Produccion de Trichoderma harzianum mediante fermentacion

solida sobre medio arroz y evaluacion del producto siguiendo el

manual de Cenicafe 1

Mauricio Vargas & Lina Natalia Noy Nio

Facultad de Ingeniera. Ingeniera Qumica
Laboratorio de Biotecnologa
Universidad de la Sabana. Cha, Cundinamarca, Colombia.

Asesor: Felipe Arroyave Rovida

Presentado el 3 de abril de 2017

Resumen
Trichoderma harzianum, es un hongo filamentoso,
saprfito, aerobio, que cuenta con una pared
celular compuesta principalmente por quitina, se
reproduce de forma asexual. Se produce el hongo
Trichoderma harzianum, para el control
microbiolgico de fitopatogenos; utilizando
diferentes mecanismos fsicos y bioqumicos, tales
como el amensalismo, la competencia y el
micoparasitismo, esta produccin se da por medio
de la fermentacin sobre sustrato slido, con
ausencia o baja cantidad de agua. Este hongo se
encuentra en el suelo y crece sobre diferentes
cultivos PDA, Saboreaud, YPG y subproductos
agroindustriales como cebada, trigo, suero de
leche, pero en este caso se utilizar el arroz. Los
productos finales pueden ser de polvo, granulado
o lquido, los cuales contienen conidios y micelio
mezclados con diferentes materiales como
coadyuvantes; estos productos deben pasar por un
control de calidad, realizando pruebas, como la
determinacin del nmero de conidios por gramo
de sustrato, capacidad germinativa de las
unidades infectivas y pruebas de antagonismo;
para verificar si los requerimientos mnimos se
cumplen y garantizar la efectividad contra los
diversos microorganismos blanco, como lo
estipula el boletn tcnico CENICAFE , en donde
para que el producto fuese comercializado de debe
cumplir que el porcentaje de germinacin fuese
superior al 85%, por lo cual se obtiene
178402500 conidios/g y 50% de germinacin, as
que el producto no podr ser comercializado.
Palabras claves: Trichoderma harzianum,
fermentacin slida, medio arroz, Agar PDA,
control microbiolgico, amensalismo,
competencia, micoparasitismo, CENICAF,
conidios, germinacin.
Abstract
The fungus Trichoderma harzianum is produced,
for the microbiological control of phytopathogens;
Using different physical and biochemical
mechanisms, such as amensalism, competition and
mycoparasitism, this production is given by means
of fermentation on a solid substrate, with absence
or low amount of water. This fungus is found in the
soil and grows on different crops PDA,
Saboreaud, YPG and agro-industrial by-products
such as rice, barley, wheat, whey, among others.
The final products may be of powder, granulate or
liquid, which contain conidia and mycelium mixed
with different materials as adjuvants; These
products must undergo a quality control,
performing tests, such as the determination of the
number of conidia per gram of substrate,
germinative capacity of the infective units,
percentage of purity and tests of antagonism; To
verify if the minimum requirements are fulfilled
and to guarantee the effectiveness against the
various microorganisms target, as stipulated in the
technical bulletin CENICAF, where in order that
the product should be commercialized it must
comply with the percentage of germination to be
greater than 85%, whereby 178402500 Conidia /
g and 50% germination, so the product can not be
marketed.
Keywords: Trichoderma harzianum, solid
fermentation, medium rice, PDA agar,
microbiological control, amensalism, competition,
mycoparasitism, CENICAF, conidia,
germination.
INTRODUCCIN
Los hongos Trichoderma sp son un grupo de
microorganismos que habitan en distintos suelos
agrcolas. Estos crecen debi a la descomposicin
de materia orgnica y su crecimiento se ve
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influenciado por la presencia de otros hongos que microscpico y contar en los 25 cuadrantes,
atacan cultivos, es decir actan como un realizando el recuento seis veces.
controlador biolgico de fitopatgenos.
Para determinar la germinacin, tomar 5 L de la
Trichoderma se puede encontrar fcilmente en las
dilucin y depositarlos en la caja de agar agua. A
races de las plantas y en los suelos.
razn de 5 alcuotas por caja, dejar absorber la
Cientficos se han interesado por las propiedades muestra por 10 minutos y llevar a incubar 24 horas
antagnicas frente a hongos fitopatgenos. a 30C. Agregar una gota de azul de lactofenol y
Especies de Trichoderma compiten por los cortar con bistur cuadrados de 1 cm X 1 cm;
nutrientes en el suelo mediante micoparasitismo y enfocar con lente de 40X y contar 100 conidios
la antibiosis, claramente hay una dependencia registrando los germinados y no germinados en
entre antagonista-patgeno y de las condiciones cada cuadrado.
medio ambientales.
RESULTADOS
Trichoderma sp, produce tres tipos de propgalos
Se realiza la practica en el medio de cultivo de
como lo son las hifas, clamidosporas y conidios,
arroz, generando las composiciones y condiciones
en diferentes fases de su crecimiento, lo que indica
necesarias para permitir el crecimiento del
que hay actividad contra fitopatgenos todo el microorganismo y que lleve a cabo todos sus
tiempo. diferentes mecanismos fsicos y bioqumicos
Los hongos se reproducen con mayor facilidad en (amensalismo, competencia y micoparasitismo)
adems sirve como fuente de nutrientes y como
medio lquido. Al usar este medio hay mayor
soporte para que los microorganismos crezcan.
variacin en la obtencin de estructuras
reproductivas de T.harzianum. Estudios usando Por otra parte, se realiz una caracterizacin
diferentes fuentes de carbono y fermentacin macroscpica del medio de cultivo y microscpica
liquida logran producir de 2-3 108 conidios/ml. del hongo T. harziarum con azul lactofenol. Los
resultados obtenidos se mostrarn en la siguiente
tabla.
MATERIALES Y METODO
Desprender los conidios de forma fsica
Caractersticas Caractersticas
adicionando 19 mL de agua con tween 80 al 0,1%
macroscpicas. microscpicas. Descripcin
(v/v) a la caja con T. harzianum, luego colocar las Descripcin escrita escrita
perlas de vidrio dentro de la caja de petri y
desprender los conidios. Transferir la totalidad de Se evidencia un Se observaron conidiforos,
la solucin concentrada a un tubo de ensayo. cultivo de con presencia de muchos
crecimiento de color conidios o clamidosporas, y
A partir de la solucin concentrada realizar blanco como se presentan estructuras de
diluciones seriadas 10-1, 10-2, 10-3. algodn sin madurar, hifa, ramificadas de las cuales
Posteriormente colocar 10 L de la dilucin y y a su alrededor se desarrollan conidioforos,
realizar el conteo en la cmara. Inocular y verde, segn la es decir, con ramas cortas,
distribuir la solucin uniformemente sobre el literatura que miden de 18- 25m. A
sustrato slido. Adicionar 50 mL de agua destilada inicialmente el partir de fialides delgadas en
para humedecer el sustrato y tapar nuevamente. crecimiento micelial forma de botella se
Incubar por ocho das a temperatura ambiente. es color blanco y de desprenden conidios de
textura algodonosa y paredes lisas, subglobosos,
Para remover los conidios y determinar el nmero luego se van cortos, ovoides con
de estos, adicionar 200 mL de agua destilada con tornando a blanco- aproximadamente de 2,8-3,2
tween 80 al 0,1% (v/v) y preparar diluciones desde verdosas hasta llegar x 2,5-2,8m. (Lpez, R.2010)
la 10-1 hasta 10-8 y realizar el recuento a un verde total.
seleccionando la dilucin en la que se observe en (Samson,2004). Por
promedio ms de 20 conidios por campo lo cual el
crecimiento del
 Produccion de Trichoderma harzianum mediante fermentacion solida sobre medio arroz y
evaluacion del Producto siguiendo el manual de Cenicafe 3

hongo fue
satisfactorio.

Caractersticas Caractersticas
microscpicas macroscpicas
Figura 1. Aspecto in vitro y
representacin representacin grfica
crecimiento de Trichoderma
grfica Figura#2.
harzianum, ocho das despus
de sembrado en el medio de Crecimiento esperado
cultivo PDA. (Vsquez, A. de conidios y hifas
2010) para una germinacin
del 100%(Vsquez,
A. 2010).

Tabla#3. Comparaciones macroscpicas y

microscpicas experimentales respecto a la
literatura.

El desarrollo de Trichoderma harzianum est

Tabla#1. Comparaciones macroscpicas y
microscpicas de la fermentacin de Trichoderma
harzianum.
ANLISIS DE RESULTADOS
afectado por diversos factores de tipo fsico y
nutricional como la temperatura, ya que
Trichoderma harzianum es un microorganismo
mesfilo, cuya temperatura ptima de crecimiento
es de 25- 30C, pero a la vez capaz de crecer en
temperaturas que van de los 10-40C; otro factor es
el pH que estar entre 2 y 9, pero lo hace de forma
ptima entre 4 y 7; la humedad entre 20-90% pero
crece ptimamente en humedades entre 70-80%.
(Simkovic, 2008)

Comparacin Comparacin Se utiliza el medio de arroz y el medio de agar

macroscpicas descripcin microscpicas PDA, debido a enzimas hidrolticas como
escrita descripcin escrita amilasas, celulasas, peptinasas, quitinasas, entre
otras, para que Trichoderma harzianum degrade
activamente los sustratos como almidn, celulosa y
El objetivo era obtener un Se basan en que el peptina, las cuales son empleadas como fuente de
crecimiento exponencial de primero presenta hifas crecimiento. Se puede presentar o no crecimiento
Trichoderma harzianum, el poco ms delgadas y al ser expuesto a determinadas concentraciones de
cual se representa en la figura conidios de menor sales, as como a CaCl2, debido a que en
#1. tamao los cuales concentraciones mayores a 80g/L inhibe el
macroscpicamente crecimiento y a 10g/L puede desarrollarse de
tienden a presentar manera ptima. Frente a sales como a NaCl y KCl
una coloracin verde es difcil su crecimiento. (Sharna K,2009)
oliva mientras
Determinacion del numero de conidios/g de
producto
Comparacin Comparacin Se realiza el conteo en la camara y se hace el
microscpicas macroscpicas recuento de conidios/mL utilizando la cuadric ula
representacin grfica representacin central contando en los cuadrados de los extremos
grfica y en el central.

Se realiz el conteo de conidios en la cmara de

Neubauer, seleccionando la dilucin en la que se
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observe en promedio ms de 20 conidios por

campo microscpico, contando en los 25
cuadrantes; para la determinacin del nmero de
conidios/g de producto. A continuacin, se adjunta
el nmero de conidios respecto a su posicin en la
cuadricula.
Las condiciones de cultivo slido, estan
determinadas por factores, tales como el
tamao de partcula, el tipo de material,
alcanzando concentraciones superiores o
iguales a 107 conidios/g (Pandey, 2003).

Determinacion del porcentaje de germinacion

de conidios
La germinacin de los conidios est mediada por
el tipo de enlace que presenta la fuente de carbono
la cual puede ser un disacrido o un polisacrido,
Tabla#2. Recuento de conidios en la cmara de
sobre los cuales actuarn enzimas como amilasas,
Neubauer.
celulasas, peptinasas, quitinasas, -glucosidadas,
Se determina el nmero de conidios,mediante la endo y exoglucanasas que realizan la hidrlisis de
siguiente ecuacin los azcares para dar inicio a la germinacin.
(Cruz, C.2007).
/
= Ec. 1

Para conocer el nivel de germinacin fue necesario
obtener una vista a nivel microscpico. Se observ
las ramificaciones y los conidios.
Repeticiones

1 2 3 4 5 6 conidios/
ml

80 79 80 78 79 80 476 2,38E+0
8

92 79 80 82 80 70 483 2,42E+0
8

91 98 93 90 95 96 563 2,82E+0
8 Figura#3. Imgenes microscpicas del cultivo
115 95 93 113 113 108 637 3,19E+0 despus de 8 das.
8
Se determina el porcentaje de germinacin,
83 85 79 88 68 81 484 2,42E+0 partiendo de la figura#3 y contando el nmero de
8 conidio germinados y no germinados, ya que en
Promedio 2,643E+ estas imgenes se ven muchas hifas, las cuales
08 aparecen de los conidios obteniendo la siguiente
tabla:

Numero de conidios observados en las alcuotas


= Ec. 2 1 2 3 4 5 Totales

, G NG G NG G NG G NG G NG G NG G+NG %G
= = 178402500 Ec. 3

11 4 8 3 15 4 7 4 9 2 50 17 67 50

Tabla#3. Porcentaje de Germinacin de Conidios

 Produccion de Trichoderma harzianum mediante fermentacion solida sobre medio arroz y
evaluacion del Producto siguiendo el manual de Cenicafe
Se cuentan en total 50 conidios germinados y
unos 17 no germinados. Por lo cual, no supera
el porcentaje requerido mnimo de
germinacin segn boletn tcnico
CENICAFE, ya que su porcentaje de
germinacin es 50% y el requerido es de 85%,
es por ello que el producto obtenido no se
podra comercializar. Esto pude ser debido a
factores como la temperatura, la cual se debe
encontrar entre 15C y 30C, el bajo nivel de
tolerancia osmtica la cual debe ser 0,5M o
menor (Chvez, 2007).
Prueba de antagonismo
La funcin principal de este hongo se basa en
inhibir el crecimiento de fitopatogenos que
generan prdidas en los cultivos. Por esta razn es
de extrema importancia que se corrobore la
capacidad que tiene el producto para combatir a
estos hongos dainos (Ward O,1989), para ello se
debe de realizar una prueba en una caja de petri
con PDA en donde en un extremo se siembra
Trichoderma Harzianum y en el otro extremo se
sembr un fitopatogenos con el fin de ver si el
hongo se comporta como un agente inhibidor del
fitopatogenos y de esa forma no permitir que
crezca el hongo maligno; dicha capacidad vara
dependiendo de las dos partes: de la agresividad
del antagonista y de la susceptibilidad del
patgeno (Infante, D. 2009)por ello indispensable
realizar esta prueba en futuras prcticas.
CONCLUSIONES
Se logr realizar la produccin Trichoderma
harzianum, mediante la fermentacin slida en el
medio de arroz obteniendo como resultado la
generacin de esporas durante su proceso.
Se determin la cantidad de produccin de
conidios en fermentacion liquida (medio de
arroz), esta fue de 6650 Conidios/ml, y en
fermentacin solida (agar PDA) de 178402500
Conidios/g para una cantidad de sustrato de
200 gramos.
La fermentacion solida fue mas optima, ya que
a comparacion de la fermentacion liquida ya
que
5
El Trichoderma sobre el arroz, tiene una
aparariencia de color blanco en los primeros
dias, pero luego de que el hongo se desarrolla
se torna de color verde oscuro debido a la
aparicion de esporas.
A travs de la fermentacin slida o liquida es
posible realizar un anlisis de control de
calidad y verificar si el producto es ptimo
para comercializacin, por lo cual nuestro
cultivo no es ptimo ya que los requerimientos
mnimos segn CENICAF no se cumplieron,
ya que se obtuvo un 50% de germinacin y se
esperaba obtener un 85%.
Es recomendable para proximas practicas, realizar
la determinacion de porcentaje de pureza en el
cultivo.
REFERENCIAS
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(Bachelor's thesis).
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Trichoderma harzianum Isolates for their Efficacy

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Ward O. Biotecnologa de las fermentaciones.
Editorial Acribia S.A. Zaragoza-Espaa.
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T.Harzianum por fermentacin liquida, Instituto
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Venezuela.