,200 - - 0,100 - 0,100
11 - - 0,100 - 0,100 0,100 0,100
12 - - 0,150 - 0,100 0,050 0,100

Tabela 2.

[S] [I]
tubos final final A 420 A 420 A 420
(mM) (M)
branco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Tratamento de Dados e Anlise dos Resultados

PRTICA 9 CARACTERIZAO DA ALFA-GLICOSIDASE DETERMINAO DE PADRO DE
INIBIO POR MALTOSE
Relatrio 7
INSTRUES:
1-Construir os grficos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk para determinao de
V max e K m
2-Construir o grfico de Lineweaver-Burk na presena do inibidor.
3-Determinar os valores de K m , V max e o padro de inibio

TABELA 1 - PARA O CLCULO DE K M E V MAX

36
 Tempo de
tubos A 420 no de mols velocidade
ensaio
(unidades de abs) (nmol) (min) (nmol/min)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

TABELA 2 - PARA O CLCULO DE KM E V MAX

GRFICO GRFICO
(MICHAELIS-MENTEN) (LINEWEAVER-BURK)

[S] Velocidade 1/[S] 1/velocidade

(mM) (nmol/min) (mM)-1 (nmol/min)-1

0,05
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,8
1
2
2,6
3

K M = __________ mM V MAX = __________ mU

37